CN116643050B - 一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法 - Google Patents
一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116643050B CN116643050B CN202310406671.7A CN202310406671A CN116643050B CN 116643050 B CN116643050 B CN 116643050B CN 202310406671 A CN202310406671 A CN 202310406671A CN 116643050 B CN116643050 B CN 116643050B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant protein
- rotavirus
- detection method
- group
- fusion recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 241001137860 Rotavirus A Species 0.000 title claims abstract description 16
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 35
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 30
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 24
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 23
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims description 20
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 19
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 18
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims description 17
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 claims description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 10
- 241000520007 Porcine rubulavirus Species 0.000 abstract description 9
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 abstract description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 14
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 7
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000702665 Porcine rotavirus Species 0.000 description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 6
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 5
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 108700031314 Rotavirus VP6 Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 4
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000003022 colostrum Anatomy 0.000 description 3
- 235000021277 colostrum Nutrition 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 2
- 241001135549 Porcine epidemic diarrhea virus Species 0.000 description 2
- 241001135989 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus Species 0.000 description 2
- 206010067470 Rotavirus infection Diseases 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 101000608653 Homo sapiens UbiA prenyltransferase domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 229940124859 Rotavirus vaccine Drugs 0.000 description 1
- 201000004224 Schnyder corneal dystrophy Diseases 0.000 description 1
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 1
