CN112876559A - 一种特异性结合猪轮状病毒的单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种特异性结合猪轮状病毒的单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了特异性结合猪轮状病毒的鼠单克隆抗体的可变区序列、其制备的抗体或抗体片段，该抗体的应用以及用该抗体制备的试剂盒和药物组合物。本发明的抗体可用于间接免疫荧光以及免疫组化等；本发明的试剂盒能有效检测猪轮状病毒，灵敏度高，检测快速；本发明的药物组合物能有效预防和治疗猪轮状病毒感染。
Description
技术领域
本发明涉及一对猪轮状病毒单克隆抗体，以及使用该单克隆抗体制备的药物组合物、试剂盒及其应用，本发明属于生物医药领域。
背景技术
猪轮状病毒病(Porcine rotavirus disease)是由猪轮状病毒(Porcinerotavirus,PRoV)引起的猪急性肠道传染病，主要症状为厌食、呕吐、下痢。哺乳仔猪发病率高，发病率一般为50％～80％，病死率一般为10％以内。猪轮状病毒是一种人畜均可感染的病毒，在猪群中感染率极高，感染后导致猪特别是仔猪的免疫力急剧下降，从而诱发多种病原的混合感染，导致仔猪死亡率上升或生长迟缓。猪轮状病毒被分为A、B、C、E共4个亚群，各个亚群的基因组进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后，会产生特异的电泳移行图。流行病学研究显示A群的流行率较高，占总发病率的80％以上，B群和C群占总发病率各为10％，E群流行率较低。
猪轮状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒均为引起猪腹泻的重要病原，临床上很难区分这三种病原的感染。各种年龄段的猪均易感猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒，哺乳仔猪、架子猪或育肥猪的发病率可达100％、尤其对哺乳仔猪的危害最为严重。
目前，检测猪轮状病毒的方法包括病毒分离鉴定、血清检查及PCR方法，但分离鉴定、血清检查耗时过长，PCR方法虽然灵敏但需昂贵的仪器和专业的操作人员。虽有市售的猪轮状病毒胶体金检测试纸条，但其仅能检出A群轮状病毒而不能检出其他群的轮状病毒，检测复杂的临床样品会产生较高的背景导致不易观察，敏感性和特异性均欠佳。因而，现有技术中亟需研制一种简单、快速、准确检测猪轮状病毒的产品。
发明内容
为了解决现有技术的缺点和不足，本发明提供了一对猪轮状病毒单克隆抗体，以及含单克隆抗体的试剂盒、药物组合物及其应用。
本发明涉及一种特异性结合猪轮状病毒的鼠单克隆抗体8C3D6的可变区序列，其中，所述单克隆抗体8C3D6重链可变区为SEQ ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体8C3D6轻链可变区为SEQ ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明涉及一种特异性结合猪轮状病毒的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段的重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪轮状病毒的能力。
作为本发明的一种优选实施方式，所述抗体为单克隆抗体8C3D6。
所述单克隆抗体8C3D6重链可变区为SEQ.ID No.1或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.ID No.2或其简并序列编码；所述单克隆抗体8C3D6对不同群猪轮状病毒的IFA效价均为1∶25600，中和效价均不低于1∶128，相对亲和力常数为0.55μg/ml，表明对不同群猪轮状病毒均具有良好的反应性，且高中和活性可抑制猪轮状病毒重复感染靶细胞，还可用于高效价地免疫组化对不同组织的检测。
作为本发明的一种实施方式，所述单链抗体8C3D6重链可变区为SEQ.ID No.1或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.ID No.2或其简并序列编码。
所述单链抗体8C3D6对猪轮状病毒IFA效价为1∶25600、中和效价为1∶128，表明其与猪轮状病毒具有良好的反应特性。
本发明涉及一种特异性结合猪轮状病毒的鼠单克隆抗体6D4A8的可变区序列，其中，所述单克隆抗体6D4A8重链可变区为SEQ ID No.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体6D4A8轻链可变区为SEQ ID No.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
本发明涉及一种特异性结合猪轮状病毒的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪轮状病毒的能力。
作为本发明的一种优选实施方式，所述抗体为单克隆抗体6D4A8。
所述单克隆抗体6D4A8重链可变区为SEQ.ID No.3或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.ID No.4或其简并序列编码；对不同群猪轮状病毒的IFA效价为1∶25600，相对亲和力为0.48μg/ml，具有良好的反应性，还可用于用于免疫组化对不同组织的检测。
作为本发明的一种实施方式，所述单链抗体6D4A8重链可变区为SEQ.ID No.3或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.ID No.4或其简并序列编码。
所述单链抗体6D4A8对猪轮状病毒IFA效价为1∶12800，表明其与猪轮状病毒具有良好的反应特性。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞8C3D6株，所述杂交瘤细胞8C3D6株分泌所述的单克隆抗体8C3D6。
本发明还涉及一种杂交瘤细胞6D4A8株，所述杂交瘤细胞6D4A8株分泌所述的单克隆抗体6D4A8。
杂交瘤细胞8C3D6株、6D4A8株分别能有效分泌单克隆抗体8C3D6、6D4A8，分泌的单克隆抗体8C3D6、6D4A8纯度均高。
本发明还涉及一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含治疗有效量的所述抗体8C3D6或所述抗体的片段，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包括免疫量的所述单克隆抗体8C3D6，以及药学上可接受的载体。
作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物经肌肉注射或腹腔注射给药。
