CN112415207A - 一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒，属于畜牧检测技术领域。本发明的ELISA检测试剂盒是以流行的PEDV变异毒株(基因型GⅡb)为亲本毒株，在体外成功的表达了其完整的S2蛋白，然后将完整S2蛋白为抗原包被至酶标板。所述试剂盒能有效同时检测血清和猪口腔粘液类型样本。采用本发明提供的试剂盒成功建立了一种敏感性强、特异性高、稳定性、重复性好且易于制备的PEDV特异性IgA抗体的ELISA检测方法，该方法对PEDV的临床诊断及防控具有重要临床实践意义。

Description

一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗 体ELISA检测试剂盒
技术领域
本发明属于畜牧检测技术领域，具体涉及一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒。
背景技术
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)引起的一种以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的急性、高度接触性的猪肠道传染病。PEDV可以感染各年龄段的猪，但哺乳仔猪更易感染，其死亡率和发病率接近100％。近年来，国内PED的流行更是越来越广泛，特别是新的变异株不断出现。因此，有效的疫苗免疫及猪群免疫后抗体水平的检测是有效防控PED的关键问题之一，而尽快建立以新型变异毒株相关抗原蛋白为基础的新型ELISA抗体检测方法就显得至关重要。
目前，国内外已建立了数种基于PEDV全病毒(Myint et al.BMCVeterinaryResearch,2019)、完整N蛋白(Lin et al.VetMicrobiol,2007)、截断S1蛋白(Gui et al.Microbial Pathogenesis,2018)、截断S2蛋白(秦毅斌等,中国动物传染病学报,2020)及M蛋白(Rodák et al.Vet Microbiol,2005)的PEDV抗体ELISA检测方法。但上述方法所选取的包被PEDV抗原均存在一定程度的不足，如全病毒包被存在散毒风险且抗原纯度较低，存在一定比例的细胞蛋白等杂蛋白，从而导致假阳性较高；以N蛋白为包被抗原容易造成由TGEV感染或免疫所引起的假阳性，主要是因为相关研究显示PEDV的N蛋白抗原与TGEV的N蛋白存在一定程度的抗原交叉反应(Xie et al.J GenVirol.2019)；S1蛋白由于经典毒株、S-INDEL毒株及大片段缺失毒株之间存在巨大差异，因此作为包被抗原检测不同类型毒株诱导的特异性抗体时存在一定程度的无效检测，特别是对于S1区域缺失两百多个氨基酸的大片段缺失变异株时；M蛋白作为膜蛋白，其主要功能不是诱导机体产生PEDV特异性抗体，因此不是建立ELISA方法的最佳蛋白。
近年来，相关研究表明PEDV的S蛋白的S2亚基上存在具有免疫优势的中和抗原表位，并且PEDV的S蛋白的S2亚基较S1亚基保守。对其他冠状病毒的研究也显示，S2亚基的表位可以诱导产生中和性抗体，且不同基因型之间具有较高保守型的一种重要靶抗原蛋白。正常完整PEDV S2基因长度约为1791bp左右，对应蛋白质大小约为597aa，相关研究也已鉴定到S2蛋白中的部分线性B细胞表位区：aa：969-984；1065-1096；1225-1280；1361-1382(李凤平等,微生物学通报,2019)。前期也有基于PEDV S2蛋白的ELISA检测方法研究报道(秦毅斌等,中国动物传染病学报,2020)，但该方法是基于截短的重组S2蛋白(删除了约S2蛋白两端的约90aa蛋白序列)，而不是完整的S2蛋白。众所周知的是，作为ELISA包被抗原的完整抗原蛋白中一般都会包含有数个连续的由序列上不相连的氨基酸残基通过折叠所形成的构象表位和由序列上相连接的一些氨基酸残基通过共价键所形成的线性表位。上述文件(秦毅斌等,中国动物传染病学报,2020)中包被所使用的截短S2蛋白是以基因型GⅡa PEDV毒株CH/GX/2015/750A S2蛋白的部分区域(大小为1524bp，对应蛋白大小为508aa)为模板进行扩增、克隆进而原核表达制备的(刘磊等,中国畜牧兽医,2020)。根据李凤平等人的研究报道，上述文件中的截断S2蛋白已经缺失了S2蛋白两端的969-984aa，1361-1382aa的线性B细胞表位，而对于构象表位是否缺失，由于目前对于S2蛋白构象表位研究尚未报道，所以目前尚不可知。而这种截断表达可能会导致完整S2蛋白中的部分潜在的重要线性或构象表位缺失，从而使其作为包被抗原的抗原性降低，并最终影响ELISA方法的检测结果。
