CN108472350A - 新表位rna癌症疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含多核苷酸或多肽的抗癌疫苗、其中使用这种抗癌疫苗治疗癌症的方法以及用于产生所述疫苗的方法。所述疫苗包含含有核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码靶向单元、二聚单元、第一接头和抗原单元，其中所述抗原单元包含n‑1个抗原亚单元，每个亚单元包含癌症新表位序列的至少一部分和第二接头且所述抗原单元还包含最终癌症新表位序列，其中n为3至50的整数，或所述疫苗包含由所述多核苷酸编码的多肽或由两个多肽组成的二聚蛋白，这两个多肽是由所述多核苷酸编码。
Description
发明领域
本发明涉及一种包含新表位多核苷酸或多肽的抗癌疫苗、其中使用这种抗癌疫苗治疗癌症的方法以及用于产生所述疫苗的方法。
发明背景
虽然癌症的治疗在过去几十年间已有改善，尤其归因于早期检测和诊断，这显著地延长了存活期，仅约60％诊断为癌症的患者在诊断后的5年内仍活着。
大多数在用的癌症治疗是手术操作、放射线和细胞毒性化疗剂，然而，它们都有严重的副作用。近来还使用了利用针对已知癌症相关抗原的抗体的治疗。
在最近几年间，借助于患者自己的免疫系统靶向癌细胞的癌症免疫疗法(即癌症疫苗)已引起了人们的关注，因为这种疗法可减少或甚至消除传统癌症治疗中所见的一些副作用。
免疫学的基础是基于自身-非自身辨别。诱导感染性疾病的大多数病原体含有可由宿主识别并触发免疫应答的分子签名，然而，肿瘤细胞来源于正常细胞，并且通常不表达任何分子签名，使得它们更难以与正常细胞区分
然而，大多数肿瘤细胞表达不同类别的肿瘤抗原。一类肿瘤抗原是所谓的肿瘤相关抗原，即在正常组织中以低水平表达且在肿瘤组织中以高得多的水平表达的抗原。近十年来，这种肿瘤相关抗原成为了癌症疫苗的靶标。然而，针对肿瘤相关抗原的免疫治疗存在的几个问题在于，肿瘤细胞可通过所讨论的抗原的下调而逃避免疫系统，且该治疗还可由于正常细胞破坏而产生毒性。
近来，已鉴别了另一类肿瘤抗原，即所谓的肿瘤新抗原或肿瘤特异性抗原。肿瘤新抗原是由于肿瘤基因组中的一个或多个突变而出现，所述突变在所讨论的蛋白质的氨基酸序列中产生变化。由于在正常组织中不存在这些突变，所以针对肿瘤相关抗原的治疗的副作用在用针对肿瘤新抗原的免疫治疗时并不出现。
体细胞的、肿瘤特异性非同义突变的平均数目对于恶性黑色素瘤来说介于100与120之间。一些基因改变可由免疫系统识别，代表理想的抗原。动物模型已证实了肿瘤新抗原的免疫效用，并且已经开始了两个临床试验，一个是用包含高达10个突变蛋白质的疫苗，而另一个是用RNA疫苗(IVAC MUTANOME)。RNA疫苗包含2个RNA分子，每个包含五个不同的突变编码序列。
然而，通过施用几种不同蛋白质或几个RNA序列，难以控制针对所施用的或在体内表达的各种蛋白质的免疫应答。
因此，需要一种更高效的疫苗，其确保突变蛋白质在体内或体外的表达并且确保抗原的递送以及引发强T细胞应答所需的抗原呈递细胞的活化。
发明内容
本发明涉及一种抗癌疫苗，所述疫苗涉及来自肿瘤新抗原的多个新表位。由此获得特异性地靶向所鉴别的肿瘤抗原的个性化新抗原疫苗。
一方面，本发明涉及一种包含免疫有效量的多核苷酸的治疗性抗癌疫苗，所述多核苷酸包含编码抗原单元的核苷酸序列，所述抗原单元包含
-2至50个抗原亚单元，每个亚单元包含癌症新表位序列的至少一部分和接头
-最终的癌症新表位序列。
在一个优选实施方案中，接头是柔性接头。优选的是，所述接头是非免疫原性的。在另一优选实施方案中，所述接头在所有抗原亚单元中是相同的。
接头优选是丝氨酸-甘氨酸接头。
在一个实施方案中，接头的长度是4至20个氨基酸。在一个优选实施方案中，接头的长度是10至15个氨基酸。在一个具体实施方案中，接头的长度是10个氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，疫苗包含每个癌症新表位的一个拷贝。在另一实施方案中，疫苗包含至少一个癌症新表位的至少两个拷贝。
在一个实施方案中，癌症新表位序列具有7至30个氨基酸的长度。在一个优选实施方案中，癌症新表位序列具有7至10个氨基酸的长度。在一个具体的实施方案中，癌症新表位序列具有13至30个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，每个癌症新表位序列具有相同的长度。
在一个优选实施方案中，癌症新表位基本上位于癌症新表位序列的中间。优选地，癌症新表位序列是癌症新抗原的子序列。
优选的是，最具疏水性的抗原亚单元大致上在所述抗原单元的中间且最具亲水性的抗原亚单元在所述抗原单元的末端处。
在本发明的一个实施方案中，所述抗原单元的长度为约100个氨基酸至约1000个氨基酸。
在一个实施方案中，n是介于3与30之间的整数。在更具体的实施方案中，n是介于10与20之间的整数。
另一方面，本发明涉及一种包含如本文所定义的核苷酸序列的多核苷酸。
又一方面，本发明涉及一种由本文所定义的多核苷酸编码的多肽。
另一方面，本发明涉及如本文所定义的疫苗用于治疗癌症的用途。
本发明还涉及一种包含如本文所定义的核苷酸序列的载体。
另一方面，本发明涉及一种宿主细胞，其包含编码如本文所定义的抗原单元的核苷酸序列或包含如本文所定义的载体。
本发明还涉及一种用于制备疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的如本文所定义的多肽，所述方法包括
a.将如权利要求21所述的多核苷酸转染到细胞群中；
b.培养所述细胞群；
c.收集并纯化由所述细胞群表达的多肽；
d.将在步骤c)获得的多肽与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
又一方面，本发明涉及一种用于制备疫苗的方法，所述疫苗包含免疫有效量的如本文所定义的多核苷酸，所述方法包括
a.制备如本文所定义的多核苷酸；
b.将在步骤a)获得的多核苷酸与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
在一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：
-为肿瘤的外显子组测序；
-鉴别包含来自所述肿瘤的新表位的肿瘤新抗原；
-基于抗原性选择新表位，
之后进行制备所述多核苷酸的步骤。