- 102100039547 UbiA prenyltransferase domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 230000002953 anti-rotaviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 1
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M sodium bicarbonate Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- WCTAGTRAWPDFQO-UHFFFAOYSA-K trisodium;hydrogen carbonate;carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OC([O-])=O.[O-]C([O-])=O WCTAGTRAWPDFQO-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/14—Reoviridae, e.g. rotavirus, bluetongue virus, Colorado tick fever virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法，属于畜牧检测技术领域。本发明的ELISA检测方法是以流行的PoRV变异毒株为亲本毒株，在体外成功的表达了重组的VP6融合重组蛋白，然后将VP6融合重组蛋白做为抗原包被至酶标板来建立一种新的ELISA检测方法。本发明所提供的方法具有敏感性强、特异性高、稳定性强、重复性好且易于制备的优点，该方法对PoRV的临床诊断及防控具有重要临床实践意义。
Description
技术领域
本发明属于畜牧检测技术领域，尤其涉及一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法。
背景技术
猪轮状病毒(porcine rotavirus，PoRV)属于呼肠孤病毒科，其中猪A群轮状病毒(RVAs)是导致哺乳仔猪严重脱水性腹泻的最重要肠道病原体之一。病毒基因组由11个双链RNA片段组成，编码6种结构蛋白(VP1-VP4、VP6、VP7)和6种非结构蛋白(NSP1-NSP6)。轮状病毒的外衣壳蛋白VP4和VP7可以独立产生中和抗体，根据这两种蛋白可将轮状病毒分为P型和G型。近年来，国内猪RVAs的流行更是越来越广泛，特别是新的G型和P型组合变异株不断出现。因此，有效的疫苗免疫及猪群免疫后抗体水平的检测是有效防控PoRV的关键问题之一，而尽快建立以新型变异毒株相关抗原蛋白为基础的新型检测方法就显得至关重要。
VP6是轮状病毒颗粒中的主要结构蛋白，靶向中衣壳层VP6蛋白的抗体在防止轮状病毒感染方面起着关键作用。同时，VP6具有高免疫原性和抗原性，目前国内猪轮状病毒VP6流行基因型为A群，因此基于A群重组VP6是诊断性检测PoRV抗体最理想的靶标，用以评估在猪群感染和疫苗接种背景下有助于预防轮状病毒疾病的能力。
另外大量研究结果表明，轮状病毒感染后，肠道和血清中存在的抗轮状病毒IgA抗体而非IgG抗体与产生的保护力高度相关，是保护猪免于轮状病毒疾病的最为相关的因素。仔猪主要通过母猪乳汁获得母源IgA抗体而获得猪轮状病毒的被动免疫保护，其中初乳中IgA抗体的黏膜免疫是仔猪获得PoRV免疫保护的最佳途径。IgA作为黏膜免疫系统的重要效应因子，其主要特性是多链性、黏膜亲和性以及对蛋白酶的抵抗性，这有助于抗体对病毒的亲和作用，并具有阻抑黏附，免疫排除和中和病毒等多种生物功能。猪轮状病毒疫苗免疫后母猪乳汁中的IgA抗体水平是评价疫苗免疫原性的一项重要指标。因此，建立一种安全、稳定、易于制备的IgA抗体检测方法对猪轮状病毒的防治具有重要临床实践意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于抗猪A群轮状病毒的VP6融合重组蛋白的IgA抗体ELISA检测方法，满足同时对血清和初乳样本检测，同时实现仔猪对PoRV免疫保护效果的检测。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
首先，本发明提供了一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括包被有VP6融合重组蛋白的酶标板，样本稀释液，洗涤液，底物显色液，终止液。
优选地，所述VP6融合重组蛋白的是以抗猪A群轮状病毒为模板合成的VP6融合重组蛋白。
优选地，所述VP6融合重组蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述VP6融合重组蛋白的包被浓度为3.5μg/mL。
优选地，所述VP6融合重组蛋白的包被时间为10-14h。
其次，本发明提供了一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测方法，所述方法包括如下步骤：
包被：用pH值为9.6的0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液将VP6融合重组蛋白稀释至3.5μg/mL，每孔加入100μL，4℃吸附14h；
包被完毕后，弃去孔中液体，每孔加入含0.05％ Tween-20的PBS洗涤液250μL，洗涤3次，最后一次拍干；
封闭：每孔加入含5％ BSA、0.05％ Tween-20的PBS封闭液200μL，37℃封闭1h；
封闭完成后，弃去孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤3次，最后一次拍干；
一抗孵育：按照1:100的比例使用样品稀释液稀释待检乳汁样品或按照1:200的比例使用样品稀释液稀释待检血清样品，每孔加入100μL，37℃反应60min；
弃去孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤5次，最后一次拍干；