另外大量研究结果表明，仔猪主要通过母猪乳汁获得母源IgA抗体而获得猪流行性腹泻的被动免疫保护，其中初乳中IgA抗体的黏膜免疫是仔猪获得PEDV免疫保护的最佳途径。IgA作为黏膜免疫系统的重要效应因子，其主要特性是多链性、黏膜亲和性以及对蛋白酶的抵抗性，这有助于抗体对病毒的亲和作用，并具有阻抑黏附，免疫排除和中和病毒等多种生物功能。猪流行性腹泻疫苗免疫后母猪乳汁中的IgA抗体水平是评价疫苗免疫原性的一项重要指标。因此，建立一种安全、稳定、易于制备的IgA抗体ELISA检测方法对猪流行性腹泻的防治具有重要临床实践意义。而文献(秦毅斌等,中国动物传染病学报,2020)中报道的PEDV ELISA检测方法是用来检测血清中PEDV特异性IgG抗体的，而相关研究及实践结果显示，血清PEDV特异性IgG抗体与仔猪免疫保护效果没有直接的相关性。
参考文献：
Ohnmar Myint,Ayako Yoshida,Satoshi Sekiguchi,Nguyen Van Diep,NaoyukiFuke,Uda Zahli Izzati,Takuya Hirai1 and Ryoji Yamaguchi.Development ofindirect enzyme-linked immunosorbent assay for detection of porcine epidemicdiarrhea virus specific antibodies(IgG)in serum of naturally infectedpigs.BMCVeterinary Research(2019)15:409.
Xi-Lin Hou,Li-Yun Yu,Jianzhu Liu.Development and evaluation ofenzyme-linked immunosorbent assay based on recombinant nucleocapsid proteinfor detection of porcine epidemic diarrhea(PEDV)antibodies.VetMicrobiol.2007Jul 20；123(1-3):86-92.
Rui Gui,Hong-yan Shi,Wei Liu,Li Feng,Ke-li Yang,Rui Guo,Wan Liang,Fang-yan Yuan,Zheng-ying Duan,Ze-wen Liu,Khalid Mehmood,Riaz Hussain,Dan-naZhou,Yong-xiang Tiana.Development of sandwich Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay for the detection of porcine epidemic diarrhea virus in fecalsamples.Microbial Pathogenesis 122(2018)151–155
秦毅斌，刘磊，卢冰霞，段群棚，何颖，陈忠伟，周英宁，李斌，赵硕，梁家幸，苏乾莲，蒋冬福，赵武.猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用.2020,网络发表.
Rodák L,Valícek L,Smíd B,NevoránkováZ.Nevora′nkovaAn ELISA optimizedforporcine epidemic diarrhoea virus detection in faeces.Vet Microbiol.2005Jan5；105(1):9-17.
Wenting Xie,Chaojie Ao,Yilin Yang,Yinan Liu,Rui Liang,Zhe Zeng,GangYe,Shaobo Xiao,Zhen F.Fu,Wanyu Dong1,and Guiqing Peng.Two critical N-terminalepitopes ofthe nucleocapsid protein contribute to the cross-reactivitybetween porcine epidemic diarrhea virus and porcine transmissiblegastroenteritis virus.J Gen Virol.2019Feb；100(2):206-216.
李凤平,刘英杰,董世娟,王瑞阳,王剑,于瑞嵩,李震.猪流行性腹泻病毒S2截短肽的原核表达及其线性B细胞表位区鉴定.微生物学通报,2019,46(7):1785-1795.
刘磊,秦毅斌,卢冰霞,蒋冬福,陈忠伟,何颖,赵硕,周英宁,李斌,段群棚,梁家幸,赵武.猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株S2蛋白的原核表达及抗原性分析.中国畜牧兽医,2020,47(6):1668-1676.