另一方面，本发明涉及一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用如本文所定义的疫苗。
优选地，疫苗是真皮内或肌内施用。
在一个实施方案中，核苷酸序列是DNA。在另一实施方案中，核苷酸序列是RNA。
在一个优选实施方案中，施用是用喷射注射器进行。施用可例如借助于电穿孔。
附图简述
图1示出了在用包含10个新表位(VB4007，上图)的DNA疫苗候选物NEO B16-X或包含3个新表位(VB4008，下图)的NEO B16-III注射的B16黑色素瘤模型小鼠中的总免疫应答。该图示出了每106个脾细胞的IFNγ-斑点的总数。包含10个新表位的疫苗产生比包含3个新表位的疫苗更强且更广泛的总免疫应答。作为阴性对照，将小鼠用不包含新表位的空载体注射。如从图中可见，用空载体的注射不产生任何显著的免疫应答。
NEO B16-X＝VB4007＝B16 pepM1-M10
NEO B16-III＝VB4008＝B16 pepM1-M3
图2示出了用相应的10个新表位B16 pepM1-M10加上佐剂(20或200μg肽混合物)的混合物注射B16黑色素瘤模型小鼠仅产生模糊的免疫应答。作为阴性对照，将小鼠用不包含新表位的空载体注射。
定义
肿瘤在本上下文中既表示实体肿瘤又表示见于中体液如血液中的肿瘤细胞。
肿瘤新抗原用于表示与宿主外显子组相比包含一个或多个突变的任何肿瘤特异性抗原并且与术语癌症新抗原同义使用。
肿瘤新表位用于表示肿瘤抗原中的任何免疫原性突变并且与术语癌症新表位同义使用。
肿瘤新表位序列用于描述在抗原亚单元中包含新表位的序列，并且与术语癌症新表位序列同义使用。
治疗性抗癌疫苗描述了以下实情：所述疫苗是用于减少或破坏患者中已存在的肿瘤细胞。
发明详述
癌症通过一个或几个由于突变而开始异常不受控的细胞增殖的细胞由患者的正常组织发展而来。虽然癌细胞是突变的，但大多数基因组是完整的且与患者中的其余细胞相同。这也解释了先前在开发抗癌疫苗的尝试中的一些失败，即，该疫苗在某种程度上也针对患者中的正常细胞。如上所论述，如本发明所定义的攻击肿瘤的方法是使用以下认识：任何肿瘤由于突变而表达突变蛋白质，即所谓的新抗原，该新抗原与患者正常细胞中的任何蛋白质不相同，且因此所述新抗原是治疗性抗癌疫苗的有效靶标。肿瘤中所见的突变通常是高度个人的，且因此，对根据本发明的疫苗进行个性化以便仅用于具有所讨论的突变的患者中。
根据本发明的疫苗使用正常适应性免疫系统以提供针对肿瘤细胞的免疫力。适应性免疫系统是特异性的，因为每个外源抗原通过在称为抗原呈递的过程中识别特异性“非自身”抗原而引发特异性地针对所述外源抗原的免疫应答。适应性免疫系统的细胞是淋巴细胞，特别是B细胞和T细胞。B细胞参与了体液免疫应答，而T细胞参与了细胞介导的免疫应答。
具体来说，根据本发明的疫苗被设计来通过T细胞的活化引发针对新抗原的细胞介导的免疫应答。当T细胞已被加工并与如下文所论述的MHC分子一起复合呈递时，其识别新表位。
主要组织相容性复合体(MHC)
根据本发明的新表位被设计以存在于MHC-新表位复合体中。存在两种主要类别的主要组织相容性复合体(MHC)分子，即MHC I和MHC II。
MHC I见于体内所有有核细胞的细胞表面上。MHC I的一个功能是将细胞内部的非自身蛋白质的肽展示给细胞毒性T细胞。将MHC I复合体-肽复合体插入呈递肽到细胞毒性T细胞上的细胞的质膜中，由此触发细胞毒性T细胞针对特定的MHC-肽复合体的活化。肽位于MHC I分子的沟中，从而容许肽长度为约8-10个氨基酸。
MHC II分子是通常仅见于抗原呈递细胞如树突细胞、单核吞噬细胞、一些内皮细胞、胸腺上皮细胞和B细胞上的分子家族。
与MHC I相反，由II类肽呈递的抗原来源于胞外蛋白。胞外蛋白被内吞，在溶酶体中消化，且所生成的抗原肽被加载到MHC II类分子上，然后呈递在细胞表面处。MHC II类分子的抗原结合沟在两端打开并且能够呈递更长的肽，通常长度介于15与24个氨基酸残基之间。
MHC I类分子是由T细胞上的CD8和共受体识别，所述T细胞通常称为CD8+细胞，而MHC II类分子是由T细胞上的CD4和共受体识别，所述T细胞通常称为CD4+细胞。
疫苗
本发明涉及包含癌症新表位序列的多核苷酸疫苗，所述癌症新表位序列是通过为肿瘤DNA或RNA测序并鉴别代表新抗原的肿瘤特异性突变而获得。因此，获得特异性地靶向所鉴别的肿瘤抗原的个性化新抗原疫苗。
因此，一方面，本发明涉及一种包含免疫有效量的多核苷酸的治疗性抗癌疫苗，所述多核苷酸包含编码抗原单元的核苷酸序列，所述抗原单元包含
-2至50个抗原亚单元，每个亚单元包含癌症新表位序列的至少一部分和接头，以及
-最终的癌症新表位序列
根据本发明的抗原单元包含多个肿瘤新表位，其中每个新表位对应于肿瘤新抗原中所鉴别的突变。突变可为在至少一个氨基酸中引起变化的任何突变。因此，突变可为以下中的一个：
-引起氨基酸中的变化的非同义突变
-造成移码及由此突变后方向上的完全不同的开放阅读框的突变
-连读突变，其中终止密码子被修饰或缺失，产生具有肿瘤特异性新表位的更长蛋白
-产生独特的肿瘤特异性蛋白序列的剪接突变
-生成在两个蛋白的接合处具有肿瘤特异性新表位的嵌合蛋白的染色体重排
在抗原单元中，除最后一个之外的所有肿瘤新表位是在抗原亚单元中排列，其中每个亚单元由肿瘤新表位序列和接头组成，而最后一个亚单元仅包含新表位，即没有这种接头。由于肿瘤新表位序列被所述接头分隔，所以每个新表位以对免疫系统最佳的方式存在，由此如下文所论述确保疫苗的效率。
在一个实施方案中，根据所选新表位，抗原亚单元是以较大抗原性至较小抗原性的次序排列。
癌症新表位序列优选具有适于由以上论述的MHC分子呈递的长度。因此，在一个优选实施方案中，癌症新表位为7至30个氨基酸长。更优选的是具有7至10个氨基酸长度的癌症新表位序列或具有13至30个氨基酸长度的癌症新表位序列。
为了避免肿瘤通过终止突变基因的表达来逃避免疫系统(如果疫苗是针对所述基因的表达产物的话)，最好将多个不同的新表位纳入到抗原单元中。通常，肿瘤必须终止的基因越多，肿瘤能够终止其全部并仍能增殖或甚至存活的可能性越小。此外，肿瘤之所以异质是因为不是每个新抗原都是由所有肿瘤细胞表达。因此，根据本发明，方法是将尽可能多的新表位纳入到疫苗中以有效地攻击肿瘤。并且，为了确保所有新表位都有效地加载到相同抗原呈递细胞上，它们被作为一条氨基酸链而非离散肽来排列。然而，如上所述，疫苗的目标是针对新表位激活T细胞，并且在太多新表位被纳入疫苗中的情况下，T细胞可被稀释，且因此，提供在抗原单元中具有最佳的新表位数目的疫苗是一种平衡。