作为本发明的一种实施方式，所述药物组合物包括但不限于粉末剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂。
本发明涉及所述药物组合物在制备预防和/或治疗猪轮状病毒感染相关疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式，本发明提供了含有免疫量的所述单克隆抗体8C3D6的药物组合物在制备预防和/或治疗猪轮状病毒感染相关疾病的药物中的应用。
本发明还涉及本发明的抗体或抗体片段在制备预防和/或治疗猪轮状病毒感染相关疾病的药物中的应用。
含本发明猪轮状病毒单克隆抗体的药物组合物可解决现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪猪轮状病毒感染的问题。
本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体8C3D6、和有效量的所述单克隆抗体6D4A8，以及用于对猪轮状病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体6D4A8的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体6D4A8，所述硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体8C3D6，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗；其中，所述单克隆抗体6D4A8标记时含量为0.5-2μg/ml，所述单克隆抗体8C3D6固定含量为0.5-1.5mg/ml，所述羊抗鼠二抗或羊抗鼠多克隆抗体固定含量为1-3mg/ml。
作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的部件之间相互接触，而不相邻的部件之间不接触。
所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液。
作为本发明的一种实施方式，所述硝酸纤维素膜经封闭液封闭处理，所述封闭液为2％-3％W/V的牛血清白蛋白(BSA)。
作为本发明的一种实施方式，所述金标抗体标记时胶体金溶液的pH值调为8.0-8.5。
作为本发明的一种实施方式，所述金标垫上还含有金标抗体PEDV-McAB2、金标抗体3D2，所述硝酸纤维素膜上还有2条检测线，其上分别固定有固定抗体PEDV-McAB1、固定抗体4B4。
作为本发明的一种实施方式，所述金标抗体PEDV-McAB2标记时浓度为50-2000μg/ml，金标抗体3D2标记时浓度为0.5～2mg/ml；所述固定抗体PEDV-McAB1浓度为25-1000μg/ml，所述固定抗体4B4浓度为0.5～1.5mg/ml。
本发明还涉及一种用于制备所述胶体金检测试纸条的方法，包括步骤1)用胶体金将单克隆抗体6D4A8标记为金标抗体，制成金标垫，所述单克隆抗体6D4A8标记时的含量为0.5-2μg/ml；步骤2)固定单克隆抗体8C3D6、羊抗鼠二抗或多抗，使其分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线、质控线，其中所述单克隆抗体8C3D6稀释至0.5-1.5mg/ml，固定后作为检测线，所述羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗为1-3mg/ml，固定后作为质控线；步骤3)配制样品处理液，分装；以及步骤4)将所述步骤1)所制备的金标垫、所述步骤2)所制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在所述底板上，裁剪；连同所述步骤3)制备的样品处理液组装成试剂盒。优选地，所述步骤1)还包括用胶体金将抗体PEDV-McAB2标记为金标抗体、将抗体3D2标记为金标抗体，制成金标垫；相应地所述步骤2)还包括固定抗体PEDV-McAB1、抗体4B4，使其吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线；其中所述金标抗体PEDV-McAB2标记时浓度为50-2000μg/ml，金标抗体3D2标记时浓度为0.5～2mg/ml；所述固定抗体PEDV-McAB1浓度为25-1000μg/ml，所述固定抗体4B4浓度为0.5～1.5mg/ml。
本发明涉及所述抗体特别是单克隆抗体或者所述试剂盒在用于非诊断目的的猪轮状病毒检测中的应用。
含本发明猪轮状病毒单克隆抗体的试剂盒可用于非诊断目的的猪轮状病毒检测中的应用或者表位鉴定研究；本发明所述试剂盒能够在流行病学分析、对离体组织进行检测等非诊断目的方面应用。
本发明还涉及所述单克隆抗体8C3D6在鉴别检验含猪轮状病毒抗原和其他抗原的组合物中的应用；其中，所述其他抗原包括猪流行性腹泻病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；进一步优选地，所述其他抗原选自猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒抗原中的一种或两种。
本发明的有益效果：
(1)本发明的猪轮状病毒单克隆抗体可与不同群的猪轮状病毒呈现良好的反应性，特别地含本发明猪轮状病毒单克隆抗体的药物组合物能有效预防和治疗猪轮状病毒感染，可解决现有疫苗、母源抗体不足时所引发的仔猪猪轮状病毒感染的问题。
(2)本发明的试剂盒能有效检测猪轮状病毒，灵敏度高，检测快速。含本发明猪轮状病毒单克隆抗体的试纸条可灵敏地检测不同群的猪轮状病毒，弥补了现有产品不能检出A群以外的猪轮状病毒，以及检测复杂的临床样品会产生较高的背景导致不易观察、敏感性低的缺陷。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
术语“猪轮状病毒”(Porcine rota virus,PRoV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，为双股正链RNA病毒，易引起以厌食、呕吐、下痢为特征的猪轮状病毒病。
术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、人源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。
术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与猪流行性腹泻病毒特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。
术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。
术语“基因工程抗体”均能够通过基因工程的方法由适当的宿主细胞表达。本发明可使用多种表达宿主细胞，如原核宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌、芽孢杆菌属、链霉菌属等的菌株；真核宿主，包括但不限于曲霉属、酵母菌等的菌株，以及哺乳动物细胞、植物细胞等。本发明并不局限于具体的表达载体和表达宿主，只要其能够表达本发明所述的基因工程抗体，其保守性变异体。