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒，满足同时对血清和黏液样本检测，同时实现仔猪对PEDV免疫保护效果的检测。
本发明提供了一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒，包括以下组成：
包被有PEDV变异株S2完整重组蛋白的酶标板；所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被浓度为2.5～20μg/mL；所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
稀释度为1:2500～1:10000的酶标山羊抗猪IgA抗体溶液。
优选的，所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被浓度为5～15μg/mL。
优选的，所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的编码序列是以CH/HNPJ/2017毒株的cDNA为模板，用S2-F和S2-R引物进行PCR扩增获得；
所述S2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述S2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选的，所述PCR扩增的反应程序：98℃1min；95℃30s，60℃40s，68℃1min，34个循环；68℃1min。。
优选的，所述PCR扩增的反应体系：5×PrimerStar GXLbuffer 10μL，dNTP4μL，上游引物2μL，下游引物2μL，无菌ddH2O 28μL，cDNA3μL，PrimerStarGXL 1μL。
优选的，所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被温度为4～6℃；所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被时间为10～14h。
优选的，所述酶标山羊抗猪IgA抗体溶液的稀释度为1:5000～1:8000。
优选的，包被有PEDV变异株S2完整重组蛋白的酶标板为采用封闭液封闭后得到；
所述封闭液为含质量浓度4％～6％脱脂奶粉、体积浓度0.04％～0.06％Tween-20的PBS溶液；
所述封闭的温度为37～38℃；
所述封闭的时间为1～2h。
优选的，还包括样本稀释液、洗涤液、底物显色液和终止液。
优选的，所述洗涤液为含体积浓度0.04％～0.06％Tween-20的PBS溶液。
本发明提供的基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒。本发明以流行的PEDV变异毒株(基因型GⅡb)为亲本毒株，在体外成功的表达了其完整的S2重组蛋白为包被抗原，成功的建立了一种敏感性强、特异性高、稳定、重复性好且易于制备的PEDV特异性IgA抗体ELISA检测试剂盒。通过检测130份猪血清，并与IDEXX公司生产的商品化试剂盒结果进行比较分析，结果表明，采用本发明建立的基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒与IDEXX公司生产的商品化试剂盒的检测结果符合率为90.77％。此外，对40份猪口腔粘液(其中包含10份攻毒猪阳性样品和30份健康猪阴性样品)检测，结果表明本发明提供的基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒敏感性为90％，特异性为93.3％。由此可见，本发明提供的试剂盒基本满足同时对猪血清和猪口腔粘液两种样品类型的检测，而且取得了较理想的检测阳性率，因此，本发明提供的试剂盒对PEDV的临床诊断及防控具有重要临床实践意义。
附图说明
图1为本发明构建的PET-24a-S2重组表达载体；其中图1a为PCR扩增获得的S2基因；图1b为PET-24a-S2重组表达载体的酶切产物电泳图；
图2为S2重组蛋白的表达和纯化结果；其中图2a为S2重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果，图2b为S2重组蛋白经镍柱亲和层析纯化的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒，包括以下组成：
包被有PEDV变异株S2完整重组蛋白的酶标板；所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被浓度为2.5～20μg/mL；所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
稀释度为1:2500～1:10000的酶标山羊抗猪IgA抗体溶液。
在本发明中，所述试剂盒包括包被有PEDV变异株S2完整重组蛋白的酶标板。所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的编码序列优选是以CH/HNPJ/2017毒株的cDNA为模板，用S2-F和S2-R引物进行PCR扩增获得；所述S2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述S2-R的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示。所述PCR扩增的反应程序优选如下：98℃1min；95℃30s，60℃40s，68℃1min，34个循环；68℃1min。所述PCR扩增的反应体系优选如下：5×PrimerStar GXLbuffer 10μL，dNTP4μL，上游引物2μL，下游引物2μL，无菌ddH2O 28μL，cDNA 3μL，PrimerStar GXL 1μL。所述CH/HNPJ/2017毒株在现有技术中报道，可参见如下两篇现有技术：
[1]Xinsheng Liu,Qiaoling Zhang,Liping Zhang,Peng Zhou,Jun Yang,YuzhenFang,Zhaoliang Dong,Donghong Zhao,Weiyan Li,Jiaxin Feng,Baofeng Cui,YongguangZhang,Yonglu Wang.A newly isolated Chinese virulent genotype GIIb porcineepidemic diarrhea virus strain:biological characteristics,pathogenicity andimmune protective effects as an inactivated vaccine candidate.VirusResearch.2019Jan 2；259:18-27.
[2]Xinsheng Liu,Liping Zhang,Qiaoling Zhang,Peng Zhou,Yuzhen Fang,Donghong Zhao,Jiaxin Feng,Weiyan Li,Yongguang Zhang,Yonglu Wang.Evaluationand comparison of immunogenicity and cross-protective efficacy of twoinactivated PEDV vaccines in suckling piglets.VeterinaryMicrobiology.2019Mar；230:278-282.