如下文更详细地论述，分析肿瘤外显子组以鉴别新抗原且随后选择大多数抗原新表位。本发明者已发现，应选择至少3个新表位以掺入到疫苗中，如至少5个新表位、如至少7个新表位、如至少10个新表位，以便能够有效地“打击”大致上所有肿瘤细胞。
另外，本发明者已发现，将疫苗构建体中新表位的数目从3个新表位增至10个新表位，使得免疫应答产生惊人的增强(参见图1)。优选地，根据本发明的疫苗包含至少10个新表位。
在一个实施方案中，3至50个新表位被纳入疫苗中以便获得最有效的免疫应答，而不会稀释T细胞，如3至30个新表位、如3至20个新表位、如3至15个新表位、如3至10个新表位，且因此，n优选为3至50的整数，如3至30、如5至25、如3至20、如3至15、如3至10。
在另一实施方案中，5至50个新表位可被纳入疫苗中以便获得最有效的免疫应答，而不会稀释T细胞，如5至30个新表位、例如5至25个新表位、如5至20个新表位、如5至15个新表位、如5至10个新表位，且因此，n优选为5至50的整数，如5至30、如5至20、如5至15、如5至10。
在又一实施方案中，10至50个新表位可被纳入疫苗中以便获得最有效的免疫应答，而不会稀释T细胞，如10至40个新表位、如10至30个新表位、如10至25个新表位、如10至20个新表位、如10至15个新表位，且因此，n优选为10至50的整数，如10至30，例如10至25、如10至20或如10至15个新表位。
本发明者已显示包含10个新表位的疫苗体(vaccibody)DNA疫苗诱导比仅包含3个新表位的疫苗体DNA疫苗更强且更广泛的总免疫应答(参见图4和实施例2)。此外，使新表位数目增至超过20个可产生有效性较低的疫苗，这归因于T细胞的稀释。更进一步，纳入超过20个新表位可与技术难点有关。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，疫苗包含10至20个新表位。
在又一实施方案中，15至50个新表位被纳入疫苗中以便获得最有效的免疫应答，而不会稀释T细胞，如15至30个新表位或如15至20个新表位，且因此，n优选为15至50的整数，如15至30或如15至20个新表位。
在一个实施方案中，抗原单元包含每个癌症新表位的一个拷贝，以便当10个新表位被纳入疫苗中时，可引发针对10个不同新表位的细胞介导的免疫应答。
然而，如果仅鉴别了几个相关抗原突变，那么抗原单元可包含至少一个新表位的至少两个拷贝以便增强针对这些新表位的免疫应答。而且出于制造和法规原因，保持质粒且即抗原单元的长度恒定可为有利的，且因此可有利地在抗原单元中包括相同新表位的一个以上拷贝。
如上所论述，保持抗原单元长度恒定可为有利的，且因此，在一个实施方案中，优选的是所有癌症新表位序列具有相同长度。然而，如果新表位中的一个或多个是由引起移码的突变或终止密码子突变产生，那么新表位可具有相当长的长度，如由蛋白质的至少突变部分、突变蛋白的最具抗原性部分或也许整个突变蛋白组成，由此新表位中至少一个的长度基本上长于由非同义点突变产生的新表位。
抗原单元的长度主要由抗原单元中排列的新表位的长度和新表位的数目确定，且为约21至1500，优选约30个氨基酸至约1000个氨基酸、更优选约50至约500个氨基酸、如约100至约400个氨基酸、约100至约300个氨基酸。
特别当新表位较短，如几个氨基酸长时，癌症新表位序列包含在两侧由氨基酸序列侧接的新表位。优选地，新表位基本上位于癌症新表位序列的中间，以便确保新表位在加工之后由抗原呈递细胞呈递。侧接在新表位上的氨基酸序列优选为侧接在新抗原中的新表位上的氨基酸序列，从而癌症新表位序列是癌症新抗原氨基酸序列的真正子序列。
虽然有可能获得针对肿瘤的相关免疫应答，如果新表位随机地在抗原亚单元中排列的话，但优选的是遵循用于为抗原单元中的新表位排序以便增强免疫应答的以下方法中的至少一种。
在另一实施方案中，特别是如果新表位之中的亲水性/疏水性极大地变化，那么优选的是，最具疏水性的抗原亚单元基本上位于抗原单元的中间且最具亲水性的抗原亚单元位于抗原单元的起始和/或末端处。或者，新表位可在亲水性与疏水性新表位之间交替排列。
此外，富GC的新表位应被间隔开以避免GC簇；优选地，富GC的新表位被至少一个亚单元间隔开。
接头被设计成非免疫原性的且优选还是柔性接头，从而，尽管有较高数量的抗原亚单元存在于抗原单元中，但肿瘤新表位是以对T细胞最佳的方式存在。优选地，接头长度为4至20个氨基酸以保证柔性。在另一优选实施方案中，接头长度为8至20个氨基酸、如8至15个氨基酸、例如8至12个氨基酸或例如10至15个氨基酸。在一个具体的实施方案中，接头长度为10个氨基酸。
在一个特定实施方案中，本发明的疫苗包含10个新表位，其中接头的长度为8至20个氨基酸，如8至15个氨基酸，例如8至12个氨基酸或如10至15个氨基酸。在一个具体的实施方案中，本发明的疫苗包含10个新表位，其中接头的长度为10个氨基酸。
接头优选地在所有抗原亚单元中是相同的。然而，如果新表位中的一个或多个包含类似于接头的氨基酸基序，那么用不同序列的接头取代相邻接头可为有利的。另外，如果新表位-第二接头接合点经预测构成表位本身，那么可能使用不同序列的接头。
接头优选地为丝氨酸-甘氨酸接头，如柔性GGGGS接头，如GGGSS、GGGSG、GGGGS或其多个变体，如GGGGSGGGGS或(GGGGS)m、(GGGSS)m、(GGGSG)m，其中m为1至5、1至4或1至3的整数。在一个优选实施方案中，m为2。
在一个优选实施方案中，丝氨酸-甘氨酸接头还包含至少一个亮氨酸(L)，如至少2个或至少3个亮氨酸。丝氨酸-甘氨酸接头可例如包含1、2、3或4个亮氨酸。优选地，丝氨酸-甘氨酸接头包含1个亮氨酸或2个亮氨酸。
在一个实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGGGS、GLGGS、GGLGS、GGGLS或GGGGL。在另一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGGSG、GLGSG、GGLSG、GGGLG或GGGSL。在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGGSS、GLGSS、GGLSS、GGGLS或GGGSL。
