ES2344150T3 - Procedimientos y reactivos para diagnosticar la infeccion por hantavirus. - Google Patents

Procedimientos y reactivos para diagnosticar la infeccion por hantavirus. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para detectar anticuerpos contra hantavirus en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto dicha muestra biológica con al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus, en el que los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que hay presente al menos un antígeno recombinante de cada uno de los serotipos, siendo la puesta en contacto realizada en condiciones que permiten que los anticuerpos contra los hantavirus, cuando están presentes en la muestra biológica, se unan con al menos uno de dichos antígenos G1 o N para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y (b) detectar la presencia o la ausencia de dicho complejo de anticuerpo/antígeno, detectando así la presencia o la ausencia de anticuerpos contra hantavirus en dicha muestra.

Description

Procedimientos y reactivos para diagnosticar la infección por hantavirus.
Campo técnico
La presente invención se refiere, en general, a los hantavirus. En particular, la invención se refiere a reactivos inmunogénicos derivados de múltiples serotipos de hantavirus, incluyendo la nucleocápside inmunogénica y polipéptidos glicoproteicos, para su uso en composiciones para diagnosticar la infección por hantavirus.
Antecedentes
Los hantavirus (Bunyaviridae: Hantavirus) son virus de ARN de sentido negativo y con envoltura lipídica. El ARN del genoma viral es tripartito, constando de tres fragmentos denominados en general S, M y L que se refieren a los fragmentos pequeño, mediano y grande del genoma, respectivamente. El segmento M codifica una proteína precursora que es procesada para formar las dos glucoproteínas de la envoltura denominadas G1 y G2. El segmento S codifica una proteína de la nucleocápside denominada N que forma la nucleocápside helicoidal filamentosa del virus y produce la respuesta humoral. El segmento L del genoma codifica una ARN polimerasa dependiente del ARN (RDRP). Se han descubierto más de 20 hantavirus distintos en asociación con roedores o insectívoros huéspedes específicos en todo el mundo. Se han publicado sus modos de transmisión a seres humanos, los reservorios naturales y las características clínicas de la infección humana (véase, p. ej., Mertz et al., Adv. Internal Med. (1997) 42:369-421).
El Síndrome Pulmonar por Hantavirus (HPS), también conocido como Síndrome Cardiopulmonar por Hantavirus (HCPS), es una enfermedad febril aguda con una tasa de mortalidad de hasta el 50%. Los pacientes se presentan con síntomas inespecíficos que progresan rápidamente hacia un edema pulmonar fulminante y un colapso cardiovascular. El agente predominante del HPS en Estados Unidos es el Virus Sin Nombre (SNV; también conocido como Virus Four Corners y Virus Muerto Canyon). (Sone et al., Lancet (1994) 344: 1637; Khan et al., J. Med. Virol (1995) 46:281-286; Kahn et al., Am. J. Med. (1996) 100:46-48; Morzunov et al., J Virol (1995) 69:1980-1983; Rollin et al., J. Med. Virol (1995) 46:35-39; Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, Morbid. Mortal. Weekly Rep. (1993) 43:45-48). Se han asociado al menos otros tres hantavirus con el HPS en Estados Unidos, incluyendo el Virus New York (NYV), el Virus Black Creek Canal (BCV) y el Virus Bayou (BAYV).
En todo el mundo, hay un mayor número de enfermedades provocadas por hantavirus euroasiáticos que causan fiebre hemorrágica y el Síndrome Renal (HFRS). Los virus asociados al HFRS incluyen el Virus Hantaan (HTNV), Virus Puumala (PUUV), Virus Seoul (SEOV) y Virus Dobrava-Belgrade (DOBV) (Lee et al., J. Infect. Dis. (1978) 137:298-308; Lee, et al., J. Infect. Dis. (1982) 146:638-644; Lee et al., J. Infect. Dis. (1982) 146:645-651; Brummer- Korvenkontio et al., J. Infect. Dis. (1980) 141:131-134). Las manifestaciones clínicas del HFRS son generalmente más graves para las infecciones por el HTNV y el DOBV, mientras que la infección por PUUV está asociada a una forma más suave del HFRS, nefropatía epidérmica (NE), que se da en Escandinavia, Finlandia, Rusia Occidental y Europa Central. Se han publicado tasas de mortalidad de hasta el 20% por las formas más graves del HFRS.
Entre los hantavirus asociados con el HFRS, el HTNV, el SEOV y el DOBV son antigénicamente similares. Los virus asociados al HPS también están estrechamente relacionados entre sí y reaccionan de forma cruzada con el PUUV. La reactividad cruzada antigénica es más pronunciada entre las proteínas N virales. En los análisis de diagnóstico de antígenos recombinantes, el antígeno N viral es dominante frente a las glucoproteínas virales. Los anticuerpos contra el antígeno N surgen pronto en el transcurso de la infección, y se detectan universalmente en la convalecencia. Todas las personas con una infección aguda por el SNV tienen anticuerpos detectables contra el antígeno N del SNV de la clase IgM mediante la aparición de síntomas clínicos, y casi todos tienen anticuerpos IgG dirigidos contra los antígenos N y G1 (Bharadwaj et al., J. Infect. Dis. (2000) 182:43-48). Los anticuerpos contra G1 del SNV no son reactivos con los antígenos G1 de otros hantavirus (Jenison et al., J. Virol. (1994) 68:3000-3006; Hjelle et al, J. Gen. Virol. (1994) 75:2881-2888).
Los hantavirus se transmiten a los seres humanos por inhalación de aerosoles contaminados por virus de la saliva, la orina y las heces de roedores. Un trabajador puede contraer una infección por hantavirus simplemente entrando en una habitación con roedores infectados, lo que apoya enormemente la opinión imperante de que los hantavirus se transmiten por el aire. Esta observación también está apoyada por una reciente investigación epidemiológica que muestra que las exposiciones en espacios interiores son sumamente comunes. Se ha demostrado la transmisión de persona a persona para el Virus Andes (ANDV) en Argentina, y es probable que sea responsable de dos grupos familiares en Chile. El virus también se puede transmitir por mordiscos de roedores y, posiblemente, a través de la ingestión de alimentos o agua contaminados.
Todas las especies de hantavirus parecen estar fundamentalmente asociadas a un roedor huésped específico. Hay tres grandes grupos de hantavirus y están asociados a las subfamilias de roedores Murinae, Arvicolinae y Sigmondontinae. Las relaciones filogenéticas entre los roedores de estas diversas subfamilias son paralelas, para la mayor parte, a las relaciones filogenéticas y antigénicas de los virus asociados a cada reservorio en particular. Cada uno de estos grupos de hantavirus contiene una o más especies o tipos que son conocidos patógenos humanos. En la Tabla 1, se presenta la información relativa a los diversos hantavirus.
TABLA 1
1
TABLA 1 (continuación)
2
Se han hecho progresos significativos en el tratamiento de la infección por hantavirus, pero un tratamiento satisfactorio requiere que los pacientes sean diagnosticados antes del estadio preagónico inmediato de la enfermedad. Se han hecho avances en la atención terciaria que pueden reducir la mortalidad debida a la infección por hantavirus. Sin embargo, como la infección progresa muy rápido, es probable que estos avances sólo tengan efecto en el pronóstico de aquellos pacientes que puedan ser diagnosticados de la manera oportuna. Un procedimiento para la detección rápida de los anticuerpos apropiados contra hantavirus en el ámbito rural y que pudiera aplicarse en los estadios tempranos de la enfermedad podría mejorar la posibilidad de una intervención temprana.
Se han intentado aplicar varios análisis para el diagnóstico a tiempo de la infección por hantavirus. Por ejemplo, se ha empleado una variedad de formatos para el diagnóstico serológico de la infección por hantavirus, incluyendo el aglutinamiento de perlas, los análisis de inmunofluorescencia e inmunoprecipitación, usando virus cultivados en laboratorio, la inhibición de la hemoaglutinación, análisis de neutralización de la reducción de placas y focos, y formatos de ELISA (Lee et al., J. Infect. Dis. (1978) 137:298-308; Lee et al., J. Infect. Dis. (1982) 146:638-644; Lee et al., J. Infect. Dis. (1982), 146: 645-651; Lundkvist et al., Clin. Diagnos. Lab. Immunol. (1995) 2:82-56; Chu et al., Virology (1994) 198: 196-204; Elgh et al., J. Med. Virol (1995) 45: 146-150).
También se ha usado el análisis de inmunotransferencia en tiras en un intento por realizar el diagnóstico eficaz de la infección por hantavirus (véase, p. ej., Hjelle et al., J. Clin. Microbiol. (1997) 35:600-608; Bharadwaj et al., J. Infect. Dis. (2000) 182:43-48; Yee, et al., J. Wildl. Dis. (2003) 39:271-277). Sin embargo, actualmente no hay disponible un análisis universal para identificar las múltiples cepas de hantavirus.
La disponibilidad generalizada de un análisis preciso, eficaz y rápido para la infección por hantavirus sería enormemente deseable y podría salvar un número considerable de vidas.
Resumen de la invención
La presente invención proporciona un procedimiento simple, preciso y eficaz para diagnosticar la infección por hantavirus, así como para determinar el tipo de hantavirus que está presente. Los procedimientos permiten la rápida detección, p. ej., en menos de una hora, de la infección por hantavirus provocada por varios hantavirus, tales como hantavirus de más de un serotipo de hantavirus. Si se detecta la infección, se puede dar un tratamiento apropiado al individuo en el momento adecuado para evitar su muerte. El procedimiento utiliza los antígenos N y/o G1 y/o los anticuerpos dirigidos contra estos antígenos de al menos seis serotipos diferentes de hantavirus, incluyendo el HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV. Los análisis proporcionan una prueba de diagnóstico rápida y fiable, y son adecuados para su uso en instalaciones con capacidades de laboratorio relativamente poco sofisticadas. Además, los análisis se pueden usar para rastrear roedores salvajes para la infección por hantavirus con el fin de determinar si una determinada población de roedores está infectada con el virus, previniendo así la infección en personal de laboratorio, trabajadores del campo u otras personas que trabajan con o se encuentran con roedores salvajes.
Se pueden usar técnicas recombinantes para generar los productos descritos en la presente memoria con el fin de proporcionar preparaciones proteicas carentes de otras moléculas que normalmente están presentes, tales como otros contaminantes virales y proteínas dañinas.
Por consiguiente, en una realización, la invención se dirige a un procedimiento para detectar anticuerpos contra hantavirus en una muestra biológica. El procedimiento comprende:
(a)
poner en contacto la muestra biológica con al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus, en el que los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que hay presente al menos un antígeno recombinante de cada uno de los serotipos, siendo la puesta en contacto realizada en condiciones que permitan que los anticuerpos contra los hantavirus, cuando estén presentes en la muestra biológica, se unan con al menos uno de los antígenos G1 o N para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y
(b)
detectar la presencia o la ausencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectando así la presencia o la ausencia de los anticuerpos contra hantavirus en la muestra. Los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus pueden ser cualquier combinación de los antígenos G1 y N, siempre y cuando al menos esté presente uno de los antígenos de los al menos seis serotipos de hantavirus, a saber, Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV). En una realización preferida, los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus son todos antígenos N.
\vskip1.000000\baselineskip
En otras realizaciones, la invención se dirige a un equipo de análisis de inmunodiagnóstico para detectar la infección por hantavirus. El equipo de análisis comprende:
(a)
al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus, en el que los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que está presente al menos un antígeno de cada uno de los serotipos;
(b)
e instrucciones para realizar el análisis de inmunodiagnóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización preferida, los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus son todos antígenos N.
En otras realizaciones más, la invención se dirige a un procedimiento para detectar antígenos de hantavirus en una muestra biológica. El procedimiento comprende:
\newpage
(a)
poner en contacto la muestra biológica con al menos seis anticuerpos diferentes, en el que cada uno de los dichos anticuerpos es específico de al menos uno de los seis antígenos de hantavirus, en el que los seis antígenos de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que está presente al menos un anticuerpo específico de al menos un antígeno de cada uno de los serotipos, siendo la puesta en contacto realizada en condiciones que permitan que los antígenos de hantavirus, cuando estén presentes en la muestra biológica, se unan con los anticuerpos para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y
(b)
detectar la presencia o la ausencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectando así la presencia o la ausencia de antígenos de hantavirus en la muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones del procedimiento anterior, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
En otra realización más, la invención se dirige a un equipo de análisis de inmunodiagnóstico para detectar la infección por hantavirus. El equipo de análisis comprende:
(a)
al menos seis anticuerpos diferentes, en el que cada uno de los anticuerpos es específico de al menos uno de los seis antígenos de hantavirus, en el que los seis antígenos de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que está presente al menos un anticuerpo específico de al menos un antígeno de cada uno de los serotipos; y
(b)
instrucciones para realizar el análisis de inmunodiagnóstico.
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En ciertas realizaciones del equipo de análisis de inmunodiagnóstico anterior, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
En otras realizaciones, la invención se dirige a un soporte sólido que comprende al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus, en el que los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de los hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que está presente al menos un antígeno de cada uno de los serotipos. El soporte sólido puede ser una tira de nitrocelulosa.
En ciertas realizaciones, el soporte sólido comprende además al menos un anticuerpo contra una inmunoglobulina humana, siendo dichos uno o más anticuerpos seleccionados del grupo constituido por un anticuerpo contra IgM humana, un anticuerpo contra IgG humana y un anticuerpo contra IgA humana, en el que los antígenos de hantavirus y el anticuerpo contra inmunoglobulina humana están inmovilizados en posiciones diferenciadas sobre el soporte sólido.
En otras realizaciones, el soporte sólido comprende además al menos dos controles internos, en el que uno de los controles define el límite de detección inferior para un resultado positivo en un inmunanálisis en el que se use el soporte sólido y el otro control define un resultado muy positivo en un inmunoanálisis en el que se use el soporte sólido.
En otras realizaciones más, la invención se dirige a un equipo de análisis de inmunodiagnóstico para detectar hantavirus. El equipo de análisis comprende:
(a)
un soporte sólido según lo descrito anteriormente; y
(b)
instrucciones para realizar el análisis de inmunodiagnóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
En más realizaciones, la invención se dirige a un procedimiento para detectar la presencia de anticuerpos contra hantavirus en una muestra biológica. El procedimiento comprende:
(a)
proporcionar una muestra biológica;
(b)
proporcionar un soporte sólido según lo descrito anteriormente;
(c)
poner en contacto la muestra biológica con el soporte sólido, en condiciones que permitan a los anticuerpos contra hantavirus, si están presentes en la muestra biológica, unirse con al menos uno de los antígenos de hantavirus para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y
(d)
detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectando así la presencia de los anticuerpos contra hantavirus en la muestra biológica.
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En ciertas realizaciones, el procedimiento anterior comprende además:
(e)
eliminar los anticuerpos contra hantavirus sin unir;
(f)
proporcionar uno o más restos capaces de asociarse con el complejo de anticuerpo/antígeno; y
(g)
detectar la presencia del uno o más restos, detectando así la presencia de los anticuerpos contra hantavirus en la muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
En ciertas realizaciones, el uno o más restos comprenden un antígeno de hantavirus marcado detectablemente. En estas y en otras realizaciones, el marcador detectable puede ser una enzima.
En una realización más, la invención se dirige a un procedimiento para preparar un flujo sanguíneo que comprende sangre entera, plaquetas, plasma o suero, sustancialmente libre de hantavirus. El procedimiento comprende:
(a)
rastrear alícuotas de sangre entera, plaquetas, plasma o suero de las muestras sanguíneas recogidas mediante el procedimiento de uno cualquiera de los procedimientos descritos anteriormente;
(b)
eliminar cualquier muestra en la que se detecte un antígeno de un hantavirus o un anticuerpo contra un hantavirus; y
(c)
combinar las muestras en las que no se detecte un antígeno de hantavirus ni un anticuerpo contra un hantavirus para proporcionar un flujo sanguíneo sustancialmente libre de hantavirus.