二抗孵育：按照1:10000的比例用抗体稀释液稀释酶标二抗，每孔加入100μL，37℃反应60min；
弃去孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤5次，最后一次拍干；
显色读数：每孔加入100μL单组分TMB底物显色液，37℃避光反应15min，加入100μL/孔终止液，酶标仪读取OD 450nm值；
所述方法用于非疾病诊断目的。
优选地，所述VP6融合重组蛋白是以猪A群轮状病毒为模板合成的VP6融合重组蛋白。
优选地，所述VP6融合重组蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述待检乳汁样品的cut-off值为0.262；
当OD值≥0.262时，检测结果为阳性，当OD值<0.262时，检测结果为阴性。
优选地，所述待检血清样品的cut-off值为0.319；
当OD值≥0.319时，检测结果为阳性，当OD值<0.319时，检测结果为阴性。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的基于抗猪A群轮状病毒VP6融合重组蛋白的IgA抗体ELISA检测方法。本发明以流行的PoRV变异毒株为亲本毒株，在体外成功的表达了VP6重组蛋白为包被抗原，成功的建立了一种敏感性强、特异性高、稳定、重复性好且易于制备的PoRV特异性IgA抗体ELISA检测方法，基本满足同时对猪血清和猪初乳两种样品类型的检测，对PoRV的临床诊断及防控具有重要临床实践意义。
附图说明
图1为本发明构建的pColdII-VP6重组表达载体的酶切产物电泳图；
图2为VP6融合重组蛋白经镍柱亲和层析纯化的结果；
图3为本发明检测方法的特异性检测结果；
图4为本发明检测方法的敏感性检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
实施例1：pColdII-VP6重组表达载体的构建
(1)参照GenBank中CHN/SCCD/A/2017毒株VP6序列(SEQ ID NO.1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司对序列进行合成。
(2)将合成产物经酶切纯化后插入pColdII-VP6载体的BamH I/HindIII的多克隆位点中，经测序验证得到预期结果，构建得到重组表达载体pColdII-VP6。
从图1的酶切结果可以看出，目的基因被正确的插入到pColdII-VP6载体中。
实施例2：重组蛋白的表达与纯化
(1)将构建的重组质粒pColdII-VP6转化至BL21感受态细胞，获得重组表达菌株BL21-pColdII-VP6；
(2)在37℃、220r/min振荡培养2～3h直至OD 600nm值达到0.6～0.8时，向其中加入终浓度为0.1mmol/L IPTG并于16℃、220r/min振荡培养进行诱导表达；
(3)采用离心方法收集菌体并进行超声破碎裂解；
(4)将细胞裂解液经离心得到上清和沉淀，两者分别进行SDS-PAGE，分析该VP6重组蛋白的表达形式，收集含有目的蛋白的样品，参考Ni-NTA Superflow Cartridge手册进行镍柱亲和层析纯化pColdII-VP6重组蛋白，纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE。
从图2中，可以看出可溶性蛋白用镍柱亲和层析纯化得到纯度在95％以上的pColdII-VP6重组蛋白。
实施例3：抗原最佳包被浓度及二抗最佳工作浓度的确定
(1)采用方阵发测定抗原最佳包被浓度及二抗最佳工作浓度。用包被液将VP6融合重组蛋白依次稀释至7μg/mL、3.5μg/mL、1.75μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.156μg/mL6个浓度，每个浓度的VP6融合重组蛋白包被ELISA板的1个横排，100μL/孔；
(2)用抗体稀释液将HRP标记的山羊抗猪IgA抗体依次进行1:5000、1:10000、1:20000的比例稀释，每个稀释度加两竖列，100μL/孔，形成方阵；
(3)选择阳性乳汁OD 450nm值与阴性乳汁OD 450nm值的比值(P/N值)最大的抗原浓度和二抗稀释度作为最佳抗原包被浓度及最佳二抗工作浓度，结果见表1。
表1抗原最佳包被浓度及二抗最佳工作浓度的确定
由表1可知，VP6融合重组蛋白的浓度稀释至1.25～7μg/mL，酶标二抗稀释度在1:5000～20000的范围，均能实现较高的P/N值，其中VP6融合重组蛋白的浓度为3.5μg/mL，酶标二抗稀释度为1:10000时得到的P/N值最高，表明该剂量组合为最优组合。
实施例4：抗原最佳包被条件的确定
以实施例2中得到的最佳抗原包被浓度和最佳二抗工作浓度为试验条件。设置37℃孵育1h，37℃孵育2h和4℃孵育过夜(15～16h)三个试验组进行ELISA检测，计算P/N值(P/N值＝阳性样本OD 450nm平均值/阴性样本OD 450nm平均值)，选取P/N值最大的为最佳抗原包被条件。结果见表2。
表2抗原最佳包被条件的确定
由表2可知，在4℃过夜的包被条件与37摄氏度包被1～2h的方案在P/N值方面具有明显的优势，因此，以4℃过夜的包被方法包被VP6融合重组蛋白。
实施例5：最佳封闭条件的确定
以最佳抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板。设置37℃封闭1h，37℃封闭2h和4℃过夜三个试验组。分别测定各组的阴阳性乳汁OD 450nm值，并计算出P/N值，确定最佳封闭时间，结果见表3。
表3最佳封闭条件的确定
从表3可知，在37℃封闭1～2h的方案比4℃过夜的封闭条件与在P/N值方面具有明显的优势，本发明以37℃封闭1h的封闭方法处理酶标板。
实施例6：最佳乳汁稀释度和反应时间的确定
(1)以确定好的最优条件进行ELISA试验，将阴阳性乳汁分别进行1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释，100μL/孔。
