RU2590606C2 - Способ получения тест-системы "ханта-n" для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом - Google Patents
Способ получения тест-системы "ханта-n" для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом Download PDFInfo
- Publication number
- RU2590606C2 RU2590606C2 RU2012114474/10A RU2012114474A RU2590606C2 RU 2590606 C2 RU2590606 C2 RU 2590606C2 RU 2012114474/10 A RU2012114474/10 A RU 2012114474/10A RU 2012114474 A RU2012114474 A RU 2012114474A RU 2590606 C2 RU2590606 C2 RU 2590606C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dobrava
- hanta
- viruses
- hfrs
- puumala
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения иммуноферментной тест-системы для оценки содержания иммуноспецифических белков хантавирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Способ предусматривает получение моноклональных антител к вирусам Пуумала и Добрава с одинаковой чувствительностью, в соответствии с титром вируса, выявляющих антигены каждого из 4-х хантавирусов - возбудителей ГЛПС, и их последующую сорбцию на поверхность полистироловой панели. 3 табл., 2 пр.
Description
Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом - острое, вирусное заболевание зоонозной природы, характеризующееся системным поражением мелких кровеносных сосудов, геморрагическим диатезом и своеобразным поражением почек, высоким уровнем заболеваемости, тяжелым течением (нередко с летальным исходом) и стойкой потерей трудоспособности. Отсутствие специфических средств лечения и профилактики обусловливают высокую социальную и медицинскую значимость ГЛПС как в России, так и во многих странах мира. Случаи заболевания ГЛПС выявлены в 57 административных регионах Российской Федерации и составляют ежегодно 8-10 тысяч больных, при этом 98% заболеваемости регистрируется в Европейской части России.
Наиболее эффективным методом борьбы с ГЛПС является вакцинопрофилактика, что было продемонстрировано в Китае и Южной Корее. В настоящее время коммерческие вакцины против ГЛПС производятся только в Китае, однако ни одна из этих вакцин не может применяться в европейских регионах России, так как не обеспечивает защиты от вирусов Пуумала и Добрава - возбудителей ГЛПС в этих регионах.
Для изготовления и контроля вакцины против вирусов, возбудителей ГЛПС, необходимо решить проблему разработки эффективных методов контроля содержания специфических антигенов - индукторов иммунного ответа в вакцинных препаратах, в том числе на технологических этапах их производства. Одним из способов иммунохимического определения вирусных белков является метод иммуноферментного анализа. Для повышения специфичности и чувствительности анализа в качестве основы такого метода было решено использовать моноклональные антитела.
Целью предлагаемого изобретения является получение универсальной иммуноферментной тест-системы определения иммуногенных белков хантавирусов - возбудителей ГЛПС.
Процесс конструирования иммуноферментной тест-системы «XAHTA-N» включает:
получение очищенных моноклональных антител к хантавирусам Пуумала и Добрава, отбор антител, перекрестно-реагирующих с вирусами Пуумала, Добрава, Хантаан, Сеул, и приготовление конъюгата моноклональных антител с пероксидазой хрена (далее пероксидазный конъюгат), комплектация набора тест-системы.
Более подробно получение тест-системы осуществляют следующим образом.
I. Получение моноклональных антител. Мышей линии BALB/c иммунизируют очищенными препаратами инактивированных вирусов (Пуумала, штамм К-27/Уфа-85 и Добрава, штамм Аа 1854/Липецк-06) в дозе 100мкг/мышь. Иммунизацию проводят в подушечки задних лап дважды с двухнедельным интервалом. Клетки подколенных лимфоузлов иммунных мышей гибридизуют с клетками мышиной миеломы линии SP2/0 по стандартной методике, используя полиэтиленгликоль 4000. Гибридомные клетки, продуцирующие специфические антитела, подвергают 2-4-кратному клонированию методом предельных разведений. Клоны гибридомы с устойчивой продукцией антител нарабатывают в культуре в среде DMEM (HyClone) с добавлением 5% фетальной телячьей сыворотки. Для наработки антител гибридомные клетки вводят в перитонеальную полость мышей, через 7-14 дней регистрируют развитие асцитных опухолей.
