CN101163498B - 用于诊断汉他病毒感染的方法和试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于检测汉他病毒感染的新方法和免疫诊断测试试剂盒。该方法和试剂盒采用来自至少六种不同的汉他病毒血清型，包括汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的重组N和/或G1抗原的组合。也可存在来自这些和其它汉他病毒类型的其它汉他病毒抗原。该方法提供了高度准确的结果并且能够检测感染，以便给予治疗和避免死亡。

Description

用于诊断汉他病毒感染的方法和试剂
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2004年6月18日提交的临时申请60/581,027的优先权，将此申请全文纳入本文作参考。
关于联邦政府资助的研究或开发的声明
本发明在来自国立过敏和传染病研究所的NIH资助号U01AIO54779的支持下进行。因此，美国政府可享有本发明的某些权利。
技术领域
本发明总地涉及汉他病毒。具体说，本发明涉及衍生自多种汉他病毒血清型的免疫原性试剂，包括免疫原性核衣壳和糖蛋白多肽，用于诊断汉他病毒感染的组合物中。
背景
汉他病毒(Hantavims)(布尼亚病毒科(Bunyaviridae)：汉他病毒)是脂质包膜的负链RNA病毒。该病毒基因组的RNA分成三部分，由通常分别称为S、M和L的小、中和大的3个基因组片段组成。M节段编码可加工形成称为G1和G2的两种包膜糖蛋白的前体蛋白。S节段编码称为N的核衣壳蛋白，它能形成病毒的丝状螺旋核衣壳和引发体液应答。基因组的L节段编码RNA-依赖性RNA聚合酶(RDRP)。在世界范围内发现超过20种不同的汉他病毒与特定啮齿类或食虫宿主有关。已经综述了它们传播给人的方式、天然储存库和人感染的临床特征(参见例如，Mertz等，Adv.Internal Med.(1997)42:369-421)。
汉他病毒肺综合征(HPS)，也称为汉他病毒心肺综合征(HCPS)是急性发热性疾病，死亡率高达50％。患者出现非特定症状，并快速进展成暴发性肺水肿和心血管虚脱。在北美引起HPS的主要物质是无名(Sin Nombre)病毒(SNV；也称为四角(Four
Corners)病毒和莫尔托-卡尼翁(Muerto Canyon)病毒)。(Song等，Lancet(1994)344：1637；Khan等，J.Med.Virol(1995)46：281-286；Kahn等，Am.J.Med.(1996)100：46-48；Morzunov等，J.Virol(1995)69：1980-1983；Rollin等，J.Med.Virol(1995)46：35-39；疾病控制预防中心，Morbid.Mortal.Weekly Rep.(1993)43：45-48)。在北美至少三种其它汉他病毒与HPS有关，包括纽约病毒(NYV)、污黑小河沟病毒(BlackCreek Canal virus，BCCV)和牛轭湖病毒(Bayou virus，BAYV)。
世界范围内，更大量的疾病是由引起出血热与肾综合症(HFRS)的欧亚(Eurasian)汉他病毒引起的。HFRS-相关性病毒包括汉坦病毒(Hantaan)(HTNV)、普马拉病毒(Puumala)(PUUV)、首尔病毒(Seoul)(SEOV)和多不拉伐-贝尔格莱德(Dobrava-Belgrade)(DOBV)病毒(Lee等，J.Infect.Dis.(1978)137：298-308；Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146：638-644；Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146：645-651；Brummer-Korvenkontio等，J.Infect.Dis.(1980)141：131-134)。HTNV和DOBV感染引起的HFRS的临床表现通常最为严重，而与PUUV感染有关的HFRS形式较温和，此HFRS形式是出现在斯堪的纳维亚、芬兰、俄罗斯西部和中欧的流行性肾病(NE)。据报道，HFRS的最严重形式的死亡率高达20％。
在HFRS相关性汉他病毒中，HTNV、SEOV和DOBV的抗原性相似。HPS相关性病毒也互相紧密相关，并且能与PUUV交叉反应。在病毒N蛋白中抗原交叉反应性最突出。在重组抗原诊断试验中，病毒N抗原相对于病毒糖蛋白是显性的。N抗原的抗体在感染早期出现，在逐渐康复的过程中普遍可检测到。在临床症状发作前，患有急性SNV感染的所有人中都可检测到IgM类型的SNV N抗原的抗体，几乎所有人都有抗N和G1抗原的IgG抗体(Bharadwaj等，J.Infect.Dis.(2000)182：43-48)。SNV G1抗体不与其它汉他病毒的G1抗原反应(Jenison等，J.Virol.(1994)68：3000-3006；Hjelle等，J.Gen.Virol.(1994)75：2881-2888)。