(2)加入稀释好的乳汁后设置3个试验组，第一组37℃孵育30min，第二组37℃孵育45min，第三组37℃孵育60min。
(3)分别测定各组的阴阳性乳汁OD 450nm值，并计算出P/N值，确定最佳乳汁稀释度和反应时间，结果见表4。
表4乳汁稀释度及反应时间的优化
由表4可知，在乳汁稀释度为1:50～200的范围内，得到的P/N值有明显的优势，因此，本发明以稀释度为1:100，孵育时间1h的方法来检测乳汁样品。
实施例7：最佳血清稀释度和反应时间的确定
以确定好的最优条件进行ELISA试验，将阴阳性血清分别进行1:50、1:100、1:200、1:400倍稀释，100μL/孔。加入稀释好的血清后设置3个试验组，第一组37℃孵育30min，第二组37℃孵育45min，第三组37℃孵育60min。分别测定各组的阴阳性血清OD 450nm值，并计算出P/N值，确定最佳血清稀释度和反应时间，结果见表5。
表5血清稀释度及反应时间的优化
由表5可知，在血清稀释度为1:100～400的范围内，得到的P/N值有明显的优势，因此，本发明以稀释度为1:200，孵育时间1h的方法来检测血清样品。
实施例8：最佳二抗反应时间的确定
(1)以确定好的最优条件进行ELISA试验，加入酶标二抗后(100μL/孔)。设置三个试验组，第一组37℃孵育30min，第二组37℃孵育45min，第三组37℃孵育60min。；
(2)测定各组阴阳性乳汁的OD 450nm值，并计算出P/N值，以确定二抗最佳反应时间，结果见表6。
表6最佳二抗反应时间的确定
由表6可知，37℃反应60min的二抗孵育方案为最佳方案。
实施例9：最佳底物显色时间的确定
(1)以确定好的最优条件进行ELISA试验，加入TMB后(100μL/孔)设置三个试验组，第一组室温反应10min，第二组室温反应15min，第三组室温反应20min；
(2)显色完成后每孔加入100μL终止液终止显色，进行OD 450nm读值，并计算出P/N值，以确定最佳底物显色时间，结果见表7。
表7 TMB显色时间的确定
从表7可知，37℃15min的显色时间最佳。
实施例10：ELISA检测方法制备及使用方法
(1)包被：用0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3(pH值9.6)缓冲液将VP6融合重组蛋白稀释至3.5μg/mL，100μL/孔，4℃吸附14h。包被完毕后，弃去孔中液体，每孔加入含0.05％Tween-20的PBS洗涤液250μL，洗涤3次，最后一次拍干；
(2)封闭：每孔加入含5％BSA、0.05％Tween-20的PBS封闭液200μL，37℃封闭1h。封闭完成后，弃去孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤3次，最后一次拍干；
(3)一抗孵育：用样品稀释液稀释待检乳汁样品(1:100)或待检血清样品(1:200)，100μL/孔，37℃反应60min。弃去孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤5次，最后一次拍干；
(4)二抗孵育：用抗体稀释液稀释酶标二抗(1:10000)，100μL/孔，37℃反应60min，弃去孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤5次，最后一次拍干；
(5)显色读数：每孔加入100μL单组分TMB底物显色液，37℃避光反应15min，加入100μL/孔终止液。酶标仪读取OD 450nm值。
实施例11：临界值的确定
以实施例8制备的检测方法和检测方法对实验室保存的24份猪RV阴性乳汁、30份猪RV阴性血清进行ELISA检测，每份样品重复2次。测定每份样品的OD 450nm读值，计算S/P值。
检测24份已知阴性的乳汁的OD450nm的吸光值，其中，24份阴性乳汁的OD450nm的吸光值平均值为0.154，SD值为0.035，为保证有99％的置信区间，cut off值为平均值加3倍SD值，最终计算得到cut off值为0.262。
检测30份已知阴性的血清的OD450nm的吸光值，其中，30份阴性血清的OD450nm的吸光值平均值为0.271，SD值为0.015，为保证有99％的置信区间，cut off值为平均值加3倍SD值，最终计算得到cut off值为0.319。
实施例12：特异性试验
(1)按照优化的ELSIA方法，检测本实验室保存的猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病病毒、口蹄疫病毒(O型)标准阳性血清，同时设PRoV阴阳性血清对照，以判定本试验建立的PRoV间接ELISA检测方法是否与其它主要猪病毒性病原的抗体有交叉反应，结果如图3。
从图3可知，猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪蓝耳病病毒、口蹄疫病毒(O型)标准阳性血清S/P值均小于0.319，显示为PRoV阴性，说明本发明建立的基于抗猪A群轮状病毒VP6融合重组蛋白的IgA抗体ELISA检测方法具有良好的特异性。
实施例13：敏感性检测
将3份PRoV阳性乳汁从1:10开始进行稀释，利用建立好的间接ELISA方法进行检测，并设阴阳性对照。测定OD 450nm值，分析该ELISA方法的敏感性，结果见图4。
结果表明，3份阳性乳汁均在稀释400倍时检测仍为阳性(0D450nm值≥0.262)。说明本发明建立的基于抗猪A群轮状病毒VP6融合重组蛋白的IgA抗体ELISA检测方法具有很高的敏感性。
实施例14：重复性试验
(1)在不同时间包被三个批次的PRoVVP6融合重组蛋白，对3份阳性乳汁和3份阴性乳汁进行ELISA检测，批次内设4个重复，测定OD 450nm值，计算出平均值、标准差和变异系数，以确定批内的可重复性和批间的可重复性，结果如表8所示。
表8 VP6融合重组蛋白的IgA抗体ELISA检测方法的重复性试验
从表8可知，本发明建立的基于猪A群轮状病毒变异毒株VP6融合重组蛋白的IgA抗体ELISA检测方法具有良好的重复性。