所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的制备方法，优选包括重组表达载体的构建和重组蛋白的表达与纯化；重组表达载体的构建方法优选将所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的编码序列克隆至PET-24a载体的BamHI和IXhoI的多克隆位点处，得到重组表达载体PET-24a-S2。本发明对所述PET-24a载体的来源不做具体限制，采用本领域所熟知的PET-24a载体即可。所述克隆至PET-24a载体的BamHI和IXhoI的多克隆位点处的方法优选为采用包含BamHI和IXhoI酶切位点的引物对所述编码序列进行PCR扩增，得到两端带有酶切位点的DNA片段，然后将所述DNA片段和所述PET-24a载体分别经BamHI和IXhoI双酶切，两种酶切产物连接，筛选，得到重组表达载体。所述表达的方法优选将所述重组表达载体转化至BL21感受态细胞中，培养，采用IPTG进行诱导表达，破碎菌体，得到粗蛋白液。所述纯化的方法参考Ni-NTA Superflow Cartridge手册进行镍柱亲和层析纯化PET-24a-S2重组蛋白。
在本发明中，所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被浓度为2.5～20μg/mL，优选为5～15μg/mL，更优选为5μg/mL。包被浓度过低(例如浓度为2.0μg/mL及以下)，导致不能与样品中全部的IgA抗体发生特异性结合，使检测结果偏低；而包被浓度过高(例如浓度为20μg/mL以上)，虽然能够提高检测最低限，但是会增加生产成本。
所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被温度优选为4～6℃，更优选为4℃。所述包被时间优选为10～14h，更优选为11～13h，最优选为12h。本发明通过实验验证，与其他包被温度(37℃)和时间(1h或2h)相比，4℃条件下包被过夜更有利于提高P/N值。P/N值≥2.1表示检测阳性结果，这表明该包被条件下有利于提高检测最低限。所述PEDV变异株S2完整重组蛋白优选采用包被液稀释至目标浓度，所述包被液优选为0.05mol/L pH值9.6的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。
在本发明中，包被有PEDV变异株S2完整重组蛋白的酶标板优选为采用封闭液封闭后得到；所述封闭液优选为含质量浓度4％～6％脱脂奶粉、体积浓度0.04％～0.06％Tween-20的PBS溶液，更优选为含质量浓度5％脱脂奶粉、体积浓度0.05％Tween-20的PBS溶液。所述封闭液的pH值优选为7.0～7.5，更优选为7.2。所述封闭的温度优选为37～38℃，更优选为37℃。所述封闭的时间优选为1～2h，更优选为1h。与低温过夜封闭方法(低温为4℃，)相比，本发明提供的封闭在提高P/N值方面取得了显著优势。
本发明对所述检查板没有特殊限制，采用本领域所熟知的96孔板即可。
在本发明中，所述酶标山羊抗猪IgA抗体溶液的稀释度优选为1:5000～1:8000，更优选为1:5000～1:7000。本发明对所述酶的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的用于ELISA检测的酶即可。在本发明实施例中，HRP标记山羊抗猪IgA抗体购自Abcam公司。酶标山羊抗猪IgA抗体溶液优选采用酶标抗体稀释液稀释。所述酶标抗体稀释液购于济南百迪泰生物科技有限公司。
在本发明中，所述试剂盒优选还包括所述样本稀释液、洗涤液、底物显色液和终止液。所述洗涤液优选为含体积浓度0.04％～0.06％Tween-20的PBS溶液，更优选为含体积浓度0.05％Tween-20的PBS溶液。所述底物显色液优选为单组分TMB底物显色液，购于索莱宝生物科技有限公司。终止液为2M的H2SO4溶液。
在本发明中，所述试剂盒的使用方法，优选包括以下步骤：
将包被有PEDV变异株S2完整重组蛋白的酶标板的孔中添加一定体积的样品，在37℃条件下孵育30～60min，弃去反应液，用洗涤液洗涤后添加酶标山羊抗猪IgA抗体溶液，在37℃下孵育30min，弃去反应液后用洗涤液再次洗涤，添加底物显色液反应10min，检测OD450nm值。
在本发明中，所述样品优选采用样品稀释液进行稀释。样品的稀释度优选为1:80～1:160，更优选为1:120。稀释度过高(1:320～1:2560)或过低(1:20～1:40)均会对检测的P/N值造成数据过低，因此，不恰当的样品稀释度也是影响检测结果的因素。
在本发明中，S/P值值表示检测临界值，按照式I计算：S/P值＝(样品血清OD450nm值-阴性对照血清OD450nm值)/(阳性对照血清OD450nm值-阴性对照血清OD450nm值)式I。
当样品S/P值≥0.04时为阳性；样品S/P值≤0.02时为阴性；样品S/P值介于0.02～0.04之间为可疑。
在本发明中，实验表明，本发明提供的基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒具有良好的特异性、较高的敏感性、良好的重复性。同时本发明以血清和口腔粘液两种类型的样本进行检测，结果表明本发明能够满足同时检测两种样本的阳性检测的要求。
下面结合实施例对本发明提供的一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
主要试验材料