通过吸入病毒污染的啮齿类唾液、尿和粪便的气溶胶使汉他病毒传播给人。工人仅通过进入有感染啮齿类的房间就可接触汉他病毒感染，这强烈地支持了汉他病毒通过空气传播这一流行的观点。最近流行病学研究证明室内接触及其普遍，这也支持了此观察结果。在阿根廷，也证明了安第斯(Andes)病毒(ANDV)能够进行人对人传播，它可能是智利的两个科群(family cluster)的传播方式。啮齿类咬伤后也可传播病毒，并可能通过摄入污染的食物或水传播病毒。
所有种类的汉他病毒似乎主要与特定啮齿类宿主相关。有三大组汉他病毒，它们与啮齿类亚科：鼠亚科(Murinae)、田鼠亚科(Arvicolinae)和绵鼠亚科(Sigmodontinae)相关。这些各亚科的啮齿类的系统发育关系大部分是平行的，病毒的系统发育和抗原性关系与各具体库相关。这些汉他病毒组各自含有一个或多个种类或类型，它们是已知的人类病原体。表1中提供了关于各种汉他病毒的信息。
表1.
汉他病毒身份
亚科 病毒 相关疾病 动物宿主 区域
鼠亚科 汉坦病毒 HFRS 黑线姬鼠(apodemus agrarius) 亚洲、俄罗斯远东地区
多不拉伐病毒 HFRS 黄喉姬鼠(A.flavicollis)黑线姬鼠(A.agrarius) 欧洲巴尔干半岛
首尔病毒 HFRS 褐家鼠(rattus norvegicus)大家鼠(R.rattus) 全世界
普马拉病毒 HFRS 田鼠(cleothrianomys glareolus) 欧洲
绵鼠亚科 无名病毒 HCPS 麋鼠(peromyscus maniculatus)(草地型) 美国中西部和加拿大
Monongahela病毒 HCPS 麋鼠(p.maniculatus)(森林型) 美国东部和加拿大
纽约病毒 白脚鼠(P.leucopus)(东部正模标本) 美国东部
蓝河(Blue River)病毒 HCPS 白脚鼠(SN/NW正模标本) 美国中部
牛轭湖病毒 HCPS 稻大鼠(oryzomys palustris) 美国西南部
污黑小河沟病毒 HCPS 棉鼠(Sigmondon hispidus)(东部型) 佛罗里达
Muleshoe病毒 棉鼠(S.hispidus)(西部型) 美国南部
Cano Delgadito病毒 山棉花鼠(s.alstoni) 委内瑞拉
安第斯病毒 HCPS 长尾矮小稻鼠(O.longicaudatus) 阿根廷和智利
Oran病毒 HCPS 长尾矮小稻鼠(O.longicaudatus) 阿根廷西北部
Lechiguanas病毒 HCPS O.flavescens 阿根廷中部
贝尔梅霍(bermejo)病毒 O.chacoensis 阿根廷西北部
Hu39694病毒 HCPS 未知 阿根廷中部
Pergamno病毒 南美小田鼠(Akadon azarae) 阿根廷中部
Maciel病毒 Bolomys abscurus 阿根廷中部
Laguna Negra病毒 HCPS 森林小暮鼠(calomys laucha) 巴拉圭和波利维亚
Juquitiba病毒 HCPS 未知 巴西
Rio Mamore病毒 长尾矮小稻鼠(Oligoryzomys microtis) 波利维亚和秘鲁
El Moro Canyon病毒 大耳禾鼠(Reithrodontomys megalotis) 美国西部和墨西哥
Rio Segundo病毒 墨西哥木鼠(R.mexicanus) 哥斯达黎加
田鼠亚科 希望山病毒 北美草田鼠(Microtus pennsylvanicus) 美国北部
Bloodland Lake病毒 橙腹田鼠(M.ochrogaster) 美国北部
希望山样病毒 北美草田鼠/山地田鼠/橙腹田鼠(M.pennsylvanicus/montanus/ochrogster) 美国北部
岛景(Isla Vista)病毒 加州田鼠(M.californicus) 美国西部和墨西哥
处理汉他病毒感染方面有重大进展，但成功的处理需要恰好在疾病的濒死前阶段诊断出患者。三级护理的进展可降低由汉他病毒感染引起的死亡率。然而，由于感染进展地非常快，这些进展可能只能影响及时作出诊断的患者的预后。适合在乡村条件下快速检测汉他病毒抗体并可在疾病早期施用的方法可提高早期介入的前景。
已尝试几项试验及时地诊断汉他病毒感染。例如，采用各种形式的血清学方法诊断汉他病毒感染，包括珠凝集、用实验室培育的病毒进行的免疫荧光和免疫沉淀试验、血凝抑制、噬斑(plaque)-和细胞灶(focus)-减少中和试验以及ELISA形式(Lee等，J.Infect.Dis.(1978)137：298-308；Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146：638-644；Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146：645-651；Lundkvist等，Clin.Diagnos.Lab.Immunol.(1995)2：82-86；Chu等，Virology(1994)198：196-204；Elgh等，J.Med.Virol(1995)45：146-150)。