术语“中和活性”是指中和抗体具有中和病毒的作用，其中“中和抗体”在本文以最广义使用，指的是抑制猪轮状病毒重复感染靶细胞的任何抗体，而不管实现中和的机制。因而，举例来说，可通过抑制病毒附着或粘附到细胞表面来实现中和，例如通过设计抗体，所述抗体直接结合到，或者接近于，负责病毒附着或粘附的位点，还可以通过定向到病毒体(Virion)表面的抗体来实现中和，其导致病毒体的聚集，可通过抑制病毒附着到靶细胞以后病毒和细胞膜融合，通过抑制胞吞作用(endocytosis)抑制感染的子代病毒等，进一步发生中和。本发明的中和抗体不受限于实现中和的机制。
术语“检测样品”包括但不限于动物或患者的排泄物、口鼻腔分泌物、动物细胞培养的完整病毒或裂解病毒液等。
术语“免疫量”当理解为“预防有效量”时是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述“预防有效量”随免疫接种的方式、时机、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的“预防有效量”。
术语“免疫量”当理解为“治疗有效量”时是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规程，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的“治疗有效量”。
术语“药学上可接受的载体”是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂。
术语“预防和/或治疗”在涉及猪轮状病毒感染时是指抑制猪轮状病毒的复制、抑制猪轮状病毒的传播或防止猪轮状病毒在其宿主体内定居，以及减轻猪轮状病毒感染的疾病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪轮状病毒单克隆抗体的制备、纯化及鉴定
1.1单克隆抗体的制备
培养猪轮状病毒OSU株(购自ATCC)，将收获的病毒液经5000转/分钟离心30分钟，取上清32000转/分钟离心2小时，将沉淀用PBS重悬；配制55％、65％、75％密度的蔗糖溶液，加入离心管中制成55％-75％的蔗糖浓度梯度，加入沉淀重悬液，4℃、32000转/分钟离心2小时，收获60％-70％浓度梯度之间的病毒液，纯化后经测定蛋白浓度为0.98mg/ml；将其与弗氏佐剂乳化，按终含量30μg/只每隔2周免疫小鼠，免疫3次后对小鼠采血并用间接免疫荧光(IFA)(将PRoV接种细胞至细胞出现30％的病变，用80％丙酮4℃固定30min，用pH7.4磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤3次，5min/次即可制成IFA抗原板)检测小鼠血清的IFA效价，小鼠血清IFA效价均为1:1600，IFA效价较低、达不到细胞融合的标准故无法进行细胞融合。
鉴于猪轮状病毒全病毒免疫小鼠后的IFA效价达不到融合标准，本研究考虑：增加核心蛋白的表达，进行单独免疫或与全病毒进行交叉免疫。从培养的病毒液中扩增出VP6基因，通过分子生物学手段进行杆状病毒表达，之后将其转入sf9细胞中表达VP6蛋白，纯化浓缩后蛋白浓度为0.72mg/ml。首先，选择表达的蛋白进行免疫，选择5只小鼠，首次免疫选择弗氏佐剂乳化的表达蛋白，间隔14天二次免疫和间隔28天三次免疫选择不完全弗氏佐剂乳化的VP6蛋白。三次免疫后14天对小鼠采血并用间接免疫荧光IFA检测小鼠血清的IFA效价。血清IFA效价均为1∶200～1∶400，较低，不选择进行融合。其次，选择5只小鼠，首次免疫选择弗氏佐剂乳化的全病毒抗原30μg，间隔14天二次免疫和间隔28天三次免疫选择不完全弗氏佐剂乳化的VP6蛋白。三次免疫后14天对小鼠采血并用间接免疫荧光IFA检测小鼠血清的IFA效价。3/5小鼠血清的IFA效价达到≤1∶12800，1/5小鼠血清的IFA效价为1∶25600，1/5小鼠血清的IFA效价达到1∶102400，选择小鼠血清IFA效价最高的小鼠冲击免疫全病毒抗原40μg，3天后进行细胞融合。用间接免疫荧光IFA对其进行有限稀释法亚克隆筛选，共获得6株阳性的单克隆杂交瘤细胞，检测细胞上清的IFA效价，4株(6D5E1、4A1E11、6E9A2、4H11C8)的IFA效价为1∶20～1∶40，2株(6D4A8、8C3D6)的IFA效价为1∶160。
1.1.2单克隆抗体的纯化和检测
将6株阳性杂交瘤细胞在小鼠体内制备单克隆抗体的腹水，在腹水中加入乙酸钠缓冲液调整pH值至4.5，在4℃下搅拌30分钟，期间缓慢加入辛酸；在4℃静置2小时，10000转/分钟、30分钟离心后，取上清；加入PBS，在4℃环境中，30分钟内加入硫酸铵溶液至终浓度为0.277g/ml，静止1小时；10000转/分钟、4℃离心30分钟，弃去上清，沉淀溶于起始腹水体积1/5的PBS中；用100倍体积的PBS 4℃透析过夜；在4℃离心去除不溶物，上清即为纯化的抗体。之后用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，用BCA蛋白定量试剂盒按照说明书分别进行定量分析浓度，并进行IFA效价检测。结果(见表1)：6株单抗纯化后的纯度均不低于90％，浓度均不低于2mg/ml。单克隆抗体6D4A8、8C3D6、6D5E1、4A1E11分别使用OSU株(A群)、HN03株(A群，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:V201653，参见中国专利CN108220248A)、LY01株(B群，见实施例2)和LY02株(C群，见实施例2)病毒测定IFA效价，均可达到1∶25600，表明这4株单克隆抗体与不同群的猪轮状病毒反应良好；而单克隆抗体6E9A2、4H11C8仅与OSU株、HN03株抗原反应，效价为1∶12800。
表1 6株单克隆抗体的效价和纯化后抗体浓度
1.1.3亲和力测定
用ELISA方法测定单克隆抗体6D4A8、8C3D6、6D5E1、4A1E11的相对亲和力。ELISA方法：用纯化的猪轮状病毒10μg/ml包被ELISA板，用1％BSA(牛血清白蛋白)封闭2小时后，用PBST(磷酸盐吐温缓冲液)洗涤1次；加入倍比稀释的单克隆抗体，置于37℃作用30分钟；用PBST洗涤3次后，加入酶标二抗1∶10000，置于37℃作用30分钟；洗涤后显示，测定OD450nm值。结果：单克隆抗体6D4A8、8C3D6、6D5E1、4A1E11的相对亲和力分别为0.48μg/ml、0.55μg/ml、0.85μg/ml、0.92μg/ml,表明：单克隆抗体6D4A8、8C3D6具有较强的结合病毒的能力。
1.1.4识别抗原表位鉴定