\vskip1.000000\baselineskip
En cualquiera de los procedimientos anteriores, la muestra biológica puede proceder de una muestra sanguínea humana. Además, en cualquiera de las realizaciones anteriores, el o los antígenos G1 pueden comprender una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40. El o los antígenos G1 pueden ser uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 14, SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 22, SEC ID N.º 24, SEC ID N.º 42, SEC ID N.º 43, SEC ID N.º 44, SEC ID N.º 45, SEC ID N.º 46 y SEC ID N.º 47.
Además, el o los antígenos N pueden comprender una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 39. En otras realizaciones, el o los antígenos N pueden ser uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 26, SEC ID N.º 28, SEC ID N.º 30, SEC ID N.º 32, SEC ID N.º 34, SEC ID N.º 36, SEC ID N.º 48, SEC ID N.º 49, SEC ID N.º 50, SEC ID N.º 51, SEC ID N.º 52 y SEC ID N.º 53.
El o los antígenos G1 pueden comprender una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40 y el o los antígenos N comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 39. En otras realizaciones, el o los antígenos G1 son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 14, SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 22, SEC ID N.º 24, SEC ID N.º 42, SEC ID N.º 43, SEC ID N.º 44, SEC ID N.º 45, SEC ID N.º 46 y SEC ID N.º 47, y el o los antígenos N son uno o más antígenos que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 26, SEC ID N.º 28, SEC ID N.º 30, SEC ID N.º 32, SEC ID N.º 34 y SEC ID N.º 36.
En otras realizaciones, está presente al menos un antígeno G1 de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV, y está presente al menos un antígeno N de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV.
En más realizaciones, está presente al menos un antígeno N de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV.
Estas y otras realizaciones de la presente invención se harán fácilmente evidentes para los expertos en la técnica a la vista de la revelación de la presente memoria.
Breve descripción de las figuras
Las Figuras 1A y 1B (SEC ID N.º 1 y 2) muestran una secuencia de nucleótidos representativa para el segmento M de longitud completa del aislado 76-118 del HTNV, que codifica las proteínas de la envoltura G1 y G2 (Figura 1A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína G1 (Figura 1B).
Las Figuras 2A y 2B (SEC ID N.º 3 y 4) muestran una secuencia de nucleótidos representativa para el segmento M de longitud completa del aislado CG1820 del PUUV, que codifica las proteínas de la envoltura G1 y G2 (Figura 2A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína G1 (Figura 2B).
Las Figuras 3A y 3B (SEC ID N.º 5 y 6) muestran una secuencia de nucleótidos representativa para el segmento M de longitud completa del aislado 80-39 del SEOV, que codifica las proteínas de la envoltura G1 y G2 (Figura 3A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína G1 (Figura 3B).
Las Figuras 4A y 4B (SEC ID N.º 7 y 8) muestran una secuencia de nucleótidos representativa para el segmento M de longitud completa del DOBV, que codifica las proteínas de la envoltura G1 y G2 (Figura 4A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína G1 (Figura 4B).
Las Figuras 5A y 5B (SEC ID N.º 9 y 10) muestran una secuencia de nucleótidos representativa para el segmento M de longitud completa del aislado NM H10 del SNV, que codifica las proteínas de la envoltura G1 y G2 (Figura 5A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína G1 (Figura 5B).
Las Figuras 6A y 6B (SEC ID N.º 11 y 12) muestran una secuencia de nucleótidos representativa para el segmento M de longitud completa del aislado Chile-9717869 del ANDV, que codifica las proteínas de la envoltura G1 y G2 (Figura 6A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos para la proteína G1 (Figura 6B).
Las Figuras 7A y 7B (SEC ID N.º 13 y 14) muestran la secuencia de nucleótidos (Figura 7A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 7B) del péptido G1 del HTNV representativo para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 8A y 8B (SEC ID N.º 15 y 16) muestran la secuencia de nucleótidos (Figura 8A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 8B) del péptido G1 del PUUV representativo para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 9A y 9B (SEC ID N.º 17 y 18) muestran la secuencia de nucleótidos (Figura 9A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 9B) del péptido G1 del SEOV representativo para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 10A y 10B (SEC ID N.º 19 y 20) muestran la secuencia de nucleótidos (Figura 10A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 10B) del péptido G1 del DOBV representativo para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 11A y 11B (SEC ID N.º 21 y 22) muestran la secuencia de nucleótidos (Figura 11A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 11B) del péptido G1 del SNV representativo para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 12A y 12B (SEC ID N.º 23 y 24) muestran la secuencia de nucleótidos (Figura 12A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 12B) del péptido G1 del ANDV representativo para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 13A y 13B (SEC ID N.º 25 y 26) muestran la secuencia de nucleótidos representativa (Figura 13A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 13B) de una proteína N del HTNV de longitud completa del aislado 76-118 para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 14A y 14B (SEC ID N.º 27 y 28) muestran una secuencia de nucleótidos representativa (Figura 14A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 14B) de una proteína N del PUUV de longitud completa del aislado CG1820 para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 15A y 15B (SEC ID N.º 29 y 30) muestran una secuencia de nucleótidos representativa (Figura 15A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 15B) de una proteína N del SEOV de longitud completa del aislado 80-39 para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 16A y 16B (SEC ID N.º 31 y 32) muestran la secuencia de nucleótidos representativa (Figura 16A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 16B) de una proteína N del DOBV de longitud completa para su uso en los presentes análisis. Las Figuras 17A y 17B (SEC ID N.º 33 y 34) muestran una secuencia de nucleótidos representativa (Figura 17A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 17B) de una proteína N del SNV de longitud completa del aislado NM H10 para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 18A y 18B (SEC ID N.º 35 y 36) muestran la secuencia de nucleótidos representativa (Figura 18A) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (Figura 18B) de una proteína N del ANDV de longitud completa del aislado Chile-9717869 para su uso en los presentes análisis.
Las Figuras 19A y 19B (SEC ID N.º 37 y 38) muestran una secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de la SOD humana representativa, respectivamente, usadas en las fusiones de la SOD con los antígenos G1 y N descritos en los ejemplos. La secuencia de la SOD fusionada incluye los aminoácidos 1-158 de la Figura 19B (nucleótidos 1-489 de la Figura 19A), que incluye cinco aminoácidos de una secuencia no SOD en el terminal C (TRQNK, SEC ID N.º 41) para proporcionar un sitio de restricción para la clonación.
La Figura 20 (SEC ID N.º 42) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión G1 de SOD/HTNV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 21 (SEC ID N.º 43) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión G1 de SOD/PUUV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 22 (SEC ID N.º 44) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión G1 de SOD/SEOV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 23 (SEC ID N.º 45) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión G1 de SOD/DOBV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 24 (SEC ID N.º 46) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión G1 de SOD/SNV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 25 (SEC ID N.º 47) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión G1 de SOD/ANDV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 26 (SEC ID N.º 48) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión N de SOD/HTNV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 27 (SEC ID N.º 49) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión N de SOD/PUUV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 28 (SEC ID N.º 50) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión N de SOD/SEOV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 29 (SEC ID N.º 51) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión N de SOD/DOBV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 30 (SEC ID N.º 52) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión N de SOD/SNV representativa para su uso en los presentes análisis.
La Figura 31 (SEC ID N.º 53) muestra la secuencia de aminoácidos de una fusión N de SOD/ANDV representativa para su uso en los presentes análisis.
Descripción detallada de la invención
La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de Virología, Química, Bioquímica, técnicas de ADN recombinante e Inmunología pertenecientes al alcance de la técnica. Tales técnicas se explican de manera completa en la bibliografía. Véase, p. ej., "Fundamental Virology", III Edición, vol. I y II (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds.); "Handbook of Experimental Immunology", VoI. I-IV (D.M. Weir y CC. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); T. E. Creighton, "Proteins: Structures and Molecular Properties" (W. H. Freeman y Compañía, 1993); A. L. Lehninger, "Biochemistry" (Worth Publishers, Inc., edición actual); Sambrook, et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (II Edición, 1989); "Methods In Enzymology" (S. Colowick y N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).
En el texto, se usan las siguientes abreviaturas de los aminoácidos:
3
I. Definiciones
En la descripción de la presente invención, se emplearán los siguientes términos, y se pretende que sean definidos como se indica a continuación.
Debe señalarse que, como se usan en la presente memoria y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno", "una", "el" y "la" incluyen los referentes en plural, a no ser que el contenido dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polipéptido G1" incluye una mezcla de dos o más de tales polipéptidos, y similares.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácido, y no se limitan a una longitud mínima del producto. De este modo, los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros y similares están incluidos en la definición. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas están englobados por la definición. Los términos también incluyen modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, la glicosilación, acetilación y fosforilación, y similares. Además, a efectos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (en general, conservadoras en la naturaleza) en la secuencia nativa, siempre y cuando la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis de un sitio específico, o accidentales, tal como a través de mutaciones de los huéspedes que producen las proteínas o los errores debidos a la amplificación por PCR.
El término "antígeno", cuando se usa con referencia a los diversos polipéptidos de hantavirus para su uso con la presente invención, se refiere a un polipéptido N, G1, etc., bien nativo, recombinante o sintético, que incluye uno o más epítopos que reconocen anticuerpos contra hantavirus y que derivan de cualquiera de los diversos aislados de la cepa de hantavirus en cuestión. Por consiguiente, "un antígeno de hantavirus" es un antígeno derivado de cualquiera de los serotipos, cepas y aislados de hantavirus, incluyendo, sin limitación, cualquiera de los diversos aislados de las subfamilias Murinae, Sigmodontinae y Arvicolinae. Por ejemplo, un antígeno del SNV será derivado de cualquiera de los diversos aislados del Virus Sin Nombre, tales como el aislado del SNV prototipo New Mexico, 3H226, aislados de California, aislados de British Columbia, etc. De manera similar, un antígeno del SEOV será derivado de cualquiera de los diversos aislados del Virus Seoul, etcétera. Se pueden derivar más antígenos para su uso en la presente invención de otros hantavirus asociados al HPS y al HFRS, incluyendo, pero no limitándose a, el Virus Sin Nombre (SNV; también conocido como Virus Four Corners y Virus Muerto Canyon); Virus Andes (ANDV); Virus New York (NYV); Virus Black Creek Canal (BCV); Virus Bayou (BAYV); Virus Hantaan (HTNV); Virus Puumala (PUUV); Virus Seoul (SEOV) y Virus Dobrava-Belgrade (DOBV). Se conocen las secuencias genómicas para estos virus y más adelante se explican detalladamente varias secuencias antigénicas para su uso con la presente invención.
El antígeno en cuestión necesita no incluir la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la molécula de referencia, pero puede incluir sólo tanto de la molécula cuanto sea necesario para que el polipéptido reaccione con los anticuerpos contra hantavirus apropiados. De este modo, sólo es necesario que estén presentes uno o unos cuantos epítopos de la molécula de referencia. Además, el antígeno puede comprender una proteína de fusión entre la molécula de referencia de longitud completa o un fragmento de la molécula de referencia y otra proteína, tal como otro antígeno de hantavirus y/o una proteína que no afecte a la reactividad del antígeno de hantavirus. Resulta evidente que el antígeno puede comprender, por lo tanto, la secuencia de longitud completa, fragmentos, secuencias truncadas y parciales, así como análogos, muteínas y formas precursoras de la molécula de referencia. El término también pretende incluir eliminaciones, adiciones y sustituciones de la secuencia de referencia, siempre y cuando el antígeno conserve la capacidad de reaccionar con los anticuerpos contra los hantavirus.
A este respecto, se producirá una variación natural del aislado para aislarse dentro de una determinada cepa de hantavirus. De este modo, el término pretende englobar tal variación y, en particular, a un antígeno que varíe en la composición de sus aminoácidos en no más de aproximadamente el 20 por ciento del número, más preferiblemente, en no más de aproximadamente el 10 al 15 por ciento del número y, lo más preferible, en no más de aproximadamente el 5 por ciento del número con respecto al antígeno de referencia. Por lo tanto, las proteínas que tienen sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la molécula de referencia, pero que poseen sustituciones de aminoácidos menores que no afectan sustancialmente a las capacidades de unión del antígeno con el anticuerpo, pertenecen a la definición de polipéptido de referencia.
Un antígeno "derivado de" un serotipo, una cepa o un aislado de hantavirus pretende significar un antígeno que comprende una secuencia de un antígeno codificado por el genoma del hantavirus de referencia. Comúnmente, el antígeno incluye uno o más epítopos, y generalmente tendrá una secuencia de aminoácidos sustancialmente homóloga a la del polipéptido de referencia, según lo definido más adelante. De este modo, la expresión "derivado/a de" se usa para identificar la fuente original de una molécula, pero no pretende limitar el procedimiento mediante el que se crea la molécula, que puede ser, por ejemplo, mediante síntesis química o procedimientos recombinantes.
Los términos "análogo" y "muteína" se refieren a derivados biológicamente activos de la molécula de referencia que conservan la actividad deseada, tal como la inmunorreactividad en los análisis descritos en la presente memoria. En general, el término "análogo" se refiere a compuestos que tienen una secuencia y una estructura del polipéptido nativo con una o más adiciones, sustituciones (en general, conservadoras en la naturaleza) y/o eliminaciones de aminoácidos en relación con la molécula nativa, siempre y cuando las modificaciones no destruyan la actividad inmunogénica y que sean "sustancialmente homólogas" a la molécula de referencia según lo definido más adelante. Se conoce una serie de regiones conservadas y variables entre los diversos aislados y, en general, las secuencias de los aminoácidos de los epítopos derivados de estas regiones tendrán un alto grado de homología secuencial, p. ej., una homología de la secuencia de aminoácidos de más del 50%, en general, de más del 60%-70%, al alinear las dos secuencias. El término "muteína" se refiere a los péptidos que tienen uno o más mímicos peptídicos ("peptoides"). Preferiblemente, el análogo o la muteína tienen al menos la misma inmunorreactividad que la molécula nativa. Los procedimientos para crear análogos y muteínas de polipéptidos son conocidos en la técnica y se describen más detalladamente a continuación.
Los términos "análogo" y "muteína" también engloban mutaciones hechas con un objetivo en la molécula de referencia. Los análogos particularmente preferidos incluyen sustituciones que son conservadoras en la naturaleza, i. e., aquellas sustituciones que tienen lugar en una familia de aminoácidos que están relacionados con sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos: aspartato y glutamato; (2) básicos: lisina, arginina, histidina; (3) no polares: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y (4) polares sin cargar: glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican a veces como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que una sustitución aislada de leucina por isoleucina o valina, un aspartato por un glutamato, una treonina por una serina, o una sustitución conservadora similar de un aminoácido por un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto muy importante en la actividad biológica. Por ejemplo, el antígeno de interés puede incluir hasta aproximadamente 5-10 sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o incluso hasta aproximadamente 15-25, 50 ó 75 sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o cualquier número entero entre 5-75, siempre y cuando la función deseada de la molécula permanezca intacta. Cualquier experto en la técnica puede determinar fácilmente las regiones de la molécula de interés que pueden tolerar el cambio tomando como referencia las gráficas de Hopp/Woods y Kyte-Doolittle, ampliamente conocidas en la técnica.