在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGLGS、GLGLS、GLLGS、LGGLS或GLGGL。在另一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGLSG、GLLSG、GGLSL、GGLLG或GLGSL。在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGLSS、GLGLS、GGLLS、GLGSL或GLGSL。
在本发明的另一实施方案中，第二丝氨酸-甘氨酸接头具有10个氨基酸的长度且包含1个亮氨酸或2个亮氨酸。
在一个实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGGGSGGGGS、GLGGSGGGGS、GGLGSGGGGS、GGGLSGGGGS或GGGGLGGGGS。在另一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGGSG GGGSG、GLGSGGGGSG、GGLSGGGGSG、GGGLGGGGSG或GGGSLGGGSG。在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGGSSGGGSS、GLGSSGGGSS、GGLSSGGGSS、GGGLSGGGSS或GGGSLGGGSS。
在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGGGSLGGGS、GLGGSGLGGS、GGLGSGGLGS、GGGLSGGGLS或GGGGLGGGGL。在另一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGGSGLGGSG、GLGSGGLGSG、GGLSGGGLSG、GGGLGGGGLG或GGGSLGGGSL。在又一实施方案中，第二接头包含以下序列或由以下序列组成：LGGSSLGGSS、GLGSSGLGSS、GGLSSGGLSS、GGGLSGGGLS或GGGSLGGGSL。
在一个优选实施方案中，根据本发明的疫苗包含至少10个新表位，这些新表位被10个氨基酸接头分隔。在另一优选实施方案中，根据本发明的疫苗包含至少15个被10个氨基酸接头分隔的新表位，如至少20个被10个氨基酸接头分隔的新表位。
在另一优选实施方案中，疫苗包含10至20个或10至25个被第二接头分隔的新表位。优选地，所述第二接头为10个氨基酸。第二接头也可具有如上文所定义的任何长度，例如8至12个氨基酸。
替代接头可选自由以下组成的组：GSAT接头和SEG接头、或其多个变体。
信号肽
在一个优选实施方案中，多核苷酸还包含编码信号肽的核苷酸序列。信号肽被构建以便容许在用所述多核苷酸转染的细胞中分泌由本发明的多核苷酸编码的多肽。
可使用任何合适的信号肽。合适的肽的实例为Ig VH信号肽，如SEQ ID NO:31；人TPA信号肽，如SEQ ID NO:32；及包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列1-23有至少80％序列同一性的氨基酸序列的信号肽。
在一个优选实施方案中，信号肽包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列1-23具有以下序列同一性的氨基酸序列：至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％。
在更优选的实施方案中，信号肽是由与SEQ ID NO:1的氨基酸序列1-23具有以下序列同一性的氨基酸序列组成：至少80％，优选至少85％、如至少86％、如至少87％、如至少88％、如至少89％、如至少90％、如至少91％、如至少92％、如至少93％、如至少94％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％、如100％。
序列同一性
序列同一性可如下测定：高水平的序列同一性表明第一序列可能来源于第二序列。氨基酸序列同一性需要两个比对序列之间的相同氨基酸序列。因此，与参照序列享有70％氨基酸同一性的候选序列需要：在比对之后，候选序列中的70％氨基酸与参照序列中相应的氨基酸相同。同一性可借助于计算机分析来测定，如但不限于ClustalW计算机比对程序(Higgins D.,Thompson J.,Gibson T.,Thompson J.D.,Higgins D.G.,Gibson T.J.,1994.CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting,position-specific gap penalties andweight matrix choice.Nucleic Acids Res.22:4673-4680)及其中建议的默认参数。使用在其默认设置下的此程序，将查询多肽的成熟(生物活性)部分与参照多肽进行比对。对完全保守的残基的数目计数并除以参照多肽的长度。这样做时，形成查询序列的一部分的任何标签或融合蛋白序列在序列同一性的比对和后续测定中被忽略。
ClustalW算法可类似地用于比对核苷酸序列。序列同一性可以与针对氨基酸序列所示类似的方式来计算。
用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法。将这种算法结合到ALIGN程序(2.0版)中，ALIGN程序是FASTA序列比对软件包(Pearson WR,Methods Mol Biol,2000,132:185-219)的一部分。比对是基于全局比对来计算序列同一性。Align0并未罚分至序列末端处的缺口。当利用ALIGN og Align0程序来比较氨基酸序列时，优选使用具有–12/-2的缺口打开/延伸罚分的BLOSUM50取代矩阵。
多核苷酸
本发明还涉及一种如上所述的多核苷酸。所述多核苷酸可包含DNA核苷酸序列或RNA核苷酸序列，如基因组DNA、cDNA和RNA序列，呈双链或单链。
优选的是，多核苷酸被优化为表达本发明的多肽的种类，即，多核苷酸序列优选为人密码子优化的。
多肽
本发明还涉及一种由如上所定义的多核苷酸序列编码的多肽。多肽可在体外表达以便产生本发明的疫苗，或多肽可由于如上所定义的多核苷酸的施用而在体内表达。
载体