Claims (1)
1.一种用于猪乳汁检测的抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被有VP6融合重组蛋白的酶标板，样本稀释液，洗涤液，底物显色液，终止液；
所述VP6融合重组蛋白的是以抗猪A群轮状病毒为模板合成的VP6融合重组蛋白；
所述VP6融合重组蛋白的编码序列如SEQ ID NO.1所示；
所述VP6融合重组蛋白的包被浓度为3.5μg/mL；
所述VP6融合重组蛋白的包被时间为10-14h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310406671.7A CN116643050B (zh) | 2023-04-17 | 2023-04-17 | 一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310406671.7A CN116643050B (zh) | 2023-04-17 | 2023-04-17 | 一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116643050A CN116643050A (zh) | 2023-08-25 |
| CN116643050B true CN116643050B (zh) | 2024-05-24 |
Family
ID=87617740
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310406671.7A Active CN116643050B (zh) | 2023-04-17 | 2023-04-17 | 一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116643050B (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR19990020106A (ko) * | 1997-08-30 | 1999-03-25 | 김강권 | 돼지콜레라 바이러스 ｇｐ55 단백질을 이용한 돼지콜레라 바이러스 중화항체를 검출하는 방법 |
| CN105527437A (zh) * | 2015-12-17 | 2016-04-27 | 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 | 一种检测试剂盒及其应用 |
| WO2017107974A1 (zh) * | 2015-12-23 | 2017-06-29 | 中国人民解放军第二军医大学 | 血清psmd4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用 |
| CN112415207A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-26 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒 |
| CN112876559A (zh) * | 2019-11-29 | 2021-06-01 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 一种特异性结合猪轮状病毒的单克隆抗体及其应用 |
| CN114426974A (zh) * | 2020-10-29 | 2022-05-03 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白及由其制备的试剂盒和抗体 |
| CN115073613A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-09-20 | 扬州大学 | 一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20180017556A1 (en) * | 2016-07-14 | 2018-01-18 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture | Modified Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay Optimal for Monitoring Acute and Long Term Carrier Infections of Diverse Babesia bovis Strains |
-
2023
- 2023-04-17 CN CN202310406671.7A patent/CN116643050B/zh active Active
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR19990020106A (ko) * | 1997-08-30 | 1999-03-25 | 김강권 | 돼지콜레라 바이러스 ｇｐ55 단백질을 이용한 돼지콜레라 바이러스 중화항체를 검출하는 방법 |
| CN105527437A (zh) * | 2015-12-17 | 2016-04-27 | 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司 | 一种检测试剂盒及其应用 |
| WO2017107974A1 (zh) * | 2015-12-23 | 2017-06-29 | 中国人民解放军第二军医大学 | 血清psmd4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用 |
| CN112876559A (zh) * | 2019-11-29 | 2021-06-01 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 一种特异性结合猪轮状病毒的单克隆抗体及其应用 |