"Fragmento" pretende significar un antígeno que sólo consta de una parte de la secuencia y la estructura del polipéptido intacto de longitud completa. El fragmento puede incluir una eliminación C-terminal, una eliminación N-terminal y/o una eliminación interna del polipéptido nativo. Los fragmentos de G1 representativos para su uso en los presentes análisis se muestran en las Figuras 7-12 de la presente memoria. "Fragmento inmunogénico" pretende significar un fragmento de un polipéptido de hantavirus que incluye uno o más epítopos y que, por tanto, provoca una o más de las respuestas inmunológicas descritas en la presente memoria. Un "fragmento inmunogénico" de una determinada proteína de hantavirus incluirá generalmente al menos aproximadamente 5-10 residuos de aminoácido contiguos de la molécula de longitud completa, preferiblemente, al menos aproximadamente 15-25 residuos de aminoácido contiguos de la molécula de longitud completa, y lo más preferible, al menos aproximadamente 20-50 o más residuos de aminoácido contiguos de la molécula de longitud completa, que definen un epítopo, o cualquier número entero entre 5 aminoácidos y la secuencia de longitud completa, con la condición de que el fragmento en cuestión conserve la capacidad de provocar una respuesta inmunológica según lo definido en la presente memoria.
"Antígeno N" pretende significar un antígeno, según lo definido anteriormente, que es derivado de la proteína de la nucleocápside del hantavirus en cuestión. Se conocen el ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes de las diversas proteínas N de los hantavirus. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos y la correspondiente secuencia de aminoácidos de los antígenos N representativos del HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV se muestran en las Figuras 13-18, respectivamente. Además, se han depositado en el GenBank los segmentos S que codifican las proteínas N de un gran número de aislados, y se describen más detalladamente a continuación. En la publicación internacional n.º WO 95/00648, publicada el 5 de enero de 1995, se describen más secuencias. Hjelle, et al., J. Virol (1994) 68:592-596 describe las secuencias de aminoácidos de los antígenos N derivados del SNV, del Virus Prospect Hill (PHV) y del PUUV.
Como se explica anteriormente, los antígenos N que se usan en los presentes análisis incluyen las proteínas de longitud completa o de longitud sustancialmente completa, así como los fragmentos, las fusiones o los mutantes de las proteínas, que incluyen uno o más epítopos de modo que se conserva la reactividad con los anticuerpos presentes en una muestra biológica de un individuo con la infección por un hantavirus particular en cuestión. Por ejemplo, los antígenos N para su uso en los análisis descritos en la presente memoria pueden ser una fusión recombinante entre la secuencia N del SNV de longitud completa con otra proteína, tal como otro antígeno de hantavirus, y/o una fusión con una proteína que ayuda en la expresión recombinante, tal como con una proteína de unión a la maltosa de E. coli de 50 kDa o una proteína superóxido dismutasa (SOD) humana o de levadura. Un fragmento inmunorreactivo representativo de la proteína N útil en los presentes análisis es un segmento próximo al terminal amino de 43 aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos encontrada en las posiciones 17-59 del polipéptido N, numerado en relación con NM 10 del SNV y que tiene la secuencia de aminoácidos QLVTARQKLKDAERAVELDPDDVNKS
TLQSRRAAVSALETKLG (SEC ID N.º 39). Este fragmento incluye un epítopo inmunodominante de la proteína N y los anticuerpos dirigidos contra este epítopo reaccionan de forma cruzada con las proteínas N del PUUV, SEOV y HTNV (véase, p. ej., Yamada et al., J. Virol. (1995) 69:1939-1943; y la publicación internacional n.º WO 95/06250, publicada el 2 de marzo de 1995). De este modo, este fragmento, así como los fragmentos mayores que incluyen esta secuencia, serán de utilidad en los análisis de la presente memoria. Para las descripciones de los epítopos de la proteína N, véase también Lundkvist et al., Clin. Diag. Lab. Immunol. (1995) 2:82-86; y Gott et al., Virus Res. (1991) 19:1-16.
"Antígeno G1" pretende significar un antígeno, según lo definido anteriormente, que es derivado de la glucoproteína de la envoltura conocida como G1 del hantavirus en cuestión. Se conocen el ADN y las secuencias de aminoácidos correspondientes de las diversas proteínas G1 de hantavirus. En las Figuras 1-6 de la presente memoria, se muestran las regiones de G1 representativas. Además, se han depositado en el GenBank los segmentos M que codifican las proteínas G1 de una serie de aislados, y se describen más detalladamente a continuación. Como se explica anteriormente, los antígenos G1 para su uso en los presentes análisis incluyen las proteínas de longitud completa o de longitud sustancialmente completa, así como los fragmentos, las fusiones o los mutantes de las proteínas, que incluyen uno o más epítopos de modo que se conserva la reactividad con los anticuerpos presentes en una muestra biológica de un individuo con la infección por hantavirus concreta en cuestión. Los antígenos G1 usados en los análisis descritos en la presente memoria incluyen fusiones entre el antígeno G1 en cuestión y una secuencia de la superóxido dismutasa (SOD) humana mostrada en la Figura 19 para facilitar la expresión recombinante del antígeno. En las Figuras 7-12 de la presente memoria, se muestra una serie de más fragmentos inmunorreactivos representativos de la proteína G1 de un número de serotipos de hantavirus. Otro fragmento inmunorreactivo representativo de la proteína G1 es un péptido de 31 aminoácidos mapeado hasta un segmento entre los aminoácidos 59 y 89, numerado en relación con NM H10 del SNV y que tiene la secuencia de aminoácidos LKIESSCNFDLHVPATTTQKYNQVDWTKKSS (SEC ID N.º 40). Esta parte de la proteína G1 constituye un epítopo lineal inmunorreactivo reconocido por los anticuerpos contra el SNV de diversos aislados del SNV (Jenison et al., J. Virol. (1994) 68:3000-3006). Este fragmento, así como los fragmentos mayores que incluyen esta secuencia, serán de utilidad en los análisis de la presente memoria.
Secuencia "inmunogénica" de un antígeno de hantavirus pretende significar una molécula que incluye una secuencia de aminoácidos con al menos un epítopo de hantavirus, de modo que la molécula es capaz de reaccionar con anticuerpos dirigidos contra el hantavirus en cuestión, así como de estimular la producción de los anticuerpos en un huésped apropiado. "Epítopo" pretende significar un sitio sobre un antígeno al que responden células B y/o células T específicas, volviendo al epítopo de hantavirus en cuestión capaz de reaccionar con los anticuerpos contra hantavirus presentes en una muestra biológica, así como de estimular la producción de anticuerpos. El término también se usa indistintamente con "determinante antigénico" o "sitio determinante antigénico". Un epítopo puede comprender 3 o más aminoácidos en una configuración espacial única del epítopo. Generalmente, un epítopo consta de al menos 5 de tales aminoácidos y, más habitualmente, consta de al menos 8-10 de tales aminoácidos o más.
Las regiones de un polipéptido dado que incluyen un epítopo se pueden identificar usando cualquier número de técnicas de mapeado de epítopos conocidas en la técnica. Véase, p. ej., "Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology", Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, se pueden determinar epítopos lineales, p. ej., sintetizando simultáneamente grandes números de péptidos sobre soportes sólidos, péptidos que corresponden a partes de la molécula de proteína, y haciendo reaccionar los péptidos con anticuerpos mientras que los péptidos todavía están unidos a los soportes. Tales técnicas son conocidas y se describen en, p. ej., la patente estadounidense n.º 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 81:3998-4002; Geysen et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82:178-182; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De manera similar, los epítopos configuracionales se identifican fácilmente determinando la configuración espacial de los aminoácidos, tal como, p. ej., mediante cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional. Véase, p. ej.: "Epitope Mapping Protocols", supra. También se pueden identificar las regiones antigénicas de las proteínas usando gráficas de antigenicidad e hidropatía estándar, tales como las calculadas usando, p.ej., el programa informático Omiga versión 1.0 disponible en Oxford Molecular Group. Este programa informático emplea el procedimiento de Hopp/Woods, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci EE.UU. (1981) 78:3824-3828 para determinar perfiles de antigenicidad, y la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. MoI. Biol. (1982) 157:105-132 para las gráficas de hidropatía.
Una "composición inmunogénica" es una composición que comprende al menos un polipéptido inmunogénico (p.ej., un antígeno de hantavirus N y/o G1).
"Sustancialmente purificado/a" generalmente se refiere al aislamiento de una sustancia (compuesto, polinucleótido, proteína, polipéptido, composición de polipéptido) de modo que la sustancia comprenda el porcentaje de la mayoría de la muestra en la que reside. Comúnmente, en una muestra, un componente sustancialmente purificado comprende el 50%, preferiblemente, el 80%-85%, más preferiblemente, el 90-95% de la muestra. Las técnicas para purificar los polinucleótidos y los polipéptidos de interés son ampliamente conocidas e incluyen, por ejemplo, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de afinidad y la sedimentación según la densidad.
"Aislado/a" pretende significar, cuando se refiere a un polipéptido, que la molécula indicada está separada y diferenciada del organismo entero con el que se encuentra la molécula en la naturaleza o está presente en una ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. El término "aislado/a" con respecto a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico privada, en su totalidad o en parte, de las secuencias que están normalmente asociadas con ella en la naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con la misma; o una molécula disociada del cromosoma.
"Determinante antigénico equivalente" pretende significar un determinante antigénico de diferentes aislados o cepas de un hantavirus, determinantes antigénicos que no son necesariamente idénticos debido a la variación de las secuencias, pero que tienen lugar en posiciones equivalentes de la secuencia de hantavirus en cuestión. En general, las secuencias de aminoácidos de los determinantes antigénicos equivalentes tendrán un alto grado de homología secuencial, p. ej., una homología de las secuencias de aminoácidos de más del 30%, habitualmente, de más del 40%, tal como de más del 60%, e incluso una homología de más del 80-90%, cuando las dos secuencias están alineadas.
"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre dos restos de polinucleótidos o dos restos de polipéptidos. Dos secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias presentan al menos aproximadamente el 50%, preferiblemente, al menos aproximadamente el 75%, más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80%-85%, preferiblemente, al menos aproximadamente el 90%, y lo más preferible, al menos aproximadamente el 95%-98% de identidad secuencial a lo largo de una longitud definida de las moléculas. Como se usa en la presente memoria, sustancialmente homólogas también se refiere a secuencias que muestran una identidad total con la secuencia especificada.
En general, "identidad" se refiere a una correspondencia exacta de nucleótido a nucleótido o de aminoácido a aminoácido de dos polinucleótidos o dos secuencias de polipéptido, respectivamente. El porcentaje de identidad se puede determinar mediante una comparación directa de la información secuencial entre dos moléculas (la secuencia de referencia y una secuencia con un % de identidad desconocido con la secuencia de referencia) alineando las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo la longitud de la secuencia de referencia y multiplicando el resultado entre 100. Se pueden usar programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, tal como ALIGN, Dayhoff, M.O., en "Atlas of Protein Sequence and Structure" M.O. Dayhoff ed., 5 Supl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Advances in Appl. Math. 2:482-489, 1981, para el análisis de péptidos. Hay programas para determinar la identidad de las secuencias de nucleótidos disponibles en el paquete de análisis de secuencias de Wisconsin, Versión 8 (disponible en Genetics Computer Group, Madison, WI); por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas se utilizan fácilmente con los parámetros por defecto recomendados por el fabricante y descritos en el paquete de análisis de secuencias de Wisconsin al que se hace referencia anteriormente. Por ejemplo, es posible determinar el porcentaje de identidad de una determinada secuencia de nucleótidos con una secuencia de referencia usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación por defecto y una penalización por huecos de seis posiciones de nucleótidos.
Otro procedimiento para establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención consiste en usar el paquete de programas MPSRCH cuyos derechos están registrados por la Universidad de Edimburgo, desarrollado por F. Collins y Shan S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Con este conjunto de paquetes, se puede emplear el algoritmo de Smith-Waterman, en el que se usan los parámetros por defecto para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización por apertura de hueco de 12, penalización por extensión de hueco de uno y un hueco de seis). De los datos generados, el valor de "coincidencia" refleja la "identidad secuencial". Hay otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o de similitud entre secuencias que se conocen en general en la técnica. Por ejemplo, otro programa de alineamiento es el BLAST, usado con los parámetros por defecto. Por ejemplo, se pueden usar el BLASTN y el BLASTP usando los siguientes parámetros por defecto: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenado por = HIGH SCORE; Bases de datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS translations + Swiss protein + Spupdate + PIR. Los datos de estos programas se pueden obtener fácilmente.
Alternativamente, se puede determinar la homología mediante la hibridación de polinucleótidos en condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguida por la digestión con nucleasa(s) específica(s) de moléculas monocatenarias y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas se pueden identificar en un experimento de hibridación Southern, por ejemplo, en condiciones restrictivas según lo definido para un determinado sistema. La definición de las condiciones de hibridación apropiadas pertenece al alcance de la técnica. Véase, p. ej.: Sambrook et al., supra; "DNA Cloning", supra; "Nucleic Acid Hybridization", supra.
"Recombinante", como se usa en la presente memoria para describir una molécula de ácido nucleico, significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc, viral, semisintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación no está asociado con todo o con una parte del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza. El término "recombinante", como se usa con respecto a una proteína o un polipéptido, significa un polipéptido producido mediante la expresión de un polinucleótido recombinante. En general, se clona el gen de interés y luego se expresa en organismos transformados, según lo descrito más detalladamente a continuación. El organismo huésped expresa el gen foráneo para producir la proteína en condiciones de expresión.
Un "anticuerpo" pretende significar una molécula que se une específicamente con un epítopo de interés presente en un antígeno. "Que se une específicamente" pretende significar que el anticuerpo reconoce e interactúa con el epítopo en un tipo de interacción de "cerradura y llave" para formar un complejo entre el antígeno y el anticuerpo, a diferencia de la unión inespecífica que podría darse entre el anticuerpo y, por ejemplo, el sustrato de prueba con el que reacciona el anticuerpo. De este modo, un anticuerpo G1 contra un hantavirus es una molécula que se une específicamente con un epítopo de una proteína G1 del hantavirus. El término "anticuerpo", como se usa en la presente memoria, incluye los anticuerpos obtenidos a partir de preparaciones tanto policlonales como monoclonales, así como los siguientes: moléculas de anticuerpo (quiméricas) híbridas (véase, por ejemplo, Winter et al., Nature (1991) 349:293-299; y la patente estadounidense n.º 4.816.567); fragmentos F(ab')_{2} y F(ab); moléculas Fv (heterodímeros no covalentes, véase, por ejemplo, Inbar et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU. (1972) 69:2659-2662; y Ehrlich et al., Biochem (1980) 19:4091-4096); moléculas Fv monocatenarias (sFv) (véase, por ejemplo, Huston et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU. (1988) 85:5879-5883); constructos de fragmentos de anticuerpos diméricos y triméricos; minicuerpos (véase, p. ej., Pack et al., Biochem (1992) 31:1579-1584; Cumber et al., J Immunology (1992) 149B: 120-126); moléculas de anticuerpos humanizados (véase, por ejemplo, Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyan et al., Science (1988) 239:1534-1536; y la publicación de patente británica n.º GB 2.276.169, publicada el 21 de septiembre de 1994); y cualquier fragmento funcional obtenido de tales moléculas, en las que tales fragmentos conservan las propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo precursora.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a una composición de anticuerpos que tiene una población de anticuerpos homogénea. La expresión no se limita a referirse a la especie o el origen del anticuerpo, ni pretende estar restringida a la manera la que se crea. La expresión engloba inmunoglobulinas enteras, así como fragmentos tales como Fab, F(ab')_{2}, Fv y otros fragmentos, así como poblaciones de anticuerpos humanizados o quiméricos homogéneas que presentan propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo monoclonal precursora.
Como se usa en la presente memoria, un "soporte sólido" se refiere a una superficie sólida a la que una macromolécula, p. ej., una proteína, un polipéptido, un péptido, un polinucleótido puede unirse, tal como una perla magnética, una perla de látex, un pocillo de una placa de microvaloración, una placa de vidrio, nailon, agarosa, poliacrilamida, partícula de sílice, membrana de nitrocelulosa y similares.
"Inmunológicamente reactivo" significa que el antígeno en cuestión reaccionará específicamente con los anticuerpos contra el hantavirus presentes en una muestra biológica de un individuo infectado por el hantavirus.