也已采用条带免疫印迹试验，以尝试有效诊断汉他病毒感染(参见例如，Hjelle等，J.Clin.Microbiol.(1997)35：600-608；Bharadwaj等，J.Infect.Dis.(2000)182：43-48；Yee等，J.Wildl.Dis.(2003)39：271-277)。然而，现在还没有鉴定多株汉他病毒的通用试验。
非常需要具有普遍可用性的准确、有效和快速的试验来检测汉他病毒感染，它们可拯救很多生命。
发明概述
本发明提供了简单、准确和有效的方法来诊断汉他病毒感染，以及测定存在的汉他病毒类型。该方法能够快速检测(例如在一小时以内)几种汉他病毒，如来自一种以上汉他病毒血清型的汉他病毒引起的汉他病毒感染。如果检测到感染，可给予该个体足够时间的适当治疗，以防止死亡。该方法利用N和/或G1抗原和/或抗这些抗原的抗体，这些抗原来自至少六种不同的汉他病毒血清型，包括HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。该试验提供了快速和可靠的诊断测试，适合用于实验室能力相对不复杂的设备。而且，可用该试验筛选野生啮齿类动物的汉他病毒感染，以确定具体啮齿类群体是否感染了该病毒，从而防止实验室工作者、野外工作者以及与野生啮齿类一起工作和遇到野生啮齿类的其他人感染。
可用重组技术产生本文所述产物，以提供不含通常存在的其它分子，如其它病毒污染物和有害蛋白的蛋白质制剂。
因此，在一个实施方式中，本发明涉及检测生物样品中的汉他病毒抗体的方法。该方法包括：
(a)将生物样品与至少六种汉他病毒重组抗原相接触，其中所述至少六种汉他病毒重组抗原包括来自汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的G1和/或N抗原的组合，其中存在各血清型的至少一种重组抗原，所述接触在允许汉他病毒抗体(存在于生物样品中时)结合于至少一种G1或N抗原以形成抗体/抗原复合物的条件下进行；和
(b)检测是否存在抗体/抗原复合物，从而检测样品中是否存在汉他病毒抗体。所述至少六种汉他病毒重组抗原可以是G1和N抗原的任何组合，只要存在来自至少六种汉他病毒血清型即汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)中的至少一种抗原。在优选实施方式中，这至少六种汉他病毒重组抗原都是N抗原。
在其它实施方式中，本发明涉及检测汉他病毒感染的免疫诊断测试试剂盒。该测试试剂盒包括：
(a)至少六种汉他病毒重组抗原，其中这至少六种汉他病毒重组抗原包括来自汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的G1和/或N抗原的组合，其中存在各血清型的至少一种抗原；
(b)和进行该免疫诊断测试的说明书。
在优选实施方式中，这至少六种汉他病毒重组抗原都是N抗原。
在其它实施方式中，本发明涉及检测生物样品中汉他病毒抗原的方法。该方法包括：
(a)将生物样品与至少六种不同抗体相接触，其中所述抗体各自至少对六种汉他病毒抗原之一特异，其中所述六种汉他病毒抗原包括汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的G1和/或N抗原的组合，其中存在对各血清型的至少一种抗原特异的至少一种抗体，其中所述接触在允许汉他病毒抗原(存在于生物样品中时)结合于所述抗体以形成抗体/抗原复合物的条件下进行；和
(b)检测是否存在抗体/抗原复合物，从而检测样品中是否存在汉他病毒抗原。
在上述方法的某些实施方式中，抗体是单克隆抗体。
在又一实施方式中，本发明涉及检测汉他病毒感染的免疫诊断测试试剂盒。该测试试剂盒包括：
(a)至少六种不同的抗体，其中各抗体至少对六种汉他病毒抗原之一特异，这六种汉他病毒抗原包括汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的G1和/或N抗原的组合，其中存在对各血清型的至少一种抗原特异的至少一种抗体；和
(b)进行所述免疫诊断测试的说明书。
在上述免疫诊断测试试剂盒的某些实施方式中，抗体是单克隆抗体。
在其它实施方式中，本发明涉及包含至少六种汉他病毒重组抗原的固体支持物，其中这至少六种汉他病毒重组抗原包括汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的G1和/或N抗原的组合，其中存在各血清型的至少一种抗原。所述固体支持物可以是硝酸纤维素条带。
在某些实施方式中，固体支持物还包含至少一种抗-人免疫球蛋白抗体，所述一种或多种抗体选自抗-人IgM抗体、抗-人IgG抗体和抗-人IgA抗体，其中所述汉他病毒抗原和抗-人免疫球蛋白抗体固定在固体支持物上的分离的(discrete)位置中。
在其它实施方式中，固体支持物还包含至少两种内标，其中一种内标确定了采用该固体支持物的免疫试验中阳性结果的检测下限，另一内标确定了采用该固体支持物的免疫试验中的高度阳性结果。
在另一实施方式中，本发明涉及检测汉他病毒的免疫诊断测试试剂盒。该测试试剂盒包括：
(a)如上所述的固体支持物；和
(b)进行所述免疫诊断测试的说明书。
在其它实施方式中，本发明涉及检测生物样品中是否存在汉他病毒抗体的方法。该方法包括：
(a)提供生物样品；
(b)提供如上所述的固体支持物；
(c)将生物样品与固体支持物相接触，接触条件允许汉他病毒抗体(如果存在于生物样品中)与至少一种汉他病毒抗原结合以形成抗体/抗原复合物；和
(d)检测是否存在抗体/抗原复合物，从而检测生物样品中是否存在汉他病毒抗体。
在某些实施方式中，上述方法还包括：
(e)去除未结合的汉他病毒抗体；
(f)提供能够与抗体/抗原复合物结合的一个或多个部分；和
(g)检测是否存在一个或多个部分，从而检测生物样品中是否存在汉他病毒抗体。
在某些实施方式中，所述一个或多个部分包括可检测标记的汉他病毒抗原。在这些和其它实施方式中，可检测标记可以是酶。
在又一实施方式中，本发明涉及制备基本不含汉他病毒的血液供给品的方法，所述血液供给品包括全血、血小板、血浆或血清。该方法包括：
(a)用上述方法中的任何一种方法筛选收集的血液样品中的全血、血小板、血浆或血清等份；
(b)清除检测到汉他病毒抗原或汉他病毒抗体的任何样品；和
(c)混合没有检测到汉他病毒抗原和汉他病毒抗体的样品，以提供基本不含汉他病毒的血液供给品。
在任何上述方法中，生物样品可来自人血样品。此外，在任何上述实施方式中，G1抗原可包含对应于氨基酸序列SEQ ID NO：40的氨基酸序列。G1抗原可以是包含选自下组的氨基酸序列的一种或多种抗原：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47。
此外，N抗原可包含对应于氨基酸序列SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在其它实施方式中，N抗原可以是包含选自下组的氨基酸序列的一种或多种抗原：SEQ IDNO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53。
G1抗原可包含对应于氨基酸序列SEQ ID NO：40的氨基酸序列，且N抗原包含对应于氨基酸序列SEQ ID NO：39的氨基酸序列。在其它实施方式中，G1抗原是包含选自下组的氨基酸序列的一种或多种抗原：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ IDNO：47，N抗原是包含选自下组的氨基酸序列的一种或多种抗原：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：36。
在其它实施方式中，至少一种G1抗原由各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV递呈，至少一种N抗原由各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV递呈。
在其它实施方式中，至少一种N抗原由各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV递呈。
根据本文公开内容，本领域技术人员不难实施本发明的这些和其它实施方式。
附图简要说明
图1A和1B(SEQ ID NO：1和2)显示了HTNV分离物76-118的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图1A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图1B)。
图2A和2B(SEQ ID NO：3和4)显示了PUUV分离物CG1820的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图2A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图2B)。
图3A和3B(SEQ ID NO：5和6)显示了SEOV分离物80-39的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图3A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图3B)。
图4A和4B(SEQ ID NO：7和8)显示了DOBV的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图4A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图4B)。
图5A和5B(SEQ ID NO：9和10)显示了SNV分离物NM H10的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图5A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图5B)。
图6A和6B(SEQ ID NO：11和12)显示了ANDV分离物智利-9717869的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图6A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图6B)。
图7A和7B(SEQ ID NO：13和14)显示了用于所述试验的代表性HTNV G1肽的核苷酸序列(图7A)和相应氨基酸序列(图7B)。
图8A和8B(SEQ ID NO：15和16)显示了用于所述试验的代表性PUUV G1肽的核苷酸序列(图8A)和相应氨基酸序列(图8B)。
图9A和9B(SEQ ID NO：17和18)显示了用于所述试验的代表性SEOV G1肽的核苷酸序列(图9A)和相应氨基酸序列(图9B)。
图10A和10B(SEQ ID NO：19和20)显示了用于所述试验的代表性DOBV G1肽的核苷酸序列(图10A)和相应氨基酸序列(图10B)。
图11A和11B(SEQ ID NO：21和22)显示了用于所述试验的代表性SNV G1肽的核苷酸序列(图11A)和相应氨基酸序列(图11B)。
图12A和12B(SEQ ID NO：23和24)显示了用于所述试验的代表性ANDV G1肽的核苷酸序列(图12A)和相应氨基酸序列(图12B)。
图13A和13B(SEQ ID NO：25和26)显示了用于所述试验的分离物76-118的全长HTNV N的代表性核苷酸序列(图13A)和相应氨基酸序列(图13B)。
图14A和14B(SEQ ID NO：27和28)显示了用于所述试验的分离物CG1820的全长PUUV N的代表性核苷酸序列(图14A)和相应氨基酸序列(图14B)。
图15A和15B(SEQ ID NO：29和30)显示了用于所述试验的分离物80-39的全长SEOV N的代表性核苷酸序列(图15A)和相应氨基酸序列(图15B)。
图16A和16B(SEQ ID NO：31和32)显示了用于所述试验的全长DOBV N的代表性核苷酸序列(图16A)和相应氨基酸序列(图16B)。
图17A和17B(SEQ ID NO：33和34)显示了用于所述试验的分离物NM H10的全长SNV N的代表性核苷酸序列(图17A)和相应氨基酸序列(图17B)。
图18A和18B(SEQ ID NO：35和36)显示了用于所述试验的分离物智利-9717869的全长ANDV N的代表性核苷酸序列(图18A)和相应氨基酸序列(图18B)。
图19A和19B(SEQ ID NO：37和38)分别显示了如实施例所述用于SOD与G1和N抗原的融合物的代表性人SOD核苷酸和氨基酸序列。融合的SOD序列包括图19B的氨基酸1-158(图19A的核苷酸1-489)，它包括C-末端上非SOD序列的五个氨基酸(TRQNK，SEQ ID NO：41)，以提供用于克隆的限制性位点。
图20(SEQ ID NO：42)显示了用于所述试验的代表性SOD/HTNV G1融合物的氨基酸序列。
图21(SEQ ID NO：43)显示了用于所述试验的代表性SOD/PUUV G1融合物的氨基酸序列。
图22(SEQ ID NO：44)显示了用于所述试验的代表性SOD/SEOV G1融合物的氨基酸序列。
图23(SEQ ID NO：45)显示了用于所述试验的代表性SOD/DOBV G1融合物的氨基酸序列。
图24(SEQ ID NO：46)显示了用于所述试验的代表性SOD/SNV G1融合物的氨基酸序列。
图25(SEQ ID NO：47)显示了用于所述试验的代表性SOD/ANDV G1融合物的氨基酸序列。
图26(SEQ ID NO：48)显示了用于所述试验的代表性SOD/HTNV N融合物的氨基酸序列。
图27(SEQ ID NO：49)显示了用于所述试验的代表性SOD/PUUV N融合物的氨基酸序列。
图28(SEQ ID NO：50)显示了用于所述试验的代表性SOD/SEOV N融合物的氨基酸序列。
图29(SEQ ID NO：51)显示了用于所述试验的代表性SOD/DOBVN融合物的氨基酸序列。
图30(SEQ ID NO：52)显示了用于所述试验的代表性SOD/SNVN融合物的氨基酸序列。
图31(SEQ ID NO：53)显示了用于所述试验的代表性SOD/ANDVN融合物的氨基酸序列。
发明详述