Асцитные жидкости проверяют на содержание специфических антител методом иммуноферментного анализа. Для этого образцы, содержащие очищенные антигены хантавирусов в концентрации 100 нг/мл в фосфатносолевом буфере (ФСБ), вносят в лунки иммунопанели (Costar, 3018), с последующей инкубацией при 6±2°С - 18 часов. Далее в лунки вносят 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) (Sigma, 8159) и панели оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре (22±3°С). После отмывания панели (здесь и далее: 5 раз по 5 мин раствором 0,01 М ФСБ+0,05% Tween-20) в лунки вносят культуральную жидкость гибридомы. После 1 ч контакта при 37°С лунки отмывают и вносят меченные пероксидазой хрена IgG против иммуноглобулинов мыши (Sigma, A 4416). В качестве индикатора используют тетраметиленбензидин (ТМБ, Sigma, T8665). Антитела (IgG) выделяют из асцитных жидкостей аффинной хроматографией на колонке с HiTeap ProteinG (GE Healthcare, 17-0405-03). Очищенные моноклональные антитела стандартизуют по белку (до 1 мг/мл) и далее определяют их специфическую активность методом иммунофлюоресценции.
II. Отбор перекрестно-реагирующих антител проводят методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моновалентных культуральных антигенов хантавирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул. Антигены хантавирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул для метода иммунофлюоресценции получают путем заражения культуры клеток VеrоЕ6 с множественностью 0,1-0,5 ФОЕ/кл при объеме инокулята 15 мл на 1-литровую роллерную бутыль. Сбор клеток, содержащих вирусные антигены, проводят на 10-11 сутки инкубации зараженных клеток при 37±1°С. Клетки снимают со стекла смесью 0,02% версена и 0,5% трипсина, 5-кратно отмывают 0,85% раствором NaCl, готовят суспензию инфицированных клеток (450-550 тыс.кл/мл) и наносят ее по 0,005 мл на предметные стекла для иммунофлюоресценции. После высушивания стекла помещают на 30 минут в охлажденный ацетон для фиксации клеток и инактивации вируса и затем высушивают при комнатной температуре. Аналогично готовят контрольные антигены из незараженных клеток VеrоЕ6. Образцы мАТ титруют на 0,85% растворе NaCl и наносят на антигенные препараты. Для индикации мАТ, связавшихся с антигеном, используют антитела к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с флюоресцеинизотиоционатом. Опыт учитывают с помощью люминесцентного микроскопа под водно-иммерсионным объективом (×60 или ×65).
Отбирают клоны антител Пуумала и Добрава, в равной степени перекрестно реагирующие с антигенами вирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул. Нами использованы 2 клона антител, соответствующие этим характеристикам: моноклональные антитела к вирусу Пуумала - ПУУ/Н6 и к вирусу Добрава - ДОБ/А4.