"Complejo inmune" pretende significar la combinación formada cuando un anticuerpo se une con un epítopo en un antígeno.
Como se usa en la presente memoria, una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o de fluido aislada de un sujeto, tal como, pero sin limitarse a, sangre, plasma, suero, materia fecal, orina, médula ósea, bilis, fluido espinal, fluido linfático, fluido cerebroespinal, muestras de la piel, secreciones de la piel, tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, órganos, biopsias y también muestras de constituyentes de cultivos celulares in vitro incluyendo, pero no limitándose a, medios acondicionados que resultan del crecimiento de células y tejidos en el medio de cultivo, p. ej., células recombinantes y componentes celulares. Las muestras anteriormente detalladas no necesitan estar en su forma originaria. Por ejemplo, se puede tratar la muestra antes de su uso, tal como, por ejemplo, calentando, centrifugando, etc., antes del análisis.
Como se usan en la presente memoria, las expresiones "marcador" y "marcador detectable" se refieren a una molécula capaz de detectar, incluyendo, pero no limitándose a, isótopos radiactivos, fluorescentes, nanocristales semiconductores, quimioluminiscentes, cromóforos, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, colorantes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (p. ej., biotina, estrepavidina o haptenos), y similares. El término "fluorescente" se refiere a una sustancia o a una parte de la misma que es capaz de presentar fluorescencia en el intervalo detectable. Los ejemplos concretos de marcadores que se pueden usar en la invención incluyen, pero no se limitan a, peroxidasa de rábano picante (HRP), fluoresceína, ITCF, rodamina, dansil, umbeliferona, éster de dimetil-acridinio (DMAE), rojo Texas, luminol, NADPH y \alpha-\beta-galactosidasa.
II. Modos de llevar a cabo la invención
Antes de describir la presente invención detalladamente, se entenderá que esta invención no está limitada a formulaciones ni a parámetros de procedimiento concretos, y como tales, por supuesto, pueden variar. También se entenderá que la terminología usada en la presente memoria es sólo a efectos de describir realizaciones particulares de la invención, y no pretende ser restrictiva.
Aunque es posible usar una serie de procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria en la práctica de la presente invención, en la presente memoria, se describen los materiales y los procedimientos preferidos.
La presente invención se basa en el descubrimiento de nuevos procedimientos de diagnóstico para detectar de manera exacta la infección por hantavirus. Los procedimientos utilizan antígenos N y/o G1 recombinantes de hantavirus que comprenden epítopos inmunodominantes y/o anticuerpos dirigidos contra estos antígenos de al menos seis serotipos diferentes de hantavirus, incluyendo el HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV. En ciertas realizaciones, los análisis incluyen, por ejemplo, seis antígenos G1 recombinantes (y/o anticuerpos dirigidos contra seis antígenos G1) uno de cada uno de los serotipos anteriores y/o seis antígenos N recombinantes, uno de cada uno de los serotipos anteriores. En realizaciones alternativas, el análisis puede incluir, por ejemplo, al menos un antígeno N recombinante derivado de uno cualquiera de estos seis serotipos, que produce anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con uno o más de otros cinco serotipos, y seis antígenos G1 recombinantes, uno de cada uno de los seis serotipos. Por ejemplo, los análisis pueden incluir un antígeno N (y/o anticuerpos dirigidos contra el antígeno N) del SNV. Los análisis también incluirán antígenos G1 (y/o los anticuerpos dirigidos contra antígenos G1), preferiblemente, del total de los seis serotipos HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV. Alternativamente, el análisis puede incluir un antígeno G1 (y/o anticuerpos contra el mismo) de uno cualquiera de estos seis serotipos, y seis antígenos N (y/o anticuerpos contra los mismos) de cada uno de estos seis serotipos. En otra realización, el análisis puede incluir, por ejemplo, tres antígenos G1 (y/o anticuerpos contra los mismos) de tres de los seis serotipos, y tres antígenos N (y/o anticuerpos contra los mismos) de otros tres de los seis serotipos. Alternativamente, el análisis puede incluir dos antígenos G1 (y/o anticuerpos contra los mismos) y cuatro antígenos N (y/o anticuerpos contra los mismos) o cuatro antígenos G1 (y/o anticuerpos contra los mismos) y dos antígenos N (y/o anticuerpos contra los mismos) o un antígeno G1 (y/o anticuerpos contra el mismo) y cinco antígenos N (y/o anticuerpos contra los mismos) o cinco antígenos G1 (y/o anticuerpos contra los mismos) y un antígeno N (y/o anticuerpos contra el mismo) o cuatro antígenos G1 (y/o anticuerpos contra los mismos) y cuatro antígenos N (y/o anticuerpos contra los mismos) o cinco antígenos G1 (y/o anticuerpos contra los mismos) y cinco antígenos N (y/o anticuerpos contra los mismos), etcétera. Resulta evidente que se puede usar cualquier combinación de antígenos G1 y N recombinantes (y/o anticuerpos contra los mismos), siempre y cuando estén representados los seis serotipos HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV.
Los análisis de la presente invención también pueden utilizar más antígenos de hantavirus derivados de cualquiera de las diversas cepas de hantavirus descritas en la Tabla 1 u otros identificados posteriormente.
El uso de los antígenos N y/o G1 de hantavirus (y/o anticuerpos contra los mismos) de los seis serotipos HTNV, PUUV, SEOV, DOBV SNV y ANDV, opcionalmente, en combinación con otras proteínas y/o anticuerpos contra hantavirus, permite el diagnóstico de la infección provocada por cualquiera de los diversos serotipos de hantavirus conocidos. Además, se pueden adaptar los análisis de modo que se pueda identificar el serotipo de hantavirus en concreto que esté provocando la infección. Por ejemplo, las muestras biológicas de pacientes infectados con una variedad de hantavirus asociados al HPS y al HFRS reaccionan con antígenos N del SNV, pero no necesariamente con antígenos G1 del SNV. De este modo, la presencia de reactividad con un antígeno N del SNV y la ausencia de reactividad con un antígeno G1 del SNV indica la infección con un hantavirus distinto del SNV, y similares. Resulta evidente que se puede usar una amplia variedad de antígenos y de combinaciones de antígenos (o anticuerpos dirigidos contra estos antígenos) en los presentes análisis de diagnóstico.
Los procedimientos son útiles para detectar la infección por hantavirus en seres humanos, así como en poblaciones de roedores. Los procedimientos pueden detectar la infección por hantavirus en muestras de sangre, incluyendo sin limitación, en sangre entera, en suero y en plasma. De este modo, los procedimientos se pueden usar para diagnosticar la infección por hantavirus en un sujeto, tal como un ser humano o un sujeto roedor, así como para detectar la contaminación por hantavirus en muestras de sangre donadas. Se pueden rastrear alícuotas de muestras donadas individuales o muestras mezcladas en cuanto a la presencia de hantavirus, y se pueden eliminar aquellas muestras o muestras mezcladas contaminadas con hantavirus antes de su combinación. De este modo, se puede proporcionar un flujo sanguíneo sustancialmente libre de contaminación por hantavirus.
Para entender mejor la invención, a continuación, se proporciona una descripción más detallada de los hantavirus, así como de los diversos antígenos y anticuerpos contra hantavirus para su uso en los presentes procedimientos y composiciones.
Antígenos de hantavirus
Como se explica anteriormente, la familia de virus Hantavirus pertenece al género Bunyavirus, y se trata de virus de ARN de sentido negativo con envoltura. El ARN del genoma viral es tripartito, constando de tres fragmentos denominados en general S, M y L que se refieren a los fragmentos pequeño, mediano y grande del genoma, respectivamente. El segmento M codifica dos glucoproteínas de la envoltura, denominadas G1 y G2, en un único marco de lectura abierto. El segmento S codifica la proteína de la nucleocápside, denominada N, y el segmento L del genoma codifica una ARN polimerasa dependiente del ARN.
Se han descubierto varios hantavirus distintos en asociación con huéspedes roedores específicos en todo el mundo (véase la Tabla 1). Como se explica anteriormente, en la presente memoria, serán útiles los antígenos N y/o G1 derivados de al menos seis serotipos de hantavirus principales, HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV. Se conocen secuencias de los antígenos N y G1 de numerosos aislados identificados como pertenecientes a estos serotipos, así como las secuencias de ácidos nucleicos que codifican a estos antígenos. En las Figuras 1-12 de la presente memoria, se representan las secuencias representativas de las que se derivan los antígenos G1. Aunque los antígenos G1 representados en las figuras incluyen una metionina N-terminal, los péptidos G1 para su uso en la presente memoria no necesitan incluir esta metionina, especialmente, si son producidos mediante procedimientos sintéticos. Los antígenos G1 para su uso en la presente memoria pueden incluir la proteína G1 de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de la proteína G1. Son particularmente útiles los fragmentos que incluyen al menos la región correspondiente a la secuencia de 31 aminoácidos representada por los aminoácidos 59-89, numerados con respecto a NM H10 del SNV (LKIESSCNFDLHVPATTTQKYNQVDWTKKSS (SEC ID N.º 40). Esta región de la proteína G1 constituye un epítopo lineal inmunorreactivo, y se encuentra en cada uno de los fragmentos inmunogénicos G1 mostrados en las Figuras 7-12 de la presente memoria. Esta secuencia no es la misma en los seis serotipos de hantavirus de interés de la presente memoria. De este modo, se entenderá que una secuencia de aminoácidos de un hantavirus no SNV que "corresponda" a esta secuencia es un segmento de aminoácidos del hantavirus no SNV que pertenece a la misma región y presenta homología con esta secuencia, pero que no muestra necesariamente una identidad del 100% con esta secuencia. La región correspondiente de los otros cinco serotipos de hantavirus es fácilmente identificable si se examinan las Figuras 7-12 de la presente memoria.
Los antígenos G1 inmunogénicos que comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 40 pueden incluir, por ejemplo, 31 aminoácidos, hasta la longitud completa de la molécula G1, tal como 31-500 aminoácidos, preferiblemente, 31-250 aminoácidos, incluso más preferiblemente, 31-150 aminoácidos, tal como de 31 a 50... 60... 70... 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86... 90... 100... 200... 300... 400... 500, hasta la longitud completa de la molécula G1, o cualquier número entero dentro de estos intervalos. Además, los antígenos G1 para su uso en la presente memoria pueden carecer de toda o de una parte del dominio de unión transmembrana y/o la cola citoplasmática encontrada en el terminal C de la envoltura. De este modo, la presente invención contempla el uso de polipéptidos de la envoltura que conservan el dominio de unión transmembrana y la cola citoplasmática, así como los antígenos que carecen de toda o de una parte del dominio de unión transmembrana y/o la cola citoplasmática, así como partes adyacentes de la proteína G1. La ubicación de tales dominios se puede determinar fácilmente usando programas informáticos y algoritmos ampliamente conocidos en la técnica, tales como la técnica de Kyte-Doolittle, Kyte et al., J. MoI. Biol. (1982) 157:105-132.
Se conocen ampliamente secuencias adicionales de las que se pueden derivar los antígenos G1. Las secuencias de G1 se pueden derivar, por ejemplo, de cualquiera de las diversas secuencias del HTNV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso NC_005219, AF345636, D25532, D25529, D00377, D00376, AF288645, AF366569, AF035831, Y00386, U38177, U37729, M14627 y L08753. Las secuencias de G1 se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del SNV, tales como aquellas depositadas en el NCBI con los números de acceso L37903, L25783, AF030552, AF030551 y U02471. Las secuencias de G1 se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del ANDV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso NC_003467 y AF291703. Las secuencias de G1 se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del SEOV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso AF458104, AB027521, AF288654, AF288652, AF288650 y S47716. Las secuencias de G1 se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del PUUV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso NC_005223, AY526218, U14136, U22418, L08754, L08755, X61034, X55129 y M29979. Las secuencias de G1 se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del DOBV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso NC_005234, AJ410616, AY168578, AY168577 y L33685.
En las Figuras 13-18 de la presente memoria, se representan las secuencias representativas de las que se pueden derivar los antígenos N. Según lo descrito anteriormente para los antígenos G1, los antígenos N pueden incluir o no una metionina N-terminal. Los antígenos N para su uso en la presente memoria pueden incluir la proteína N de longitud completa o fragmentos inmunogénicos de la proteína N. Son particularmente útiles los fragmentos que incluyen al menos la región correspondiente a la secuencia de 43 aminoácidos encontrada en las posiciones 17-59 del polipéptido N, numerada con respecto a NM H10 del SNV (QLVTARQKLKDAERAVELDPDDVNKSTLQSRRAAVSALETKLG (SEC ID N.º 39). Esta región de la proteína N incluye un epítopo inmunodominante, y los anticuerpos dirigidos contra este epítopo reaccionan de forma cruzada con las proteínas N del PUUV, SEOV y HTNV.
Esta secuencia no es la misma en los seis serotipos de hantavirus de interés de la presente memoria. De este modo, se entenderá que una secuencia de aminoácidos de un hantavirus no SNV que "corresponda" a esta secuencia es un segmento de aminoácidos del hantavirus no SNV que pertenece a la misma región y presenta homología con esta secuencia, pero que no muestra necesariamente una identidad del 100% con esta secuencia. Examinando las Figuras 13-18 de la presente memoria se puede identificar fácilmente la región correspondiente de los otros cinco serotipos de hantavirus.
Los antígenos N inmunogénicos que comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º 39 pueden incluir, por ejemplo, 43 aminoácidos, hasta la longitud completa de la molécula N, tal como 43-350 aminoácidos, preferiblemente, 43-300 aminoácidos, más preferiblemente, 43-200 aminoácidos, incluso más preferiblemente, 43-100 aminoácidos, tal como de 43 a 60... 70... 80... 90... 100... 200... 300... 400, hasta la longitud completa de la molécula N, o cualquier número entero dentro de estos intervalos.
Se conocen ampliamente secuencias adicionales de las que se pueden derivar los antígenos N. Las secuencias de N se pueden derivar, por ejemplo, de cualquiera de las diversas secuencias del HTNV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso AB127998, AB027101, AB027523, AB027097, D25533, AF288646, AF288644, AF427324, AF427323, AF427322, AF427320, AF427319, AF427318, AF366568, AY017064, AF321095, AF321094, AF288296, U37768 y M14626. Las secuencias de N se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del SNV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso NC_005216, L37904, L25784, L33816, L33683 y U02474. Las secuencias de N se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del ANDV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso NC_003466, AF325966, AF0044660 y AF291702. Las secuencias de N se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del SEOV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso NC_005236, AF488708, AF488707, AY273791, AB027522, AF329390, AF288655, AF288653, AF288643, AF406965 y AY006465. Las secuencias de N se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del PUUV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso NC_005224, AY526219, AJ314601, AJ314600, AJ314599, AJ314598, AJ314597, AF442613, AF367071, AF367070, AF367068, AF367067, AF367066, AF367065, AF367064, AJ277030, AJ277076, AJ277075, AJ277034, AJ277033, AJ277032, AJ277031, AJ238791, AJ238790, AJ238789, AJ238788, X61035, AB010731, AB010730, U14137, AF294652, U22423, L08804, L11347 y M32750. Las secuencias de N se pueden derivar de cualquiera de las diversas secuencias del DOBV, tales como aquellas secuencias depositadas en el NCBI con los números de acceso NC_005233, AJ616854, AJ410619, AJ410615, AJ131673, AJ131672, AJ269550, AJ269549, AJ009775, AJ009773, AY168576 y L41916.