将实施例1.1中纯化的猪轮状病毒加入2×SDS(十二烷基硫酸钠)进行煮沸后，经SDS-PAGE电泳，转印至硝酸纤维素膜上，加入5％BSA封闭后，用PBST洗涤三次；将单抗进行1/500稀释后，置于室温震荡孵育1小时，PBST洗涤三次；加入1/2000稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，置于室温震荡孵育1小时，PBST洗涤三次；用DAB-双氧水显色。结果显示：单克隆抗体6D4A8、8C3D6与猪轮状病毒液45KD处有明显的反应条带，表明单克隆抗体6D4A8、8C3D6与猪轮状病毒的VP6蛋白具有良好的反应性。
将实施例1.1中的猪轮状病毒以包被浓度为10μg/ml包被酶标板，将纯化的单抗6D4A8进行1000倍稀释后，包被酶标板，100μl/孔，37℃作用1小时，PBST洗涤三次；将纯化的单抗8C3D6进行1000倍稀释后，加入以上酶标板，100μl/孔，37℃作用1小时，PBST洗涤三次；加入10000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗，室温震荡孵育1小时，PBST洗涤三次；用DAB-双氧水显色，加入2M浓硫酸进行终止。结果判定：AI＝(2×A1+2-(A1+A2))/(A1+2)×100％，A1为单抗6D4A8的OD492nm值，A2为单抗8C3D6的OD492nm值，A1+2为两株单抗叠加的OD492nm值，AI＞50％表明两株单抗针对不同的抗原表位，AI＜50％表明两株单抗针对相同的抗原表位。结果显示：两株单抗的AI＝69.3％即＞50％，表明两株单抗针识别不同的抗原表位。
综上所述，表明单抗6D4A8和8C3D6识别的是VP6蛋白上不同的抗原表位。
结合单克隆抗体纯化后的IFA效价、相对亲和力指数和单抗针对表位的差异性，选择单抗6D4A8和8C3D6进一步进行鉴定，以作为试纸条调试的原材料。
1.2单克隆抗体6D4A8、8C3D6的亚型及可变区序列测定
用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒对单克隆抗体6D4A8、8C3D6的亚型进行鉴定。结果：单克隆抗体6D4A8和8C3D6的重链亚型分别为IgG2b和IgG2a，轻链类型均为kappa。
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：P1：5’-ACTAGTTGACGTGGTCTCTAGGGTCACTTTAGTTTTCCT-3’P2：5’-CGGAAGCTTCCAGCGRCCARKCCATATACIGRTGG-3’
设计轻链可变区引物序列：
P3：5’-GCCATCTCATGRAGWCATTKWCYCAAGTCTTT-3’
P4：5’-CGGACGCTTACTGCCTGGTAAGAAGATGGA-3’
PCR反应程序为：98℃5分钟；95℃30秒，56℃30秒，72℃30秒，共35个循环；72℃10分钟。通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体6D4A8和8C3D6的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。测定单克隆抗体8C3D6的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2所示；单克隆抗体6D4A8的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。
1.3单克隆抗体6D4A8、8C3D6特异性的鉴定
将猪轮状病毒PRoV、猪流行性腹泻病毒PEDV、猪传染性胃肠炎病毒TGEV、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV、猪伪狂犬病病毒PRV及培养PRoV用MA-104细胞分别包被于反应板，用于测定单克隆抗体的特异性。结果：单克隆抗体6D4A8、8C3D6与PEDV、TGEV、PRRSV、PRV及MA-104细胞均无交叉反应，仅与PRoV反应呈阳性，表明单克隆抗体6D4A8、8C3D6均是猪轮状病毒的特异性单克隆抗体。
1.4单克隆抗体6D4A8、8C3D6中和活性的鉴定
2株单克隆抗体与500TCID50/0.1ml的不同来源的PRoV毒株(包括OSU株、HN03株、LY01株、LY02株)中和后接种于MA-104细胞、和PEDV毒株中和后接种于Vero细胞、和TGEV毒株中和后接种于ST细胞，置于37℃、5％CO2条件下培养3-5天，通过这一中和试验测定可知(见表2)：单克隆抗体8C3D6具有中和PoRV毒株的能力，且中和抗体效价≥1∶128，而单克隆抗体6D4A8的中和效价均<1∶2；单克隆抗体6D4A8、8C3D6与PEDV、PoRV的中和效价均<1∶2。表明单克隆抗体8C3D6良好的中和活性，6D4A8无中和活性；且2株单克隆抗体特异性良好。
表2单克隆抗体6D4A8、8C3D6对不同毒株的中和效价
1.5单克隆抗体鉴别联苗的应用
将哈尔滨维科生物技术开发公司生产的猪传染性胃肠炎、猪流性腹泻、猪轮转病毒(G5型)三联活疫苗用疫苗稀释液按照疫苗使用说明书稀释疫苗至105.0TCID50/ml。取等体积稀释后的疫苗分别与单克隆抗体8C3D6、抗PRoV高免血清(按照中国专利CN103709248A中高免血清的制备方法，制备抗PRoV高免血清，中和效价>1:128)、抗PEDV单克隆抗体8A3A10(参见中国专利：105461805A)、抗TGEV单克隆抗体4B4(参见中国专利：109232736A)以不同组合混匀后置于37℃中和作用1小时。取中和后的病毒液先稀释5倍，然后10倍倍比稀释后，接种铺有Vero细胞或ST细胞的96孔板测定毒价。统计中和后的细胞病变孔，计算毒价。结果见表3。
表3三联活疫苗经中和后PEDV和TGEV的毒价
结果显示：三联活疫苗用高免血清中和PRoV后，测定TGEV和PEDV毒价损失较多；而用单克隆抗体8C3D6中和PRoV后，测定TGEV和PEDV毒价，更接近于配苗的理论值。因此，单克隆抗体8C3D6可以用于多联活疫苗中病毒含量的测定。
1.6单克隆抗体在免疫组化中的应用
分别取OSU株、HN03株攻毒仔猪的肠组织切片，分别加入不同倍数稀释的单克隆抗体6D4A8、8C3D6作为一抗，阳性对照加入小鼠阳性血清，阴性对照用PBS孵育，置于湿盒中，4℃过夜孵育；次日取出，放置于37℃45分钟，用PBS缓冲液漂洗3次，5分钟/次；加入HRP标记的兔抗鼠二抗(1:200稀释)进行标记，置于37℃20分钟；置于PBS缓冲液中漂洗3次，5分钟/次，风干后滴加SABC，置于37℃20分钟；置于PBS缓冲液中漂洗3次，5分钟/次，使用DAB显色，于显微镜下控制显色时间；显色完后，用苏木素复染1-2分钟；清水冲洗切片，经梯度酒精脱水；使用二甲苯进行透明，使用中性树胶封片，显微镜下观察判断结果，阴性细胞不着色，阳性细胞呈现棕黄色(见表4)。表明：单克隆抗体8C3D6、6D4A8均可用于免疫组化检测，特别地单克隆抗体8C3D6稀释1∶400时还可满足检测需求。
表4单克隆抗体6D4A8、8C3D6对不同PRoV毒株的免疫组化检测结果