Таблица 1 | ||||||
Характеристики моноклональных антител | ||||||
мАТ | Субизотип | АНТИГЕНЫ | ||||
ПУУ | ХАН | СЕУЛ | ДОБ | Vero-Е6 | ||
ПУУ/Н6 | IgG1 | 4096 | 4096 | 4096 | 4096 | <32 |
ДОБ/А4 | IgG2a | 1024 | 512 | 512 | 4096 | <32 |
III. Конъюгация моноклональных антител ДОБ/А4 с пероксидазой хрена. Растворяют 5 мг пероксидазы хрена с RZ 3,0 в 1 мл 0,3 М бикарбонатного раствора и после полного растворения пероксидазы добавляют 0,025 мл 0,32% раствора формальдегида (1:100). Осторожно перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 минут при температуре от 15 до 25°С, затем к смеси добавляют 1 мл 0,04 М раствора периодата натрия. По истечении 30 минут перемешивания цвет смеси (коричневый) приобретает зеленоватый оттенок. Добавляют 1 мл 0,16 М раствора этиленгликоля, перемешивают в течение 1 часа. Смесь диализуют против 1 л 0,01 М карбонатно-бикарбонатного буферного раствора (КББ) в течение 16-20 час при температуре (6±2)°С. Параллельно диализуют против 1 л КББ мАТ ДОБ/А4 (1,5 мл) в концентрации 10 мг/мл в тех же условиях. После диализа активированную пероксидазу переносят в тот же флакон, добавляют 1 мл мАТ ДОБ/А4, диализованных против КББ, смесь осторожно перемешивают при температуре 18-25°С в течение 2 часов. Добавляют 5 мг NaBH4 и оставляют на 2 часа при температуре (6±2)°С. Смесь диализуют против 1 л 0,01М ФСБ в течение 16-20 час при температуре 18-25°С. После диализа коньюгат извлекают из мешка и наносят на колонку (1,6×90 см) с сефадексом G-100, уравновешенную 1М ФСБ. Элюируют тем же буфером (скорость элюции свободная) при температуре (6±2)°С, собирая фракции по 3 мл. Окрашенные фракции фотометрируют при 280 нм и 403 нм. Определяют отношение оптической плотности (ОП) каждой фракции при 403 нм к 280 нм (показатель RZ - ОП 403/ОП 280) и отбирают 1-2 пиковые фракции с RZ 0,45-0,6 (оптимум - 0,5). Коньюгат разводят 1:10 в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина на 0,1 М ФСБ, для хранения в жидком виде разводят 1:2 в глицерине и разливают в зависимости от величины рабочего разведения в инсулиновые флаконы.
Определение специфических вирусных белков вирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул с помощью иммуноферментной системы «XAHTA-N». В лунки иммунопанели вносят мАТ ПУУ/Н6 в концентрации 1 мкг/мл в КББ. После контакта в течение 12-18 часов при температуре (6±2)°С или 3-х часов при 37°С в лунки вносят 3% БСА и панели оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывания панели (здесь и далее 5 раз по 5 мин раствором 0,01 М ФСБ+0,05% Tween-20) в лунки вносят исследуемые образцы. После 2-часового контакта при 37°С лунки отмывают и вносят пероксидазный конъюгат мАТ ДОБ/А4 и инкубируют панели 1 ч при 37°С. В качестве индикаторной системы используют тетраметиленбензидин (ТМБ) по инструкции производителя (Sigma, T8665). Положительной считают пробу, для которой отношение оптической плотности в лунке со специфическим иммуноглобулином превышает показатель оптической плотности с нормальным иммуноглобулином в 2,1 раза (индекс P/N).
Предлагаемый способ позволяет получить иммуноферментную тест-систему, обладающую следующими достоинствами:
1) универсальностью, проявляющейся в том, что ИФ тест-система «XAHTA-N» выявляет антигены всех 4-х хантавирусов - возбудителей ГЛПС, что позволяет унифицировать методы контроля специфической активности поливалентных вакцинных препаратов против ГЛПС;
2) с одинаковой чувствительностью (в соответствии с титром вируса) определяются антигены каждого из 4-х хантавирусов - возбудителей ГЛПС, что обеспечивается использованием моноклональных антител, полученных к 2-м филогенетически различным хантавирусам Пуумала и Добрава (для сенсибилизации панели и приготовления конъюгата) и отобранных по принципу перекрестного реагирования с вирусами Пуумала, Добрава, Хантаан, Сеул.
3) с одинаковой чувствительностью выявляются антигены как живого, так и инактивированного формалином вируса, что важно с точки зрения их применения для оценки специфической и протективной активности инактивированных вакцинных
препаратов на технологических этапах их производства.
Пример 1.