PEDV CH/HNPJ/2017(GIIb)毒株(P10)、原核表达载体PET-24a由本实验室保存；PrimeSTAR GXL DNAPolymerase、DNA ladderMarker均购自宝生物工程(大连)有限公司。AMV反转录试剂盒购自Promega公司(美国)；RNeasyMini Kit试剂盒来自Qiagen公司；AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit购自Axygen公司；卡那霉素、大肠杆菌BL21(DE3)菌株购自生工生物工程(上海)有限公司。Chelating Sepharose Fast Flow购自GE Healthcare公司。山羊抗猪IgA(HRP)购于Abcam公司；PEDV抗体检测试剂盒购于IDEXX公司；PEDV阴阳性血清由本实验室保存。
实施例1
1.1PET-24a-S2重组表达载体的构建
参照GenBank中CH/HNPJ/2017毒株S基因序列(MF152604.1)，设计用于扩增S2基因的引物：S2-F：GCGGATCCATGACCAACTTTAGTATGAG(BamH I)；S2-R：GCCTCGAGCTGCACGTGGACCTTTTC(XhoI)。委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以PEDV CH/HNPJ/2017(GIIb)毒株P10为材料提取PEDV RNA，经反转录试剂盒扩增获得cDNA，然后以cDNA为模板经PCR扩增获得S2基因，PCR反应的扩增程序如下：98℃1min；95℃30s，60℃40s，68℃1min，34个循环；68℃1min；4℃保存；PCR扩增的反应体系为：5×PrimerStarGXLbuffer 10μL，dNTP 4μL，上游引物2μL，下游引物2μL，无菌ddH2O 28μL，cDNA 3μL，PrimerStar GXL 1μL。将扩增产物经纯化后插入PET-24a载体的BamH I/XhoI的多克隆位点中，经测序验证得到预期结果，构建得到重组表达载体PET-24a-S2。
将PCR扩增获得的S2基因(图1a)后插入PET-24a载体中，成功构建重组表达载体PET-24a-S2。经酶切(图1b)和生工生物工程(上海)股份有限公司测序验证目的基因正确的插入到PET-24a载体中。
1.2重组蛋白的表达与纯化
将构建的重组质粒PET-24a-S2转化至BL21感受态细胞，获得重组表达菌株BL21-PET24a-S2，在37℃、220r/min振荡培养4～5h直至OD600nm值达到0.6～0.8时，向其中加入终浓度为0.5mmol/L IPTG进行诱导表达。采用离心方法收集菌体并进行超声破碎裂解。再将细胞裂解液经离心得到上清和沉淀，两者分别进行SDS-PAGE，分析该S2重组蛋白的表达形式。收集含有目的蛋白的样品，参考Ni-NTA Superflow Cartridge手册进行镍柱亲和层析纯化PET-24a-S2重组蛋白，纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE。
SDS-PAGE电泳图显示，目的蛋白主要以包涵体形式表达(图2a)，包涵体经8M Urea溶液裂解后，用镍柱亲和层析纯化得到纯度在90％以上的PET-24a-S2重组蛋白(图2b)。
实施例2
抗原最佳包被浓度及二抗最佳工作浓度的确定
采用方阵发测定抗原最佳包被浓度及二抗最佳工作浓度。用包被液将重组S2蛋白依次稀释至20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、2.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL和0.2μg/mL 8个浓度，每个浓度的重组S2蛋白包被ELISA板的1个横排，100μL/孔。用抗体稀释液将HRP标记的山羊抗猪IgA抗体依次进行1:2500、1:5000、1:10000的比例稀释，每个稀释度加两竖列，100μL/孔，形成方阵。选择阳性血清OD450nm值与阴性血清OD450nm值的比值(P/N值)最大的抗原浓度和二抗稀释度作为最佳抗原包被浓度及最佳二抗工作浓度。结果见表1。
表1抗原最佳包被浓度及二抗最佳工作浓度的确定
Figure BDA0002744974650000101
Figure BDA0002744974650000111
由表1可知，重组S2蛋白的浓度稀释至2.5～20μg/mL，酶标二抗稀释度在1:2500～10000的范围，均能实现较高的P/N值，其中重组S2蛋白的浓度为5μg/mL，酶标二抗稀释度为1:5000时得到的P/N值最高，表明该剂量组合为最优组合。
实施例3
抗原最佳包被条件的确定
以实施例2中得到的最佳抗原包被浓度和最佳二抗工作浓度为试验条件。设置37℃孵育1h，37℃孵育2h和4℃孵育过夜(15～16h)三个试验组进行ELISA检测，计算P/N值(P/N值＝阳性样本OD450nm平均值/阴性样本OD450nm平均值)，选取P/N值最大的为最佳抗原包被条件。结果见表2。
表2抗原最佳包被条件的确定
Figure BDA0002744974650000112
Figure BDA0002744974650000121
由表2可知，在4℃过夜的包被条件与37摄氏度包被1～2h的方案在P/N值方面具有明显的优势，因此，以4℃过夜的包被条方法包被重组S2蛋白。
实施例4
最佳封闭条件的确定
以最佳抗原包被浓度，最佳包被条件包被酶标板。设置37℃封闭1h，37℃封闭2h和4℃过夜三个试验组。分别测定各组的阴阳性血清OD450nm值，并计算出P/N值，确定最佳封闭时间。结果见表3。
表3最佳封闭条件的确定
Figure BDA0002744974650000122
由表3可知，在37℃封闭1～2h的方案比4℃过夜的封闭条件与在P/N值方面具有明显的优势，本发明以37℃封闭1h的封闭方法处理酶标板。
实施例5