| 毒株名称 | 单克隆抗体6D4A8 | 单克隆抗体8C3D6 | 阳性对照 | 阴性对照 |
| OSU株 | 1∶20 | 1∶400 | + | - |
| HN03株 | 1∶80 | 1∶800 | + | - |
| 正常对照 | - | - | - | - |
注：“+”表示阳性；“-”表示阴性。
临床收集濒死仔猪的肛拭子或粪便病料，经检测为猪轮状病毒阳性，选取12头处死后取肠组织按上述免疫组化方法进行切片、包埋以进行临床检验，分别将高免血清(原倍)、单克隆抗体6D4A8(原倍)、单克隆抗体8C3D6(400倍稀释)作为一抗进行检验。结果：10份经PCR检测为阳性的病料，当高免血清(原倍)作为一抗时，用免疫组化方法检测，仅2份为阳性，符合率为17％(2/12)；当单克隆抗体6D4A8(原倍)作为一抗时用免疫组化方法检测，仅7份为阳性，符合率为58％(7/12)；当400倍稀释的单克隆抗体8C3D6作为一抗时用免疫组化方法检测，10份为阳性，符合率为83％(10/12)。表明：单克隆抗体8C3D6可在临床上用于免疫组化的检验。
1.7猪轮状病毒单链抗体的制备及鉴定
将实施例1.1中的单克隆抗体8C3D6、6D4A8的重链可变区、轻链可变区基因序列分别进行扩增，将重链可变区基因、轻链可变区基因通过连接肽连接，分别构建重组质粒8C3D6-ScFv、6D4A8-ScFv、8C3D6重+6D4A8轻-ScFv、6D4A8重+8C3D6轻-ScFv，将ScFv基因插入到pCDNA-3.1载体中，分别构建了pCDNA-8C3D6-ScFv、pCDNA-6D4A8-ScFv、pCDNA-8C3D6重+6D4A8轻-ScFv、pCDNA-6D4A8重+8C3D6轻-ScFv真核表达系统，将pCDNA-ScFv转染MDCK细胞进行表达。
用IFA方法对表达后的单链抗体进行鉴定。将单链抗体8C3D6、6D4A8分别稀释后加入PRoV抗原板进行IFA检测，结果：单链抗体8C3D6、6D4A8、8C3D6重+6D4A8轻、6D4A8重+8C3D6轻的IFA效价分别为1∶25600、1∶12800、1：25600、1：25600，均不低于1∶6400，表明与PRoV反应性良好。用中和试验测定单链抗体8C3D6、6D4A8、8C3D6重+6D4A8轻、6D4A8重+8C3D6轻的中和效价，结果：仅单链抗体8C3D6的中和效价为1∶128，其余中和效价均<1∶2。
以上结果显示SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4可用于猪轮状病毒基因工程抗体的制备。
实施例2试剂盒的制备及应用
2.1单克隆抗体的配对研究
将单克隆抗体8C3D6、6D4A8分别作为金标抗体、固定抗体制备胶体金检测试纸条。将PRoV OSU株、HN03株稀释到105.0TCID50/ml，检测PRoV OSU株、HN03株和RT-PCR鉴定的临床阴性粪便，结果见表5：使用金标抗体6D4A8、固定抗体8C3D6配对时检测PRoV OSU株、HN03株稀释液均为阳性、临床阴性粪便为弱阳性，为假阳性。故选择金标抗体6D4A8、固定抗体8C3D6为搭配方式进行试剂盒制备。
表5单克隆抗体的配对结果
| 固定抗体 | 金标抗体 | OSU株 | HN03株 | 临床阴性粪便 |
| 6D4A8 | 8C3D6 | + | + | + |
| 8C3D6 | 6D4A8 | + | + | - |
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性。
2.2 PRoV胶体金检测试纸条的制备
用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液，配制0.01％氯金酸溶液100ml，加热后迅速加入1.0ml的1％柠檬酸钠，继续加热煮沸5-8分钟，溶液颜色逐渐由深蓝色转为深红色，停止煮沸，自然冷却，用超纯水恢复至原体积，即得到胶体金溶液。将胶体金溶液用0.2mol/L的K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至8.0，匀速搅拌25分钟。用胶体金溶液标记1/15体积的单克隆抗体6D4A8(工作浓度为0.5-2μg/ml)，匀速搅拌25分钟，逐滴加入适量的10％BSA溶液，匀速搅拌30分钟，置于2-8℃2.5小时后，2-8℃2000rpm离心30分钟，弃去沉淀，上清用12000rpm离心30分钟，弃去上清，沉淀即为金标抗体6D4A8，用喷涂或浸泡使金标单克隆抗体6D4A8包被做成金标垫；将单克隆抗体8C3D6(包被浓度为0.5-1.5mg/ml)和羊抗鼠IgG(包被浓度为1-3mg/ml)喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线(T)和质控线(C)。将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴于底板上，即为猪轮状病毒胶体金检测试纸条(简称试纸条1)。样品处理管内含磷酸盐缓冲液制备的样品处理液。
2.3检测方法的建立
检测时，将待检样品(粪便、肛拭子、组织研磨液)置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-4滴混匀后的样品至试纸条加样孔中心；10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色即试验成立，则检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色即试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。
2.4试纸条制备关键参数的选择
2.4.1封闭液的选择
用1％、2％、3％、4％W/V的BSA作为封闭液，对硝酸纤维素膜进行封闭处理，结果如表6，最终确定使用终浓度为2％-3％W/V的BSA作为封闭液。
表6硝酸纤维素膜封闭液浓度的选择
| BSA浓度 | 层析时间 | 反应结束的背景色 |
| 1％ | 10分钟 | 紫红色 |
| 2％ | 10分钟 | 淡粉色 |
| 3％ | 10分钟 | 白色 |
| 4％ | 10分钟 | 过于白色 |
2.4.2金标抗体pH值的选择
取金标单克隆抗体6D4A8，用K2CO3溶液或盐酸溶液调整胶体金溶液至一系列pH值，用精密pH试纸条测定pH值。结果：pH值在8.5以上逐渐变蓝，pH值在9.5时变为蓝色，确定单克隆抗体与胶体金结合的最佳pH值为8.0-8.5。
2.4.3对照线抗体工作浓度的选择
通过摸索硝酸纤维素膜上固定抗体的包被浓度，检测PRoV、PEDV、TGEV、PPV、PRV、CSFV和阴性粪便，结果见表7。最终确定：对照线(即质控线)羊抗鼠多抗包被浓度为1-3mg/ml。
表7对照线多抗包被浓度确定
| 对照线包被浓度 | 对照线显示 |
| 0.5mg/ml | 对照线显色较弱 |
| 1mg/ml | 对照线显色强 |
| 3mg/ml | 对照线显色强 |
