CN106046125B - Htnv gp上的ctl表位肽及其筛选方法和应用 - Google Patents

Htnv gp上的ctl表位肽及其筛选方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了HTNV GP上的CTL表位肽及其筛选方法和应用，其中，该表位肽由8个氨基酸构成：异亮氨酸‑苏氨酸‑丝氨酸‑亮氨酸‑苯丙氨酸‑丝氨酸‑亮氨酸‑亮氨酸(ITSLFSLL)，序列位置为：GPaa456～463；该表位肽的筛选方法包括以下步骤：预测‑合成‑检测；经研究，该表位肽可应用在刺激机体细胞免疫应答反应中。本发明的有益之处在于：通过对HTNV GP上的CTL表位肽的筛选和杀伤力检测，结合GP本身具有丰富的中和表位，能够刺激机体产生较强中和抗体的优势，有助于开发具有中和表位和CTL表位的新型多功能高效肽段疫苗，对HTNV新型基因工程疫苗的研究具有重要意义。

Description

HTNV GP上的CTL表位肽及其筛选方法和应用
技术领域
本发明涉及汉滩病毒包膜糖蛋白(简称HTNV GP)上的CTL表位肽、该表位肽的筛选方法、以及该表位肽的应用，属于微生物免疫技术领域。
背景技术
汉滩病毒(Hantaan virus，HTNV)隶属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、汉坦病毒属(Hantavirus)。1976年，韩国学者李镐汪于该国疫区汉滩河流域黑线姬鼠的肺组织中首次成功分离该病毒。该病毒宿主为鼠类等啮齿类动物，主要通过动物排泄物污染而经由呼吸道、消化道及破损的皮肤等途径传播给人类，引起肾综合征出血热(Hemorrhagic feverwith renal syndrome，HFRS)，主要临床表现为发热、出血和急性肾功能损害。我国是世界上HFRS疫情最严重的国家，具有流行范围广、发病人数多、病死率高等特点，据文献报道，从1950年-2007年间，我国共发生1557622例HFRS，其中死亡46427例，死亡率约为3％，而且我国的31个省自治区直辖市中有29个(新疆和西藏除外)报道发现过HFRS病例。另据中国疾病预防控制中心统计，2015年我国共发生10812例HFRS。由于HFRS的宿主广泛，传播途径多，到目前为止临床上尚缺乏特异有效的治疗药物，因此其防治任务十分艰巨。
目前我国对于HFRS的预防主要采取综合预防策略，包括公共卫生安全知识的宣传和普及、鼠害的控制、流行病学调查和监督以及特 异性疫苗的研制，其中疫苗的研制和使用是预防HFRS最主要的措施，而HFRS新型基因工程疫苗的研发一直是HFRS预防领域的研究热点。
在HFRS基因工程疫苗的研究中，目前主要是利用HTNV的结构蛋白，包括包膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)作为抗原组分，而CTL表位诱导的细胞免疫应答在抗病毒感染中也发挥重要作用。有关HTNV结构蛋白表位研究的报道主要集中在NP和GP。现有的研究表明，HTNV NP上具有CTL表位，GP上具有中和表位和血凝表位。到目前为止，尚未有对HTNV GP上CTL表位研究的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于：通过对HTNV GP上的CTL表位肽进行筛选和鉴定以及研究该表位肽在机体免疫中的应用，从而为研究HTNV新型基因工程疫苗奠定基础。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种HTNV GP上的CTL表位肽，其特征在于，所述CTL表位肽由8个氨基酸构成：异亮氨酸-苏氨酸-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸，序列位置为：GP aa456～463。
一种筛选所述的HTNV GP上的CTL表位肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1：从NCBI数据库获得HTNV 76-118株GP的氨基酸序列，运用生物信息学技术将这些氨基酸序列输入表位预测软件中，预测由 8个氨基酸构成的CTL表位肽，H-2b限制；
Step2：依据预测的多肽序列合成相应的多肽，纯度≥98％，将合成的多肽分别溶解于DMSO中，浓度为5mg/ml，-80C保存备用；
Step3：采用ELISPOT细胞因子测定试剂盒检测每条多肽刺激C57/BL6小鼠脾细胞分泌IFN-γ的水平；
Step4：经检测，序列位置为GP aa456～463的多肽有效地刺激了HTNV感染后的小鼠脾细胞以及CD8+T细胞分泌IFN-γ，该条表位肽即为最终筛选出来的表位肽。
本发明的有益之处在于：
(一)筛选方法
ELISPOT技术是目前检测生物体细胞免疫水平的最佳技术之一，由于它集高灵敏度、高可信度、高通量、单细胞水平、功能性检测与相对低成本等诸多优点于一身，在国内免疫学界获得了高度的认可和广泛的应用，目前已成为主流免疫学检测技术之一。