Los antígenos N y G1 recombinantes se pueden proporcionar como productos diferenciados o como fusiones de los diversos antígenos N y G1, con o sin otros antígenos de hantavirus de uno o de más de estos seis serotipos, así como con antígenos derivados de serotipos, además del HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV. A modo de ejemplo, las fusiones pueden comprender antígenos G1 de los seis serotipos anteriores. Esta fusión se puede usar sola o en combinación con una segunda fusión que incluya uno o más antígenos N de uno o más de estos seis serotipos. De manera similar, las fusiones pueden comprender antígenos N de los seis serotipos anteriores y esta fusión se puede usar sola o en combinación con una segunda fusión que incluya uno o más antígenos G1 de uno o de más de estos seis serotipos. Alternativamente, todos los antígenos N y G1 se pueden proporcionar en una sola fusión o en múltiples fusiones. Resulta evidente que las proteínas de fusión de la presente invención pueden adoptar cualquier serie de formas, siempre y cuando estén presentes los antígenos N y/o G1 del HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV. Si se produce una fusión, no es necesario que los polipéptidos estén organizados en el mismo orden que el que se encuentra en el virus nativo. De este modo, por ejemplo, se puede fusionar un polipéptido G1 al terminal N o al terminal C de un polipéptido N, etc. Otras proteínas de fusión posibles incluyen una fusión de una proteína superóxido dismutasa (SOD) humana o de levadura, o un fragmento de la proteína SOD, con un polipéptido G1 y/o N de hantavirus. Para consultar ejemplos de proteínas recombinantes expresadas como antígenos de fusión de SOD humana, véase Barr et al., Vaccine (1987), 5:90-101; Pichuantes et al., Proteins Struct. Fuct. Genet. (1989) 6:324-327; Pichuantes et al., J. Biol. Chem. (1990) 23:13890-13898.
Los antígenos para su uso con la presente invención se pueden obtener usando técnicas estándar. Por ejemplo, los antígenos de hantavirus se generan convenientemente usando procedimientos recombinantes ampliamente conocidos en la técnica. Véase, p. ej., la publicación internacional n.º WO 95/00648, publicada el 5 de enero de 1995; la publicación internacional n.º WO 95/06240, publicada el 2 de marzo de 1995; y Hjelle, et al., J. Virol (1994) 68:592-596, para consultar descripciones de la producción recombinante de antígenos de hantavirus.
Se pueden crear sondas de oligonucleótido basadas en las secuencias conocidas del genoma de los hantavirus, y usarlas para sondar genotecas o bancos de ADNc para genes de hantavirus que codifiquen los antígenos útiles en la presente invención. Entonces se pueden aislar además los genes usando técnicas estándar y, si se desea, enzimas de restricción empleadas para mutar el gen en las partes deseadas de la secuencia de longitud completa.
De manera similar, se pueden aislar genes de hantavirus directamente de tejido infectado usando técnicas conocidas, tales como mediante extracción con fenol (véase, p. ej., la publicación internacional n.º WO 95/00648, publicada el 5 de enero de 1995) y se puede seguir manipulando la secuencia para producir cualquier modificación deseada. Véase, p. ej.: Sambrook et al., supra, para consultar una descripción de las técnicas usadas para obtener y aislar ADN. Finalmente, se pueden producir sintéticamente los genes que codifican los antígenos de hantavirus en base a las secuencias conocidas. Se puede diseñar la secuencia de nucleótidos con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos deseada en particular. En general, se seleccionarán los codones preferidos para el huésped deseado en el que se expresará la secuencia. Generalmente, la secuencia completa se ensambla desde los oligonucleótidos solapantes preparados mediante procedimientos estándar y ensamblados en una secuencia codificante completa. Véase, p. ej., Edge, Nature (1981) 292:756; Nambair et al., Science (1984) 223:1299; Jay et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.
Los polinucleótidos pueden comprender secuencias codificantes para los diversos polipéptidos que tienen lugar de manera natural o pueden incluir secuencias artificiales que no tienen lugar en la naturaleza. Se pueden ligar estos polinucleótidos para formar una secuencia codificante para una proteína de fusión, si se desea, usando técnicas de Biología Molecular estándar.
Una vez preparadas o aisladas las secuencias codificantes, se pueden clonar tales secuencias en cualquier vector o replicón adecuado. Los expertos en la técnica conocen numerosos vectores de clonación, y la selección de un vector de clonación apropiado está a su elección. Los vectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagos, transposones, cósmidos, cromosomas o virus que son capaces de replicarse cuando se asocian con los elementos de control apropiados. Entonces, se coloca la secuencia codificante bajo el control de los elementos de control adecuados, en función del sistema que se vaya a usar para la expresión. De este modo, se puede colocar la secuencia codificante bajo el control de un promotor, un sitio de unión al ribosoma (para la expresión bacteriana) y, opcionalmente, un operador, de modo que la secuencia de ADN de interés sea transcrita en el ARN mediante un transformante adecuado. La secuencia codificante puede contener o no un péptido señal o una secuencia líder que posteriormente pueda se eliminada por el huésped en el procesamiento posterior a la traducción. Véanse, p. ej., las patentes estadounidenses n.º 4.431.739; 4.425.437; 4.338.397.
Si está presente, la secuencia señal puede ser la líder nativa encontrada en asociación con el polipéptido de hantavirus de interés. Por ejemplo, si el polipéptido de hantavirus que está siendo expresado es un antígeno G1, se puede incluir toda o parte de la secuencia líder de G1 nativa. Alternativamente, puede estar presente una secuencia señal heteróloga que pueda aumentar la eficacia de la secreción. Hay una serie de secuencias líder representativas conocidas en la técnica e incluyen, sin limitación, el factor-\alpha líder de levadura, el péptido señal de tPA, el péptido señal de Ig, y similares. Las secuencias para estas y otras secuencias líder son ampliamente conocidas en la técnica.
Además de las secuencias control, puede ser deseable añadir secuencias reguladoras que permitan la regulación de la expresión de las secuencias relativas al crecimiento de la célula huésped. Los expertos en la técnica conocen las secuencias reguladoras, y los ejemplos incluyen aquéllas que provocan la activación o la desactivación de la expresión de un gen como respuesta a estímulos químicos o físicos, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También pueden estar presentes otros tipos de elementos reguladores en el vector. Por ejemplo, en la presente memoria, se pueden usar elementos potenciadores para aumentar los niveles de expresión de los constructos. Los ejemplos incluyen el potenciador del gen temprano de SV40 (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), el potenciador/promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Sarcoma de Rous (Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci., EE.UU., 79:6777) y elementos derivados del CMV humano (Boshart et al. (1985) Cell 41:521), tales elementos incluidos en la secuencia del intrón A del CMV (patente estadounidense n.º 5.688.688). El casete de expresión puede incluir además un origen de replicación para la replicación autónoma en una célula huésped adecuada, uno o más marcadores seleccionables, uno o más sitios de restricción, un potencial para un número alto de copias y un promotor potente.
Los vectores de expresión se construyen de modo que la secuencia codificante en particular se ubica en el vector con las secuencias reguladoras apropiadas, siendo la colocación y la orientación de la secuencia codificante con respecto a las secuencias control de modo que la secuencia codificante sea transcrita bajo el "control" de las secuencias control (i. e., la ARN polimerasa que se une a la molécula de ADN en las secuencias control transcribe la secuencia codificante). Puede ser deseable la modificación de las secuencias que codifican la molécula de interés para alcanzar este fin. Por ejemplo, en algunos casos, puede ser necesario modificar la secuencia de modo que se pueda unir a las secuencias control en la orientación apropiada; i. e., para mantener el marco de lectura. Las secuencias control y otras secuencias reguladoras se pueden ligar a la secuencia codificante antes de su inserción en un vector. Alternativamente, se puede clonar directamente la secuencia codificante en un vector de expresión que ya contenga las secuencias control y un sitio de restricción apropiado.
Como se explica anteriormente, también puede ser deseable producir mutantes o análogos del polipéptido de interés. Los mutantes o los análogos de los polipéptidos de hantavirus para su uso en las presentes composiciones se pueden preparar mediante la eliminación de una parte de la secuencia que codifica la molécula de interés, mediante la inserción de una secuencia y/o mediante la sustitución de uno o más nucleótidos en la secuencia. Las técnicas para modificar secuencias de nucleótidos, tales como la mutagénesis dirigida a un sitio específico, y similares son ampliamente conocidas por los expertos. Véase, p. ej., Sambrook et al., supra; Kunkel, T. A. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. (1985) 82:448; Geisselsoder et al. (1987) BioTechniques 5:786; Zoller y Smith (1983) Methods Enzymol. 100:468; Dalbie-McFarland et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci, EE.UU. 79:6409.
Para facilitar la expresión recombinante, la molécula de interés se puede expresar como una proteína de fusión, tal como una fusión con, p. ej., una proteína de unión a la maltosa de E. coli de 50 kDa, una fusión con una superóxido dismutasa (SOD) humana o de levadura, o un fragmento de la misma, o como una proteína de fusión a la ubiquitina.
Las moléculas se pueden expresar en una amplia variedad de sistemas, incluyendo sistemas de expresión de insectos, mamíferos, bacterianos, virales y de levaduras, todos ampliamente conocidos en la técnica. Por ejemplo, los sistemas de expresión de células de insecto, tales como los sistemas de baculovirus, son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en p. ej., Summers y Smith, Boletín "Texas Agricultural Experiment Station Bulletin" n.º 1555 (1987). Los materiales y los procedimientos para los sistemas de expresión de baculovirus/células de insecto se encuentran comercialmente disponibles en forma de los equipos de, entre otros, Invitrogen, San Diego CA (equipo "MaxBac"). De manera similar, los sistemas de expresión de células bacterianas y de mamífero son conocidos en la técnica y se describen p. ej., en Sambrook et al., supra. También se conocen en la técnica los sistemas de expresión de levaduras, y se describen p. ej., en "Yeast Genetic Engineering" (Barr et al., eds., 1989) Butterworths, Londres.
También se conoce una serie de células huésped apropiadas para su uso con los sistemas anteriores. Por ejemplo, en la técnica, se conocen líneas celulares de mamífero, e incluyen líneas celulares inmortalizadas disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), tales como, pero sin limitarse a, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de hámster neonato (BHK), células de riñón de mono (COS), células de riñón embrionario humano, células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), células de riñón bovino de Madin-Darby ("MDBK"), así como otras. De manera similar, los huéspedes bacterianos tales como E. coli, Bacillus subtilis y Streptococcus spp., serán útiles con los presentes constructos de expresión. Los huéspedes de levadura útiles en la presente invención incluyen, entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Las células de insecto para su uso con los vectores de expresión de baculovirus incluyen, entre otros, Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda y Trichoplusia ni.
Las moléculas de ácido nucleico que comprenden las secuencias de nucleótidos de interés pueden estar integradas de manera estable en un genoma de célula huésped o mantenidas en un elemento episomal estable de una célula huésped adecuada usando diversas técnicas de administración de genes ampliamente conocidas en la técnica. Véase, p. ej., la patente estadounidense n.º 5.399.346.
En función del sistema de expresión y del huésped seleccionado, las moléculas se producen cultivando células huésped transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente en condiciones mediante las que se exprese la proteína. Entonces se aísla la proteína expresada de las células huésped y se purifica. Si el sistema de expresión segrega la proteína en los medios de crecimiento, el producto se puede purificar directamente desde los medios. Si no es segregada, se puede aislar de lisados celulares. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas y de los procedimientos de recuperación pertenece al alcance de la técnica.
Los antígenos de hantavirus se usan en la presente memoria como herramientas de diagnóstico para detectar la presencia de anticuerpos reactivos dirigidos contra el virus en una muestra biológica. Además, los antígenos se pueden usar para determinar qué tipo de hantavirus es responsable de la infección. Los antígenos también se pueden usar para producir anticuerpos para su uso en diagnósticos.
Anticuerpos contra hantavirus
Los antígenos de hantavirus se pueden usar para producir anticuerpos policlonales y monoclonales específicos de un hantavirus. Los anticuerpos policlonales y monoclonales específicos de un hantavirus se unen específicamente a los antígenos del hantavirus. Los anticuerpos policlonales se pueden producir mediante la administración del antígeno de hantavirus a un mamífero, tal como un ratón, un conejo, una cabra o un caballo. Se recoge suero del animal inmunizado y se purifican los anticuerpos del plasma mediante, por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio, seguida por una cromatografía, preferiblemente, una cromatografía de afinidad. Las técnicas para producir y procesar antisueros policlonales son conocidas.
También se pueden producir fácilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra epítopos específicos de un hantavirus presentes en las proteínas. Las células B normales de un mamífero, tal como un ratón (véase, p. ej., Kohler y Milstein, Nature (1975) 256:495-497) o un conejo (véase, p. ej., la patente estadounidense n.º 5.675.063) inmunizado con un antígeno de hantavirus se pueden fusionar con, por ejemplo, células de mieloma de ratón sensibles a HAT para producir hibridomas. Los hibridomas que producen anticuerpos específicos de un hantavirus se pueden identificar usando un RIA o un ELISA, y se pueden aislar mediante clonación en un agar semi-sólido o por dilución limitante. Los clones que producen anticuerpos específicos de un hantavirus se aíslan mediante otra serie de rastreo.
Puede ser deseable proporcionar anticuerpos quiméricos. Es posible formar anticuerpos quiméricos compuestos de secuencias de aminoácidos humanas y no humanas a partir de moléculas de anticuerpos monoclonales de ratón para reducir su inmunogenicidad en seres humanos (Winter et al. (1991) Nature 349:293; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 86:4220; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138:4534; y Brown et al. (1987) Cancer Res. 47:3577; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534; y Jones et al. (1986) Nature 321:522; Publicación EP n.º 519.596, publicada el 23 de diciembre de 1992; y la publicación de patente británica n.º GB 2.276.169, publicada el 21 de septiembre de 1994).
Se pueden producir, usando técnicas conocidas, fragmentos de moléculas de anticuerpos, p. ej., moléculas F(ab')_{2}, Fv y sFv, que son capaces de presentar propiedades de unión inmunológica de la molécula de anticuerpo monoclonal precursora. Inbar et al., (1972) Proc. Nat. Acad. Sci., EE.UU., 69:2659; Hochman et al. (1976) Biochem 15:2706; Ehrlich et al. (1980) Biochem 19:4091; Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci., EE.UU., 85(16):5879; y las patentes estadounidenses n.º 5.091.513 y 5.132.405, concedidas a Huston et al.; y 4.946.778, concedida a Ladner et al.
Como alternativa, se puede usar un sistema de despliegue en fagos para ampliar las poblaciones de moléculas de anticuerpos monoclonales in vitro. Saiki, et al. (1986) Nature 324:163; Scharf et al. (1986) Science 233: 1076; patentes estadounidenses n.º 4.683.195 y 4.683.202; Yang et al. (1995) J. MoI Biol 254:392; Barbas, III et al. (1995) Methods: Comp. Meth Enzymol 8:94; Barbas, III et al. (1991) Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 88:7978.
Una vez generado, el banco de despliegue en fagos se puede usar para mejorar la afinidad de unión inmunológica de las moléculas Fab usando técnicas conocidas. Véase, p. ej., Figini et al. (1994) J. MoI. Biol. 239:68. Se pueden aislar o sintetizar las secuencias codificantes de las partes de cadena pesada o ligera de las moléculas Fab seleccionadas del banco de despliegue en fagos, y clonarlas en cualquier vector o replicón adecuado para su expresión. Se puede usar cualquier sistema de expresión adecuado, incluyendo los descritos anteriormente.
Los anticuerpos que son dirigidos contra epítopos de hantavirus son particularmente útiles para detectar la presencia de hantavirus o antígenos de hantavirus en una muestra, tal como una muestra de suero de un ser humano infectado por hantavirus. Un inmunoanálisis para un antígeno de hantavirus puede utilizar un anticuerpo o varios anticuerpos bien solos o en combinación con antígenos de hantavirus. Un inmunoanálisis para un antígeno de hantavirus puede usar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal dirigido hacia un epítopo de hantavirus, una combinación de anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopos de un polipéptido de hantavirus, anticuerpos monoclonales dirigidos hacia epítopos de diferentes polipéptidos de hantavirus, anticuerpos policlonales dirigidos hacia el mismo antígeno de hantavirus, anticuerpos policlonales dirigidos hacia diferentes antígenos de hantavirus o una combinación de anticuerpos monoclonales y policlonales. Los protocolos de los inmunoanálisis se pueden basar, por ejemplo, en análisis de competición, de reacción directa o los de tipo sándwich usando, por ejemplo, anticuerpo marcado, y se describen más detalladamente a continuación. Los marcadores pueden ser, por ejemplo, fluorescentes, quimioluminiscentes o radiactivos.