| 4mg/ml | 对照线显色较强 |
2.4.4单克隆抗体工作浓度的优化
将金标抗体6D4A8、固定抗体8C3D6按表7的工作浓度，将羊抗鼠IgG按1mg/ml进行包被，制备试纸条1A～1H。将PRoV OSU株、HN03株分别稀释到103.4TCID50/ml，用制备的试纸条1A～1H进行检测，结果(见表8)显示：金标抗体6D4A8(标记时工作浓度为0.5-2μg/ml)、固定抗体8C3D6(包被浓度为0.5-1.5mg/ml)结果良好，这一范围之外的检测结果为假阴性或背景较大，无法准确地进行离体动物病料的临床检测和流行病学调研。
表8试剂条1中单克隆抗体工作浓度
为便于描述，本发明将试纸条1B用于后续评价结果一一呈现。
2.5试纸条1的应用
按照检测方法检测不同病毒含量PRoV(OSU株)、TGEV(华毒株)、PEDV(CV777株)、CSFV(C株)、PPV(WH-1株)和PRV(Bartha株)病毒液以及阴性粪便样品，以及采集的20份临床样品(包括粪便、肛拭子、组织研磨液)，同时用RT-PCR方法进行确证，并用商品化韩国安捷猪轮状病毒胶体金试纸条检测。
RT-PCR方法参考田小艳等(田小艳等.3种致猪腹泻病毒的多重RT-PCR检测.动物医学进展，2009,30:54-57)进行，提取核酸后，进行反转录获得cDNA，按照商品化试剂盒配制PCR反应体系，PCR反应程序为：95℃5分钟；95℃40秒，51℃40秒，72℃50秒，共30个循环；72℃10分钟。该RT-PCR方法为检测3种腹泻病毒的多重RT-PCR方法，分别针对PEDV的N基因，TGEV的N基因和PRoV的VP6基因设计引物，一次检测即可得到3种病原的检测结果。
表9试纸条1、RT-PCR、安捷试纸条检测样品结果比对
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性。
结果(见表9)：试纸条1的灵敏度为103.1TCID50/ml，且不与PEDV、TGEV、PPV、CSFV、PRV等引起仔猪腹泻的病毒发生反应，不与阴性粪便发生非特异性反应，而安捷试纸条的灵敏度为104.9TCID50/ml，在检测临床样品时有非特异性反应。临床样品的检测结果表明试纸条1的检测结果和RT-PCR的符合率达到了90％，且未出现非特异性，而安捷试纸条与RT-PCR检测结果的符合率仅为80％，且有假阳性结果的出现。故试纸条1的敏感性和特异性均优于安捷试纸条。
进一步的，将临床样品9处理后，接种猪轮状病毒的敏感细胞系MA104细胞上，进行病毒分离，盲传至第二代即可观察到典型的细胞病变，感染病毒的细胞变圆，逐渐脱落。在细胞上传达至第五代，收获病毒液，病毒含量可达107.5TCID50/ml。将收获的病毒液按照实施例1.1中的猪轮状病毒纯化方法进行纯化后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可观测到典型的电泳移行图，RNA片段群集在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个区域的片段数分别为4∶2∶2∶3，为典型的B群轮状病毒电泳图。说明从临床样品9中分离得到的猪轮状病毒为B群猪轮状病毒，命名为LY01株。取试纸条1和安捷胶体金检测试纸条进行检测，其中试纸条1检测为阳性，而安捷胶体金检测试纸条检测为阴性。说明试纸条1至少可以检测A群和B群猪轮状病毒，而安捷胶体金检测试纸条不能检测B群猪轮状病毒。
进一步的，将临床样品19处理后按上述方法接种、繁毒，测定病毒含量可达108.0TCID50/ml。将收获的病毒液按照实施例1.1中的猪轮状病毒纯化方法进行纯化后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),可观测到典型的电泳移行图，RNA片段群集在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个区域的片段数分别为4∶3∶2∶2，为典型的C群轮状病毒电泳图。说明从临床样品19中分离得到的猪轮状病毒为C群猪轮状病毒，命名为LY02株。取试纸条1和安捷胶体金检测试纸条进行检测，其中试纸条1检测为阳性，而安捷胶体金检测试纸条检测为阴性。说明试纸条1可以检测A群、B群、C群猪轮状病毒，而安捷胶体金检测试纸条不能检测B群和C群猪轮状病毒。
2.6 PEDV-TGEV-PRoV胶体金检测试纸条的制备及应用
2.6.1制备
按实施例2.2制备胶体金溶液。结合专利CN105461805A胶体金检测试纸条使用到的PEDV-McAB1和PEDV-McAB2，专利CN109232736A胶体金检测试纸条使用到的TGEV-McAB1和4B4，制备胶体金溶液并分别标记PEDV-McAB2(标记时浓度为50-2000μg/ml)、3D2(标记时浓度为0.5～2mg/ml)和6D4A8，用喷涂或浸润使金标单克隆抗体PEDV-McAB2、3D2和6D4A8包被做成金标垫；将PEDV-McAB1(浓度为25-1000μg/ml)、4B4(浓度为0.5～1.5mg/ml)、单克隆抗体8C3D6和羊抗鼠IgG喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线(T1)、检测线(T2)、检测线(T3)和质控线(C)。将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫粘贴于底板上，即为PEDV-TGEV-PRoV胶体金检测试纸条。
样品处理管内含磷酸盐缓冲液制备的样品处理液。
组合形式一：金标垫包被PEDV-McAB2、TGEV-McAB2和6D4A8，硝酸纤维素膜上的三条检测线可按任意顺序包被单克隆抗体PEDV-McAB1、TGEV-McAB1、8C3D6，质控线为羊抗鼠IgG。作为试纸条2。
组合形式二：在同一个检测卡上有三个检测窗口，共用同一个加样孔，一个窗口以PEDV胶体金检测试纸条的形式进行组装，一个窗口以TGEV胶体金检测试纸条的形式进行组装，一个窗口以PRoV胶体金检测试纸条的形式进行组装。作为试纸条3。
2.6.2应用
按照实施例2.3中所述的检测方法检测实施例2.2.3所述部分样品，结果见表10。
表10胶体金检测试纸条、RT-PCR、安捷试纸条检测样品结果比对
注：“+”表示检测结果为阳性，“-”表示检测结果为阴性；P、T、R分别表示猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒；P1-P3代表病毒含量为105.0TCID50/ml、104.5TCID50/ml、104.0TCID50/ml的猪流行性腹泻病毒病毒液，T1-T3代表病毒含量为105.5TCID50/ml、105.0TCID50/ml、104.5TCID50/ml的猪传染性胃肠炎病毒病毒液；R1-R3代表病毒含量为104.9TCID50/ml、104.6TCID50/ml、103.1TCID50/ml的猪轮状病毒病毒液；S1-S4分别代表PPV(106.0TCID50/ml)、PRV(106.0TCID50/ml)、CSFV(106.0TCID50/ml)和阴性粪便；Y1-Y10表示临床样品1-10；安捷试纸条P、T、R分别表示安捷公司试纸条(即猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒胶体金检测试纸条)的检测结果。