CTL杀伤实验是通过间接地对乳酸脱氢酶(LDH)释放量进行定量检测，进而评估CD8+T细胞毒性，可以快速、准确的检测到早期、低水平的细胞毒性，是目前细胞免疫功能评估的常用方法。
流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种在功能水平上对单细胞进行定量分析和分选的检测手段，它可以快速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞分析技术之一。
(二)筛选获得的表位肽
该条表位肽可视为能有效刺激机体细胞免疫应答的病毒亚单位，即病毒体功能所需的高度保守区。可由此来设计多肽疫苗，这个策略的目的是接种“由明确抗原组成的最小结构”来激发有效的特异性细胞免疫应答，具备传统疫苗不可比拟的优点，而且使用安全方便，在抗病毒过程中有着广泛的应用前景。
附图说明
图1是HTNV GP上筛选到全部15条多肽刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ水平的ELISPOT检测结果；
图2是HTNV GP上CTL表位肽(GP aa456～463)刺激小鼠脾细胞的CTL杀伤试验检测结果；
图3(a)是HTNV GP上CTL表位肽(GP aa456～463)刺激小鼠脾细胞增殖的FCM检测结果；
图3(b)是HTNV NP上已知的CTL表位肽刺激小鼠脾细胞增殖的FCM检测结果；
图3(c)是阳性对照刺激小鼠脾细胞增殖的FCM检测结果；
图3(d)是阴性对照刺激小鼠脾细胞增殖的FCM检测结果；
图4(a)是HTNV GP上CTL表位肽(GP aa456～463)刺激小鼠脾细胞分化的FCM检测结果；
图4(b)是HTNV NP上已知的CTL表位肽刺激小鼠脾细胞分化的FCM检测结果；
图4(c)是阳性对照刺激小鼠脾细胞分化的FCM检测结果；
图4(d)是阴性对照刺激小鼠脾细胞分化的FCM检测结果。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一、汉滩病毒包膜糖蛋白上的CTL表位肽的筛选方法
Step1：预测
从NCBI数据库获得HTNV 76-118株糖蛋白的氨基酸序列，运用生物信息学技术将这些氨基酸序列输入表位预测软件IMMUNE EPITOPE DATABASE AND ANALYSIS RESOURCE中，预测由8个氨基酸构成的CTL表位肽，H-2b限制。
预测软件共计预测出HTNV GP上15条表位肽，这15条表位肽的氨基酸分别是：
(1)GP aa39～46：SVIGYVEL丝氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-酪氨酸-缬氨酸-谷氨酸-亮氨酸；
(2)GP aa44～51：VELPPVPL缬氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸-缬氨酸-脯氨酸-亮氨酸；
(3)GP aa64～71：SMDNHQSL丝氨酸-甲硫氨酸-天冬氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-丝氨酸-亮氨酸；
(4)GP aa208～215：IVCFFVAV异亮氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸；
(5)GP aa420～427：VNFVCQRV缬氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-缬氨酸；
(6)GP aa456～463：ITSLFSLL异亮氨酸-苏氨酸-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸；
(7)GP aa489～496：VTFCFGWV缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-色氨酸-缬氨酸；
(8)GP aa499～506：PAITFIIL脯氨酸-丙氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-亮氨酸；
(9)GP aa797～804：ITIRYSRR异亮氨酸-苏氨酸-异亮氨酸-精氨酸-酪氨酸-丝氨酸-精氨酸-精氨酸；
(10)GP aa845～852：TLLFFGPL苏氨酸-亮氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸-亮氨酸；
(11)GP aa925～932：QSFNTSTM谷氨酰胺-丝氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺-苏氨酸-丝氨酸-苏氨酸-甲硫氨酸；