Se pueden usar anticuerpos contra hantavirus además para aislar partículas o antígenos de hantavirus mediante columnas de inmunoafinidad. Se pueden fijar los anticuerpos a un soporte sólido mediante, por ejemplo, adsorción o enlace covalente, de modo que los anticuerpos conserven su actividad inmunoselectiva. Opcionalmente, se pueden incluir grupos espaciadores de modo que el sitio de unión antigénica del anticuerpo permanezca accesible. Entonces se pueden usar anticuerpos inmovilizados para unir partículas o antígenos de hantavirus de una muestra biológica, tal como de sangre o plasma. Las partículas o los antígenos de hantavirus unidos se recuperan de la matriz de la columna mediante, por ejemplo, un cambio de pH.
Análisis de diagnóstico de hantavirus
Como se explica anteriormente, en los análisis, se pueden usar los antígenos de hantavirus inmunogénicos y los anticuerpos contra los antígenos para identificar la infección por hantavirus. Comúnmente, la presencia de hantavirus en una muestra biológica se determinará mediante la presencia de anticuerpos contra los hantavirus en la muestra, aunque en casos apropiados, se puede detectar la presencia de las proteínas virales y usarla como un indicador de hantavirus en la muestra. Se pueden usar los reactivos para detectar hantavirus en muestras de sangre, incluyendo sin limitación, en sangre entera, en suero y en plasma. Los antígenos y los anticuerpos se pueden usar para detectar la infección por hantavirus en un sujeto, tal como un ser humano o un sujeto roedor, así como para detectar la contaminación por hantavirus en muestras de sangre donadas. De este modo, se pueden rastrear alícuotas de muestras donadas individuales o muestras mezcladas en cuanto a la presencia de hantavirus, y se pueden eliminar aquellas muestras o muestras mezcladas contaminadas con hantavirus antes de mezclarlas. De este modo, se puede proporcionar un flujo sanguíneo sustancialmente libre de contaminación por hantavirus. "Sustancialmente libre de hantavirus" pretende significar que no se detecta la presencia de hantavirus usando los análisis descritos en la presente memoria, preferiblemente, usando el análisis de inmunotransferencia en tiras descrito de manera más completa más adelante.
Los análisis que se usan en la presente memoria incluyen transferencias Western; análisis de aglutinación; inmunoanálisis marcados y mediados por enzimas, tales como ELISA; análisis de tipo biotina/avidina; radioinmunoanálisis; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación; análisis de inmunotransferencia en tiras, y similares. Las reacciones incluyen generalmente dejar ver marcadores, tales como marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radiactivos, enzimáticos o moléculas colorantes, u otros procedimientos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o los anticuerpos que reaccionan con el mismo.
Los análisis anteriormente mencionados implican generalmente la separación de un anticuerpo o un antígeno sin unir en una fase líquida de un soporte de fase sólida al que están unidos los complejos de antígeno-anticuerpo. Los soportes sólidos que se pueden usar en la práctica de la invención incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (p. ej., en forma de membrana o de pocillo de microvaloración); polivinilcloruro (p. ej., láminas o pocillos de microvaloración); látex de poliestireno (p. ej., perlas o placas de microvaloración); fluoruro de polivinilidina; papel diazotizado; membranas de nailon; perlas activadas, perlas sensibles magnéticamente, y similares.
En un aspecto de la invención, los antígenos G1 y/o N de hantavirus de al menos los seis serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV se usan para la captura o la detección, o ambas cosas, de anticuerpos contra hantavirus en una muestra. En otro aspecto de la invención, se pueden usar los anticuerpos contra los antígenos de hantavirus para la captura o la detección, o ambas cosas, de antígenos de hantavirus en una muestra. "Captura" de un analito (i. e., anticuerpos contra hantavirus o antígenos de hantavirus en una muestra) pretende significar que se puede separar el analito de otros componentes de la muestra en virtud de la unión de la molécula de captura. Comúnmente, la molécula de captura está asociada a un soporte sólido, bien directa o indirectamente. Comúnmente, la molécula de detección está asociada a un marcador detectable, bien directa o indirectamente.
Comúnmente, primero se hace reaccionar un soporte sólido con un componente en fase sólida (p. ej., los antígenos G1 y/o N de hantavirus de al menos los seis serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV y/o anticuerpos contra hantavirus) en condiciones de unión adecuadas de modo que el componente esté suficientemente inmovilizado al soporte. A veces, es posible aumentar la inmovilización al soporte acoplándolo primero a una proteína con mejores propiedades de unión. Las proteínas de acoplamiento adecuadas incluyen, pero no se limitan a, macromoléculas tales como albúminas de suero que incluyen la albúmina de suero bovino (ASB), la hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovalbúmina y otras proteínas conocidas por los expertos en la técnica. Otras moléculas que se pueden usar para unir el antígeno o el anticuerpo al soporte incluyen polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y similares. Tales moléculas y procedimientos de acoplamiento de estas moléculas son ampliamente conocidos por aquéllos expertos habituales en la técnica. Véase, p. ej., Brinkley, M. A. Bioconjugate Chem. (1992) 3:2-13; Hashida et al., J. Appl. Biochem. (1984) 6:56-63; y Anjaneyulu y Staros, International J. of Peptide and Protein Res.
(1987) 30:117-124.
Una vez que el soporte sólido ha reaccionado con el componente en fase sólida, se elimina cualquier componente en fase sólida no inmovilizado del soporte lavando, y luego se pone en contacto el componente unido al soporte con una muestra biológica sospechosa de contener el componente ligando (i. e., antígenos o anticuerpos contra hantavirus) en condiciones de unión adecuadas. Tras lavar para eliminar cualquier ligando no unido, se puede añadir un resto aglutinante secundario en condiciones de unión adecuadas, aglutinante secundario que es capaz de asociarse selectivamente con el ligando unido. Luego se puede detectar la presencia del aglutinante secundario usando técnicas ampliamente conocidas.
Más concretamente, se puede usar un procedimiento de ELISA en el que los pocillos de una placa de microvaloración están revestidos con los antígenos G1 y/o N de hantavirus de al menos los seis serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV y/o anticuerpos según la presente invención. Entonces se añade una muestra biológica que contiene o es sospechosa de contener bien moléculas de inmunoglobulina contra hantavirus o antígenos de hantavirus a los pocillos revestidos. Tras un período de incubación suficiente para permitir la unión antígeno-anticuerpo, se pueden lavar la(s) placa(s) para eliminar los restos no unidos y añadir una molécula de unión secundaria marcada detectablemente. La molécula de unión secundaria se deja reaccionar con cualquier muestra capturada, se lava la placa y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria usando procedimientos ampliamente conocidos en la técnica.
En un formato particular, se usa un formato de ELISA de tipo sándwich para detectar antígenos. En este caso, se reviste el soporte sólido con los antígenos G1 y/o N de hantavirus de al menos los seis serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV. Entonces, se pone en contacto la muestra con el soporte, en condiciones que permitan a los anticuerpos contra hantavirus, si están presentes, unirse con uno o más de los antígenos de hantavirus para formar un complejo de antígeno/anticuerpo. Se retiran los reactivos sin unir y se añade un antígeno marcado enzimáticamente que reacciona con el complejo de antígeno/anticuerpo unido, tal como un antígeno N y/o G1 de hantavirus marcado. Se usa un sustrato enzimático para generar una señal.
En otro formato, se reviste el soporte sólido con anticuerpos anti-isotípicos de una especie específica (p. ej., anticuerpos contra la IgM humana, anticuerpos contra la IgG humana, anticuerpos contra la IgA humana, etc.). Entonces se reviste el soporte con la muestra en condiciones que permiten la unión de los anticuerpos presentes en la muestra con los anticuerpos anti-isotípicos. Se pueden eliminar los anticuerpos no unidos y detectar la presencia de anticuerpos contra hantavirus unidos usando los antígenos de hantavirus marcados de la presente invención. El marcador será comúnmente un marcador enzimático, p. ej., una HRP, AP.
En otra realización, se puede detectar fácilmente la presencia de ligandos de hantavirus unidos de una muestra biológica usando un aglutinante secundario que comprenda un anticuerpo dirigido contra los ligandos del anticuerpo. En la técnica, se conoce una serie de moléculas contra las inmunoglobulinas (Ig) humanas que se pueden conjugar fácilmente con un marcador enzimático detectable, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o ureasa, usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Entonces se usa un sustrato enzimático apropiado para generar una señal detectable. En otras realizaciones relacionadas, se pueden poner en práctica técnicas de ELISA de tipo competitivo usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.
Se conocen otros formatos para la detección de anticuerpos contra hantavirus en una muestra, y la combinación de antígenos de hantavirus de la presente invención se puede usar con cualquier formato conocido que emplee un antígeno de hantavirus. Véase, p. ej., Lee et al., J. Infect. Dis. (1978) 137:298-308; Lee et al., J. Infect. Dis. (1982) 146:638-644; Lee et al., J. Infect. Dis. (1982) 146:645-651; Lundkvist et al., Clin. Diagnos. Lab. Immunol. (1995) 2:82-86; Chu et al., Virology (1994) 198:196-204; Elgh et al., J. Med. Virol (1995) 45:146-150; Hjelle et al., J. Clin. Microbiol. (1997) 35:600-608; Bharadwaj et al., J. Infect. Dis. (2000) 182:43-48; Yee, et al., J. Wildl. Dis. (2003) 39:271-277).
Los antígenos G1 y/o N de hantavirus de al menos los seis serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV se pueden usar en un ELISA de captura de IgM como se explica a continuación. Se unen los anticuerpos contra la IgM humana (p. ej., anticuerpos de cabra contra la IgM humana) a un soporte sólido, se pone en contacto el soporte con una muestra que se vaya a analizar en cuanto a la presencia de IgM humana contra hantavirus en condiciones que permitirían la unión de la IgM contra hantavirus, si estuviera presente, con uno o más de los anticuerpos contra la IgM humana unidos al soporte sólido para formar complejos de anticuerpo/anticuerpo. Se añaden los antígenos G1 y/o N de hantavirus de al menos los seis serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV en condiciones que permitirían la unión con la IgM contra hantavirus en los complejos de anticuerpo/anticuerpo formando un complejo de anticuerpo/anticuerpo/antígeno. Se eliminan los antígenos sin unir y se añaden los anticuerpos contra hantavirus marcados detectablemente en condiciones que permitirían la unión con los antígenos unidos. La presencia de IgM contra hantavirus en la muestra se determina mediante la presencia de anticuerpos contra hantavirus marcados detectablemente contra los complejos de Ac contra la IgM humana unidos/IgM humana contra hantavirus/antígeno unidos al soporte sólido. Alternativamente, se pueden marcar detectablemente los propios antígenos de hantavirus, prescindiendo de la necesidad de anticuerpos contra hantavirus marcados detectablemente.
También se pueden usar los antígenos G1 y/o N de hantavirus de al menos los seis serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV en un ELISA indirecto de IgG como se explica a continuación. Se unen los anticuerpos específicos de los antígenos a un soporte sólido, se pone en contacto el soporte con los antígenos G1 y/o N de hantavirus de al menos los seis serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV en condiciones que permitirían la unión con los anticuerpos contra hantavirus unidos al soporte para formar complejos de anticuerpo/antígeno. Se retiran los antígenos sin unir y se pone en contacto el soporte con una muestra que se vaya a analizar en cuanto a la presencia de IgG humana contra los hantavirus en condiciones que permitirían la unión de la IgG humana contra hantavirus, si estuviera presente, con los antígenos en los complejos de anticuerpo/antígeno. Se puede detectar la presencia de la IgG contra hantavirus unida usando un anticuerpo contra la IgG humana marcado detectablemente.
Aunque algunos de los formatos de análisis anteriores se denominen "ELISA" (Análisis de inmunoabsorción ligado a una enzima), será evidente para cualquier experto en la técnica que es posible usar un marcador detectable distinto de un resto de unión "ligado a una enzima", pudiendo ser, en muchas ocasiones, deseable. En la presente memoria, se describen otros marcadores detectables adecuados y son ampliamente conocidos en la técnica.
También se pueden realizar análisis en soluciones, de modo que los antígenos o los anticuerpos contra hantavirus y los ligandos específicos de estas moléculas formen complejos en condiciones de precipitación. En una realización particular, se pueden unir las moléculas a una partícula en fase sólida (p. ej., una perla de agarosa o similar) usando técnicas de acoplamiento conocidas, tales como mediante el acoplamiento químico directo o indirecto. Entonces se pone en contacto la partícula revestida en condiciones de unión adecuadas con una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpos o antígenos de hantavirus. El entrecruzamiento entre los anticuerpos unidos provoca la formación de agregados de complejos que pueden ser precipitados y separados de la muestra usando un lavado y/o una centrifugación. La mezcla de reacción se puede analizar para determinar la presencia o la ausencia de complejos usando cualquiera de una serie de procedimientos estándar, tales como aquellos procedimientos de inmunodiagnóstico descritos anteriormente.
En otra realización más, se puede proporcionar una matriz de inmunoafinidad en la que, por ejemplo, se inmovilice a un sustrato una población policlonal de anticuerpos de una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpos contra hantavirus. Se puede llevar a cabo una purificación por afinidad inicial de la muestra usando antígenos inmovilizados. De este modo, la preparación de muestra resultante sólo contendrá restos contra hantavirus, evitando las posibles propiedades de unión inespecífica en el soporte de afinidad. En la técnica, se conoce una serie de procedimientos para inmovilizar inmunoglobulinas (bien fragmentos intactos o específicos) a un rendimiento elevado y con una buena retención de la actividad de unión antigénica. Una vez inmovilizadas las moléculas de inmunoglobulina para proporcionar una matriz de inmunoafinidad, se ponen en contacto las moléculas marcadas con los anticuerpos unidos en condiciones de unión adecuadas. Tras haber lavado cualquier antígeno de hantavirus unido inespecíficamente del soporte de inmunoafinidad, es posible determinar la presencia de antígeno unido analizando el marcador con el uso de procedimientos conocidos en la técnica.
En una realización particularmente preferida de la invención, se usa un análisis de inmunotransferencia en tiras (SIA) para detectar anticuerpos contra hantavirus en una muestra biológica usando los antígenos G1 y/o N de hantavirus de al menos los seis serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV inmovilizados en la tira de análisis. Las técnicas SIA son ampliamente conocidas y combinan las técnicas de transferencia Western tradicionales con las de transferencia de puntos, p. ej., la SIA RIBA® (Chiron Corp., Emeryville, CA). En estos análisis, los antígenos de hantavirus son inmovilizados como partes individuales diferenciadas, p. ej., como tiras o como puntos, sobre un soporte membranoso. De este modo, "inmovilizado diferencialmente" sobre un soporte membranoso pretende significar que los antígenos están presentes como componentes separados y no mezclados, de modo que se puede analizar la reactividad o la falta de la misma con cada uno de los antígenos presentes. Entonces se hace reaccionar una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpos contra hantavirus con la membrana de análisis. La visualización de la reactividad contra los hantavirus en la muestra biológica se realiza usando conjugados de enzimas contra la inmunoglobulina humana en combinación con un sustrato enzimático colorimétrico. También pueden estar presentes controles internos, tales como anticuerpo contra la IgM humana y anticuerpo contra la IgG humana, sobre la membrana de análisis. El análisis se puede realizar manualmente o usarlo en un formato
automático.
