CN109959788A

CN109959788A - 一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的包被抗原和酶标抗体及阻断法试剂盒

Info

Publication number: CN109959788A
Application number: CN201711420798.5A
Authority: CN
Inventors: 田克恭; 晋育丹; 昌静峰
Original assignee: Luoyang Pu Laikewantai Bioisystech Co Ltd
Current assignee: Luoyang Pu Laikewantai Bioisystech Co Ltd
Priority date: 2017-12-25
Filing date: 2017-12-25
Publication date: 2019-07-02
Anticipated expiration: 2037-12-25
Also published as: CN109959788B

Abstract

本发明涉及一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的阻断法试剂盒，该试剂盒中含有包被了本发明的猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的支持介质或包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原两种抗原的支持介质、酶标记的单克隆抗体11H1、以及用于对猪伪狂犬病病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照。本发明的试剂盒能广谱性地检测感染了猪伪狂犬病病毒的猪血清中的gE抗体，检测灵敏度高，特异性好，检测后的灰区即可疑样品少，易于伪狂犬病的净化。

Description

一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的包被抗原和酶标抗体及阻断法试剂盒

技术领域

本发明涉及用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的阻断法检测试剂盒、其中包含的包被抗原、制备该包被抗原的方法、检测抗体，属于生物医药领域。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies，PR；又名奥耶斯基氏病，Aujeszky’s disease)，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病，对我国乃至全球养猪业的健康发展造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业健康发展的重大传染病之一。猪是本病的传染源、天然宿主和储存者，健康猪与病猪、带毒猪直接接触均可感染本病。成年猪常为隐性感染；受感染的怀孕母猪则出现流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等病征；受感染的新生仔猪出现发热及神经症状，甚至衰竭死亡，死亡率可达100％。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在伪狂犬病的防治工作中，监测和检测猪血清中伪狂犬病病毒抗体的水平是非常重要的一个环节。

市场上现有的伪狂犬疫苗以PRV gE基因缺失疫苗为主，接种这些疫苗的猪血清中不含有猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体。对于尚未接种的猪只，血清中的猪伪狂犬病病毒gE抗体既可能反映了母源抗体的影响，也可能反映了隐性感染的迹象。故可通过检测猪血清gE蛋白抗体确定免疫猪群中野毒感染情况，进而可将感染的猪只隔离或捕杀从而防止病毒传播，达到净化伪狂犬病的目的。

目前，PRV gE抗体的检测方法主要为阻断ELISA，而现有商品化阻断ELISA试剂盒包被原为蛋白或全病毒，当包被原为蛋白时，所用蛋白均为生物工程手段如大肠杆菌、杆状病毒构建表达的PRV gE重组蛋白或其抗原表位蛋白，用其制备的试剂盒检测，结果特异性差、易出现假阴性从而漏检；当包被原为全病毒时，全病毒为经典株(因变异株自2011年10月起流行)经过一系列灭活纯化获得的抗原，制备的试剂盒检测变异株感染后的血清结果灵敏度欠佳，易造成假阳性结果，且灰区样品较多，无法准确判断样品为阴性还是阳性，不利于伪狂犬病的净化。另外，当包被原为全病毒时，对抗原纯度要求较高，对PRV不同类型毒株的纯化需经过大量筛选和反复检测。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的阻断法试剂盒，其中，所述试剂盒包括：包被了猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的支持介质或包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原两种抗原的支持介质、酶标记的单克隆抗体11H1、以及用于对猪伪狂犬病病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；其中所述猪伪狂犬病病毒变异株为HN1201株、HN1202株、JS-2012株、HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株、NVDC-PRV-SD株、TJ株、或ZJ01株，所述猪伪狂犬病病毒经典株为Fa株或Ma株；所述单克隆抗体11H1抗体的可变区序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；所述猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原的制备先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原，或者先用β-丙内酯灭活，再用PEG20000进行浓缩，最后经密度梯度离心纯化获得抗原。

本发明的试剂盒能在感染早期即能检出感染病毒的阳性血清，更利于伪狂犬病的净化；灵敏度高，特异性好，检测后的灰区即可疑样品少，易于伪狂犬病的净化。其检测结果较病毒中和试验更早检测出阳性结果。

本发明的试剂盒对猪伪狂犬病病毒不同类型毒株(经典株和变异株)感染猪只均能特异性检测，而对感染其他病原的猪只均表现阴性结果，保证了检测结果的准确。

猪伪狂犬病病毒不同类型毒株经特定灭活、浓缩、纯化的方法组合后制备的包被原，连同PRV gE蛋白单克隆抗体，组装猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体检测试剂盒，可用于鉴别猪伪狂犬病野毒感染和疫苗免疫，具有灵敏度高、特异性好、检出的灰区样品少等优点，可用于猪伪狂犬病(特别是猪伪狂犬病病毒变异株引发)的净化。

猪伪狂犬病病毒经典株发病后的临床症状因日龄而异，成年猪一般呈隐性感染，症状较轻微；怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊胎和种猪不育等综合症候群；15日龄以内的仔猪发病死亡率可高达100％；成年肥猪可出现生长停滞、增重缓慢等。病猪剖检后主要是肾脏布满针尖样出血点，有时可见肺水肿、脑膜表面充血、出血，脑脊髓液量过多，肝、脾等实质脏器常可见灰白色坏死病灶、肺出血、水肿、坏死点。免疫现有疫苗后即可得到预防和治疗。现有经典株包括但不限于Fa株、MA株，均可通过商品化购买获得。

猪伪狂犬病病毒变异株主要自2011年10月份开始流行，发病后的临床表现为毒株的毒力明显增强，可感染任何年龄的猪如母猪、哺乳仔猪、保育猪、小中猪，全部显性感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，均表现高热(40～42℃，持续3日以上)、呼吸困难(喘、咳嗽、打喷嚏)、食欲废绝、神经症状、口吐白沫、拉黄色水样稀粪、眼肿、发病率(10％～100％)、病死率(10％～100％，仔猪死亡率可高达100％)均很高，并可引起公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)、早产、死胎、弱仔(弱仔14日龄前死亡率高达90％以上)等繁殖障碍症状，但不限于此。病猪都有非常典型的伪狂犬病变且非常严重，扁桃体水肿、化脓、溃疡及白色坏死结节，肝脏有黄白色坏死点或坏死结节，肠道出血、肺脏出血、淋巴结肿大出血、肾出血、脑出血、水肿等病理变化特典型，眼肿表现明显，特别是出现心肌坏死，是以前临床没有过的症状。免疫现有疫苗后仍然发病。现有变异株包括但不限于HN1201株、HN1202株、JS-2012株、HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株、NVDC-PRV-SD株、TJ株、ZJ01株。其中，猪伪狂犬病病毒株JS-2012株公开于免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].童武，张青占，郑浩等，中国动物传染病学报2013,21(3):1-7)；猪伪狂犬HeN1株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNO.6656，公开于专利申请CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDC PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开于Pathogenic Pseudorabies Virus,Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,etal.China,2012Emerging Infectious Diseases，www.cdc.gov/eidol.20,No.1,January2014；PRV TJ strain(PRVTJ)株，公开于ChinaChun-HuaWangJinYuan1,Hua-YangQin1，etal，A novel gE-deleted pseudorabiesvirus(PRV)provides rapid andcomplete protection from lethal challenge with the PRV variant emerginginBartha-K61-vaccinated swine population in China Vaccine 32(2014)3379 3385中；猪伪狂犬病病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCCNo.8170，公开于CN103627678A；猪伪狂犬病病毒HN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)保藏号为CCTCC NO.V201311，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日，参见中国专利CN104004774A；猪伪狂犬病病毒HN1202株(Pseudorabies virus,strainHN1202)保藏号为CCTCCNO.V201335，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日，公开于CN104328090A。

术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源的抗体群的抗体，即组成该群体的抗体个体都相同，除了可能存在少量可能的自发突变。因此，修饰语“单克隆”是指该抗体的性质不是离散抗体的混合物。优选地，所述单克隆抗体包括单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、猪源化抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。抗体为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子，因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物、猪源化抗体以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型(如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA)及其亚型亚类；也可以是包含抗原结合结构域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb、Fd；和双链抗体(diabodies)。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP.A.0120694和EP.A.0125023中描述。抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区，参见EP.A.184187，GB2188638A或EP.A.239400。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。用于本发明的“单克隆抗体”也可用杂交瘤方法制得，因为编码本发明鼠源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到，因而也可用重组DNA方法，可用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。最后，在适合本发明抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞，然后本领域技术人员应用熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的单克隆抗体。抗体包含通过二硫桥连接在一起的多肽链几何体，称为轻链和重链的两条多肽主链构成抗体的所有主要结构类别(同型物)。重链和轻链都进一步可分为称作可变区和恒定区的一些亚区。重链包括单个的可变区和三个不同的恒定区，轻链则包括单个可变区(不同于重链的可变区)和单个恒定区(不同于重链的恒定区)。重链和轻链的可变区负责抗体的结合特异性。

术语“重链可变区”是指一种多肽，其长度为110至125个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从重链N末端氨基酸开始的重链氨基酸顺序。同样，术语“轻链可变区”是指一种多肽，其长度为95至115个氨基酸，其氨基酸顺序相应于本发明单克隆抗体从轻链N末端氨基酸开始的轻链氨基酸顺序。本领域普通技术人员显然知晓，在本发明所具体公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列基础上，可以通过常规基因工程和蛋白质工程方法进行一个或多个氨基酸的添加、删除、替换等修饰，获得保守性变异体，而仍能够保持与猪伪狂犬病病毒gE蛋白特异性结合。本发明中的单克隆抗体还包括其活性片段或保守性变异体。

术语“保守性变异体”是指基本上保留了其母本的特性，如基本的免疫学生物特性、结构特性、调节特性或生化特性的变异体。一般地，多肽的保守性变异体之氨基酸序列不同于母本多肽，但是差异是有限的，以使与母本多肽之序列与保守性变异体总体上非常相似，并且在许多区域是相同的。保守性变异体和母本多肽氨基酸序列上的差异可以是例如：一个或多个氨基酸残基及其任意组合的替换、添加和删除。替换或插入的氨基酸残基可由遗传密码编码，也可不由遗传密码编码。多肽的保守性变异体可以自然产生，或者它可以是非自然产生的变异体。多肽之非自然产生的保守性变异体可通过诱变技术或直接合成而产生。

作为本发明的一种实施方式，所述支持介质仅包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原时，所述猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的制备先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原。

作为本发明的一种实施方式，所述支持介质包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原两种抗原时，所述猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的制备先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原，所述猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原的制备先用β-丙内酯灭活，再用PEG20000进行浓缩，最后经密度梯度离心纯化获得抗原。

本发明的特定组合的灭活、浓缩和纯化方法保证了其中抗原成分的含量，为后续检测的灵敏度提供了保证。

作为本发明的一种实施方式，所述二乙烯亚胺灭活是用浓度14mM～70mM的BEA环化处理2小时，后于25～37℃摇床于转速50～200r/min灭活12～24小时，之后用硫代硫酸钠处理2～8小时；所述β-丙内酯灭活是用浓度0.01％～0.05％(w/t)的BPL灭活8～16小时；所述PEG20000透析浓缩是将PRV病毒液装入孔径500kDa以内的透析袋中，两端固定或夹住，在透析袋上下表面铺上PEG20000固体，放入2～8℃冰箱进行浓缩，浓缩20～50倍；所述膜包切向流超滤浓缩是采用500kDa以内的膜包进行切向流超滤浓缩，浓缩20～50倍；所述差速离心纯化将浓缩后的病毒液于转速35000r/min离心1～3小时，沉淀用1/10体积的0.02mol/L，pH值为7.4的PBS溶液吹溶，在转速5000r/min离心5～20分钟取上清；所述密度梯度离心纯化方法，采用30％～50％蔗糖介质密度梯度层、50％酒石酸钾-5％甘油～10％酒石酸钾-25％甘油、和5％～8％Nycodenz密度梯度层按转速35000r/min离心2～5小时。

作为本发明的一种实施方式，所述包被抗原浓度为0.5～5.0μg/ml，所述酶标记的单克隆抗体11H1标记前浓度为2～8mg/ml、IFA效价为1∶1600～1∶6400。

作为本发明的一种优选实施方式，所述包被抗原浓度为1.0μg/ml。

所述包被抗原浓度可以为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0μg/ml。

所述酶标记的单克隆抗体11H1标记前浓度为2、3、4、5、6、7、8mg/ml。

作为本发明的一种实施方式，根据所述的试剂盒，其中，所述标记的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、或β-D-半乳糖甘酶；所述对猪伪狂犬病病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂为显色剂A液、B液，显色剂A液为每1L水中含磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，显色剂B液为每1L水中含四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇100ml。

术语“酶”包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖甘酶。其中，辣根过氧化物酶所使用的底物为邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)，优选为四甲基联苯胺(TMB)；碱性磷酸酶所使用的底物为对-硝基苯磷酸酯(p-NPP)；β-D-半乳糖甘酶所使用的底物为4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷(4MUG)。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体检测试剂盒中，所述检测试剂为与所述标记的酶的底物和显色剂。

作为本发明的一种实施方式，所述支持介质优选为微滴定板。

作为本发明的一种实施方式，所述阳性对照为免疫猪伪狂犬病病毒变异株疫苗或猪伪狂犬病病毒经典株疫苗后攻毒的猪只血清，所述阴性对照为PRV抗原、抗体阴性的健康易感猪只的血清。

作为本发明的一种实施方式，所述试剂盒还包括终止液、洗涤液，所述终止液为2MH₂SO₄溶液，所述洗涤液为PBS溶液。

本发明还涉及所述抗体检测试剂盒检测样品中猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的方法，所述方法：步骤1)将检测样品用样品稀释液稀释后，连同阳性对照、阴性对照同时加入包被猪伪狂犬病病毒抗原的检测孔；步骤2)将酶标记的所述抗体或所述抗体片段，或酶标记的所述单克隆抗体11H1，加入检测孔，与检测样品中的猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体竞争结合包被的抗原。

作为本发明的一种优选实施方式，所述步骤1)中抗原附着在支持介质上，所述支持介质优选为微滴定板；所述步骤2)所述酶标记时所用酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖甘酶中的任一种，优选为辣根过氧化物酶。

本发明涉及所述抗体检测试剂盒的应用，所述应用包括野毒感染后血清的评价、离体血清的流行病学调查等。

本发明还提供一种单克隆抗体11H1，所述单克隆抗体11H1的可变区序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明的单克隆抗体11H1能与猪伪狂犬病病毒变异株抗原或猪伪狂犬病病毒经典株抗原特异性结合，具有广谱性。

作为本发明的一种实施方式，所述抗体为单克隆抗体11H1，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

本发明还涉及所述单克隆抗体11H1的可变区序列。

本发明还涉及一种特异性结合猪伪狂犬病病毒gE蛋白的单克隆抗体11H1的可变区序列，其中，1)重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；2)轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体。

本发明涉及一种由所述单克隆抗体11H1可变区序列组成的抗体；所述抗体可以为单克隆抗体、基因工程抗体；其中，所述基因工程抗体包括单链抗体、嵌合单克隆抗体、改形单克隆抗体或所述抗体的片段；所述抗体或所述抗体的片段仍保持特异性结合猪伪狂犬病病毒gE蛋白的能力。

本发明的单克隆抗体11H1可变区(重链可变区和轻链可变区)能特异性结合猪伪狂犬病病毒gE蛋白。

本发明还提供一种制备猪伪狂犬病病毒全病毒灭活抗原的方法，其中，所述方法包括先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原，或者先用β-丙内酯灭活，再用PEG20000进行浓缩，最后经密度梯度离心纯化获得抗原。

本发明的制备猪伪狂犬病病毒全病毒灭活抗原的方法，无论是制备猪伪狂犬病病毒变异株灭活抗原或猪伪狂犬病病毒经典株灭活抗原均能保证抗原中生物活性含量。

作为本发明的一种实施方式，所述猪伪狂犬病病毒全病毒灭活抗原为猪伪狂犬病病毒经典株或变异株全病毒灭活抗原。

所述猪伪狂犬病病毒变异株为HN1201株、HN1202株、JS-2012株、HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株、NVDC-PRV-SD株、TJ株、ZJ01株中的任一种，优选为HN1201株。

所述猪伪狂犬病病毒经典株为Fa株或MA株，优选为Fa株。

作为本发明的一种实施方式，所述二乙烯亚胺灭活是用浓度14mM～70mM的BEA环化处理2小时，后于25～37℃摇床在转速50～200r/min灭活12～24小时，之后用硫代硫酸钠处理2～8小时；所述β-丙内酯灭活是用浓度0.01％～0.05％(wt)的BPL灭活8～16小时；所述PEG20000透析浓缩是将PRV病毒液装入孔径500kDa以内的透析袋中，两端固定或夹住，在透析袋上下表面铺上PEG20000固体，放入2～8℃冰箱进行浓缩，浓缩20～50倍；所述膜包切向流超滤浓缩是采用500kDa以内的膜包进行切向流超滤浓缩，浓缩20～50倍；所述差速离心纯化将浓缩后的病毒液于转速35000r/min离心1～3小时，沉淀用1/10体积的0.02mol/L，pH值为7.4的PBS溶液吹溶，于转速5000r/min离心5～20分钟取上清；所述密度梯度离心纯化方法，采用30％～50％蔗糖介质密度梯度层、50％酒石酸钾-5％甘油～10％酒石酸钾-25％甘油、和5％～8％Nycodenz密度梯度层按转速35000r/min离心2～5小时。

本发明还涉及上述方法制备的抗原。所述抗原中生物活性成分含量高。

本发明的优势在于：

与商品化试剂盒相比，本发明制备的阻断ELISA检测试剂盒灵敏度高，特异性好，检测后的灰区即可疑样品少，易于伪狂犬病的净化；

本发明制备的试剂盒优选包被原为变异株灭活、纯化、浓缩后的抗原，比商品化IDEXX试剂盒早2～4天检出感染病毒的阳性血清，更利于伪狂犬病的净化。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

本发明实施例中所用的磷酸盐缓冲液为pH值7.4的PBS，其1L体积配方为：NaCl8.0g、KCl 0.2g、Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g、KH₂PO₄ 0.24g，但该实施方式无论在任何情况下均不构成对本发明的限定。

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

以下实施例以经典株Fa株、变异株HN1201株为例说明本发明。

实施例1猪伪狂犬病病毒抗原的制备

1.1抗原用毒株的选择

选择猪伪狂犬病病毒2个类型毒株中的代表性毒株进行培养增殖以获得其病毒液，如：经典株为Fa株，购自中国兽医药品监察所；变异株为HN1201株。

1.2猪伪狂犬病病毒灭活、浓缩及纯化方法

1.2.1灭活方法

灭活方法包括：甲醛法灭活方法(简称MH1)，甲醛浓度范围0.05％～0.5％(v/v)，25～37℃静置或摇床50～200r/min，灭活时间24～48小时；二乙烯亚胺BEI灭活方法(简称MH2)，BEA先2小时环化处理，病毒灭活优选14mM～70mM浓度范围，25～37℃摇床50～200r/min，灭活时间12～24小时，灭活后需要硫代硫酸钠处理2～8小时；β-丙内酯(β-PL)BPL的灭活方法(简称MH3)，BPL浓度范围0.01％～0.05％，灭活时间8～16小时；盐酸聚六亚甲基胍(PHMG)灭活方法(简称MH4)，PHMG浓度范围1％～5％，灭活时间12～24小时。详见表1。

1.2.2浓缩方法

浓缩方法包括：硫酸铵沉淀方法(简称NS1)，加入等体积饱和硫酸铵，边加入边搅拌，然后低温搅拌0.5～2小时，10000r/min离心10～20分钟，沉淀用病毒液1/50体积的PBS缓冲液(0.02mol/L，pH值7.4)溶液吹溶；PEG20000透析浓缩方法(简称NS2)，将PRV病毒液装入孔径500kDa以内的透析袋中，两端固定或夹住，在透析袋上下表面铺上PEG20000固体，放入2～8℃冰箱进行浓缩，浓缩20～50倍；膜包切向流超滤浓缩方法(简称NS3)，采用Millipore公司的500kDa以内的膜包，小型切向流机器进行超滤浓缩，浓缩20～50倍。详见表1。

1.2.3纯化方法

纯化方法包括：Core700层析方法(简称CH1)，用pH6.5～7.4的PB缓冲液2～8℃过夜透析浓缩后的病毒液，经过层析柱收集流穿峰，即为纯化样品；差速离心纯化方法(简称CH2)，浓缩后的病毒液，35000r/min离心1～3小时，沉淀用1/10体积的PBS(0.02mol/L，pH值7.4)溶液吹溶，5000r/min离心5～20分钟取上清；密度梯度离心纯化方法(简称CH3)，采用蔗糖(30％～50％密度梯度层)、酒石酸钾-甘油(50％酒石酸钾-5％甘油～10％酒石酸钾-25％甘油)和Nycodenz(5％～8％密度梯度层)等介质进行35000r/min离心2～5小时。详见表1。

表1猪伪狂犬病病毒灭活、浓缩、纯化方法汇总

对经典株Fa和变异株HN1201株进行不同灭活、浓缩和纯化方法的组合，纯化获得不同的抗原，对纯化后的抗原按100ng/ml浓度包被，用PRV gE阳性质控血清(购自荷兰GD公司)按2倍系列稀释后进行间接ELISA方法(TMB显色法)检测，读取OD_450nm吸光值2左右的阳性血清稀释度，说明抗原纯化效果与稀释度呈正相关。同时进行BCA蛋白含量测定和SDS电泳纯度检测，筛选纯化后蛋白浓度2mg/ml以上、纯度90％以上纯化的抗原。经过3种效果评价，优选经典株和变异株共计3种灭活、浓缩和纯化方法，简称纯化4、纯化6和纯化8，具体结果见表2。

表2经典株和变异株纯化方法及效果评价

实施例2单克隆抗体及酶标抗体的制备及鉴定

2.1单克隆抗体的制备及鉴定

2.1.1单克隆抗体11H1的制备

免疫原的制备：实施例1中评价效果最佳的Fa株经纯化4纯化获得2.5mg/ml、纯度91％的抗原，HN1201株分别经纯化6和8获得的抗原，以及纯化4与纯化6组合制备的经典株、变异株混合抗原，共计4种免疫原。

杂交瘤制备：详见Ed Harlow et al.,“Antibodies A Laboratory Manual”,ColdSpring Harbor Laboratory 1988.先将4种免疫原分别间隔2周用腹腔及背部皮下多点注射的体内免疫方法免疫6～8周龄雌性Balb/C小鼠三次(50μg/只，第1次与等量的弗氏完全佐剂混匀，第2～3次与等量的弗氏不完全佐剂混匀)，于三免后2周进行加强免疫(脾脏免疫，不含弗氏佐剂，100μg/只)。通过间接ELISA筛选出ELISA效价≥1∶12800和间接免疫荧光IFA检测阳性的小鼠，融合前3天再次进行加强免疫后取小鼠脾脏用PEG融合方法进行融合试验，按常规方法进行融合、培养，通过间接ELISA和IFA同时检测，经3次克隆化后，得到稳定的单克隆细胞株。

进行小鼠血清及杂交瘤细胞筛选时ELISA检测和IFA方法同时进行。选择ELISA效价≥1∶12800且IFA效价高的小鼠进行加强免疫后融合，选择ELISA效价≥1∶12800、IFA为阳性的单个杂交瘤细胞、阳性孔再进行亚克隆筛选。方法简述如下：

间接ELISA检测方法：包被原为PRV gE重组蛋白(购自Sigma)，包被过夜；洗涤后用含3％脱脂奶粉的PBS溶液于37℃封闭2小时；洗涤后将小鼠血清100倍稀释后倍比稀释液或杂交瘤细胞的细胞上清原液加入，37℃孵育1小时；洗涤后将羊抗鼠HRP酶标抗体10000倍稀释后加入，37℃孵育1小时；洗涤后加入显色液室温避光反应15分钟，再加入终止液，10分钟内用酶标仪读测OD值。

IFA检测方法：培养贴壁PK-15细胞，按照病毒感染复数MOI为0.005～0.1剂量接入含PRV HN1201株或Fa株的毒种，同时设健康细胞对照孔，37℃、5％CO₂条件下培养48～72小时后，弃上清；用80％的丙酮溶液于2～8℃固定30min，PBS洗3次，病毒接种孔和细胞对照孔分别加入100μl 1︰10稀释后再2倍倍比稀释的血清或杂交瘤细胞的细胞上清原液，同时用PRV阳性血清加入病毒接种孔作阳性对照，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入1︰500稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG或羊抗猪IgG，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入50μlPBS后于荧光显微镜下观察。

再将经ELISA及IFA方法最终筛选出的14株阳性孔的单克隆细胞上清用IFA方法进行特异性检测。IFA检测用抗原为PRV HN1201株、HB98株、Fa株和MA株(按上述IFA方法进行制备)，另包括猪源的其它常见病毒如PCV2、PRRSV、CSFV、PPV制备IFA抗原板。经过IFA检测，筛选获得4种免疫原制备的单克隆抗体株，检测结果11H1(编号4-2#)为间接ELISA效价最高、IFA效果最好、特异性最佳的单抗，详见表3。

表3 4种免疫原获得不同株杂交瘤细胞的检测结果

2.1.2单克隆抗体11H1腹水制备及纯化

将筛选的杂交瘤单抗细胞株先在37℃、5％CO₂培养箱中扩增培养后无菌注射入已注射石蜡的小鼠腹腔内，7天后从陆续抽取腹水。将腹水10000转/分钟离心上清加入等体积饱和硫酸铵溶液，2～8℃搅拌30分钟，10000转/分钟离心沉淀用PBS溶液重悬获得纯化的单抗。

2.1.3单克隆抗体11H1的鉴定

性状检验：纯化前后均为澄清液体。

无菌检验：按现行《中国兽药典》进行检验，均合格。

类型和亚类鉴定：用Pierce Papid ELISA Mouse Ab Isotyping Kit进行鉴定，结果：单克隆抗体11H1重链亚型为IgG1，轻链类型为kappa。

蛋白含量测定：用商品化BCA试剂盒检测，结果单克隆抗体11H1含量为2～8mg/ml。

广谱性：按上述IFA方法制备含变异株如HN1201株、HN1202株、JS-2012株、HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、PRV TJ株、HB98株，经典株如Fa株、MA株的抗原板，并进行IFA检测，结果：变异株和经典株均能够与之发生反应。

间接免疫荧光IFA的活性鉴定：培养贴壁PK-15细胞，按照病毒感染复数MOI为0.005～0.05剂量接入含PRV HN1201株或Fa株的毒种，同时设健康细胞对照孔，37℃、5％CO₂条件下培养48～72小时后，弃上清；用80％的丙酮溶液于2～8℃固定30min，PBS洗3次，在一系列病毒接种孔和细胞对照孔中分别加入100μl以稀释度1︰10起始的倍比稀释的血清或杂交瘤细胞的细胞上清原液，同时用PRV阳性血清加入病毒接种孔作阳性对照，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入1︰500稀释的FITC标记的羊抗鼠或羊抗猪IgG，37℃作用60分钟；用PBS洗3次并扣干；加入50μl PBS后于荧光显微镜下观察。IFA效价判定：以可观察到黄绿色荧光的接毒细胞板孔对应的抗体最大稀释度作为抗体的IFA效价。结果显示：单克隆抗体11H1的IFA效价为1∶1600～1∶6400。

特异性鉴定：分别取猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV HN1201)分别按MOI＝0.1的接种剂量分别接种96孔细胞板中单层敏感细胞(PCV2用PK15细胞、PRRSV使用Marc-145细胞、PPV用ST细胞、CSFV使用STK细胞、PRV HN1201使用PK-15细胞)，同时设健康细胞对照孔，37℃、5％CO₂条件下培养48～72小时后，弃上清，用80％的丙酮溶液于2～8℃固定30min，PBS洗3次，病毒接种孔和细胞对照孔分别加入100μl 1︰100稀释的单抗，同时分别用各自的阳性血清加入病毒接种孔作阳性对照。37℃作用60分钟后用PBS洗3次，扣干，加入1︰500稀释的FITC标记的抗鼠IgG或抗猪IgG，37℃作用60分钟后用PBS洗3次，加入50μl PBS溶液后于荧光显微镜下观察，进行单克隆抗体特异性鉴定。检测结果显示：单克隆抗体11H1与其他病毒(PCV2、PRRSV、PPV、CSFV)均不发生反应，仅与PRV HN1201发生反应，表明其是抗猪伪狂犬病病毒的特异性单克隆抗体。结果见表4。

表4 11H1单克隆抗体的特异性鉴定

病毒名称	PCV2	PRRSV	CSFV	PPV
						非特异性鉴定	无	无	无	无
PRV毒株	Fa株	MA株	HN1201株	HN1202株	HB98株
						特异性IFA鉴定荧光结果	有	有	有	有	有
PRV毒株	JS-2012株	HeN1株	NVDC-PRV-BJ株	PRV TJ株
						特异性IFA鉴定荧光结果	有	有	有	有

由表4可见，单克隆抗体11H1对猪常见的PCV2、PRRSV、CSFV和PPV病毒无特异性反应，对PRV经典株和流行株均有特异性反应。

2.1.4单克隆抗体11H1可变区序列的测定

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，设计11H1重链可变区引物序列：

P1：ACTAGTCGACATGGATTTTGGGCTGA

P2：CCAGGGACCAATGGATAAACTGATGG

设计11H1轻链可变区引物序列：

P3：ACTAGTCGACATGGTTCTTATATCCTTGCTG

P4：CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA

按照张爱华等(张爱华，闭兰，王志友等。系列鼠抗CD分子单克隆抗体轻、重链可变区基因的克隆和序列分析。中国生物制品学杂志，2001，15(2)：65-68)建立的可变区序列测定方法，通过分子克隆技术分别获得单克隆抗体11H1的可变区序列，选取对应的克隆质粒送至苏州金维智生物科技有限公司进行测序。结果，单克隆抗体11H1的重链可变区、轻链可变区的基因序列分别入SEQ ID No.1、SEQ ID No.3所示，由其推导的氨基酸序列分别为SEQID No.2、SEQ ID No.4。

2.2酶标抗体的制备及鉴定

2.2.1制备

采用改良过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)的标记。称取20mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1ml超纯水中，加入1ml新鲜配制的NaIO₄溶液(30mg NaIO₄溶于1ml超纯水)，混匀，4℃避光作用30分钟；在上述溶液中加入40μl乙二醇，4℃避光作用30分钟；按照1mg纯化的单克隆抗体11H1加100μl上述混合液的比例，将两者混匀后，加入到透析袋中，混匀，用CB缓冲液透析6小时。整个操作需避光进行；将透析后的混合液转移至1.5ml EP管中，加入10μl新鲜配制的NaBH₄溶液(20mg NaBH₄溶于1ml超纯水)，室温作用2小时，每隔30分钟混匀一次；加入等体积的饱和硫酸铵，混匀后，4℃作用15分钟。12000r/min离心10分钟，弃上清。将沉淀用与纯化抗体等体积的PBS与甘油的混合液(V∶V＝1∶1)吹悬。

2.2.2鉴定

外观：室温下，为红棕色液体，未见絮状物沉淀。

质量评价：用紫外分光光度计检测酶标抗体在403nm和280nm的吸光值A。按照公式计算相应的酶参数：

酶量(mg/ml)＝A403nm×0.4×稀释倍数。

IgG量(mg/ml)＝(A_280nm-A_403nm×0.3)×0.62×稀释倍数。

克分子比值(E/P)＝酶量×4/IgG量。

标记率＝A_403nm/A_280nm。

经过吸光值检测和计算，具体结果见表4：

表4酶标抗体的质量评价

指标	A<sub>403nm</sub>	A<sub>280nm</sub>	酶量	IgG量	克分子比值	标记率
							数据	0.401	0.601	1.604	2.980	2.153	0.667

实施例3试剂盒的制备及检测方法

3.1试剂盒的制备

抗原包被板：用CB缓冲液将纯化4、纯化6、纯化8方法制备的单一抗原，以及纯化4和6方法制备的混合抗原、纯化1和5方法制备的混合抗原，gE重组蛋白抗原分别稀释至终浓度1μg/ml进行包被，100μl/孔2～8℃包被16～24小时，150μl/孔加入3％脱脂奶粉PBS溶液，2～8℃封闭16～24小时或37℃封闭2小时，弃去封闭液后2～8℃储存备用。

酶标试剂：取PBS溶液、胎牛血清200ml、AM染料4mg混匀并补加PBS定容为1L。将酶标抗体用上述溶液按最终效价1∶10000进行稀释，0.22μm过滤，无菌分装。

样品稀释液：取PBS溶液、胎牛血清200ml、PUR染料28mg混匀并补加PBS定容为1L，0.22μm过滤，无菌分装。

20×浓缩洗涤液：取PBS溶液、吐温20 10ml混匀并补加PBS定容为1L，0.22μm过滤，无菌分装。

阳性对照：选择PRV抗原、抗体阴性的7-8周龄健康易感猪只，用Fa株或HN1201株灭活病毒液与佐剂混合乳化制备疫苗，颈部肌肉注射灭活病毒液2次免疫后攻毒；2次免间隔时间为21天，攻毒间隔2免时间为28天。IDEXX试剂盒检测gE抗体为强阳性时颈动脉采血，收集血清为gE抗体阳性血清。取PBS溶液、胎牛血清200ml、gE抗体阳性血清100ml混匀并补加PBS定容为1L，0.22μm过滤，无菌分装。

阴性对照：选择PRV抗原、抗体阴性的健康易感猪只，IDEXX试剂盒检测为阴性。颈动脉采血，收集血清为gE阴性血清。取PBS溶液、胎牛血清200ml、gE抗体阴性血清100ml混匀并补加PBS定容为1L，0.22μm过滤，无菌分装。

显色液：取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于纯化水，定容至1L，0.22μm过滤，无菌分装，为显色剂A液。取四甲基联苯二胺(TMB)0.2g，无水乙醇100ml，溶于纯化水定容至1L，0.22μm过滤，无菌分装，为显色剂B液。

终止液：2M H₂SO₄溶液。

3.2检测方法建立

操作步骤如下：

(1)加样：每孔先加入样品稀释液50μl，再分别在相应孔中加入阳性对照、阴性对照及待检样品各50μl，封板后置37℃温育60分钟。

(2)洗涤：用洗涤液洗涤5遍，最后一次扣干。

(3)加酶标试剂：每孔加入酶标试剂100μl，封板后置37℃温育30分钟。

(4)洗涤：用洗涤液洗涤5遍，最后一次扣干。

(5)显色：每孔加入显色剂A液、显色剂B液各50μl，混匀，37℃或室温避光显色15分钟。

(6)终止并检测：每孔加终止液50μl，10分钟内用酶标仪测定各孔A值(双波长450nm/600～650nm)，根据以下结果判定标准进行判定。

结果判定标准如下：

S/N比率的计算：S/N＝样品A值/阴性质控品A值

阴性判定：S/N＞0.7者为猪伪狂犬病病毒gE抗体阴性。

阳性判定：S/N≤0.6者为猪伪狂犬病病毒gE抗体阳性。

如果被测样品0.6＜S/N≤0.7，结果判为可疑。

3.3不同类型抗原制备试剂盒的评价结果

将6种不同类型抗原包被制备的试剂盒，对健康猪血清、疫苗免疫gE阴性血清2份、Fa株攻毒后gE抗体阳性血清3份、HN1201株攻毒后gE抗体阳性血清3份、特异性检测血清(如PCV2、CSFV、PPV、PRRSV阳性血清)共计13份分别检测。结果详见表5，表明gE重组蛋白作为抗原包被制备的试剂盒6#，检测3份攻毒后gE阳性血清均为阴性，有明显的漏检率，检测为假阴性结果；经典株Fa株制备试剂盒1#检测无非特异性，但gE抗体阳性血清检测为阴性，特异性差；采用纯化1和5方法纯化的经典株变异株混合抗原制备的试剂盒5#对攻毒后的6份阳性血清有漏检现象，而纯化4和6方法的变异株抗原或经典株变异株混合抗原制备的试剂盒(见表5试剂盒2#、3#、4#)检测的结果表明特异性和非特异性均好。

表5不同抗原制备5种试剂盒的评价结果

注：－表示阴性，+表示阳性。

3.4不同类型抗原优选包被量的确定

将3种不同类型抗原包被制备的试剂盒2#～4#，对健康猪血清、疫苗免疫gE阴性血清2份、Fa株攻毒后gE抗体阳性血清3份、HN1201株攻毒后gE抗体阳性血清3份、特异性检测血清(如PCV2、CSFV、PPV、PRRSV阳性血清)共计13份分别检测，结果与标准符合为13/13即符合率为100％时对应的包被量为最适包被量，其对应的范围为包被量最适范围。结果详见表6，2#试剂盒包被量最适范围为1.0μg/ml～4.0μg/ml；3#试剂盒包被量最适范围为0.5μg/ml～2.5μg/ml；4#试剂盒包被量最适范围为0.5μg/ml～5.0μg/ml。

表6不同类型抗原不同包被量制备试剂盒的评价结果

为便于后续研究和应用，将试剂盒2#～4#试剂盒的包被量均定为1μg/ml。

实施例4试剂盒的应用

4.1敏感性

用猪伪狂犬病病毒经典株Fa株及变异株HN1201株分两组、每组5头分别进行攻毒实验，将10头攻毒后不同天数即0、3、5、7、9、11、13、15天采集的80份猪血清，用实施例3制备的试剂盒2#、3#、4#及商品化试剂盒IDEXX的PRVgE抗体ELISA检测试剂盒分别进行检测。结果见表7～8：试剂盒2#(包被原为纯化6纯化的HN1201株)检出阳性的血清比IDEXX的早2～4日，检出全部转阳的血清比IDEXX的早2日，与病毒中和试验转阳结果一致；试剂盒3#(包被原为纯化8纯化的HN1201株)检出阳性的血清比IDEXX的早4日，检出全部转阳的血清比IDEXX的早4日，与病毒中和试验转阳结果一致；试剂盒4#(包被原为纯化4纯化的Fa株与纯化6纯化的HN1201株的联合抗原)检出阳性的血清比IDEXX的早4日，检出全部转阳的血清比IDEXX的早6日，较病毒中和试验转阳早2日。

综合分析试验结果，表明试剂盒2#～4#的检测敏感性均高于IDEXX的，检出阳性率均高，检测野毒感染血清的转阳时间更早，有利于提前净化猪伪狂犬病，特别是试剂盒4#。

表7不同试剂盒对攻毒系列样品检测结果汇总

注：“－”表示阴性，“+”表示阳性；中和试验效价≥1:2判为阳性，中和效价＜1:2判为阴性。

表8不同试剂盒对攻毒试验的评价效果汇总

4.2特异性

将猪伪狂犬病病毒gE抗体阴性血清、猪伪狂犬病病毒Bartha K-61株活疫苗免疫血清、猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清、猪细小病毒(PPV)阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清、猪瘟病毒(CSFV)阳性血清、猪乙型脑炎病毒(JEV)阳性血清、副猪嗜血杆菌(HPs)阳性血清、猪萎缩性鼻炎(Bb)阳性血清、大肠杆菌(BL21)阳性血清、猪肺炎支原体(Mhp)阳性血清、猪流行性腹泻病毒(PEDV)阳性血清、猪传染性胃肠炎(TGEV)阳性血清、猪轮状病毒(PRoV)阳性血清，分别用实施例3制备的试剂盒2#、3#、4#及商品化试剂盒IDEXX的PRVgE抗体ELISA检测试剂盒进行检测，结果(见表9)，均为阴性，表明各试剂盒均与其它病毒的阳性血清无交叉反应，特异性良好。

表9特异性试验试剂盒评价效果总汇

注：－表示阴性，+表示阳性。

4.3临床应用

选择背景清晰且来源于不同地区养殖场、有猪伪狂犬病感染症状、经血清中和试验方法确定阳性100份、阴性100份共计200份猪血清，分别用实施例3制备的试剂盒2#、3#、4#及商品化试剂盒IDEXX的PRVgE抗体ELISA检测试剂盒、北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的商品化试剂盒猪伪狂犬病病毒(gE基因)PCR检测试剂盒进行检测。结果见表10：与中和试验相比，IDEXX试剂盒的阳性为75份，阴性为101份，灰区即可疑样本为24份，一致性为81.0％；试剂盒2#的阳性为77份，阴性为105份，灰区即可疑样本为18份，一致性为82.0％；试剂盒3#的阳性为82份，阴性为104份，灰区即可疑样本为14份，一致性为85.5％；试剂盒4#的阳性为86份，阴性为106份，灰区即可疑样本为8份，一致性为87.0％北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的商品化试剂盒猪伪狂犬病病毒(gE基因)PCR检测试剂盒(检测血清样品中的抗原成分)的阳性为89份，阴性为101份，灰区即可疑样本为17份。表明与商品化IDEXX试剂盒相比，试剂盒2#、3#、4#检测结果与中和试验相比一致性较高，也就是说试剂盒2#、3#、4#的敏感性及特异性均优于IDEXX的，特别是试剂盒4#的，且试剂盒2#、3#、4#检测结果与中和试验相比一致性较高且试剂盒2#、3#、4#检出的灰区即可疑样本数量明显低于IDEXXPRV gE抗体检测试剂盒，特别是试剂盒4#的更利于准确进行临床应用；与北京世纪元亨动物防疫技术有限公司的商品化试剂盒猪伪狂犬病病毒(gE基因)PCR检测试剂盒IDEXX PRVgE抗体检测试剂盒相比，4#检测结果与之符合率最接近，而核酸检测法敏感性在方法学上较ELISA法高。综合评估，试剂盒4#更适用临床应用。

表10临床试验结果

综上所述，与商品化试剂盒相比，本发明制备的试剂盒比商品化IDEXX试剂盒可早2～4天检出感染病毒的阳性血清，更利于伪狂犬病的净化；灵敏度高，特异性好，检测后的灰区即可疑样品少，易于伪狂犬病的净化。

以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

序列表

<110> 洛阳普莱柯万泰生物技术有限公司

<120> 一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的包被抗原和酶标抗体及阻断法试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 396

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞 (hybridoma cells)

<400> 1

actagtcgac atggattttg ggctgaagac agaaatggag gcctggggcg tgaaggagct 60

gtcctgcaag gctttgggtc gctttcgact gactatgaaa tgcactgggt gaaacagaca 120

cctgtacatg gcctggaatg gattggagct ccggacctgg tgctgggccg cgcctgcgtc 180

aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagtctac 240

ggcggacccg gtgggccccg ctggagctca gcagccattc atctgaggac tctgctgtct 300

attactgtac aagggactac ggttataggt acaactatgc tatggactac tggggtcaag 360

gaacctcagt ccatcagttt atccattggt ccctgg 396

<210> 2

<211> 132

<212> PRT

<213> 杂交瘤细胞 (hybridoma cells)

<400> 2

Thr Ser Arg His Gly Phe Trp Ala Glu Asp Arg Asn Gly Gly Leu Gly

1 5 10 15

Arg Glu Gly Ala Val Leu Gln Gly Phe Gly Ser Leu Ser Thr Asp Tyr

20 25 30

Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Pro Asp Leu Val Leu Gly Arg Ala Cys Val Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Gly Gly Pro Gly Gly Pro Arg Trp Ser Ser Ala Ala Ile His Leu Arg

85 90 95

Thr Leu Leu Ser Ile Thr Val Gln Gly Thr Thr Val Ile Gly Thr Thr

100 105 110

Met Leu Trp Thr Thr Gly Val Lys Glu Pro Gln Ser Ile Ser Leu Ser

115 120 125

Ile Gly Pro Trp

130

<210> 3

<211> 366

<212> DNA

<213> 杂交瘤细胞 (hybridoma cells)

<400> 3

actagtcgac atggttctta tatccttgct gtacgtgtgt ctctagggcc tgaaagcaaa 60

gaacttagca gagccagcga aagtgtcact gagtatggca ttagttatat gcactggttc 120

ggccgagtac gtcacggtca tcaaggactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180

ggggtccctg ccaggtttag tggcattgag ctcccggcgc cgggcggcct cgcggcccct 240

caacatccat cctatggagg aggaaagtac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagagagga 300

ggttccgtac acgttcggag acggattatc ggcaattcca tcttcccacc atccagtaag 360

cttggg 366

<210> 4

<211> 122

<212> PRT

<213> 杂交瘤细胞 (hybridoma cells)

<400> 4

Thr Ser Arg His Gly Ser Tyr Ile Leu Ala Val Arg Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Pro Glu Ser Lys Glu Leu Ser Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Glu Tyr

20 25 30

Gly Ile Ser Tyr Met His Trp Phe Gly Arg Val Arg His Gly His Gln

35 40 45

Gly Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ile Glu Leu Pro Ala Pro Gly Gly Leu Ala Ala Pro

65 70 75 80

Gln His Pro Ser Tyr Gly Gly Gly Lys Tyr Cys Asn Val Phe Leu Ser

85 90 95

Ala Lys Arg Gly Gly Ser Val His Val Arg Arg Arg Ile Ile Gly Asn

100 105 110

Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys Leu Gly

115 120

Claims

1.一种用于检测猪伪狂犬病病毒gE抗体的阻断法试剂盒，其中，所述试剂盒包括：包被了猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的支持介质或包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原两种抗原的支持介质、酶标记的单克隆抗体11H1、以及用于对猪伪狂犬病病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂、阴性对照、阳性对照；

其中所述猪伪狂犬病病毒变异株为HN1201株、HN1202株、JS-2012株、HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株、NVDC-PRV-SD株、TJ株、或ZJ01株，所述猪伪狂犬病病毒经典株为Fa株或Ma株；

所述单克隆抗体11H1抗体的可变区序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；

所述猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原的制备先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原，或者先用β-丙内酯灭活，再用PEG20000进行浓缩，最后经密度梯度离心纯化获得抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述支持介质仅包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原时，所述猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的制备先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原；

所述支持介质包被猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原和猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原两种抗原时，所述猪伪狂犬病病毒变异株全病毒灭活抗原的制备先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原，所述猪伪狂犬病病毒经典株全病毒灭活抗原的制备先用β-丙内酯灭活，再用PEG20000进行浓缩，最后经密度梯度离心纯化获得抗原。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述二乙烯亚胺灭活是用浓度14mM～70mM的BEA环化处理2小时，后于25～37℃摇床于转速50～200r/min灭活12～24小时，之后用硫代硫酸钠处理2～8小时；

所述β-丙内酯灭活是用浓度0.01％～0.05％(w/t)的BPL灭活8～16小时；

所述PEG20000透析浓缩是将PRV病毒液装入孔径500kDa以内的透析袋中，两端固定或夹住，在透析袋上下表面铺上PEG20000固体，放入2～8℃冰箱进行浓缩，浓缩20～50倍；

所述膜包切向流超滤浓缩是采用500kDa以内的膜包进行切向流超滤浓缩，浓缩20～50倍；

所述差速离心纯化将浓缩后的病毒液于转速35000r/min离心1～3小时，沉淀用1/10体积的0.02mol/L，pH值为7.4的PBS溶液吹溶，在转速5000r/min离心5～20分钟取上清；

所述密度梯度离心纯化方法，采用30％～50％蔗糖介质密度梯度层、50％酒石酸钾-5％甘油～10％酒石酸钾-25％甘油、和5％～8％Nycodenz密度梯度层按转速35000r/min离心2～5小时。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述包被抗原浓度为0.5～5.0μg/ml，所述酶标记的单克隆抗体11H1标记前浓度为2～8mg/ml、IFA效价为1∶1600～1∶6400；优选地，所述包被抗原浓度为1.0μg/ml。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述支持介质优选为微滴定板；

所述标记的酶为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、或β-D-半乳糖甘酶；所述对猪伪狂犬病病毒的抗原抗体反应进行检测的检测试剂为显色剂A液、B液，显色剂A液为每1L水中含磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，显色剂B液为每1L水中含四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇100ml；

所述阳性对照免疫猪伪狂犬病病毒变异株或猪伪狂犬病病毒经典株后攻毒的猪只血清，所述阴性对照为PRV抗原、抗体阴性的健康易感猪只的血清；

所述试剂盒还包括终止液、洗涤液，所述终止液为2M H₂SO₄溶液，所述洗涤液为PBS溶液。

6.一种单克隆抗体11H1，所述单克隆抗体11H1的可变区序列由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体，所述轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列或该序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰保守性突变获得的保守性变异体；

优选地，所述单克隆抗体11H1，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述单克隆抗体11H1的可变区序列。

8.一种制备猪伪狂犬病病毒全病毒灭活抗原的方法，其中，所述方法包括先用二乙烯亚胺灭活，再用膜包切向流进行浓缩，最后经差速离心纯化获得抗原，或者先用β-丙内酯灭活，再用PEG20000进行浓缩，最后经密度梯度离心纯化获得抗原；优选地，所述猪伪狂犬病病毒全病毒灭活抗原为猪伪狂犬病病毒经典株或变异株全病毒灭活抗原。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述二乙烯亚胺灭活是用浓度14mM～70mM的BEA环化处理2小时，后于25～37℃摇床在转速50～200r/min灭活12～24小时，之后用硫代硫酸钠处理2～8小时；

所述β-丙内酯灭活是用浓度0.01％～0.05％(wt)的BPL灭活8～16小时；

所述差速离心纯化将浓缩后的病毒液于转速35000r/min离心1～3小时，沉淀用1/10体积的0.02mol/L，pH值为7.4的PBS溶液吹溶，于转速5000r/min离心5～20分钟取上清；

10.根据权利要求8或9所述方法制备的抗原。