最佳血清稀释度和反应时间的确定
以确定好的最优条件进行ELISA试验，将阴阳性血清分别进行1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280、1:2560倍稀释，100μL/孔。加入稀释好的血清后设置3个试验组，第一组37℃孵育30min，第二组37℃孵育45min，第三组37℃孵育60min。分别测定各组的阴阳性血清OD450nm值，并计算出P/N值，确定最佳血清稀释度和反应时间。结果见表4。
表4血清稀释度及反应时间的优化
Figure BDA0002744974650000131
由表4可知，在血清稀释度为1:80～160的范围内，得到的P/N值有明显的优势，因此，本发明以稀释度为1:80～160的方法来检测样品。
实施例6
最佳二抗反应时间的确定
以确定好的最优条件进行ELISA试验，加入酶标二抗后(100μL/孔)。设置四个试验组，第一组37℃孵育30min，第二组37℃孵育45min，第三组37℃孵育60min，第四组37℃孵育90min。测定各组阴阳性血清的OD450nm值，并计算出P/N值，以确定二抗最佳反应时间。
结果见表5。由表5可知，37℃反应30min的二抗孵育方案为最佳方案。
表5酶标二抗反应时间的确定
Figure BDA0002744974650000132
Figure BDA0002744974650000141
实施例7
最佳底物显色时间的确定
以确定好的最优条件进行ELISA试验，加入TMB后(100μL/孔)设置四个试验组，第一组室温反应5min，第二组室温反应10min，第三组室温反应15min，第四组室温反应20min。显色完成后每孔加入100μL2M H2SO4终止显色，进行OD450nm读值，并计算出P/N值，以确定最佳底物显色时间。
结果见表6。由表6可知，37℃10min的显色时间最佳。
表6 TMB显色时间的确定
Figure BDA0002744974650000142
实施例8
ELISA检测试剂盒制备及使用方法
包被：用0.05mol/LNa2CO3-NaHCO3(pH值9.6)缓冲液将重组S2蛋白稀释至5μg/mL，100μL/孔，4℃吸附15h。包被完毕后，弃去孔中液体，每孔加入含0.05％Tween-20的PBS洗涤液250μL，洗涤3次，最后一次拍干。
封闭：每孔加入含5％脱脂奶粉、0.05％Tween-20的PBS封闭液200μL，37℃封闭1h。封闭完成后，弃去孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤3次，最后一次拍干。
一抗孵育：用血清稀释液稀释待检血清样品(1:160)，100μL/孔，37℃反应60min。弃去孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤5次，最后一次拍干。
二抗孵育：用血清稀释液稀释待检血清样品(1:5000)，100μL/孔，37℃反应30min。弃去孔中液体，每孔加入洗涤液250μL，洗涤5次，最后一次拍干。
显色读数：每孔加入100μL单组分TMB底物显色液，37℃避光反应10min，加入100μL/孔2M H2SO4终止液。酶标仪读取OD450nm值。
实施例9
临界值的确定
以实施例8制备的试剂盒和检测方法对实验室保存的40份猪PEDV阴血清进行ELISA检测，每份样品重复2次。测定每份血清的OD450nm读值，计算S/P值。
S/P值＝(样品血清OD450nm值-阴性对照血清OD450nm值)/(阳性对照血清OD450nm值-阴性对照血清OD450nm值) 式I。
计算40份血清S/P值的平均值及标准差(SD)。当样品S/P值≥X+3SD时判定为阳性；当样S/P值≤X+2SD时判定为阴性；当X+2SD<样品S/P<X+3SD时判定为可疑。
当样品S/P值≥0.04时为阳性；样品S/P值≤0.02时为阴性；样品S/P值介于0.02～0.04之间为可疑。
实施例10
特异性试验
按照前面建立并优化的ELSIA方法，检测本实验室保存的猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪德尔塔冠状病毒、口蹄疫病毒(O型)标准阳性血清，同时设PEDV阴阳性血清对照，以判定本试验建立的PEDV间接ELISA检测方法是否与其它主要猪病毒性病原的抗体有交叉反应。
表7重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测方法的特异性试验
Figure BDA0002744974650000161
结果表明，猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪德尔塔冠状病毒、口蹄疫病毒(O型)标准阳性血清S/P值均小于0.02，显示为PEDV阴性，说明本发明建立的基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测方法具有良好的特异性。
实施例11
敏感性试验
将3份PEDV阳性血清从1:20开始进行倍比稀释，利用建立好的间接ELISA方法进行检测，并设阴阳性对照。测定OD450nm值，计算出S/P值，分析该ELISA方法的敏感性。结果见表8。
表8重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测方法的敏感性试验
Figure BDA0002744974650000162
Figure BDA0002744974650000171
取3份PEDV阳性血清从1:20开始进行倍比稀释，利用实施例8记载的间接ELISA方法进行检测。结果表明，3份阳性血清分别在稀释640倍、1280倍、640倍时检测仍为阳性(S/P值≥0.04)。说明本发明建立的基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测方法具有较高的敏感性。
实施例12
重复性试验
在不同时间包被三个批次的PEDV重组S2蛋白，对3份阳性血清和3份阴性血清进行ELISA检测，批次内设4个重复，测定OD450nm值，计算出平均值、标准差和变异系数，以确定批内的可重复性和批间的可重复性。
表9重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测方法的重复性试验
Figure BDA0002744974650000172
Figure BDA0002744974650000181
选取3份阳性血清和3份阴性血清进行批内和批间ELISA检测，统计学分析结果显示，批内和批间变异系数均小于7％，在10％以内。表明本发明建立的基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测方法具有良好的重复性。
实施例13
PEDV S2蛋白的IgA抗体ELISA检测方法的应用
利用发明制备的PEDV S2蛋白间接ELISA抗体检测方法对实验室保存的130份猪血清进行检测，并与IDEXX IgA抗体检测试剂盒进行检测及结果比较分析。此外，利用本发明提供的试剂盒检测实验室保存的40份猪口腔粘液，其中包含10份攻毒猪阳性样品和30份健康猪阴性样品。结果见表10和表11。
表10猪血清检测及与进口试剂盒的比较结果
Figure BDA0002744974650000182
表11猪口腔粘液检测
Figure BDA0002744974650000183
本发明提供的基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的间接ELISA方法检测实验室保存的130份猪血清，并与IDEXX公司生产的商品化试剂盒结果进行比较分析，结果表明，本发明建立的基于猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测方法与IDEXX公司生产的商品化试剂盒检测结果符合率为90.77％。
此外，本发明优于IDEXX IgA抗体检测试剂盒的特点为：利用本发明提供的试剂盒检测实验室保存的40份猪口腔粘液，其中包含10份攻毒猪阳性样品和30份健康猪阴性样品，结果表明敏感性为90％，特异性为93.3％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1803
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accaacttta gtatgagtat taggacagaa tatttacagc tttacaacac gcctgttagt 60
gttgattgtg ctacatatgt ttgtaatggt aactctcgtt gtaaacaatt actcacccag 120
tacattgcag catgtaagac catagagtca gcattacaac tcagcgctag gcttgagtct 180
gctgaagtca actctatgct tactatttct gaagaggctc tacagttagc taccatcagt 240
tcgtttaatg gtgatggata taattttact aatgtgctgg gtgtttccgt gtatgaccct 300
gcaagtggca gggtggtaca aaaaaggtct tttattgaag acctgctttt taataaagtg 360
gttactaatg gccttggtac tgttgatgaa gactataagc gctgttctaa tggtcgctct 420
gtggcagatc tagtctgtgc acagtattac tctggtgtca tggtactacc tggtgttgtt 480
gacgctgaga agcttcacat gtatagtgcg tctctcatcg gtggtatggt gctaggaggt 540
tttacttctg cagcggcatt gccttttagc tatgctgttc aagctagact caattatctt 600
gctctacaga cggatgttct acagcggaac cagcaaatgc ttgctgagtc ttttaactct 660
gctattggta atataacttc agcctttgag agtgttaaag aggctattag tcaaacttcc 720
aagggtttga acactgtggc tcatgcgctt actaaggttc aagaggttgt taactcgcag 780
ggtgcagctt tgactcaact tactgtacag ctgcaacaca acttccaagc catttctagt 840
tctattgatg acatttactc tcgactggac attctttcag ccgatgttca ggttgaccgt 900
ctcatcaccg gcagattatc agcacttaat gcttttgttg ctcaaaccct cactaagtat 960
actgaggttc aggctagcag gaagctagca cagcaaaagg ttaatgagtg cgttaaatcg 1020
caatctcagc gttatggttt ttgtggtggt gatggcgagc acattttctc tctggtacag 1080
gccgcacctc aaggcctgct gtttttacac acagtacttg taccgggtga ctttgtaaat 1140