此外，本发明涉及一种包含如上所定义的核苷酸序列的载体。优选的是，载体允许如上所述的各种单元的轻易互换，特别是抗原单元。具体来说，表达载体可以是pUMVC4a载体或NTC9385R载体主链。抗原单元可与由Sfil限制酶盒限制的抗原单元盒互换，其中5'位点被掺入GLGGL/GLSGL接头中且3'位点被纳入载体中的终止密码子之后。
宿主细胞
本发明还涉及一种宿主细胞，其包含如上所定义的核苷酸序列或包含如上所定义的载体以用于表达本发明的多肽。
合适的宿主细胞包括原核生物、酵母、昆虫或高级真核细胞。
用于制备疫苗的方法
根据本发明的疫苗在新抗原在患者肿瘤中被鉴别的意义上优选是个性化疫苗，且因此，疫苗完全是针对患者肿瘤中的特异性突变蛋白。
因此，一方面，本发明涉及一种通过在体外产生多肽来制备包含免疫有效量的如上所定义的多肽的疫苗的方法。多肽和蛋白质的体外合成可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行，如通过多肽在多种表达系统的任一种中的肽合成或表达，然后纯化。因此，在一个实施方案中，所述方法包括
a)将如上所定义的多核苷酸转染到细胞群中；
b)培养所述细胞群；
c)收集并纯化由所述细胞群表达的多肽，以及
d)将在步骤c)获得的多肽与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
在一个优选实施方案中，将在步骤c)获得的二聚蛋白或多肽溶于所述药学上可接受的载体中。
此外，可添加佐剂或缓冲液到疫苗中。
纯化可根据任何合适的方法进行，如色谱法、离心或差异溶解度。
另一方面，本发明涉及一种用于制备包含免疫有效量的如上所定义的多核苷酸的疫苗的方法。在一个实施方案中，所述方法包括
a.制备如上所定义的多核苷酸；
b.将在步骤a)获得的多核苷酸与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
多核苷酸可通过本领域技术人员已知的任何合适的方法来制备。例如，多核苷酸可使用寡核苷酸合成物通过化学合成来制备。
具体来说，较小的核苷酸序列(例如像抗原单元的亚单元)可单独合成，然后连接以在载体主链中产生最终的多核苷酸。
对于个性化疫苗的设计，上述方法是在鉴别有待纳入多核苷酸中的新表位的方法之前。
此方法优选地包括以下步骤：
-为肿瘤的基因组或外显子组测序
-鉴别包含来自所述肿瘤的新表位的肿瘤新抗原，
-基于预测的抗原性选择新表位。
肿瘤或肿瘤部分可通过任何合适的方法，如通过获得肿瘤的活组织检查或通过切除肿瘤，或来自任何合适的体液，如血液样品或尿液样品。
肿瘤基因组或外显子组的测序
基因组或外显子组(即基因组的编码部分)可使用任何合适的方法(如全外显子组测序)来测序。具体来说，测序仪可为Illumina HiSeq2500)，使用配对末端2x100-125或PE100-125(读取长度)，多重的。
鉴别肿瘤抗原
一旦鉴别了肿瘤特异性突变，下一步便是鉴别包含新表位的预测的抗原肽。
肿瘤突变是通过以下步骤发现：为肿瘤和正常组织测序并对所获得的序列进行比较。多种方法可用于检测特定的突变或等位基因在个体的DNA或RNA中的存在。举例来说，可应用以下技术，包括动态等位基因特异性杂交(DASH)、微板阵列斜凝胶电泳(MADGE)、焦磷酸测序、寡核苷酸特异性连接、TaqMan系统以及各种DNA“芯片”技术，如Affymetrix SNP芯片。
或者，可进行通过直接蛋白质测序来鉴别突变的方法。
从肿瘤外显子组中的有可能成百或上千的突变中，基于预示性HLA结合算法在电脑中选择新表位。意图是鉴别所有相关的新表位并且在排名或评分之后，确定新表位被纳入疫苗中用于所讨论的特定患者。
可使用任何合适的算法，如以下之一：
可获得的免费的肽-MHC结合的软件分析(IEDB和NetMHC)可从以下网站下载：
http://www.iedb.org/
http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/
预测最佳肽以用于疫苗设计的可商购获得的高级软件可在例如这里找到：
http://www.oncoimmunity.com/
https://omictools.com/t-cell-epitopes-category
https://github.com/griffithlab/pVAC-Seq
http://crdd.osdd.net/raghava/cancertope/help.php
http://www.epivax.com/tag/neoantigen
关于其抗原性对每个突变评分，并且在多核苷酸中选出并最佳地设计最具抗原性的新表位。如上所论述，根据本发明，3至50个新表位是优选的。
疫苗
随后产生包含以下之一的最终疫苗：
-如上所定义的多核苷酸
-由如上所定义的多核苷酸编码的多肽
疫苗还可包含药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂或缓冲剂。
药学上可接受的载体、稀释剂和缓冲剂包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、无菌等渗含水缓冲剂及其组合。
特别是对于包含多肽/蛋白质的疫苗来说，药学上可接受的佐剂包括但不限于聚-ICLC、1018 ISS、铝盐、Amplivax、AS 15、BCG、CP-870,893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact EV1P321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、Juvlmmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、Montanide ISA 206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel.RTM、载体系统、PLGA微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒颗粒及其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGF捕获剂、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、Aquila的QS21刺激子、vadimezan和/或AsA404(DMXAA)。