| CN112415207A (zh) * | 2020-10-27 | 2021-02-26 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒 |
| CN114426974A (zh) * | 2020-10-29 | 2022-05-03 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 非洲猪瘟病毒CD2v蛋白及由其制备的试剂盒和抗体 |
| CN115073613A (zh) * | 2022-06-28 | 2022-09-20 | 扬州大学 | 一种融合蛋白GLuc-p30及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Recombinant Expression And Indirect ELISA For COWP And HSP70 Proteins From Cryptosporidium andersoni.;Hao, Peng;Linsheng, Tang;Cuilan, Wu;Jun, Li;Li, Tao;Changting, Li;Zhongwei, Chen;Yongping, Xie;Acta Tropica;20201231;第214卷(第214期);全文 * |
| 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立;夏平安;尹彦涛;李素平;党占国;王建举;王中明;李伟娟;崔保安;;中国兽医学报;20090515(第05期);全文 * |
| 猪轮状病毒G4P[6]株的分离鉴定及新型检测方法的建立与应用;原霖;中国博士学位论文全文数据库农业科技辑;第2018年卷(第12期);摘要，正文第36页、第58-76页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116643050A (zh) | 2023-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108148138B (zh) | 非洲猪瘟病毒多表位融合诊断抗原及其制备方法和用途 | |
| CN113151187B (zh) | 一株非洲猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞及其应用 | |
| CN108614121B (zh) | 牛病毒性腹泻病毒e2蛋白抗原多表位融合肽及其制备与应用 | |
| CN106518990B (zh) | 一种寨卡病毒抗原及其应用 | |
| CN112877348B (zh) | 一种非洲猪瘟病毒CD2v胞外域重组蛋白及其应用 | |
| CN109142724B (zh) | 一种用于检测i群禽腺病毒4型抗体的阻断elisa试剂盒及其应用 | |
| CN111381032A (zh) | 一种检测猪流行性腹泻病毒抗体的间接elisa检测方法及其试剂盒 | |
| CN113956362A (zh) | 一种重组猫细小病毒vp2蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用 | |
| CN105061602B (zh) | 用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白、制备方法及应用 | |
| CN113943354B (zh) | 一种重组猫疱疹病毒gB蛋白抗原及其在抗体诊断和疫苗制备中的应用 | |
| CN110483625A (zh) | 一种牛支原体假想蛋白MbovP732及其应用 | |
| CN112980802A (zh) | 一种分泌鸭新型呼肠孤病毒σB蛋白单抗的杂交瘤细胞、单抗及应用 | |
| CN116643050B (zh) | 一种抗猪A群轮状病毒的IgA抗体ELISA检测试剂盒以及检测方法 | |
| CN114807178B (zh) | 非洲猪瘟病毒p72蛋白c末端多表位重组抗原及应用 | |
| CN112415207B (zh) | 一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒 | |
| CN109799342A (zh) | 一种o型口蹄疫病毒抗体竞争elisa检测试剂盒 | |
| CN116023506A (zh) | Asfv非结构蛋白优势抗原表位融合蛋白及其试剂盒与应用 | |
| CN115902236A (zh) | 一种csfv-e2抗体的阻断elisa检测试剂盒及检测方法 | |
| CN114113634A (zh) | 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用 | |
| CN110229218B (zh) | 检测塞内卡病毒抗体的试剂及其所用多肽 | |
| CN111208302A (zh) | 利用多表位串联蛋白检测猪口蹄疫o型抗体的化学发光检测试剂盒 | |
| Zhang et al. | Development of a competitive ELISA method based on VLPs detecting the antibodies of serotype A FMDV | |
| KR20070116382A (ko) | 돼지콜레라 바이러스 Ｅｒｎｓ 단백질 및 이에 특이적으로반응하는 단클론항체를 이용한 돼지콜레라 항체 감별진단방법 | |
| CN116790509B (zh) | 一种分泌抗猪伪狂犬病病毒gB蛋白抗体的单克隆杂交瘤细胞株及其应用 | |
| CN117417416B (zh) | 用于检测非洲猪瘟病毒的重组抗原蛋白及其制备方法、elisa试剂盒和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |