CN110632298A

CN110632298A - 犬腺病毒1型单克隆抗体、可变区序列、杂交瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN110632298A
Application number: CN201810664721.0A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 邓均华; 李凡
Original assignee: Luoyang Pu Tai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhongke Gene Technology Co ltd; Luoyang Pu Tai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-06-25
Filing date: 2018-06-25
Publication date: 2019-12-31
Anticipated expiration: 2038-06-25
Also published as: CN110632298B

Abstract

本发明提供了具有特异性结合犬腺病毒1型Fiber蛋白的鼠单克隆抗体的可变区序列、特异性结合犬腺病毒1型Fiber蛋白的抗体，该抗体可以用于制备试剂盒和药物组合物。本发明的试剂盒克服了现有技术检测灵敏度低的问题，避免了漏检、假阴性现象发生，可高灵敏检测犬的多种靶标，还能高灵敏检测非犬动物的多种靶标；且具有快速、简便、准确的优势；本发明的药物组合物能有效预防和治疗CAV‑1导致的疾病。

Description

犬腺病毒1型单克隆抗体、可变区序列、杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及犬腺病毒1型单克隆抗体、该单克隆抗体的可变区序列、分泌其的杂交瘤细胞株，以及使用该单克隆抗体制备的药物组合物、试剂盒和应用，属于生物技术领域。

背景技术

犬传染性肝炎及熊、狐的脑炎均由犬腺病毒1型(Canine adenovirus type I,CAV-1)引发，呈全球分布。犬传染性肝炎可感染不同品种、年龄和性别的犬，四季均可发生，以幼犬的感染率和死亡率最高(高达25％～40％且可在1-2天突然死亡)；临床症状复杂，包括呕吐、腹痛、腹泻、体温升高甚至突然死亡、眼睛损伤，还可出现暂时性角膜浑浊，俗称“蓝眼病”；易与其它病毒如犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒混合感染或继发感染，从而使病情加重并导致临床诊断困难。熊、狐的脑炎临床发病率约为16.3％，死亡率约为9.7％。CAV-1所引发的疾病是养犬业、毛皮动物养殖业危害最大的疫病之一。

目前，CAV-1的检测方法包括病毒分离、PCR、血凝试验等方法，但这些方法各有缺点，病毒分离鉴定试验过程繁琐，耗时过长，且通过肉眼观察，较为主观；以PCR为主的分子生物学方法对技术和设备要求均较高、操作繁琐；血凝试验不仅需要红细胞且要求现配现用，临床检测时还易受分泌物或排泄物中的杂质干扰，这些检测方法均难以在兽医临床现场应用。而目前市场上流行的商品化犬腺病毒1型胶体金检测试纸条仅有上海快灵生产的一种，检测灵敏度低、结果往往存在假阴性，既而导致散毒、群发感染的风险。因此，急需研制一种快速简便准确的产品以用于临床诊断。

犬CAV-1、2的预防、治疗目前主要是免疫含犬腺病毒2型的疫苗、高免血清，但疫苗中所含犬腺病毒2型毒株均为弱毒株，免疫动物后存在散毒的风险，且免疫后产生抗体尚且需要一段时间，不能快速建立对病毒的抵抗能力；而高免血清的制备程序复杂，不仅需筛选合格的试验动物，还要用弱毒、强毒多次免疫(李志敏等.犬多价高免血清的研制及应用.中国免疫学杂志,2005,21(7):521-523)。

另外，针对已经感染的犬只、狐狸特别是幼犬或幼狐发病时，需要针对发病的动物快速控制病情、进行治疗，即使免疫现有疫苗也难以在短时间产生较高的抗体，而中和活性良好的单抗可以大大提高该病的治愈率，因此，治疗性单抗对该病的治疗和控制具有重要的意义。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一对犬腺病毒1型单克隆抗体，以及含单克隆抗体的试剂盒、药物组合物及其应用。

本发明涉及一种特异性结合犬腺病毒1型的单克隆抗体4F3的可变区序列，其中，所述单克隆抗体4F3重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体4F3轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明单克隆抗体4F3的可变区序列能特异性结合犬腺病毒1型，其针对的抗原表位位于纤突蛋白即Fiber蛋白。

本发明涉及一种特异性结合犬腺病毒1型的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保留特异性结合犬腺病毒1型的能力。

作为本发明的一种优选实施方式，所述抗体为单克隆抗体4F3。

所述单克隆抗体4F3，其结合的抗原表位为Fiber蛋白的表位，重链可变区为SEQ.ID No.1或其简并序列编码，轻链可变区为SEQ.ID No.2或其简并序列编码；对CAV-1的HI效价≥1:5120，IPMA效价≥1:2560，与CAV-1具有良好的反应性；对CAV-1的中和效价为1:320，对于CAV-1具有很高的中和活性。

本发明涉及一种特异性结合犬腺病毒1型的单克隆抗体2F9的可变区序列，其中，所述单克隆抗体2F9重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体2F9轻链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明涉及一种特异性结合犬腺病毒1型的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区所示序列或其简并序列编码或其序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

作为本发明的一种优选实施方式，所述抗体为单克隆抗体2F9。

所述单克隆抗体2F9为犬腺病毒1型单克隆抗体，其结合的抗原表位为犬腺病毒1型Fiber蛋白上的表位；重链可变区的氨基酸序列为SEQ.ID No.3或其简并序列编码，轻链可变区的氨基酸序列为SEQ.ID No.4或其简并序列编码；对CAV-1的HI效价≥1∶10240、IPMA效价≥1∶1280，与CAV-1具有良好的反应性；对CAV-1的中和效价为1∶1280，对CAV-1具有很高的中和活性。

本发明还涉及一种杂交瘤细胞4F3株，所述杂交瘤细胞4F3株分泌所述单克隆抗体4F3。

本发明还涉及一种杂交瘤细胞2F9株，所述杂交瘤细胞2F9株分泌所述单克隆抗体2F9。

本发明还涉及一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的特异性结合犬腺病毒1型的抗体，以及药学上可接受的载体；所述特异性结合犬腺病毒1型的抗体选自一种或多种以下抗体：单克隆抗体4F3、单克隆抗体2F9、单克隆抗体4F3的重链可变区和轻链可变区连接而成的单链抗体、单克隆抗体4F3的重链可变区和单克隆抗体2F9的轻链可变区连接而成的单链抗体、单克隆抗体4F3的轻链可变区和单克隆抗体2F9的重链可变区连接而成的单链抗体、单克隆抗体2F9的重链可变区和轻链可变区连接而成的单链抗体。

本发明的药物组合物中含有的单克隆抗体、单链抗体具有高的中和犬腺病毒1型病毒的能力，能针对发病的动物快速控制病情、进行治疗。

作为本发明的一种优选实施方式，所述药物经肌肉注射给药。

作为本发明的一种优选实施方式，所述药物剂型包括但不限于粉末剂、颗粒剂、丸剂、片剂、胶囊剂。

本发明的药物组合物弥补了现有疫苗的不足，避免了散毒的风险；解决了高免血清制备程序复杂所带来的不便，能同时预防和治疗CAV-1，还可用于紧急治疗该病，减少了发病率、降低了死亡率。

本发明还涉及所述药物组合物在制备预防和/或治疗犬腺病毒1型感染相关疾病的药物中的应用。

本发明还涉及一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体4F3、有效量的所述单克隆抗体2F9，以及对犬腺病毒1型抗原抗体反应进行检测的检测试剂；其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括部件：底板(5)，所述底板(5)具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)，所述硝酸纤维素膜(3)与金标垫(2)接触或与样品垫(1)、金标垫(2)接触使得犬腺病毒1型抗原与所述单克隆抗体2F9的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫(2)上含有胶体金标记的所述单克隆抗体2F9，所述硝酸纤维素膜上包括检测线(6)和一条质控线(7)，所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体4F3，所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；其中，所述单克隆抗体4F3固定含量为0.5-2.5mg/ml，所述单克隆抗体2F9标记时含量为5-70μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的所述样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)相邻的部件之间相互接触，而不相邻的部件之间不接触；所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液。

作为本发明的一种实施方式，所述单克隆抗体4F3固定含量为0.8-2.0mg/ml，所述单克隆抗体2F9标记时含量为10-60μg/ml。

作为本发明的一种实施方式，所述金标垫(2)上含有胶体金标记的所述单克隆抗体2F9、4H1和/或1G5，所述硝酸纤维素膜(3)上包括二条或三条检测线，所述二条或三条检测线上分别固定化有所述单克隆抗体4F3、2B7和/或6E11；其中，所述单克隆抗体4H1标记时含量为20～150μg/ml，所述单克隆抗体1G5标记时含量为20～60μg/ml，所述单克隆抗体2B7固定含量为1～3mg/ml，所述单克隆抗体6E11固定含量为1～3mg/ml；所述犬副流感病毒单克隆抗体2B7重链可变区为SEQ ID No.5所示序列或其简并序列编码、轻链可变区为SEQ IDNo.6所示序列或其简并序列编码，所述犬副流感病毒单克隆抗体4H1重链可变区为SEQ IDNo.7所示序列或其简并序列编码、轻链可变区为SEQ ID No.8所示序列或其简并序列编码；所述犬瘟热病毒单克隆抗体6E11由保藏号为CCTCC No：C2015202的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌；所述犬瘟热病毒单克隆抗体1G5由保藏号为CCTCC No：C2015201小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌。

所述小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株保藏号为CCTCC No：C2015202，所述小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株保藏号为CCTCC No：C2015201，均公开于专利申请CN105695420A。

作为本发明的一种实施方式，从所述底板(5)第一端向第二端的方向上仅有二条检测线6A、6B，所述单克隆抗体4F3固定在所述检测线6A或6B上，另一所述固定单克隆抗体4H1或1G5则固定在所述检测线6B或6A上。

作为本发明的一种实施方式，从所述底板(5)第一端向第二端的方向上有三条检测线6A、6B、6C，所述单克隆抗体4F3、4H1和1G5可以任一排列方式分别固定在所述检测线6A、6B、6C上。

作为本发明的一种实施方式，所述相邻的所述检测线之间、离所述质控线最近的检测线与质控线之间的距离≥4mm。

本发明试剂盒检测样本选自眼鼻分泌物、咽喉分泌物、肛门分泌物、粪便、血清、尿、肝、肠或肠淋巴结、脾、肺；所述试剂盒检测样本来源于犬、狐狸、熊。

本发明试剂盒可用于检测肝、胆、肾、肠或肠淋巴结、脾、肺等多种组织，均具有良好的灵敏度，显示广泛的临床应用适应能力。

本发明的试剂盒不仅可以检测犬源样本，还可以检测非犬动物来源的样本，具有广泛的临床应用，弥补了现有商业诊断试剂不能用于非犬动物来源的样品的不足。

本发明还试剂一种免疫组化检测方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)采集感染动物组织样品，对所述组织样品进行修块，迅速置于福尔马林固定；步骤(2)将所述步骤(1)固定的组织样品经流水冲洗后脱水、透明、浸蜡，经包埋后切片、展片、裱片于用三氨丙基三乙氧基硅烷处理的玻片上，烤片；步骤(3)所述玻片脱蜡至蒸馏水，滴加3％H₂O₂静置以抑制内源性酶；步骤(4)使用热修复，或酶消化法处理所述烤片后的玻片以修复抗原，所述热修复包括高压热修复、煮沸热修复、或微波热修复；步骤(5)用磷酸盐缓冲液洗涤所述修复抗原，滴加封闭液如马血清、或牛血清白蛋白封闭；步骤(6)吸去封闭液后加入稀释的一抗，所述一抗为单克隆抗体4F3或2F9，孵育，用磷酸盐缓冲液洗涤，加入酶标的羊抗鼠抗体作为酶标二抗，孵育；以及步骤(7)用磷酸盐缓冲液洗涤，加入AEC或DAB显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明，封片、镜检。

作为本发明的一种实施方式，本发明的免疫组化检测方法中，所述步骤(1)中所述感染动物组织样品为犬的肝、胆、肾、肠组织。

本发明的免疫组化检测方法，不仅可以用于肝组织，还可以高灵敏地检测胆、肾、肠组织。

本发明还涉及所述试剂盒的制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤1)用胶体金标记所述单克隆抗体4F3为金标抗体，制成金标垫，所述单克隆抗体4F3标记时含量为10～60μg/ml；步骤2)固定所述单克隆抗体2F9、羊抗鼠二抗或羊抗鼠多抗分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线T1、质控线，所述单克隆抗体2F9稀释至0.8～2.0mg/ml固定后作为检测线T1，所述羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗为1～3mg/ml固定后作为质控线；步骤3)配制样品处理液，分装；以及步骤4)将所述步骤1)所制备的金标垫、所述步骤2)所制备的硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在底板上，裁剪；连同所述步骤3)制备的样品处理液组装成试剂盒。

作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤1)还包括用胶体金分别标记所述单克隆抗体4H1、单克隆抗体1G5为金标抗体，制成金标垫，所述单克隆抗体4H1标记时含量为20～150μg/ml、所述单克隆抗体1G5标记时含量为20～60μg/ml；所述步骤2)还包括固定所述单克隆抗体2B7、固定单克隆抗体6E11分别吸附于硝酸纤维素膜的一端作为检测线T2、检测线T3、质控线，所述单克隆抗体2B7、所述单克隆抗体6E11分别稀释至1～3mg/ml固定后作为检测线T1、T2、T3。

作为本发明的一种实施方式，所述步骤3)中所述样品处理液为磷酸盐缓冲液。

本发明还涉及所述试剂盒的检测方法，所述检测方法包括：将采集的样品插入到样品处理管中，使样品尽可能溶解在样品处理液中，将处理后的样品滴加至胶体金检测试纸条加样孔中心，10分钟后判定结果。

本发明还涉及所述抗体或抗体片段用于犬腺病毒1型抗原表位鉴定研究；所述抗体或抗体片段为单克隆抗体4F3或单克隆抗体2F9。

本发明的含有所述单克隆抗体对的试剂盒克服了现有技术检测灵敏度低的问题，避免了漏检、假阴性现象发生，不仅可高灵敏地检测多种靶标组织、样本，还能高灵敏地检测非犬动物(狐狸)样本，且具有快速、简便、准确的优势，更有利于临床的应用。

本发明还涉及所述试剂盒在用于非诊断目的的犬腺病毒1型检测中的应用。其中，所述非诊断目的的犬腺病毒1型检测包括流行病学分析、对离体组织进行检测。

附图说明

图1为本发明胶体金试纸条的第一种实施方式的示意图；

图2为本发明胶体金试纸条的第二种实施方式的示意图；

图3为本发明胶体金试纸条的第三种实施方式的示意图；

附图标记：样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、吸水垫4、底板5、检测线6、检测线6A、检测线6B、检测线6C、质控线7。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行说明。

术语“犬腺病毒1型”(Canine adenovirus type I,CAV-1)属于腺病毒属(Adenovirus)，又称犬传染性肝炎病毒(Infectious canine hepatitis virus，ICHV)，感染犬、熊、狐狸等并引发犬传染性肝炎及熊、狐的脑炎，临床症状主要包括呕吐、腹痛、腹泻、体温升高甚至突然死亡、眼睛损伤等。

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、犬源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、犬源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187、GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成核苷酸序列或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。

术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保留与犬腺病毒1型特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。

术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体的氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽的非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。

术语“有效量”当理解为“预防有效量”时，是指能够在接种的个体中足以引发免疫保护反应的量。本领域技术人员知晓，所述“预防有效量”随免疫接种的方式、时机、给药对象以及所述单克隆抗体或其片段的不同而不同，结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规范，本领域技术人员应当能够通过有限的试验得出所用单克隆抗体的“预防有效量”。

术语“有效量”当理解为“治疗有效量”时，是指能够对受试个体产生有效保护以及中和病毒的量。本领域技术人员知晓，所述“治疗有效量”随治疗方案、病程、治疗对象的状况以及所用单克隆抗体或其片段的不同而不同。结合本领域已知的文献和教导以及相应的临床规程，临床技术人员应当能够凭借其经验得出所用单克隆抗体的“治疗有效量”。

术语“有效量”当理解为“检测有效量”时，是指能够以高灵敏度检测出阳性样本，并可区分出阴性样本的量。

术语“药学上可接受的载体”是指不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂。

术语“预防和/或治疗”在涉及犬腺病毒1型感染时是指抑制犬腺病毒1型的复制、抑制犬腺病毒1型的传播或防止犬腺病毒1型在其宿主体内定居，以及减轻犬腺病毒1型感染的疫病或病症的症状。若病毒荷载量减少、病症减轻和/或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。

术语“质控线”、“对照线”可互换使用，是指用于检测抗原抗体反应的条件是否适宜，同时用于监测反应背景能否干扰影响检测结果。

术语“眼鼻拭子”与“眼鼻分泌物”、“咽拭子”与“咽喉分泌物”可互换使用。

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实例中所用的样品保存液为PBS缓冲液(pH7.4，0.01mol/L)，其1L体积配方为：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄ 0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1现有产品检测临床情况分析

收集的193份临床犬、狐狸病料，用PCR检测方法检出95份阳性、98份阴性，用商品化试纸条检出24份阳性、169份阴性。商品化试纸条与PCR方法符合率较低，存在严重的漏检现象，从而误导医者或养殖者使其放松警惕、不能及早预防和治疗。通过跟踪调查发现，漏检、假阴性犬、狐狸，通常随后感染更为严重病患，并且其排泄物或分泌物作为传染源导致群发感染，严重者因未给予及时治疗从而导致死亡。基于此，本发明人开展研究犬腺病毒1型单克隆抗体及相关产品。

另外，流行性学调查发现，现有用于预防犬腺病毒1型的商品化疫苗均为弱毒株，免疫犬后存在散毒的风险，且产生抗体需要一段时间；特别地，幼犬出生后从母乳内能够获取母源抗体，为确保避免母源抗体的干扰，幼犬在6周龄后才可首次接种。而母源抗体消失后自身抗体产生前存在空白期，极易感染犬腺病毒1型。

实施例2犬腺病毒1型单克隆抗体的制备、纯化、鉴定及检验

2.1犬腺病毒1型单克隆抗体的制备和纯化

培养犬腺病毒1型，收获细胞培养物，冻融后3000转/分钟离心30分钟，取上清作为抗原与弗氏佐剂乳化，按终含量200μg/ml免疫小鼠，四免后将小鼠进行细胞融合。用HI方法(将来源于ATCC的CAV-1 Utrecht株用人O型红细胞按《中国兽药典》进行红细胞凝集试验即HA试验，根据结果制备8单位抗原，之后分别将待检样品进行红细胞凝集抑制试验即HI效价检测，按《中国兽药典》进行)进行亚克隆筛选及培养，获得10株阳性杂交瘤细胞，并对其细胞上清测定HI效价。考虑到CAV-1与CAV-2全基因组具有高度同源性，用CAV-2Toronto A26/61株作为HI抗原进行HI评价，结果有5株与CAV-2有交叉反应，见表1。

同时为避免筛选的10株阳性杂交瘤细胞存在假阳性、筛选方法单一造成所筛选杂交瘤细胞所针对的抗原谱选择范围窄、漏筛等现象发生，用CAV-1Utrecht株接种细胞后病变的细胞包被于玻片进行免疫过氧化物酶单层细胞试验即IPMA方法复筛，共获得5株阳性杂交瘤细胞。另中和试验评价10株杂交瘤细胞，结果仅3株即2F9、4F3、4H9有中和活性。详见表1。

表1 CAV-1阳性杂交瘤细胞上清评价结果

根据上述评价结果，将5株即1E7、2F9、4H1、4F3、4H9仅与CAV-1反应的细胞复苏后注射小鼠体内制备腹水。制备过程中发现1株1E7所对产腹水量较少(舍弃)，其余4株所产腹水较好。

故用辛酸-硫酸铵联合沉淀法纯化单克隆抗体2F9、4H1、4F3、4H9的腹水，用SDS-PAGE凝胶电泳进行鉴定，结果：纯度均不低于85％；用BCA蛋白定量试剂盒定量蛋白含量，结果：单克隆抗体2F9、4H1、4F3、4H9的浓度分别为3.8、2.0、3.2、2.8mg/ml。

分别测定4株单克隆抗体的HI、IPMA效价，结果见表2。

表2 CAV-1纯化后单克隆抗体评价结果

2.2试纸条用单克隆抗体配对试验初步研究

用抗体相加试验进行初步研究。将离心后的CAV-1 Utrecht株上清作为包被原，包被于微孔板后用封闭液进行封闭，然后加入第一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应，洗涤、拍干，再加入另一株饱和浓度的单克隆抗体与之反应。两株单克隆抗体反应完毕后，再加入HRP标记的羊抗鼠IgG与之反应，洗涤、显色，测定其吸光度A值。按公式AI＝[(A1.2-A1)/A2]×100％，分别计算单隆抗体两两叠加的增值指数AI。其中，A1、A2分别为单抗1和2的A值，A1.2为单抗1叠加单抗2的A值；当AI大于50％即可初步断定两种单抗对应不同的抗原结合位点。结果见表3。可知：仅单克隆抗体4F3、2F9抗体相加指数AI值均＞50％，其余均＜50％。表明两株单克隆抗体识别不同的抗原表位，可用于建立双抗体夹心方法检测抗原。

表3单克隆抗体两两叠加的增值指数AI

2.3单克隆抗体4F3、2F9其它特性的鉴定

亚型：用单克隆抗体亚型试剂盒对抗体的亚型进行鉴定。结果：单克隆抗体4F3、2F9的重链亚型均为IgG1，轻链亚型均为kappa。

特异性：将CAV-1、CAV-2、犬瘟热病毒CDV、犬细小病毒CPV、犬副流感病毒CPIV、水貂犬瘟热病毒以及培养的CAV-1用MDCK细胞分别包被于玻片上进行IPMA检测，用于测定单克隆抗体的特异性。结果：单克隆抗体4F3、2F9与犬常见病毒CAV-2、CDV、CPV、CPIV、水貂犬瘟热病毒及MDCK细胞均无交叉反应，仅与CAV-1呈阳性反应，表明：单克隆抗体4F3、2F9均为犬腺病毒1型的特异性单克隆抗体。

中和活性：按《中国兽药典》中和试验法中的固定病毒稀释血清法分别测定纯化后单克隆抗体4F3、2F9对CAV-1的中和效价，具体为：将实施例2.2制备的纯化后的2株单克隆抗体稀释与含100个TCID₅₀的病毒液等量混合，每个滴度重复4孔，同时设健康细胞、阳性对照。置37℃作用1h后，用含8％血清的培养基稀释至2×10⁴个细胞/ml，100μl/孔加入以上96孔细胞培养板，于37℃、5％CO₂培养箱培养5天，观察细胞病变情况。结果：对照均成立，根据细胞病变情况计算单克隆抗体的中和效价，结果见表2。表明：2株单克隆抗体对CAV-1均具有较好的中和活性，可用于开发制备预防和治疗犬腺病毒1型病的药物组合物。

2.4单克隆抗体4F3、2F9识别蛋白的研究

用DNA试剂盒提取CAV-1核酸并作为模板，设计引物分别用PCR扩增Fiber蛋白、Penton蛋白的基因序列，通过杆状病毒表达系统表达，将表达后的质粒转染至Vero细胞，培养后80％冷丙酮固定，作为IFA抗原板，将单克隆抗体作为一抗进行间接免疫荧光IFA检测。结果：单克隆抗体4F3、2F9均只与Fiber蛋白构建的质粒呈阳性反应。表明：单克隆抗体4F3、2F9均识别CAV-1的Fiber蛋白。

2.5单克隆抗体4F3、2F9可变区序列的测定

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计重链可变区引物序列：

P1：ACTAGTCGACATGAAGWTGTGGBTRAA

P2：CCAGGGRCCARKGGATARACNGRTGG

设计轻链可变区引物序列：

P3：ACTAGTCGACATGGAGWCAGACACACTSCT

P4：CCCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATCCA

收集2株单克隆抗体4F3、2F9的细胞上清，提取RNA后反转录作为模板，用上述引物对其可变区序列进行扩增，将扩增产物送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，单克隆抗体4F3的重链可变区、轻链可变区序列分别如SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.2所示，单克隆抗体2F9的重链可变区、轻链可变区序列分别如SEQ.ID No.3、SEQ.ID No.4所示。

实施例3免疫组化方法的建立及应用

3.1免疫组化方法的建立

免疫组化的方法包括以下步骤：

1)取材：采集犬的肝、胆、肾、肠等组织样品，迅速置于福尔马林固定，必要时对其进行适当修块。

2)石蜡切片的制备：组织样品固定后经流水冲洗后再用自动脱水机进行脱水、透明、浸蜡，用包埋机包埋后切片、展片、裱片于用三氨丙基三乙氧基硅烷处理的玻片上，烤片。

3)抑制内源性酶：将玻片按常规脱蜡至蒸馏水，滴加3％H₂O₂静置以抑制内源性酶。

4)抗原修复：用抗原热修复如高压热修复、煮沸热修复、微波热修复，或酶消化法处理烤片后的玻片以修复抗原。

5)封闭：用磷酸盐缓冲液洗涤3次，滴加封闭液如马血清、或牛血清白蛋白(BSA)封闭。

6)染色：吸去封闭液后加入稀释的一抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟或2-8℃孵育过夜；用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入酶标的羊抗鼠抗体作为酶标二抗，室温孵育1小时或37℃孵育45-60分钟。

7)显色：用磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入AEC或DAB显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明，封片、镜检。

3.2免疫组化用一抗的筛选

将实施例2制备的4株单克隆抗体2F9、4H1、4F3、4H9为一抗，倍比稀释后对CAV-1Utrecht株攻毒后收集的临床病料，按实施例3.1所述方法进行免疫组化检测，结果(见表4)：单克隆抗体2F9、4F3用于免疫组化反应时效价分别为1∶500、1∶1200，背景均干净。

表4免疫组化用一抗的评价结果

3.3临床应用

将临床收集的208份肝、胆、肾、肠等组织样品经CAV-1PCR方法检测，共检出120份阳性、88份阴性。将单克隆抗体2F9 1∶500稀释液)、4F3 1∶1200稀释液分别作为一抗按实施例3.1所述免疫组化方法进行检测，两种抗体检测结果一致，共检出131份阳性(以肝组织样品检出率为最高)、77份阴性。PCR与免疫组化的符合率为94％，检测效果略差。特别地，免疫组化结果显示病变组织集中于肝组织且呈现密集状态，其次为胆、肾。

综上所述，以单克隆抗体2F9、4F3为一抗建立的免疫组化方法可代替PCR方法进行更为准确有效的流行病学调查；可准确定位病变组织、清晰明了地观察到病原在组织中的密集状态，使得病原检测更加直观清晰，为犬腺病毒1型所引发的疫病预防和治疗提供支持，为后期犬腺病毒1型致病机理和过程的研究，以及表位鉴定研究奠定基础。

实施例4试纸条的制备及应用

4.1试纸条用单克隆抗体配对试验进一步研究

用CAV-1Utrecht株(10^8.3TCID₅₀/ml)的稀释液、PCR检测为阴性的粪便、PBS缓冲液，对单克隆抗体配对试验进行进一步确认，结果见表5：

表5单克隆抗体搭配结果汇总

注：“+”代表阳性，“-”代表阴性。

结果：固定单克隆抗体2F9、标记单克隆抗体4F3搭配后制备试纸条，检测CAV-1灵敏度仅为10^6.0TCID₅₀/ml，检测阴性粪便、PBS缓冲液均为阴性，表明此搭配模式会使灵敏度降低；而固定单克隆抗体4F3、标记单克隆抗体2F9搭配后制备试纸条检测CAV-1灵敏度高(为10^4.8TCID₅₀/ml)，检测阴性粪便、PBS缓冲液均为阴性，故选择这一搭配模式进行后续研究。

4.2胶体金检测试纸条的制备及检测

4.2.1试纸条1-4的制备及检测

将0.01％氯金酸溶液加热煮沸后再加入1％柠檬酸三钠溶液，制备成胶体金，冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。

用0.2mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液的pH至8.0，匀速搅拌后将单克隆抗体2F9溶液(工作浓度为10-60μg/ml)加于胶体金溶液中进行标记，搅拌后逐滴加入适量的10％BSA，匀速搅拌30min。于2～8℃静置2小时后，4℃2000r/min离心30min，沉淀用1/10体积的含1％BSA的PBS缓冲液溶解即为金标单克隆抗体2F9，用喷涂或浸泡使金标单克隆抗体2F9包被做成金标垫2；将单克隆抗体4F3(包被浓度为0.8-2.0mg/ml)和羊抗鼠二抗(包被浓度为1-3mg/ml)喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线6和质控线7。将样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4粘贴于底板5上，即为犬腺病毒1型胶体金检测试纸条(作为试纸条1)。样品处理管内含磷酸盐缓冲液制备的样品处理液。

将标记单克隆抗体2F9、固定单克隆抗体4F3，以及犬副流感病毒单克隆抗体4H1、2B7与CN105695420A中犬瘟热病毒单克隆抗体1G5、6E11，制备胶体金溶液并分别标记4H1(标记时对应pH值为8.2、标记浓度为20～50μg/ml)和1G5(按CN105695420A专利进行，标记浓度为20～60μg/ml)，用喷涂或浸润使金标单克隆抗体4H1和1G5包被做成金标垫2；将单克隆抗体2B7、6E11和羊抗鼠二抗喷涂在硝酸纤维素膜上分别作为检测线6B、检测线6C和质控线(C)。将样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3和吸水垫4粘贴于底板5上，即为胶体金检测试纸条。样品处理管内含磷酸盐缓冲液制备的样品处理液。有三种组合方式：①金标垫2包被标记后的2F9、4H1，硝酸纤维素膜上2条检测线6A、6B分别为单克隆抗体4F3、2B7，质控线为羊抗鼠二抗，作为试纸条2。②金标垫2包被标记后的2F9、1G5，硝酸纤维素膜上2条检测线6A、6B分别为单克隆抗体4F3、6E11，质控线为羊抗鼠二抗，作为试纸条3。③金标垫2包被标记后的2F9、4H1、1G5，硝酸纤维素膜上3条检测线6A、6B、6C分别为单克隆抗体4F3、2B7、6E11，质控线为羊抗鼠二抗，作为试纸条4。

检测时，将待检样品置于样品处理管中，使样品尽可能溶解在溶液中，将含有待检样品的样品处理管盖子头部折断，滴加2-4滴混匀后的样品至试纸条加样孔中心；10分钟后在检测试纸条的检测区观察记录结果，并依据判定标准进行判定。结果判定标准：质控线显色即试验成立，则检测线显色即为阳性、不显色即为阴性；质控线未显色即试验不成立，无论检测线是否显色均判定为无效结果，需重测。

4.2.2试纸条中单克隆抗体工作浓度的优化

分别按表6中的固定单克隆抗体4F3、金标单克隆抗体2F9的浓度制备试纸条，并对不同梯度的CAV-1Utrecht株(10^8.3TCID₅₀/ml)的稀释液、样品处理液、PCR检测20份阳性样品进行检测。选择试纸条检测灵敏度高、与PCR符合率高且检测样品处理液背景清晰的搭配模式，作为胶体金试纸条制备的固定抗体浓度、金标抗体标记浓度。结果(见表6)：固定抗体浓度为0.5-2.5mg/ml、金标抗体标记浓度5～70μg/ml时均可制备试纸条用于检测，但当固定抗体浓度为0.8-2.0mg/ml、金标抗体标记浓度为10～60μg/ml时制备的试纸条检测效果最优。

表6试剂条1中单克隆抗体工作浓度

另从成本角度考虑用试纸条1C用于后续评价。

4.3胶体金检测试纸条的应用

4.3.1试纸条1-4特性研究

按照实施例4.2.1中所述的检测方法，用试纸条1-4分别检测CAV-1Utrecht株、犬副流感病毒CPIV HeN0718株(Caihong Liu，Xiangdong Li et.al.Isolation and genomiccharacterization of a canine parainfluenza virus type 5strain inChina.Archives of Virology,August 2017,Volume 162,Issue 8,pp 2337–2344)、犬瘟热病毒CDV CVCC AV299株(源于中国微生物资源平台)、CAV-2 Toronto A26/61株各病毒液的稀释液，及犬细小病毒CPV阳性病料、犬冠状病毒CCV阳性病料、PCR检测的CAV-1阴性病料，并用商品化上海快灵CAV-1试纸条按其试剂盒说明书进行检测，结果见表7。

表7试纸条1-4及商品化产品检测样品结果比对

注：“+”表示检测结果为阳性，“－”表示检测结果为阴性，“/”表示未检测。

由表7可知：试纸条1-4对CAV-1的灵敏度均为10^4.8TCID₅₀/ml，特异性良好，而商品化试纸条的灵敏度远低于试纸条1-4的灵敏度，极易造成临床检测假阴性，使得发病动物错过最佳治疗时间而导致不必要的损失。特别地，试纸条2-4还可同时鉴别检测CDV和/或CPIV，使得混合感染病例确诊，可及早开展治疗。

4.3.2临床应用

4.3.2.1CAV-1病料检测

对收集的临床犬、狐狸病料用CAV-1PCR方法检测按照说明书检测后获得193份临床样品(包括95份阳性、98份阴性)，用试纸条1-4检测，同时用商品化上海快灵CAV-1胶体金检测试纸条按照其说明书进行检测，结果见表8。

表8临床检测结果比较

注：“+”表示检测结果为阳性所对应的份数，“－”表示检测结果为阴性所对应的份数；阳性符合率、阴性符合率表示与PCR检测结果一致的比率。

由表7可知：试纸条1-4检测与PCR方法的阳性符合率为85％～87％，总符合率为92％～93％，而商品化试纸条检测与PCR的阳性符合率为22％，总符合率为55％。表明本发明所制备的试纸条可以检测CAV-1，与CDV、CPIV制备的联检试纸条对各自检测也不会造成干扰，与经典方法PCR较为接近，检测结果较为准确、可靠，而商品化试纸条存在严重的漏检、假阴性现象，从而误导医者或养殖者使其放松警惕、不能及早预防和治疗，导致犬、狐狸等感染对象严重患病甚至死亡。

本发明的试纸条1-4不仅能高灵敏地检测犬的不同组织样品、病料；还能高灵敏地检测非犬动物(狐狸)的不同组织样品、病料；填补了现有商业应用上的空白。

4.3.2.2CDV、CPIV病料检测

用试纸条2-4检测102份CDV、CPIV单独和混合感染的临床病料(含有发热、咳嗽、流涕等呼吸道症状犬及攻毒试验犬咽拭子、眼鼻拭子、血清样品)，具体如下。

CPIV抗原检测：CPIV RT-PCR检测CPIV阳性64份、阴性38份，试纸条2、4检出50～51份阳性，阳性率为78.1％～79.7％，阴性符合率100％，总符合率为86.3％～87.3％，便于临床推广应用。详见表9。

表9犬源临床样品检测CPIV结果

CDV抗原检测：CDV RT-PCR检测CDV阳性56份、阴性46份，试纸条3、4检出阳性43～44份，阳性率为76.8％～78.6％，阴性符合率100％，总符合率为87.3％～88.2％，比商品化试纸条检测效果优，便于临床推广应用。详见表10。

表10犬源临床样品检测CDV结果

综上所述，本发明所制备的试纸条1-4，克服了商品化试纸条检测灵敏度低的问题，避免了漏检、假阴性现象的发生；解决了现有技术不能检测狐狸病料的问题，为该经济动物提供了技术支持；解决了现有技术不能检测多种靶标的缺陷；具有快速、简便、准确的优势，便于非诊断目的的犬腺病毒1型检测中的临床应用，特别是流行病学调查、健康体检及排查等研究。

实施例5单克隆抗体预防、治疗CAV-1感染的评价

5.1单克隆抗体治疗病毒感染的评价

将16只CAV-1抗原、抗体阴性的小于1.5月龄幼犬随机分成A1～A4 4组，将16只CAV-1阴性的大于1.5月龄的犬随机分成B1～B4 4组，分别按5ml/只的剂量口鼻接种CAV-1Utrecht株病毒液(10^8.0TCID₅₀/ml)，接种后连续观察临床症状。试验犬出现呕吐、腹痛、腹泻、体温升高、蓝眼等犬传染性肝炎症状判为发病，取每只犬的粪便用CAV-1PCR方法进行检测，结果为犬腺病毒1型感染阳性。按每1kg体重注射1ml的量肌肉注射，1组注射单克隆抗体2F9，2组注射单克隆抗体4F3，3组注射单克隆抗体4F3、2F9 1/1(V/V)混合液，4组注射生理盐水作为对照。注射后连续观察10天，计算病犬治愈率及治愈情况，并用PCR检测排毒情况，结果见表11。可知：当CAV-1感染时，犬只单独或混合注射单克隆抗体4F3、2F9后治疗均能完全保护、效果良好，且对小于1.5月龄幼犬的治疗效果早于大龄犬的，以单克隆抗体4F3单独注射、两种单克隆抗体混合注射效果较优。

表11发病犬治愈及排毒情况汇总

5.2单克隆抗体预防病毒感染的评价

将16只CAV-1抗原、抗体阴性的小于1.5月龄幼犬随机分成C1～C4组，将16只CAV-1阴性的大于1.5月龄的犬随机分成D1～D4组。按表12每1kg体重肌肉注射1ml，1组注射单克隆抗体2F9，2组注射单克隆抗体4F3，3组注射单克隆抗体4F3、2F9 1/1(V/V)混合液，4组注射生理盐水作为对照。1天后按5ml/只的剂量口鼻接种CAV-1Utrecht株病毒液(10^8.0TCID₅₀/ml)。连续观察10天，每日观察犬的临床症状，通过临床死亡率、发病情况及用PCR方法检测粪便中的排毒情况，评价该单克隆抗体的预防犬腺病毒1型感染的效果，结果见表12。可知：当遭遇CAV-1侵袭时，犬只单独或混合注射单克隆抗体2F9、4F3均能保护、效果良好，以单克隆抗体4F3单独注射、两种单克隆抗体混合注射效果较优，且对幼犬的预防效果早于大龄犬的。

表12犬只预防及排毒情况汇总

综上所述，2株单克隆抗体施用能够减轻由犬腺病毒1型引起的临床症状，减少死亡率以及减少排毒现象，具有较好的治疗和/或预防作用。特别地，不用考虑母源抗体干扰，小于1.5月龄幼犬也可使用。

实施例5基因工程抗体的制备及应用

按照李越等(李越.A型流感病毒单链抗体基因的克隆及抗病毒活性研究.新疆农业大学硕士学位论文,2014)建立的单链抗体制备的操作方法，分别用单克隆抗体4F3、2F9的可变区序列制备相对应的单链抗体1和单链抗体2，用单克隆抗体4F3的重链可变区和单克隆抗体2F9的轻链可变区制备单链抗体3，用单克隆抗体2F9的重链可变区和单克隆抗体4F3的轻链可变区制备单链抗体4。按照《中国兽药典》对单链抗体1-4分别进行HI效价检测，结果：单链抗体1-4对CAV-1的HI效价均≥1∶2560，表明单链抗体1-4与CAV-1具有良好的反应特性。

按照实施例2所述方法，测定单链抗体1-4对CAV-1的中和效价，结果为1∶320～1∶640，表明单链抗体1-4均可以和CAV-1,发生特异性的中和反应。

以上结果显示SEQ.ID No.1、SEQ.ID No.2、SEQ.ID No.3和SEQ.ID No.4可用于犬腺病毒1型基因工程抗体的制备，也可将其用于制备预防和/或治疗犬腺病毒1型相关疾病的药物组合物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 洛阳普泰生物技术有限公司

<120> 犬腺病毒1型单克隆抗体、可变区序列、杂交瘤细胞株及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 360

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞4F3株（hybridoma strain 4F3）

<400> 1

caggtgcaac tgaaggaatc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatt 60

acctgcgctg tctctgggtt ctcattaagc aactatgata taagttggaa tcgccagcca 120

ccaggaaagg gtctggagtg gcttggagta atatgggctg gtggacgtac agattataat 180

tccgctttca tgtccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaatc tgatgacaca gccatatatt actgtgtaag agaggggggg 300

ctctaccaag attacgacgg ggcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞4F3株（hybridoma strain 4F3）

<400> 2

caaattgttc tcacccagtc tccaacaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

ataacctgca gtgccacctc aagtgtaagt tacatgcact ggttccagca gaagccaggc 120

acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt cccttctcgc 180

ttcagtggca gtggatctgg gacctcttat tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattattg ccagcaaagg agtagttacc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaatgaaacg g 321

<210> 3

<211> 351

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞2F9株（hybridoma strain 2F9）

<400> 3

cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60

tcctgcaagg cttctggttc taccttcaca gccttttcaa tgcactgggt gaagcaggct 120

ccaggagagg gtttaaagtg gatgggctgg atatacactg agactggtga gccaacatat 180

gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccac cactgcctat 240

ttgcagatca acaacctcaa aagtgaggac acggctacat atttctgtag tagagagggg 300

gggacgtcgt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 4

<211> 324

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞2F9株（hybridoma strain 2F9）

<400> 4

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct cctctactac acatcaagat tgcactcagg agtcccgtca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtgctaccc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggaaataga acgg 324

<210> 5

<211> 348

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞2B7株（hybridoma strain 2B7）

<400> 5

gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60

tcatgtgcag cctctttact agtcgacatg aagatgtggg tgaactgggt ccgccaggct 120

ccaggaaagg ttttggaatg ggttgctcgc ataagaagta aaagtaataa ttatgcaaca 180

tattatgccg attcagtgaa agacaggttc accatctcca gagatgattc acaaagcatg 240

ctctatcttc aaatgaacaa cttgaaaact gaggacacag ccatgtatta ctgtgtgaga 300

gaagctctct actactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞2B7株（hybridoma strain 2B7）

<400> 6

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

ttcctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcggt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcggagtgg ggactgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagttc acatgttcct 300

ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaag 336

<210> 7

<211> 351

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞4H1株（hybridoma strain 4H1）

<400> 7

gaggtgcagc ttgttgagac tggtggagga ttggtgcagc ctaaagggtc attgaaactc 60

tcatgtgcag cctcacctat actagtcgac atgaagatgt gggtgaactg ggtccgccag 120

gctccaggaa agggtttgga atgggttgct cgcataagaa gtaaaagtaa taattatgca 180

acatattatg ccgattcagt gaaagacagg ttcaccatct ccagagatga ttcacaaagc 240

atggtctatc tgcaaatgaa caacttgaaa actgaggaca cagccatgta ttactgtgtg 300

agagaagctc tctactactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 8

<211> 336

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞4H1株（hybridoma strain 4H1）

<400> 8

gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagagtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgtaga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagttc acatgttcct 300

ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

Claims

1.一种特异性结合犬腺病毒1型的的单克隆抗体的可变区序列，其中，所述单克隆抗体为单克隆抗体4F3或2F9；

所述单克隆抗体4F3重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体4F3轻链可变区为SEQ.ID No.2所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；

所述单克隆抗体2F9重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述单克隆抗体2F9轻链可变区为SEQ.ID No.4所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

2.一种特异性结合犬腺病毒1型的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.ID No.1所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区为SEQ.IDNo.2所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；

优选地，所述抗体为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段，所述抗体或所述抗体的片段仍保留特异性结合犬腺病毒1型的能力；

更优选地，所述抗体为单克隆抗体4F3。

3.一种特异性结合犬腺病毒1型的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段重链可变区为SEQ.ID No.3所示序列或其简并序列编码或其经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；以及所述抗体或抗体片段轻链可变区所示序列或其简并序列编码或其序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；

更优选地，所述抗体为单克隆抗体2F9。

4.一种杂交瘤细胞4F3株，所述杂交瘤细胞4F3株分泌权利要求2所述的单克隆抗体4F3。

5.一种杂交瘤细胞2F9株，所述杂交瘤细胞2F9株分泌权利要求3所述的单克隆抗体2F9。

6.一种药物组合物，其中，所述药物组合物包含免疫量的特异性结合犬腺病毒1型的抗体，以及药学上可接受的载体；

所述特异性结合犬腺病毒1型的抗体选自一种或多种以下抗体：单克隆抗体4F3、单克隆抗体2F9、单克隆抗体4F3的重链可变区和轻链可变区连接而成的单链抗体、单克隆抗体4F3的重链可变区和单克隆抗体2F9的轻链可变区连接而成的单链抗体、单克隆抗体4F3的轻链可变区和单克隆抗体2F9的重链可变区连接而成的单链抗体、单克隆抗体2F9的重链可变区和轻链可变区连接而成的单链抗体。

7.根据权利要求6所述的药物组合物在制备预防和/或治疗犬腺病毒1型感染相关疾病的药物中的应用。

8.一种试剂盒，其中，所述试剂盒包括有效量的所述单克隆抗体4F3、有效量的所述单克隆抗体2F9，以及对犬腺病毒1型抗原抗体反应进行检测的检测试剂；

其中，所述试剂盒包括胶体金检测试纸条，所述胶体金检测试纸条包括部件：底板(5)，所述底板(5)具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向上依次有样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)，所述硝酸纤维素膜(3)与金标垫(2)接触或与样品垫(1)、金标垫(2)接触使得犬腺病毒1型抗原与所述单克隆抗体2F9的结合体能在其上向底板第二端迁移；所述金标垫(2)上含有胶体金标记的所述单克隆抗体2F9，所述硝酸纤维素膜上包括检测线(6)和一条质控线(7)，所述检测线(6)上固定化有所述单克隆抗体4F3，所述质控线(7)上固定化有羊抗鼠多抗或羊抗鼠二抗；

其中，所述单克隆抗体4F3固定含量为0.5-2.5mg/ml，所述单克隆抗体2F9标记时含量为5-70μg/ml；

优选地，所述试剂盒中沿所述第一端向第二端的方向上依次排列的所述样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)和吸水垫(4)相邻的部件之间相互接触，而不相邻的部件之间不接触；所述试剂盒还包括样品处理液，所述样品处理液为磷酸盐缓冲液；

优选地，所述单克隆抗体4F3固定含量为0.8-2.0mg/ml，所述单克隆抗体2F9标记时含量为10-60μg/ml。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述金标垫(2)上含有胶体金标记的所述单克隆抗体2F9、4H1和/或1G5，所述硝酸纤维素膜(3)上包括二条或三条检测线，所述二条或三条检测线上分别固定化有所述单克隆抗体4F3、2B7和/或6E11；

其中，所述单克隆抗体4H1标记时含量为20～150μg/ml，所述单克隆抗体1G5标记时含量为20～60μg/ml，所述单克隆抗体2B7固定含量为1～3mg/ml，所述单克隆抗体6E11固定含量为1～3mg/ml；所述犬副流感病毒单克隆抗体2B7重链可变区为SEQ ID No.5所示序列或其简并序列编码、轻链可变区为SEQ ID No.6所示序列或其简并序列编码，所述犬副流感病毒单克隆抗体4H1重链可变区为SEQ ID No.7所示序列或其简并序列编码、轻链可变区为SEQ ID No.8所示序列或其简并序列编码；所述犬瘟热病毒单克隆抗体6E11由保藏号为CCTCC No：C2015202的小鼠骨髓杂交瘤细胞6E11株分泌，所述犬瘟热病毒单克隆抗体1G5由保藏号为CCTCC No：C2015201小鼠骨髓杂交瘤细胞1G5株分泌；优选地，所述相邻的所述检测线之间、离所述质控线最近的检测线与质控线之间的距离≥4mm。

10.一种免疫组化检测方法，其中，所述方法包括：

步骤(1)采集感染动物组织样品，对所述组织样品进行修块，迅速置于福尔马林固定；优选地，所述感染动物组织样品为犬的肝、胆、肾、肠组织；

步骤(2)将所述步骤(1)固定的组织样品经流水冲洗后脱水、透明、浸蜡，经包埋后切片、展片、裱片于用三氨丙基三乙氧基硅烷处理的玻片上，烤片；

步骤(3)所述玻片脱蜡至蒸馏水，滴加3％H₂O₂静置以抑制内源性酶；

步骤(4)使用热修复，或酶消化法处理所述烤片后的玻片以修复抗原，所述热修复包括高压热修复、煮沸热修复、或微波热修复；

步骤(5)用磷酸盐缓冲液洗涤所述修复抗原，滴加封闭液如马血清、或牛血清白蛋白封闭；

步骤(6)吸去封闭液后加入稀释的一抗，所述一抗为单克隆抗体4F3或2F9，孵育，用磷酸盐缓冲液洗涤，加入酶标的羊抗鼠抗体作为酶标二抗，孵育；以及

步骤(7)用磷酸盐缓冲液洗涤，加入AEC或DAB显色液显色，视染色情况用磷酸盐缓冲液或蒸馏水终止；加入苏木素衬染细胞核以复染，必要时进行脱水、透明，封片、镜检。