特别是对于包含多核苷酸的疫苗来说，载体可包括容易转染细胞的分子并且佐剂可包括包含编码趋化因子或细胞因子的核苷酸序列的质粒以便增强免疫应答。
疫苗被配制成任何合适的制剂，如液体制剂，以用于皮内或肌内注射。
施用
疫苗可以对于多肽/蛋白质疫苗或多核苷酸疫苗来说任何合适的方式施用，如通过真皮内、肌内、皮下注射来施用，或通过粘膜或上皮施用，如鼻内、经口、肠内或施用于膀胱。在一个优选实施方案中，通过喷射注射施用疫苗。
具体来说，当疫苗为多核苷酸疫苗时，疫苗优选地肌内或真皮内施用。
在一个特定的实施方案中，疫苗是通过结内注射施用。如本文所用，术语“结内注射”意指疫苗被注射到淋巴结中。
治疗
多核苷酸和多肽优选用于治疗癌症，并且在如上所论述的疫苗中配制。通过本文所述的方法，有可能治疗患有癌症的患者，这是通过检查存在于患者肿瘤中的任何突变，产生疫苗，然后用完全针对存在于他或她的肿瘤中的新抗原的疫苗免疫患者来实现。由于现在有用于测序、表位测定并产生核苷酸序列的快速和可靠的方法，患者在肿瘤切除后12周内接受疫苗是有可能的。
癌症可为其中癌细胞包含突变的任何癌症。癌症可为原发肿瘤、转移或这两者。检查突变的肿瘤可为原发肿瘤或转移。有待治疗的癌症尤其是已知具有高突变负荷的癌症，如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌和结肠癌。
在一个优选实施方案中，用包含如上所述的多核苷酸的疫苗进行治疗，例如，其中多核苷酸为DNA或RNA。
优选的是肌内注射多核苷酸疫苗，如于大肌肉中，例如肩部、臀部或大腿。已发现多肽是局部产生的并且相关免疫细胞使基本上在产生位点处的多肽/蛋白质内化，且基本上没有多肽或蛋白质到达血流。
可使用注射多核苷酸的任何合适的方法，如通过利用喷射注射器或借助于电穿孔。
给药方案
疫苗可作为单剂量施用，或可重复施用。当重复施用疫苗时，优选的是以至少3周的时间间隔来施用，以避免T细胞的耗尽。
因此，在一个实施方案中，给药方案将为在第0、3、6周接种，然后每4周接种一次，只要患者具有临床益处。可施用疫苗持续至少一年。
疫苗是以免疫有效量施用。“免疫有效量”意指建立减小肿瘤的效果所需的疫苗的量。最终，内科医师确定该剂量对于DNA疫苗来说通常在0.3-6mg的范围内，且对于多肽/蛋白质疫苗来说在5μg-5mg的范围内。
组合治疗
根据本发明的疫苗治疗可与任何其它抗癌治疗如放射疗法、化疗和外科治疗组合。
根据本发明的疫苗治疗也可与检查点阻断抑制剂治疗组合。
实施例
实施例1：疫苗的构建和表达
先前描述的小鼠黑色素瘤癌细胞系B16-F10的外显子组测序和RNA测序揭示了成百至上千的肿瘤特异性非同义突变(Castle等人2012、Castle等人2014和Kreiter等人2015)。将基于电脑中的方法用于鉴别潜在的免疫原性新表位。用编码突变表位的肽使小鼠免疫，且观察其免疫原性作为特异性T细胞免疫应答(Elispot测定)。此外，用选自Elispot的最具免疫原性的表位接种小鼠赋予了强抗肿瘤活性(Castle等人2012和Kreiter等人2015)。
每个新表位都是包含由柔性GGGGS接头分隔的27个氨基酸的肽。对短肽(<20个氨基酸)进行加工并可将新型表位呈递于MHC I类分子上并激活CD8+T细胞。然而，优选的是疫苗激活CD8+和CD4+T细胞且因此编码长肽(>20个氨基酸)的新表位被选出。由此可允许有效的肽加工及呈递于MHC I类和II类上(Kreiter等人2015)。在NEO B16-X构建体中，所选的疏水性和亲水性新表位是均匀分布的。27聚体新表位之间的中性柔性GGGGS接头对于避免在合并的新表位的接合点中生成新免疫原性表位来说是重要的。
见于B16-F10细胞系中的新表位的序列示于表1中。
表1-B16-F10细胞系
所有新表位基因序列都是从Genscript(New Jersey,US)定购并克隆到表达载体pUMVC4a中。
实施例2：免疫应答研究
包含10个新表位的NEO B16-X(VB4007)和包含3个新表位的NEO B16-III(VB4008)被选为疫苗候选物。作为阴性对照，利用空pUMVC4a载体。
NEO B16-X＝VB4007＝B16 pepM1-M10
NEO B16-III＝VB4008＝B16 pepM1-M3
用于DNA疫苗的新表位序列示于表1中。
将每个候选物的20μg质粒DNA肌内注射到C57BI/6小鼠的胫骨前肌中，然后使用TriGrid,Ichor,(US)进行电穿孔。在第13天，对小鼠施以安乐死并采集脾脏。通过IFN-γELISpot评价T细胞应答。结果示于图1中，其中总新抗原特异性T细胞应答表示为IFN-γ斑点的数目/106个脾细胞。观察到包含新表位B16-pepM1-pepM10的DNA疫苗(VB4007)引起强免疫应答。用空载体的注射不产生显著的免疫应答(上图，图1)。包含3个新表位的NEO B16-III(VB4008)也诱导新表位特异性免疫应答，但观察到与VB4007相比的较弱的总免疫应答(下图，图1)。
作为另一对照，将小鼠用10个相应的肽B16-pepM1-pepM10加上50μg聚(I:C)佐剂的混合物皮下注射。图2示出了以下实验结果：用20或200μg肽混合物加上佐剂(即，2μg或20μg每个单独的新表位)注射小鼠。与由VB4007诱导的免疫应答相比，用包含与存在于NEOB16-X构建体(VB4007)中相同的10个新表位序列的肽混合物加上佐剂注射小鼠不产生任何显著的免疫应答(如图1的上图所示)。
实施例4
通过根据管理机构的指南进行质粒疫苗的GMP制造并填充和完成DNA疫苗来制备有待使用的治疗性DNA疫苗。DNA疫苗可通过以2-6mg/ml的浓度溶于盐水溶液如PBS中来配制。疫苗可被皮内或肌内施用，在或不在电穿孔之后，或替代地用喷射注射器。
序列
SEQ ID NO:1
B16-F10突变表位，B16-PepM1，氨基酸序列
PSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFL
SEQ ID NO:2
B16-F10突变表位，B16-PepM2，氨基酸序列
REGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHD
SEQ ID NO:3
B16-F10突变表位，B16-PepM3，氨基酸序列
SHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS
SEQ ID NO:4