Los soportes sólidos que se pueden usar en la práctica de los análisis de inmunotransferencia en tiras incluyen, pero no se limitan a, soportes membranosos derivados de una serie de polímeros primarios que incluyen celulosa, poliamida (nailon), poliacrilonitrilo, fluoruro de polivinilideno, polisulfona, polipropileno, poliéster, polietileno y resinas compuestas que constan de combinaciones o derivados de los anteriores. Los particularmente preferidos son los soportes derivados de la celulosa, tales como las membranas de nitrocelulosa, así como las membranas de nailon. El sustrato incluye generalmente la membrana deseada con un soporte de plástico inerte.
La cantidad de antígeno aplicada a la membrana varía en función del antígeno en cuestión. Generalmente, el antígeno se aplicará a la tira en una cantidad de aproximadamente 20-500 ng/tira, preferiblemente, 50-250 ng/tira, y más preferiblemente, 75-150 ng/tira. Cualquier experto en la técnica puede determinar fácilmente la cantidad de antígeno necesaria para producir un resultado utilizable. Alternativamente, puede haber dos concentraciones de los antígenos, tales como una concentración baja y una concentración alta. De este modo, por ejemplo, se puede proporcionar un antígeno N del SNV en una concentración según lo especificado anteriormente, así como en una o más bandas adicionales, en una concentración de aproximadamente, p. ej., 25-200 ng, tal como 50-150 ng, p. ej., 100 ng/tira. El control de nivel elevado estará presente en una cantidad suficientemente superior como para ofrecer un resultado muy positivo, tal como, a 200-500 ng, particularmente, 250-350 ng, p. ej., 300 ng/tira. Es evidente que la concentración del antígeno que se vaya a aplicar a la banda de análisis variará en función del antígeno específico usado y que cualquier experto en la técnica la puede determinar fácilmente.
Los anticuerpos contra las inmunoglobulinas, tales como el anticuerpo contra la IgM humana, el anticuerpo contra la IgG humana y/o el anticuerpo contra la IgA humana, pueden estar presentes en una sola concentración, o en dos concentraciones, una baja y una alta. Por ejemplo, el anticuerpo contra IgG puede estar presente en una concentración de aproximadamente 50-250 ng/ml, más preferiblemente, de aproximadamente 75-200 ng/ml y, lo más preferible, de aproximadamente 100-185 ng/ml. También puede haber presente una concentración más elevada de anticuerpo contra IgG junto con la concentración baja contra IgG para proporcionar otro control interno, tal como a una concentración de aproximadamente 400-1200 ng/ml, más preferiblemente, de aproximadamente 450-1000 ng/ml y, lo más preferible, de aproximadamente 500-950 ng/ml.
Una vez que el soporte membranoso ha reaccionado con los antígenos y las moléculas de Ig deseados, se elimina cualquier componente en fase sólida no inmovilizado de la membrana mediante lavado, y luego se ponen en contacto los componente unidos a la membrana con una muestra biológica sospechosa de contener anticuerpos contra hantavirus en condiciones de unión adecuadas. Tras lavar para eliminar cualquier anticuerpo no unido, se añade un resto aglutinante secundario en condiciones de unión adecuadas, aglutinante secundario que es capaz de asociarse selectivamente con los anticuerpos unidos. Luego se puede detectar la presencia del aglutinante segundario usando técnicas ampliamente conocidas.
En una realización particularmente preferida, se puede detectar fácilmente la presencia de ligandos de antígenos contra hantavirus unidos de una muestra biológica usando un aglutinante secundario que comprenda un anticuerpo dirigido contra los ligandos del anticuerpo. Hay una serie de moléculas contra las inmunoglobulinas (Ig) humanas conocidas en la técnica, tales como la Ig de cabra anti-humana o la Ig de conejo anti-humana comercialmente disponibles. Las moléculas de Ig para su uso en la presente memoria serán del tipo IgG, IgA o IgM. Las moléculas de Ig se pueden conjugar fácilmente con un marcador enzimático detectable, tal como peroxidasa de rábano picante, oxidasa de glucosa, \beta-galactosidasa, fosfatasa alcalina y ureasa, entre otros, usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Entonces se usa un sustrato enzimático apropiado para generar una señal detectable.
Además, se puede usar un conjugado contra anticuerpos de cadena pesada y ligera humanos para hacer que el SIA sea capaz de detectar las respuestas tanto de IgG como de IgM. Este diseño puede servir para aumentar la sensibilidad de detección de las respuestas de los anticuerpos en los estadios tempranos de la infección.
Los reactivos de análisis anteriormente descritos, incluyendo los antígenos de hantavirus y/o los anticuerpos contra los mismos, los soportes sólidos con reactivos unidos, así como otros reactivos de detección, se pueden proporcionar en equipos con instrucciones adecuadas y otros reactivos necesarios con el fin de realizar los análisis según lo según lo descrito anteriormente. El equipo también puede incluir formulaciones de control (positivo y/o negativo), reactivos marcados cuando el formato de análisis los requiera y reactivos de generación de señales (p. ej., sustrato enzimático) si el marcador no genera una señal directamente. Habitualmente, en el equipo se incluirán instrucciones (p. ej., por escrito, en cinta, VCR, CD-ROM, etc.) para llevar a cabo el análisis. El equipo también puede contener, en función del análisis usado en particular, otros reactivos y materiales envasados (i.e., tampones de lavado y similares). Los análisis estándar, tales como los descritos anteriormente, se pueden realizar usando estos equipos.
III. Parte experimental
A continuación, se presentan ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen sólo a modo ilustrativo, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención de ningún modo.
Se han hecho esfuerzos por garantizar la exactitud de los números usados (p. ej., las cantidades, las temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se debería tener en cuenta algún error y desviación experimental.
Ejemplo 1 Clonación y expresión de proteínas G1 recombinantes de hantavirus
Los antígenos G1 de hantavirus mostrados en la Tabla 2 se prepararon como se explica a continuación. Se sintetizaron fragmentos de nucleótidos codificantes de antígenos G1 recombinantes que incluían 80-83 aminoácidos de la proteína G1 del HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV usando una combinación de oligonucleótidos correspondientes a la región de interés de cada cepa. En la Tabla 2, se indica la parte de la secuencia de proteína G1 del antígeno recombinante. Se atemperaron, se ligaron y se clonaron estos fragmentos en un vector de subclonación, y la secuencia de nucleótidos correcta se confirmó mediante secuenciación del ADN. Se escindió la región de interés mediante un tratamiento con endonucleasas de restricción y se clonó junto con el fragmento promotor ADH2/GAPDH en pBS24.1. El plásmido pBS24.1 es un vector de expresión de un alto número de copias que se ha usado ampliamente para expresar una gran variedad de proteínas recombinantes (Pichuantes et al., J. Biol. Chem. (1990) 23:13890-13898; Pichuantes et al., "Expression of heterologous gene products in yeast". En: Cleland JL, Craik C, editors. "Protein engineering: a guide to design and production", (1996) Nueva York, NY, Wiley-Liss, Inc., pp 129-161). Contiene 2 \mu y secuencias de repeticiones invertidas (RI) para la replicación autónoma, el terminador del factor \alpha para garantizar la terminación de la transcripción y el Ieu2-d y URA3 para la selección. El gen de la \beta-lactamasa para la resistencia a la ampicilina y el origen de replicación de CoIE1 también están presentes en este vector para la selección y la replicación autónoma en Escherichia coli.
Para los constructos de fusión con la SOD, se clonó la región de interés en un vector pBS24.1 diseñado genéticamente que ya contenía el promotor ADH2/GAPDH junto con el gen de la SOD humana. En Hallewell et al., Bio/Technology (1987) 5:363-366, se describen la secuencia de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos de la SOD humana usadas en la clonación de los antígenos recombinantes de hantavirus. Los plásmidos resultantes se transformaron en la cepa AD3 de S. cerevisiae y se controló la expresión de las proteínas recombinantes mediante electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS y análisis de inmunotransferencia. Las diversas fusiones de SOD/G1 producidas incluyen las secuencias de G1 mostradas en las Figuras 7-12 fusionadas con el terminal C de la secuencia de la SOD mostrada en la Figura 19. Las fusiones de SOD/G1 están representadas por las SEC ID N.º 42-47.
Para producir las fusiones con la SOD, se siguió el siguiente protocolo. Aunque esta descripción explique detalladamente la producción de la fusión de G1/SOD del SNV, el resto de las fusiones se produjeron de la misma manera. Como la expresión de las extensas partes de la G1 de longitud completa fue dificultada por la inestabilidad y la expresión variable, se usó una parte más pequeña (82 aa) de G1 del SNV (residuos 35-117 con relación a la metionina de inicio del aislado NM H10) en una fusión con la secuencia de la superóxido dismutasa (SOD) humana mostrada en la Figura 19. El fragmento de G1 pequeño se sintetizó mediante PCR desde pFCV-M-1275 (Yamada et al., J. Virol (1995) 69:1939-1943) usando cebadores que introdujeron un sitio de Ncol en el extremo 5' y un sitio de SalI y dos codones de terminación en el extremo 3'. Se usó el fragmento digerido por NcoI/SalI de 268 pb para reemplazar el inserto de 347 pb de pSOD/HIV2PR113 (Pichuantes et al., J. Biol. Chem. (1990) 265:13890-13898), creando el constructo pSOD/G1. Se ligó el fragmento de StuI/SalI de 603 pb de pSOD/G1 en el vector pSI1/PR179 (Pichuantes et al., Proteins Struct. Fund. Genet. (1989) 6:324-327) para proporcionar el promotor ADH2/GAPDH. Entonces se introdujo el casete de BamHI/SalI de 2.093 pb del constructo resultante en el vector de expresión de levaduras pBS24.1 para crear el constructo de expresión final pSOD/SNV-G1. La proteína fue expresada como una fusión de SOD-G1 de 23 kD en la cepa AB 122 de Saccharomyces cerevisiae deficiente en proteasa (prbl 1132, pep 4-3) (Pichuantes et al., "Protein Engineering Principles and Practice" (1996), Capítulo 5, pp. 129-161, Cleland y Craik, eds. Wiley-Liss, Inc., Nueva York). La parte de 82 aa de la G1 expresada en este constructo abarca el epítopo inmunodominante y contiene alguna secuencia flanqueadora más. En la Figura 11B, se muestra la secuencia de la parte de G1 del SNV del antígeno.
TABLA 2 Antígenos G1 de hantavirus expresados en S. cerevisiae
4
Ejemplo 2 Clonación y expresión de proteínas N recombinantes de hantavirus
Los antígenos N de hantavirus mostrados en la Tabla 3 se prepararon como se explica a continuación. Se amplificaron por PCR los genes para las proteínas de la nucleocápside de los hantavirus PUUV, SEOV, SNV y ANDV usando ADN de plásmidos recombinantes de hantavirus como moldes. En la Tabla 3, se indican las partes de la secuencia de proteína N de hantavirus de las proteínas recombinantes. Se sintetizaron químicamente los genes de la nucleocápside del HTNV y DOBV. La clonación y la expresión se realizaron esencialmente según lo descrito anteriormente. Los diversos antígenos N producidos se muestran en las Figuras 13-18 y la secuencia de la SOD que estaba presente directamente contigua al terminal N de las fusiones de antígeno N/SOD se muestra en la Figura 19.
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TABLA 3 Antígenos N de hantavirus expresados en S. cerevisiae
5
Ejemplo 3 Purificación de proteínas recombinantes de hantavirus
Las proteínas de hantavirus, recombinantes producidas según lo descrito anteriormente, se purificaron lisando las células de S. cerevisiae transformadas en tampón de lisis (Tris 50 mM; NaCl 0,15M; EDTA 1 mM, pH 8) usando un aparato de Dino-Mill. Se lavó el lisado varias veces con urea 1-3M en tampón de lisis y se disolvió la proteína aumentando el pH hasta 11,5 y luego se sometió a cromatografía de filtración sobre gel. La purificación de las proteínas G del ANDV y G del DOBV recombinantes también incluyó la precipitación en sulfato de amonio y la disolución con PBS, SDS al 0,1%; EDTA 1 mM.
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Ejemplo 4 Purificación de anticuerpos policlonales usando las proteínas recombinantes de hantavirus
Los antígenos G1 fusionados con la SOD recombinantes purificados de HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV, y las proteínas N no fusionadas recombinantes de SEOV DOBV, SNV y ANDV (véanse las Tablas 2 y 3 anteriores) se usaron para producir anticuerpos policlonales de conejo. Se inmunizaron dos conejos y se produjeron 50 ml de anti-suero. Se analizaron entonces los anticuerpos policlonales contra las proteínas recombinante usando un análisis de transferencia Western sobre un gel de Tris-glicina al 4-20%. Se observó que los anticuerpos producidos contra cada uno de los seis antígenos G1 reaccionaron de forma cruzada con los antígenos G1 de los diferentes subtipos. De manera similar, se observó que los anticuerpos producidos contra cada una de las cuatro proteínas N reaccionaron de forma cruzada con los antígenos N de los diferentes subtipos.
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Ejemplo 5 Análisis de inmunotransferencia en tiras (SIA)
Se usan las antígenos G1 y los antígenos N recombinantes, con o sin la secuencia de la SOD, de los seis serotipos, según lo descrito anteriormente, en un SIA, tal como el análisis RIBA® (Chiron Corp., Emeryville, CA). La membrana consta de nitrocelulosa con un soporte de plástico inerte. Se aplican seis de los antígenos G1, uno de cada uno de los virus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV, y seis de los antígenos N, uno de cada uno de los virus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV, en bandas diferenciadas de tiras de nitrocelulosa a concentraciones de 75-150 ng/tira. Como controles internos, otras bandas contienen IgG humana purificada a un nivel bajo, nivel I (50-150 ng/tira) y a nivel alto, nivel II (250-350 ng/tira).
El procedimiento analítico se realiza según las instrucciones del fabricante. Todas las etapas se realizan a temperatura ambiente. Se numeran todas las tiras y luego se colocan en un tubo separado al que se añade una dilución 1:50 de suero humano en un tampón diluyente de muestras (solución salina tamponada con fosfato (PBS) con estabilizadores de proteínas bovinas y detergentes, azida de sodio al 0,1% y sulfato de gentamicina al 0,05% como conservantes). Se mecen lentamente los tubos durante 4 a 4,5 horas, se elimina la solución por aspiración y se añade 1 ml de diluyente recién preparado a cada tubo. Se mecen los tubos durante 30 minutos, se elimina la solución por aspiración y se añade 1 ml de tampón de lavado elaborado a partir de concentrado de tampón de lavado (x 50) (solución de detergente tamponado con fosfato con timerosal al 0,01% como conservante) a cada tubo. Se vacía el contenido de cada tubo en un solo recipiente de lavado y se lavan las tiras haciéndolas girar durante 20 segundos. Se decanta el tampón de lavado y se añaden 30 ml de tampón recién preparado, y se repite el procedimiento. Se elimina la solución residual por aspiración y se añaden 20 ml de solución de conjugado (IgG de cabra anti-humana marcada con peroxidasa (cadenas pesada y ligera), con estabilizadores de proteína bovina que contienen timerosal al 0,01% como conservante). Se hace girar el recipiente a 110 rpm durante 9-11 minutos, se decanta la solución de conjugado y se repite la etapa de lavado tres veces. Se vuelve a eliminar la solución residual por aspiración y se añaden 20 ml de sustrato/desarrollador (4-cloro-1-naftol en peróxido de hidrógeno tamponado con fosfato/metanol), seguidos por la rotación durante 15-20 minutos a 110 rpm. Se decanta la solución y se lavan las tiras dos veces en agua destilada. Se colocan las tiras desarrolladas boca arriba sobre papel absorbente y se dejan secar durante 30 minutos en la oscuridad.