(12)GP aa987～994：VGFTLTCL缬氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-苏氨酸-亮氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-亮氨酸；
(13)GP aa1102～1109：FSGNWIVL苯丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-色氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-亮氨酸；
(14)GP aa1113～1120：CVFLLFSL半胱氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸；
(15)GP aa1114～1121：VFLLFSLV缬氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-缬氨酸。
Step2：合成
依据预测的多肽序列合成相应的多肽，纯度≥98％，将合成的多肽分别溶解于DMSO中，浓度为5mg/ml，-80C保存备用。
Step3：检测
采用ELISPOT细胞因子测定试剂盒检测每条多肽体外刺激C57/BL6小鼠脾细胞分泌IFN-γ的水平。
具体操作步骤如下：
(1)用试剂盒中包被液稀释抗IFN-γ抗体，并加入ELISPOT板中，4℃过夜。
(2)弃去包被液，用含2％FBS的RPIM-1640培养液清洗3次后，加入含10％FBS的RPIM-1640培养液室温封闭2h。
(3)弃去板中的封闭液，取各组经HTNV感染的C57BL/6小鼠的脾细胞，按照1×106个/孔分别加入到ELISPOT板中，各实验孔中再加入待检HTNV GP上各CTL表位肽为刺激物，阳性对照孔加入等量的ConA作为刺激物，同时设置阴性对照孔(不添加任何刺激物)及背景对照孔(孔中只含有细胞培养液)，同时将HTNV NP上已知的CTL表位肽作为对照(NP aa221～228：SVIGFLAL丝氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸)。
(4)将ELISPOT板放入37℃CO2细胞培养箱中培养24h。
(5)弃去细胞后，用PBST洗涤3次，加入稀释好的生物素标记的IFN-γ抗体，室温孵育1h。
(6)PBST洗涤3次后加入稀释好的HRP标记的抗生物素抗体，室温孵育1h。
(7)PBST洗涤3次后，加入TMB底物显色液。
(8)观察板底，待斑点形成后，用去离子水清洗ELISPOT板以终止显色反应。
(9)待ELISPOT板干燥后，用ELISPOT检测仪进行检测，计算斑点形成细胞数(Spot-forming cells，SFC)。
(10)利用磁珠分选将经HTNV感染的C57BL/6小鼠的脾细胞中的CD4+T细胞分离，加入各表位肽刺激，利用ELISPOT检测其刺激细胞分泌IFN-γ水平。
所筛选的HTNV GP上全部15条多肽刺激小鼠脾细胞分泌IFN-γ水平的ELISPOT检测结果见图1。
检测结果显示，在这15条表位肽中，有一条(第6条)CTL表位肽可以明显有效地刺激HTNV感染后的小鼠脾细胞以及CD8+T细胞分泌IFN-γ，该条表位肽的序列为：异亮氨酸-苏氨酸-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸(ITSLFSLL)，序列位置为GPaa456～463。
二、HTNV GP上的CTL表位肽的杀伤力的检测
(1)取各组经HTNV感染的C57BL/6小鼠的脾细胞，分别单独加入各HTNV GP CTL表位肽作为刺激物，同时将NP上已知的CTL表位肽作为对照，置37℃CO2细胞培养箱中培养2d，作为CTL杀伤试验的效应细胞。
(2)取HTNV感染EL-4细胞，置37℃ CO2细胞培养箱中培养2d，作为可表达GP的CTL杀伤试验的靶细胞。
(3)对效应细胞和靶细胞分别进行细胞计数，并将效应细胞(2×106/孔、1×106/孔、4×105/孔)与靶细胞(2×104/孔)分别按照100：1、50：1、20：1的E/T加入U型底的96孔细胞培养板中。
另外，分别设置如下对照孔：
(a)效应细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)自发释放孔(只含有效应细胞)；
(b)靶细胞LDH自发释放孔(只含有靶细胞)；
(c)靶细胞最大LDH释放孔(靶细胞+细胞裂解液)；
(d)培养液背景孔(只含培养液)。
(4)将96孔细胞培养板置37℃ CO2培养箱中培养12h，吸取上清并转移至新的96孔板中，每孔加入OPD底物显色液后37℃避光孵育15min，加入2M H2SO4终止显色反应，放入多功能酶标仪测定各孔的A490值，依照以下公式计算脾细胞的杀伤活性：
Figure BDA0001036928980000091
计算结果见图2。