gttattgcca tcgctggctt atgtgttaac gatgaaattg ccttgactct acgtgagcct 1200
ggcttagtct tgtttacgca tgaacttcaa gatactgtga cggaatattt tgtttcatcg 1260
cgacgtatgt atgaacctag aaaacctacc gttggtgatt ttgttcaaat tgagagttgt 1320
gtggtcacct atgtcaattt gactagagac caactaccag aagtaatccc agattacatc 1380
gatgttaaca aaacacttga tgagatttta gcttctctgc ccaatagaac tggtccaagt 1440
ctttctctag atgtttttaa tgccacttat cttaatctca ctggtgaaat tgcagattta 1500
gagcagcgtt cagagtctct ccgtaatact acagaagagc tccaaagtct tatatataat 1560
atcaacaaca cactagttga ccttgagtgg ctcaaccgag ttgagacata tatcaagtgg 1620
ccgtggtggg tttggttgat tatttttatt gttctcattt ttgttgtgtc attactagtg 1680
ttctgctgca tttccacggg ttgttgtgga tgctgcggct gctgtggtgc ttgtttttca 1740
ggttgttgta ggggtcctag acttcaacct tacgaagctt ttgaaaaggt ccacgtgcag 1800
tga 1803
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggatccat gaccaacttt agtatgag 28
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcctcgagct gcacgtggac cttttc 26

Claims (10)

1.一种基于抗猪流行性腹泻病毒变异毒株重组S2蛋白的IgA抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括以下组成：
包被有PEDV变异株S2完整重组蛋白的酶标板；所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被浓度为2.5～20μg/mL；所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
稀释度为1:2500～1:10000的酶标山羊抗猪IgA抗体溶液。
2.根据权利要求1所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被浓度为5～15μg/mL。
3.根据权利要求1所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的编码序列是以CH/HNPJ/2017毒株的cDNA为模板，用S2-F和S2-R引物进行PCR扩增获得；
所述S2-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述S2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.根据权利要求3所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增的反应程序：98℃1min；95℃30s，60℃40s，68℃1min，34个循环；68℃1min。
5.根据权利要求3所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系：5×PrimerStar GXLbuffer 10μL，dNTP 4μL，上游引物2μL，下游引物2μL，无菌ddH2O 28μL，cDNA 3μL，PrimerStar GXL 1μL。
6.根据权利要求1所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被温度为4～6℃；所述PEDV变异株S2完整重组蛋白的包被时间为10～14h。
7.根据权利要求1所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标山羊抗猪IgA抗体溶液的稀释度为1:5000～1:8000。
8.根据权利要求1所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，包被有PEDV变异株S2完整重组蛋白的酶标板为采用封闭液封闭后得到；
所述封闭液为含质量浓度4％～6％脱脂奶粉、体积浓度0.04％～0.06％Tween-20的PBS溶液；
所述封闭的温度为37～38℃；
所述封闭的时间为1～2h。
9.根据权利要求1～8任意一项所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，还包括所述样本稀释液、洗涤液、底物显色液和终止液。
10.根据权利要求9所述ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述洗涤液为含体积浓度0.04％～0.06％Tween-20的PBS溶液。
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