由表10可知：试纸条2、试纸条3检测PEDV和PRoV的灵敏度均为104.5TCID50/ml，检测TGEV的灵敏度均为105.0TCID50/ml，且相互之间无交叉反应；不与PPV、CSFV、PRV等引起仔猪腹泻的病毒发生反应，不与阴性粪便发生非特异性反应；而安捷的试纸条在检测临床样品时有非特异性反应。临床样品的检测结果显示，试纸条2和3的检测结果和RT-PCR检测结果的符合率达到了100％，并且没有出现非特异性，而安捷纸条与RT-PCR检测结果的符合率为70％，且有假阳性结果的出现。故自制三联胶体金试纸条的敏感性和特异性均优于安捷的单个胶体金试纸条。
实施例3单克隆抗体8C3D6预防和/或治疗病毒感染的效果评价
3.1单克隆抗体8C3D6预防病毒感染效果评价
筛选PEDV、TGEV、PRoV抗原、抗体双阴性的2-3日龄仔猪15头，随机分为3组，第一组和第二组分别口服实施例1中制备的单克隆抗体8C3D6 2mL，第三组口服PBS缓冲液2mL，口服后24小时第一组和第三组均口服PRoV流行毒株HN03株小肠毒2mL(含1000个最小发病剂量)，第二组口服OSU株小肠毒(含1000个最小发病剂量)，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率及发病情况、死亡率及采用PCR方法检测肛拭子中的病毒监测排毒天数来评价单克隆抗体8C3D6的预防猪轮状病毒感染的效果，结果见表13。
表13服用单克隆抗体8C3D6后预防TGEV感染的试验结果
| 组别 | 发病率及发病情况 | 死亡率 | 排毒天数 |
| 第一组 | 2/5头猪出现轻微腹泻 | 1/5 | 第10天以后PCR检测阴性 |
| 第二组 | 1/5头猪出现轻微腹泻 | 0/5 | 第7天以后PCR检测阴性 |
| 第三组 | 5/5出现严重腹泻或呕吐、死亡 | 5/5 | 至第5天完全死亡，PCR检测均为阳性 |
3.2单克隆抗体8C3D6治疗病毒感染效果评价
筛选PEDV、TGEV、PRoV抗原、抗体双阴性的2-3日龄仔猪20头，随机分为4组，第一组和第二组分别口服PRoV流行毒株HN03株小肠毒2mL(含1000个最小发病剂量)，第三组和第四组口服OSU株小肠毒(含1000个最小发病剂量)，口服后12小时第一组和第三组分别口服实施例1制备的单克隆抗体8C3D6 2mL，第二组和第四组口服PBS，每日观察仔猪的临床症状，连续观察14天，通过临床发病率及发病程度、死亡率及采用PCR方法检测肛拭子中的病毒来监测排毒天数，从而评价单克隆抗体8C3D6治疗猪轮状病毒感染的效果，结果见表14。
表14 PRoV感染后12小时服用单克隆抗体8C3D6治疗的试验结果
结果表明，单克隆抗体8C3D6能够减轻由猪轮状病毒引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒天数，有很好的预防和/或治疗作用。
以上全面描述了本发明的优选实施例，但是可对它们进行各种替代和修改。因此，不应参照以上描述来决定本发明的范围，而是应参照所附权利要求书及其全部等同物来决定本发明的范围。任何特征，(不论是否为优选)均可与任何其他特征(不论是否为优选)相结合。本发明的权利要求书不应被理解为具有方法+功能的限制，除非在某一权利要求中通过术语“…的方法”明确地列举出此类限制。
SEQUENCE LISTING
<110> 洛阳普泰生物技术有限公司
<120> 一种特异性结合猪轮状病毒的单克隆抗体及其应用
<130> 19NAP0320C
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 354
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞
<400> 1
caggtgcagc tgaagcagtc aggacctggc ctagtgcagc cctcacagaa cctgtccatt 60
acctacacat tctctggttt cttattaagc tgctatgttg aatactggga gcgccattct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg atatggagtg gtgtttacac agactataat 180
gctgctttca tatccagatt gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttcttt 240
aaaatgaaca gtctgcaacc tgatgacaca gccatttact actgtacaag attggggaac 300
tacggtgcct ggtttgttta ctggggccaa gggactcttg tcactgtttc tgca 354
<210> 2
<211> 324
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞
<400> 2
gacatccagg aaactcagag tccagcctcc ctaggtgcaa gtgtgggaga aactgttacc 60
atcacatgtc gagcaagtga gaatatttac agttatttag catggtatca gcagaaacag 120
ggaaaaagtc cacagctcct ggtttataat gcaaaaattt tagcagaagg tgtgccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc aggcacacag tttagtctga agatcaacag cctgcagcct 240
gaagattttg ggagttatta ctgtcaacat aattttgata ctcctcccac gttcggaggg 300
gggaccaagc tggaaataaa acgg 324
<210> 3
<211> 342
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞
<400> 3
atgtgcagct ggtggagtcc tgggcgaggc ttagtgcatc ctcgagggtc ccgtaaactc 60
tcctgtgcag cctctcgatt cactttcagc agctttcgaa tgcactgggt tcgtcatgct 120
ccagaaaatg ggctggagtg ggtcgcatat attagtggtg gcagtagtac catcttctat 180
gcagacgcat tgaatggccg attcaccatc tccagagaca atcccaataa caccctgttc 240