Un suero se considera reactivo contra un antígeno dado sólo si la reactividad es mayor o igual a la banda control de IgG de nivel I, que se define como la que representa una reactividad 1+. Una reactividad equivalente a la banda control de IgG de nivel II se considera como la que representa una reactividad 3+. Una intensidad de reactividad intermedia entre las bandas control de IgG de nivel I y nivel II se considera como 2+ y una reactividad superior a la banda de nivel II se considera como 4+.
<110> Chiron Corporation
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<120> PROCEDIMIENTOS Y REACTIVOS PARA DIAGNOSTICAR
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<130> PP022009.0002 (2300-22009.40)
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\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/581.027
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<151> 18-06-2004
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<160> 53
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 3616
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<212> ADN
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<213> Virus Hantaan
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<400> 1
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7 
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8 
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9 
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<210> 2
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<211> 1135
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<212> PRT
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<213> Virus Hantaan
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<400> 2
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10 
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11 
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12 
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13 
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14 
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15 
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<210> 3
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<211> 3682
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<212> ADN
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<213> Virus Puumala
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<400> 3
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16 
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17 
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18 
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<210> 4
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<211> 1148
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<212> PRT
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<213> Virus Puumala
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<400> 4
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19 
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20 
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21 
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22 
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23 
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24 
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<210> 5
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<211> 3651
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<212> ADN
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<213> Virus Seoul
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<400> 5
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25 
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26 
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27 
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<210> 6
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<211> 1133
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<212> PRT
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<213> Virus Seoul
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<400> 6
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28 
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29 
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30 
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31 
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32 
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33 
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<210> 7
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<211> 3644
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<212> ADN
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<213> Virus Dobrava
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<400> 7
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34 
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35 
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36 
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<210> 8
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<211> 1134
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<212> PRT
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<213> Virus Dobrava
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<400> 8
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37 
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42 
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<210> 9
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<211> 3696
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<212> ADN
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<213> Hantavirus Sin Nombre
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<400> 9
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43 
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44 
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45 
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<210> 10
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<211> 1140
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<212> PRT
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<213> Hantavirus Sin Nombre
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<400> 10
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46 
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47 
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48 
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49 
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50 
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51 
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<210> 11
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<211> 3671
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<212> ADN
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<213> Virus Andes
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<400> 11
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52 
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53 
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54 
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<210> 12
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<211> 1138
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<212> PRT
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<213> Virus Andes
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<400> 12
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55 
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56 
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57 
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58 
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59 
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60 
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<210> 13
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<211> 249
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Hantaan
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm
61 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Hantaan
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
62 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Puumala
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
63 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Puumala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
64 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Seoul
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\hskip1cm
65 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Seoul
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
66 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Dobrava
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
67 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Dobrava
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
68 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hantavirus Sin Nombre
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\hskip1cm
69 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hantavirus Sin Nombre
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
70 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 258
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Andes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\hskip1cm
71 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Andes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
72 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Hantaan
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\hskip1cm
73 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Hantaan
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
75 
\hskip1cm
76 
\hskip1cm
77 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1305
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Puumala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\hskip1cm
78 
\hskip1cm
780 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 433
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Puumala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
79 
\hskip1cm
80 
\hskip1cm
81 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Seoul
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\hskip1cm
82 
\hskip1cm
820 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Seoul
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\hskip1cm
83 
\hskip1cm
84 
\hskip1cm
85 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Dobrava
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\hskip1cm
86 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 429
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Dobrava
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\hskip1cm
87 
\hskip1cm
88 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hantavirus Sin Nombre
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\hskip1cm
89 
\hskip1cm
890 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 428
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Hantavirus Sin Nombre
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\hskip1cm
90 
\hskip1cm
91 
\hskip1cm
92 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1290
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Andes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\hskip1cm
93 
\hskip1cm
930 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 428
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Virus Andes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\hskip1cm
94 
\hskip1cm
95 
\hskip1cm
96 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 489
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la superóxido dismutasa (SOD) humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
97 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 163
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de la superóxido dismutasa (SOD) humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\hskip1cm
98 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de proteína N
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
99 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de proteína G1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
100 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Terminal C de la secuencia SOD
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\hskip1cm
101 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G1 de SOD/HTNV
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\hskip1cm
102 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G1 de SOD/PUUV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\hskip1cm
104 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G1 de SOD/SEOV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\hskip1cm
106 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G1 de SOD/DOBV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\hskip1cm
108 
\hskip1cm
109 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G1 de SOD/SNV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\hskip1cm
110 
\hskip1cm
111 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> G1 de SOD/ANDV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\hskip1cm
112 
\hskip1cm
113 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N de SOD/HTNV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\hskip1cm
114 
\hskip1cm
115 
\hskip1cm
116 
\hskip1cm
117 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 596
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N de SOD/PUUV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\hskip1cm
118 
\hskip1cm
119 
\hskip1cm
120 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N de SOD/SEOV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\hskip1cm
121 
\hskip1cm
122 
\hskip1cm
123 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 592
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N de SOD/DOBV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\hskip1cm
124 
\hskip1cm
125 
\hskip1cm
126 
\hskip1cm
127 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N de SOD/SNV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
128 
\hskip1cm
129 
\hskip1cm
130 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> N de SOD/ANDV
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\hskip1cm
131 
\hskip1cm
132 
\hskip1cm
133 
\hskip1cm
134

Claims (39)

1. Un procedimiento para detectar anticuerpos contra hantavirus en una muestra biológica que comprende:
(a)
poner en contacto dicha muestra biológica con al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus, en el que los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que hay presente al menos un antígeno recombinante de cada uno de los serotipos, siendo la puesta en contacto realizada en condiciones que permiten que los anticuerpos contra los hantavirus, cuando están presentes en la muestra biológica, se unan con al menos uno de dichos antígenos G1 o N para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y
(b)
detectar la presencia o la ausencia de dicho complejo de anticuerpo/antígeno, detectando así la presencia o la ausencia de anticuerpos contra hantavirus en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40.
3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 14, SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 22, SEC ID N.º 24, SEC ID N.º 42, SEC ID N.º 43, SEC ID N.º 44, SEC ID N.º 45, SEC ID N.º 46 y SEC ID N.º 47.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho(s) antígeno(s) N comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 39.
5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho(s) antígeno(s) N son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 26, SEC ID N.º 28, SEC ID N.º 30, SEC ID N.º 32, SEC ID N.º 34, SEC ID N.º 36, SEC ID N.º 48, SEC ID N.º 49, SEC ID N.º 50, SEC ID N.º 51, SEC ID N.º 52 y SEC ID N.º 53.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40 y dicho(s) antígeno(s) N comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 39.
7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 14, SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 22, SEC ID N.º 24, SEC ID N.º 42, SEC ID N.º 43, SEC ID N.º 44, SEC ID N.º 45, SEC ID N.º 46 y SEC ID N.º 47, y dicho(s) antígeno(s) N son uno o más antígenos que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 26, SEC ID N.º 28, SEC ID N.º 30, SEC ID N.º 32, SEC ID N.º 34, SEC ID N.º 36, SEC ID N.º 48, SEC ID N.º 49, SEC ID N.º 50, SEC ID N.º 51, SEC ID N.º 52 y SEC ID N.º 53.
8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que está presente al menos un antígeno G1 de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV, y está presente al menos un antígeno N de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 4 ó 5, en el que está presente al menos un antígeno N de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV.
10. Un equipo de análisis de inmunodiagnóstico para detectar la infección por hantavirus, equipo de análisis que comprende:
(a)
al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus, en el que los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que está presente al menos un antígeno de cada uno de los serotipos;
(b)
e instrucciones para realizar el análisis de inmunodiagnóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
11. El equipo de análisis de inmunodiagnóstico de la reivindicación 10, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º 40.
12. El equipo de análisis de inmunodiagnóstico de la reivindicación 11, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 14, SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 22, SEC ID N.º 24, SEC ID N.º 42, SEC ID N.º 43, SEC ID N.º 44, SEC ID N.º 45, SEC ID N.º 46 y SEC ID N.º 47.
13. El equipo de análisis de inmunodiagnóstico de la reivindicación 10, en el que dicho(s) antígeno(s) N comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º 39.
14. El equipo de análisis de inmunodiagnóstico de la reivindicación 13, en el que dicho(s) antígeno(s) N son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 26, SEC ID N.º 28, SEC ID N.º 30, SEC ID N.º 32, SEC ID N.º 34, SEC ID N.º 36, SEC ID N.º 48, SEC ID N.º 49, SEC ID N.º 50, SEC ID N.º 51, SEC ID N.º 52 y SEC ID N.º 53.
15. El equipo de análisis de inmunodiagnóstico de la reivindicación 10, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40 y dicho(s) antígeno(s) N comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 39.
16. El equipo de análisis de inmunodiagnóstico de la reivindicación 15, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 14, SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 22, SEC ID N.º 24, SEC ID N.º 42, SEC ID N.º 43, SEC ID N.º 44, SEC ID N.º 45, SEC ID N.º 46 y SEC ID N.º 47, y dicho(s) antígeno(s) N son uno o más antígenos que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 26, SEC ID N.º 28, SEC ID N.º 30, SEC ID N.º 32, SEC ID N.º 34, SEC ID N.º 36, SEC ID N.º 48, SEC ID N.º 49, SEC ID N.º 50, SEC ID N.º 51, SEC ID N.º 52 y SEC ID N.º 53.
17. El equipo de análisis de inmunodiagnóstico de una cualquiera de las reivindicaciones 10-16, en el que está presente al menos un antígeno G1 de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV, y está presente al menos un antígeno N de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV.
18. El equipo de análisis de inmunodiagnóstico de una cualquiera de las reivindicaciones 10, 13 ó 14, en el que está presente al menos un antígeno N de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV.
19. Un procedimiento para detectar antígenos de hantavirus en una muestra biológica que comprende:
(a)
poner en contacto dicha muestra biológica con al menos seis anticuerpos diferentes, en el que cada uno de dichos anticuerpos es específico de al menos uno de los seis antígenos de hantavirus, en el que los seis antígenos de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que está presente al menos un anticuerpo específico de al menos un antígeno de cada uno de los serotipos, siendo la puesta en contacto realizada en condiciones que permiten que los antígenos de hantavirus, cuando están presentes en la muestra biológica, se unan con dichos anticuerpos para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y
(b)
detectar la presencia o la ausencia de dicho complejo de anticuerpo/antígeno, detectando así la presencia o la ausencia de antígenos de hantavirus en dicha muestra.
\vskip1.000000\baselineskip
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en el que dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
21. Un equipo de análisis de inmunodiagnóstico para detectar la infección por hantavirus, equipo de análisis que comprende:
(a)
al menos seis anticuerpos diferentes, en el que cada uno de dichos anticuerpos es específico de al menos uno de los seis antígenos de hantavirus, en el que los seis antígenos de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que está presente al menos un anticuerpo específico de al menos un antígeno de cada uno de los serotipos; y
(b)
instrucciones para realizar el análisis de inmunodiagnóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
22. El equipo de análisis de inmunodiagnóstico de la reivindicación 21, en el que dichos anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
23. Un soporte sólido que comprende al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus, en el que los al menos seis antígenos recombinantes de hantavirus comprenden una combinación de antígenos G1 y/o N de los serotipos de hantavirus Hantaan (HTNV), Puumala (PUUV), Seoul (SEOV), Dobrava (DOBV), Sin Nombre (SNV) y Andes (ANDV), en el que está presente al menos un antígeno de cada uno de los serotipos.
24. El soporte sólido de la reivindicación 23, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40.
25. El soporte sólido de la reivindicación 24, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 14, SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 22, SEC ID N.º 24, SEC ID N.º 42, SEC ID N.º 43, SEC ID N.º 44, SEC ID N.º 45, SEC ID N.º 46 y SEC ID N.º 47.
26. El soporte sólido de la reivindicación 23, en el que dicho(s) antígeno(s) N comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 39.
27. El soporte sólido de la reivindicación 26, en el que dicho(s) antígeno(s) N son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 26, SEC ID N.º 28, SEC ID N.º 30, SEC ID N.º 32, SEC ID N.º 34, SEC ID N.º 36, SEC ID N.º 48, SEC ID N.º 49, SEC ID N.º 50, SEC ID N.º 51, SEC ID N.º 52 y SEC ID N.º 53.
28. El soporte sólido de la reivindicación 23, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40 y dicho(s) antígeno(s) N comprenden una secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 39.
29. El soporte sólido de la reivindicación 28, en el que dicho(s) antígeno(s) G1 son uno o más antígenos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 14, SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18, SEC ID N.º 20, SEC ID N.º 22, SEC ID N.º 24, SEC ID N.º 42, SEC ID N.º 43, SEC ID N.º 44, SEC ID N.º 45, SEC ID N.º 46 y SEC ID N.º 47, y dicho(s) antígeno(s) N son uno o más antígenos que comprenden la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEC ID N.º 26, SEC ID N.º 28, SEC ID N.º 30, SEC ID N.º 32, SEC ID N.º 34, SEC ID N.º 36, SEC ID N.º 48, SEC ID N.º 49, SEC ID N.º 50, SEC ID N.º 51, SEC ID N.º 52 y SEC ID N.º 53.
30. El soporte sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 23-29, en el que está presente al menos un antígeno G1 de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV, y está presente al menos un antígeno N de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV.
31. El soporte sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 23, 26 ó 27 en el que está presente al menos un antígeno N de cada uno de los serotipos de hantavirus HTNV, PUUV, SEOV, DOBV, SNV y ANDV.
32. El soporte sólido de una cualquiera de las reivindicaciones 23-31, soporte sólido que es una tira de nitrocelulosa.
33. Un equipo de análisis de inmunodiagnóstico para detectar hantavirus, equipo de análisis que comprende:
(a)
un soporte sólido según una cualquiera de las reivindicaciones 23-32; y
(b)
instrucciones para realizar el análisis de inmunodiagnóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
34. Un procedimiento para detectar la presencia de anticuerpos contra hantavirus en una muestra biológica, procedimiento que comprende:
(a)
proporcionar una muestra biológica;
(b)
proporcionar un soporte sólido según una cualquiera de las reivindicaciones 23-32;
(c)
poner en contacto dicha muestra biológica con dicho soporte sólido, en condiciones que permiten a los anticuerpos contra hantavirus, si están presentes en la muestra biológica, unirse con al menos uno de los antígenos de hantavirus para formar un complejo de anticuerpo/antígeno; y
(d)
detectar la presencia del complejo de anticuerpo/antígeno, detectando así la presencia de los anticuerpos contra hantavirus en la muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
35. El procedimiento de la reivindicación 34 que comprende además:
(e)
eliminar los anticuerpos contra hantavirus sin unir;
(f)
proporcionar uno o más restos capaces de asociarse con dicho complejo de anticuerpo/antígeno; y
(g)
detectar la presencia de dicho uno o más restos,
detectando así la presencia de los anticuerpos contra hantavirus en la muestra biológica.
\vskip1.000000\baselineskip
36. El procedimiento de la reivindicación 35, en el que dichos uno o más restos comprenden un antígeno de hantavirus marcado detectablemente.
37. El procedimiento de la reivindicación 36, en el que el marcador detectable es una enzima.
38. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, 19, 20 y 34-37, en el que dicha muestra biológica procede de una muestra de sangre humana.
39. Un procedimiento para preparar un flujo sanguíneo que comprende sangre entera, plaquetas, plasma o suero, sustancialmente libre de hantavirus que comprende:
(a)
rastrear alícuotas de sangre entera, plaquetas, plasma o suero de las muestras sanguíneas recogidas mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, 19, 20 y 34-37;
(b)
eliminar cualquier muestra en la que se detecte un antígeno de hantavirus o un anticuerpo contra un hantavirus; y (c) combinar las muestras en las que no se detecte un antígeno de hantavirus ni un anticuerpo contra un hantavirus para proporcionar un flujo sanguíneo sustancialmente libre de hantavirus.
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