B16-F10突变表位，B16-PepM4，氨基酸序列
GRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVR
SEQ ID NO:5
B16-F10突变表位，B16-PepM5，氨基酸序列
FRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNM
SEQ ID NO:6
B16-F10突变表位，B16-PepM6，氨基酸序列
VVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLAS
SEQ ID NO:7
B16-F10突变表位，B16-PepM7，氨基酸序列
SSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYM
SEQ ID NO:8
B16-F10突变表位，B16-PepM8，氨基酸序列
EFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGM
SEQ ID NO:9
B16-F10突变表位，B16-PepM9，氨基酸序列
STANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEK
SEQ ID NO:10
B16-F10突变表位，B16-PepM10，氨基酸序列
DSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ
SEQ ID NO:11
Gly-Ser接头：GGGGS
SEQ ID NO:12
VB4007的氨基酸序列＝NEO B16-X＝B16pepM1-M10,5aa接头
新表位序列起始于氨基酸24。新表位序列是由接头GGGGS分隔。氨基酸1-24代表信号肽(SEQ ID NO:14)。
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSPSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVSGGGGSGRGHLLGRLAAIVGKQVLLGRKVVVVRGGGGSFRRKAFLHWYTGEAMDEMEFTEAESNMGGGGSVVDRNPQFLDPVLAYLMKGLCEKPLASGGGGSSSPDEVALVEGVQSLGFTYLRLKDNYMGGGGSEFKHIKAFDRTFANNPGPMVVFATPGMGGGGSSTANYNTSHLNNDVWQIFENPVDWKEKGGGGSDSGSPFPAAVILRDALHMARGLKYLHQ
SEQ ID NO:13
VB4008的氨基酸序列＝NEO B16-III＝B16pepM1-M3,5aa接头
新表位序列起始于氨基酸24。新表位序列是由接头GGGGS分隔。氨基酸1-24代表信号肽(SEQ ID NO:14)。
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLSPSKPSFQEFVDWENVSPELNSTDQPFLGGGGSREGVELCPGNKYEMRRHGTTHSLVIHDGGGGSSHCHWNDLAVIPAGVVHNWDFEPRKVS
SEQ ID NO:14
信号肽
MQVSTAALAVLLCTMALCNQVLS
SEQ ID NO:15.接头：GGGSS
SEQ ID NO:16.接头：GGGSG
SEQ ID NO:17.接头：GGGGS
SEQ ID NO:18.接头：LGGGS
SEQ ID NO:19.接头：GLGGS
SEQ ID NO:20.接头：GGLGS
SEQ ID NO:21.接头：GGGLS
SEQ ID NO:22.接头：GGGGL
SEQ ID NO:23.接头：LGGSG
SEQ ID NO:24.接头：GLGSG
SEQ ID NO:25.接头：GGLSG
SEQ ID NO:26.接头：GGGLG
SEQ ID NO:27.接头：GGGSL
SEQ ID NO:28.接头：LGGSS
SEQ ID NO:29.接头：GLGSS
SEQ ID NO:30.接头：GGLSS
SEQ ID NO:31.接头：GGGLS
SEQ ID NO:32.接头：GGGSL
SEQ ID NO:33.接头：LGLGS
SEQ ID NO:34.接头：GLGLS
SEQ ID NO:35.接头：GLLGS
SEQ ID NO:36.接头：LGGLS
SEQ ID NO:37.接头：GLGGL
SEQ ID NO:38.接头：LGLSG
SEQ ID NO:39.接头：GLLSG
SEQ ID NO:40.接头：GGLSL
SEQ ID NO:41.接头：GGLLG
SEQ ID NO:42.接头：GLGSL
SEQ ID NO:43.接头：LGLSS
SEQ ID NO:44.接头：GLGLS
SEQ ID NO:45.接头：GGLLS
SEQ ID NO:46.接头：GLGSL
SEQ ID NO:47.接头：GLGSL
SEQ ID NO:48.接头：LGGGSGGGGS
SEQ ID NO:49.接头：GLGGSGGGGS
SEQ ID NO:50.接头：GGLGSGGGGS
SEQ ID NO:51.接头：GGGLSGGGGS
SEQ ID NO:52.接头：GGGGLGGGGS
SEQ ID NO:53.接头：LGGSGGGGSG
SEQ ID NO:54.接头：GLGSGGGGSG
SEQ ID NO:55.接头：GGLSGGGGSG
SEQ ID NO:56.接头：GGGLGGGGSG
SEQ ID NO:57.接头：GGGSLGGGSG
SEQ ID NO:58.接头：GGGSLGGGSG
SEQ ID NO:59.接头：GLGSSGGGSS
SEQ ID NO:60.接头：GGLSSGGGSS
SEQ ID NO:61.接头：GGGLSGGGSS
SEQ ID NO:62.接头：GGGSLGGGSS
SEQ ID NO:63.接头：LGGGSLGGGS
SEQ ID NO:64.接头：GLGGSGLGGS
SEQ ID NO:65.接头：GGLGSGGLGS
SEQ ID NO:66.接头：GGGLSGGGLS
SEQ ID NO:67.接头：GGGGLGGGGL
SEQ ID NO:68.接头：LGGSGLGGSG