结果显示，随着效靶比(E/T)的提高，HTNV GP上的CTL表位肽(GP aa456～463:ITSLFSLL)刺激效应细胞发挥杀伤作用的能力也随之提高，在效靶比在100：1和50：1时，HTNV GP上的CTL表位肽刺激效应细胞发挥杀伤能力与HTNV NP上的CTL表位肽相当；在效靶比在20：1时，HTNV GP上的CTL表位肽要强于HTNV NP上的CTL表位肽。
三、HTNV GP上的CTL表位肽的应用
本发明通过对HTNV GP上的CTL表位肽进行筛选和杀伤力检测，并将其免疫小鼠后进行生物学活性鉴定，为HTNV新型基因工程疫苗的研究奠定了基础。
1、促进小鼠脾细胞增殖试验
取经HTNV感染的C57BL/6小鼠的脾细胞计数，每个离心管中加入5×106个细胞，并加入终浓度为5μM的CFSE进行标记，室温静置40min后，800rpm离心3min，弃掉上清，加入5ml的PBS缓冲液冲洗2次；加入含有10％FBS的RPIM-1640培养液，并分别加入终浓度为10μg/ml的GP CTL表位肽，将NP上已知的CTL表位肽作为对照，加入终浓度为10μg/ml的ConA作为阳性对照，并设立未刺激组作为阴性对照，置于37℃ CO2细胞培养箱培养8天后收集细胞，800rpm 3min离心，弃掉上清，用500μl PBS将细胞重悬，用FCM检测仪检测骨髓细胞增殖情况。
检测结果见图3(a)、图3(b)、图3(c)和图3(d)。
结果显示，与未刺激组相比，HTNV GP上的CTL表位肽(GP aa456～463:ITSLFSLL)可以有效的刺激经过HTNV感染的C57BL/6小鼠的脾细胞增殖。
2、促进小鼠脾细胞分化试验
取各组经HTNV感染的C57BL/6小鼠的脾细胞计数，每个离心管中加入5×106个细胞，分别加入所筛选的HTNV GP CTL表位肽，终浓度为10μg/ml，将HTNV NP上已知的CTL表位肽作为对照，加入终浓度为10μg/ml的ConA作为阳性对照，并设立未刺激组作为阴性对照，加入含有10％FBS的RPIM-1640培养液，并置于37℃ CO2细胞培养箱培养4天后收集细胞，800rpm 3min离心，弃掉上清，用500μl PBS将细胞重悬，加入稀释好的PE标记的抗CD8抗体和 FITC标记的抗CD4抗体，室温避光2h后，800rpm 3min离心，弃掉上清，再用PBS洗涤3次，加入500μl PBS重悬细胞，用FCM检测仪检测脾细胞分化情况。
分化结果见图4(a)、图4(b)、图4(c)和图4(d)。
结果显示，与未刺激组相比，HTNV GP CTL表位肽(GP aa456～463:ITSLFSLL)可以有效的刺激经过HTNV感染的C57BL/6小鼠的脾细胞向CD8+细胞分化。
经过上述实验研究发现：HTNV GP上的CTL表位肽能有效的刺激机体的细胞免疫应答反应。
近年来，国内外虽已研制出HFRS的灭活疫苗，但从应用情况来看，该类疫苗仍存在诸多不足，其中最重要的一点是刺激机体产生的细胞免疫应答欠佳，以及存在着一定的安全隐患。采用本发明的方法筛选出来的HTNV GP CTL表位肽(GP aa456～463:ITSLFSLL)，若将其应用在刺激机体细胞免疫应答反应中，将具有以下优点：
1、由CTL介导的细胞免疫应答在抗病毒感染中起重要作用。CTL识别病毒感染细胞(靶细胞)后，通过释放穿孔素、颗粒酶和经过FasL-Fas途径，导致靶细胞裂解死亡，进而达到有效清除机体内病毒感染的作用。机体内某种病毒特异性CTL的水平及其活性与该病毒的清除效果呈正相关。
2、以往研究表明，HTNV NP上有CTL表位存在，主要刺激机体产生特异性细胞免疫应答，但因其中和表位极少，刺激机体产生中和抗体能力较弱；而HTNV GP上存在着多个中和表位，可以有效地刺 激机体产生中和抗体，在此基础上，本研究发现GP上也存在着CTL表位，可以有效刺激机体细胞免疫应答，在疫苗研究策略上可以考虑结合上述两方面的优势，对于开发具有中和表位和CTL表位的新型多功能高效肽段疫苗奠定基础，而肽段疫苗作为新型基因工程疫苗的一种，其安全性是传统的灭活疫苗所不能比拟的。
由此可见，本发明对HTNV GP上的CTL表位肽进行筛选和杀伤力检测，并将其免疫小鼠后进行生物学活性鉴定，有助于开发具有中和表位和CTL表位的新型多功能高效肽段疫苗，对研究HTNV新型基因工程疫苗具有重要意义。
需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (2)

1.能够有效刺激脾细胞和CD8+ T细胞分泌IFN-γ的HTNV GP上的CTL表位肽，其特征在于，所述CTL表位肽由8个氨基酸构成：异亮氨酸-苏氨酸-丝氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-丝氨酸-亮氨酸-亮氨酸，序列位置为：GP aa456～463。
2.权利要求1所述的能够有效刺激脾细胞和CD8+ T细胞分泌IFN-γ的HTNV GP上的CTL表位肽在制备抗汉滩病毒的CTL表位肽疫苗中的应用。
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