ctgcaaatga ccagtctaag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagatggccc 300
tttgcttact ggggccacgg gactctggtc actgtctctg ca 342
<210> 4
<211> 339
<212> DNA
<213> 杂交瘤细胞
<400> 4
ggaattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcacgaga gagagtcact 60
atgagctgca gatccagtca gagtctgtta aacagtgaaa atcacagaaa ctacttgacc 120
tggttccagc agaaaccagg gcagcctcct agactgttga tctactgggc atccactagg 180
gattctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtcgatctc gaacagattt cactctcacc 240
atcagccgtg tgcagtctga aggactggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300
ccgctcacgt tcggtgctgg gaccagactg gagctggca 339
Claims (11)
1.一种特异性结合猪轮状病毒的鼠单克隆抗体8C3D6的可变区序列，其中，所述单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体的轻链可变区为SEQ ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
2.一种特异性结合猪轮状病毒的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段的重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；
优选地，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪轮状病毒的能力；
更优选地，所述抗体为单克隆抗体8C3D6或者单链抗体8C3D6。
3.一种特异性结合猪轮状病毒的鼠单克隆抗体6D4A8的可变区序列，其中，所述单克隆抗体的重链可变区为SEQ ID No.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体的轻链可变区为SEQ ID No.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。
4.一种特异性结合猪轮状病毒的抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段的重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码的氨基酸序列或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；
优选地，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪轮状病毒的能力；
更优选地，所述抗体为单克隆抗体6D4A8或者单链抗体6D4A8。
5.一种杂交瘤细胞8C3D6株，其特征在于，所述杂交瘤细胞8C3D6株分泌单克隆抗体8C3D6。
6.一种杂交瘤细胞6D4A8株，其特征在于，所述杂交瘤细胞6D4A8株分泌单克隆抗体6D4A8。
7.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含治疗有效量或者免疫量的所述抗体8C3D6或所述抗体的片段，以及药学上可接受的载体。
8.权利要求2或4所述的抗体或抗体片段或者权利要求7所述的药物组合物在制备预防和/或治疗猪轮状病毒感染相关疾病的药物中的应用。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体8C3D6、和有效量的所述单克隆抗体6D4A8，以及用于对猪轮状病毒进行抗原抗体反应进行检测的检测试剂；
优选地，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有滤纸、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜与金标垫接触或与样品垫、金标垫接触使得抗原与所述单克隆抗体6D4A8的结合体能在其上向所述底板第二端迁移；所述金标垫上含有胶体金标记的所述单克隆抗体6D4A8，所述硝酸纤维素膜上包括检测线和质控线，所述检测线上固定化有所述单克隆抗体8C3D6，所述质控线上固定化有羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗；其中，所述单克隆抗体6D4A8标记时的含量为0.5-2μg/ml，所述单克隆抗体8C3D6的固定含量为0.5-1.5mg/ml，所述羊抗鼠二抗或羊抗鼠多克隆抗体的固定含量为1-3mg/ml；
优选地，所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫相邻的部件之间相互接触，而不相邻的部件之间不接触；
优选地，所述硝酸纤维素膜经封闭液封闭处理，所述封闭液为2％-3％W/V的牛血清白蛋白；
优选地，所述金标抗体标记时胶体金溶液的pH值调节为8.0-8.5；
可选地，所述金标垫还含有金标抗体PEDV-McAB2、金标抗体3D2，所述硝酸纤维素膜上还有2条检测线，其上分别固定有固定抗体PEDV-McAB1、固定抗体4B4；其中，所述金标抗体PEDV-McAB2标记时浓度为50-2000μg/ml，金标抗体3D2标记时浓度为0.5～2mg/ml；所述固定抗体PEDV-McAB1浓度为25-1000μg/ml，所述固定抗体4B4浓度为0.5～1.5mg/ml。
10.权利要求2或4所述的抗体或权利要求9所述的试剂盒在用于非诊断目的的猪轮状病毒检测中的应用；
优选地，所述试剂盒用于非诊断目的的猪轮状病毒表位鉴定研究；所述试剂盒能够在流行病学分析、对离体组织进行检测等非诊断目的方面应用。
11.单克隆抗体8C3D6在鉴别、检验含猪轮状病毒抗原和其他抗原的组合物中的应用，其中，所述其他抗原为选自猪流行性腹泻病毒抗原、猪轮状病毒抗原、猪圆环病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病抗原、猪流感病毒抗原中的一种或多种；优选地，所述其他抗原选自猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒抗原中的一种或两种。
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