SEQ ID NO:69.接头：GLGSGGLGSG
SEQ ID NO:70.接头：GGLSGGGLSG
SEQ ID NO:71.接头：GGGLGGGGLG
SEQ ID NO:72.接头：GGGSLGGGSL
SEQ ID NO:73.接头：LGGSSLGGSS
SEQ ID NO:74.接头：GLGSSGLGSS
SEQ ID NO:75.接头：GGLSSGGLSS
SEQ ID NO:76.接头：GGGLSGGGLS
SEQ ID NO:77.接头：GGGSLGGGSL
Claims (34)
1.一种包含免疫有效量的多核苷酸的治疗性抗癌疫苗，所述多核苷酸包含编码抗原单元的核苷酸序列，所述抗原单元包含
-2至50个抗原亚单元，每个亚单元包含癌症新表位序列的至少一部分和接头，以及
-最终的癌症新表位序列。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其中所述接头是柔性接头。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的疫苗，其中所述接头是非免疫原性的。
4.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述接头在所有抗原亚单元中是相同的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述接头是丝氨酸-甘氨酸接头。
6.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述接头的长度是4至20个氨基酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述接头的长度是10至15个氨基酸。
8.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述接头的长度是10个氨基酸。
9.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其包含每个癌症新表位的一个拷贝。
10.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其包含至少一个癌症新表位的至少两个拷贝。
11.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述癌症新表位序列具有7至30个氨基酸的长度。
12.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述癌症新表位序列具有7至10个氨基酸的长度。
13.根据权利要求1至10中任一项所述的疫苗，其中所述癌症新表位序列具有13至30个氨基酸的长度。
14.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中每个癌症新表位序列具有相同长度。
15.根据前述实施方案中任一项所述的疫苗，其中所述癌症新表位基本上位于所述癌症新表位序列的中间。
16.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述癌症新表位序列是癌症新抗原的子序列。
17.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中最具疏水性的抗原亚单元大致上在所述抗原单元的中间且最具亲水性的抗原亚单元在所述抗原单元的末端处。
18.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中所述抗原单元的长度为约100个氨基酸至约1000个氨基酸。
19.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中n是介于3与30之间的整数。
20.根据前述权利要求中任一项所述的疫苗，其中n是介于10与20之间的整数。
21.一种多核苷酸，其包含如权利要求1-20中任一项所述的核苷酸序列。
22.一种多肽，其是由如权利要求21所述的多核苷酸编码。
23.如权利要求1至20中任一项所述的疫苗用于治疗癌症的用途。
24.一种载体，其包含如权利要求1至20中任一项所述的核苷酸序列。
25.一种宿主细胞，其包含如权利要求1至20中任一项所述的编码抗原单元的核苷酸序列或包含如权利要求23所述的载体。
26.一种用于制备包含免疫有效量的根据权利要求21所述的多肽的疫苗的方法，所述方法包括
e.将如权利要求21所述的多核苷酸转染到细胞群中；
f.培养所述细胞群；
g.收集并纯化由所述细胞群表达的多肽
h.将在步骤c)获得的多肽与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
27.一种用于制备包含免疫有效量的如权利要求21所述的多核苷酸的疫苗的方法，所述方法包括
a.制备如权利要求21所述的多核苷酸；
b.将在步骤a)获得的多核苷酸与药学上可接受的载体混合，由此获得所述疫苗。
28.根据权利要求27所述的方法，其还包括以下步骤：
-为肿瘤的外显子组测序；
-鉴别包含来自所述肿瘤的新表位的肿瘤新抗原；
-基于抗原性选择新表位，
之后进行制备所述多核苷酸的步骤。
29.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用如权利要求1至20中任一项所述的疫苗。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述疫苗是真皮内或肌内施用。
31.根据权利要求29至30中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列是DNA。
32.根据权利要求29至30中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列是RNA。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中施用是用喷射注射器进行。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中施用是借助于电穿孔。
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Application publication date: 20180831 |