Для определения хантавирусных антигенов в образцах культуральной жидкости после
заражения вирусами Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул применяют тест-систему «XAHTA-N». В лунки иммунопанели вносят мАТ ПУУ/Н6 в концентрации 1 мкг/мл в КББ. После контакта в течение 12-18 часов при температуре (6±2)°С в лунки вносят 3% БСА и панели оставляют в течение 1 ч при комнатной температуре. Во вспомогательной панели готовят двукратные разведения исследуемых образцов на ФСБ. После отмывания панели (как описано выше) в лунки вносят исследуемые образцы. После 2-часового контакта при 37°С лунки отмывают, вносят пероксидазный конъюгат мАТ ДОБ/А4 и инкубируют панели 1 ч при 37°С. После отмывки в лунки панели вносится ТМБ и через 20 мин проводят учет опыта, определяя оптическую плотность в лунках панели с помощью спектрофотометра (при длине волны 450). За титр антигена принимают конечное разведение образца, для которого отношение оптической плотности в лунке со специфическим иммуноглобулином превышает показатель оптической плотности с нормальным иммуноглобулином в 2,1. С целью определения чувствительности метода приводятся данные по содержанию живого вируса в образцах. Для контроля специфичности тест-системы использована культуральная жидкость клеток VеrоЕ6, являющихся субстратом для размножения вируса. Результаты, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что антигены каждого из 4-х хантавирусов - возбудителей ГЛПС определяются с одинаковой чувствительностью, в соответствии с титром вируса.
Таблица 2. | |||
Определение хантавирусных антигенов в первичных и очищенных концентратах культуральной жидкости. | |||
материал | общий белок по Лоури в мкг/мл | титр вируса в lg ФОЕ/мл | титр антигена |
ПУУ-I* | 6800 | 6,6 | 8192 |
ПУУ-II** | 0,086 | 6,4 | 4096 |
ДОБ-I | 9400 | 7,2 | 8192 |
ДОБ-II | 0,056 | 6,8 | 4096 |
XTH-I | 10120 | 7,1 | 4096 |
ХТН-II | 0,072 | 6,6 | 2048 |
СЕУЛ-I | 9800 | 6,2 | 2048 |
СЕУЛ -II | 0,048 | 5,8 | 512 |
VeroE6-I | 12800 | 0,0 | <64 |
VeroE6-II | 0,101 | 0,0 | <8 |
Примечание. * - неочищенный концентрат культуральной жидкости; ** - очищенный гельфильтрацией концентрат культуральной жидкости.
Пример 2.
Проводят определение хантавирусных антигенов во фракциях культуральной жидкости после заражения вирусами Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул, очищенных в результате гельфильтрации, и в этих же образцах после инактивирования в них вируса 0,25% формалином при температуре 8±2°С в течение 20 суток. Тест-систему «XAHTA-N» используют, как описано в примере №1. Результаты этого опыта, представленные в таблице 2, показывают, что инактивирование вируса формалином (0,25%) не влияет на чувствительность и специфичность определения хантавирусных антигенов.
Claims (1)
- Способ получения иммуноферментной тест-системы «ХАНТА-N» для оценки содержания иммуноспецифических белков хантавирусов Пуумала, Добрава, Хантаан и Сеул в вакцинных препаратах против геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), отличающийся тем, что получают моноклональные антитела к вирусам Пуумала и Добрава с одинаковой чувствительностью, в соответствии с титром вируса, выявляющие антигены каждого из 4-х хантавирусов - возбудителей ГЛПС (Пуумала, Добрава, Хантаан, Сеул), сорбируют их на поверхность полистироловой панели, а также используют для приготовления конъюгата с пероксидазой хрена.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012114474/10A RU2590606C2 (ru) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | Способ получения тест-системы "ханта-n" для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2012114474/10A RU2590606C2 (ru) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | Способ получения тест-системы "ханта-n" для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012114474A RU2012114474A (ru) | 2013-10-20 |
RU2590606C2 true RU2590606C2 (ru) | 2016-07-10 |
Family
ID=49356958
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012114474/10A RU2590606C2 (ru) | 2012-04-12 | 2012-04-12 | Способ получения тест-системы "ханта-n" для определения специфической активности вакцины против геморрагической лихорадки с почечным синдромом |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2590606C2 (ru) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2159439C2 (ru) * | 1999-03-01 | 2000-11-20 | Батыршин Ринат Авхадиевич | Способ диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом |
RU2180754C2 (ru) * | 2000-04-10 | 2002-03-20 | Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН | Способ получения диагностикума хантавирусов |
WO2006088478A2 (en) * | 2004-06-18 | 2006-08-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Methods and reagents for diagnosing hantavirus infection |
-
2012
- 2012-04-12 RU RU2012114474/10A patent/RU2590606C2/ru active IP Right Revival
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2159439C2 (ru) * | 1999-03-01 | 2000-11-20 | Батыршин Ринат Авхадиевич | Способ диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом |
RU2180754C2 (ru) * | 2000-04-10 | 2002-03-20 | Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН | Способ получения диагностикума хантавирусов |
WO2006088478A2 (en) * | 2004-06-18 | 2006-08-24 | Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. | Methods and reagents for diagnosing hantavirus infection |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MEISEL H. ET AL., Development of novel immunoglobulin G (IgG), IgA, and IgM enzyme immunoassays based on recombinant Puumala and Dobrava hantavirus nucleocapsid proteins, Clin Vaccine Immunol., 2006, v.13, no.12, p. 1349-1357. ARAKI K. ET AL., Truncated Hantavirus Nucleocapsid Proteins for Serotyping Hantaan, Seoul, and Dobrava Hantavirus Infections, J Clin Microbiol., 2001, v.39, no. 7, p. 2397-2404;. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2012114474A (ru) | 2013-10-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN112079920A (zh) | 一种用于检测SARS-CoV-2病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
JP2021177184A (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエの免疫学的検出法およびキット | |
CN111925436B (zh) | 非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
US7316905B1 (en) | Method for measurement of hepatitis C virus | |
Sarkkinen et al. | Detection of influenza A virus by radioimmunoassay and enzyme‐immunoassay from nasopharyngeal specimens | |
CN109232736B (zh) | 特异性结合猪传染性胃肠炎病毒的单克隆抗体、药物组合物、试剂盒及其应用 | |
Raizman et al. | Detection of circulating antigen in acute experimental infections with Toxoplasma gondii | |
CN103627677A (zh) | 抗Lp(a)单克隆抗体及Lp(a)胶乳增强免疫比浊检测试剂盒 | |
US20180209974A1 (en) | Preparation method of crytococcus neoformans capsular polysaccharide gxm as well as gxm antigen immunoassay kit and application thereof | |
Barroso et al. | Expression, purification, and evaluation of recombinant LecA as a candidate for an amebic colitis vaccine | |
Wang et al. | A neutralizing monoclonal antibody-based competitive ELISA for classical swine fever C-strain post–vaccination monitoring | |
CN106771181A (zh) | 一种禽流感h7n9血凝素ha抗原检测 elisa 试剂盒及检测方法 | |
CN104569428B (zh) | 一种肠道病毒71型灭活疫苗抗原酶联免疫检测试剂盒 | |
Ran et al. | Development and validation of a competitive ELISA based on bacterium-original virus-like particles of serotype O foot-and-mouth disease virus for detecting serum antibodies | |
US6623921B2 (en) | Method for measurement of hepatitis C virus | |
CN109810948B (zh) | 抗非洲猪瘟病毒k205r蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体 | |
CN112876559A (zh) | 一种特异性结合猪轮状病毒的单克隆抗体及其应用 | |
CN109959788B (zh) | 一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的包被抗原和酶标抗体及阻断法试剂盒 | |
Toaleb et al. | A simple and efficient purification method of native immunoreactive antigen for diagnosis of camel hydatidosis | |
WO2018095254A1 (zh) | 一株能分泌识别亚甲基蓝的单克隆抗体的单克隆细胞株c4及其应用 | |
Sheoran et al. | Monoclonal antibodies against Enterocytozoon bieneusi of human origin | |
CN105542000B (zh) | 一种单克隆抗体及其应用 | |
CN105296435B (zh) | 杂交瘤细胞株及其分泌的抗口蹄疫o型(o/gx/09-7)病毒的特异性单克隆抗体与应用 | |
CN115947835B (zh) | 靶向乙型流感病毒核蛋白的抗体及其应用 | |
CN107557344A (zh) | 一株表达猪瘟病毒e2蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系csfv‑3h3g6及抗体与试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20190301 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20190413 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20210601 |
|
PD4A | Correction of name of patent owner |