除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的病毒学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见例如，《基础病毒学》(Fundamental Virology)，第3版，第I和II卷(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《实验免疫学手册》(Handbook of Experimental Immunology)，第I-IV卷(D.M.Weir和CC.Blackwell编，Blackwell Scientific Publications)；T.E.Creighton，《蛋白质：结构和分子特性》(Proteins：Structures and Molecular Properties)(W.H.Freeman and Company，1993)；A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(WorthPublishers，Inc.，现有版本)；Sambrook等，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)(第2版，1989)；《酶学方法》(Methods In Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)。
将上述或下述所有发表物、专利和专利申请全文纳入本文作参考。
文中使用了下列氨基酸缩写：
丙氨酸：Ala(A)                      精氨酸：Arg(R)
天冬酰胺：Asn(N)                    天冬氨酸：Asp(D)
半胱氨酸：Cys(C)             谷氨酰胺：Gln(Q)
谷氨酸：Glu(E)               甘氨酸：Gly(G)
组氨酸：His(H)               异亮氨酸：Ile(I)
亮氨酸：Leu(L)               赖氨酸：Lys(K)
甲硫氨酸：Met(M)             苯丙氨酸：Phe(F)
脯氨酸：Pro(P)               丝氨酸：Ser(S)
苏氨酸：Thr(T)               色氨酸：Trp(W)
酪氨酸：Tyr(Y)               缬氨酸：Val(V)
I.定义
在本发明的描述中，使用了下列术语，定义如下。
必须注意的是，如本说明书中和权利要求书中使用的，单数形式“一”、“一个”、“该”包括复数，除非该内容另有明确说明。因此，例如，提到＂G1多肽＂包括两种或多种所述多肽的混合物等。
术语“多肽”和“蛋白质”指氨基酸残基的聚合物，并不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在该定义中。全长的蛋白质及其片段都包括在该定义中。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，为了本发明的目的，“多肽”指包括对天然序列的修饰(例如缺失、添加和取代(通常性质保守))的蛋白质，只要蛋白质保持了所需活性。这些修饰可以是精心设计的，如通过定点诱变，或可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主的突变，或由于PCR扩增引起的错误。
提到用于本发明的各种汉他病毒多肽时，所用术语＂抗原＂指天然、重组或合成的N、G1等多肽，其包括能识别汉他病毒抗体并且衍生自所研究的汉他病毒毒株的各种分离物的一个或多个表位。因此，“汉他病毒抗原”是衍生自任何汉他病毒血清型、毒株和分离物的抗原，分离物包括但不限于鼠亚科、绵鼠亚科和田鼠亚科的各种分离物。例如，SNV抗原衍生自各种无名病毒分离物，如原型新墨西哥SNV分离物、3H226、加利福尼亚分离物、不列颠哥伦比亚分离物等。类似地，SEOV抗原衍生自各种首尔病毒分离物等。用于本发明的其它抗原可衍生自其它HPS-和HFRS-相关性汉他病毒，包括但不限于无名病毒(SNV；也称为四角病毒和莫尔托-卡尼翁病毒)；安第斯病毒(ANDV)；纽约病毒(NYV)；污黑小河沟病毒(BCCV)；牛轭湖病毒(BAYV)；汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)和多不拉伐-贝尔格莱德病毒(DOBV)。这些病毒的基因组序列已知，以下进一步详述用于本发明的几种抗原序列。
所研究抗原不需要包括参比分子的全长氨基酸序列，但可仅包括能使多肽与合适的汉他病毒抗体反应的分子。因此，仅需要存在参比分子的一个或几个表位。而且，抗原可包含全长参比分子或参比分子片段与另一种蛋白如另一种汉他病毒抗原和/或不破坏汉他病毒抗原反应性的蛋白的融合蛋白。不难理解，抗原因此可包含参比分子的全长序列、片段、截短和部分序列，以及参比分子的类似物、突变蛋白和前体形式。该术语也指参比序列的缺失、加入和取代，只要抗原保持与汉他病毒抗体反应的能力。
在这个方面，具体汉他病毒毒株内不同分离物之间会发生天然变异。因此，该术语旨在包括这种变异，具体说，与参比抗原相比，氨基酸组成的差异不超过约20数量％、更优选不超过约10-15数量％、最优选不超过约5数量％的抗原。因此，与参比分子的氨基酸序列基本相同，但含有不显著影响抗原的抗体结合能力的少量氨基酸取代的蛋白属于参比多肽的定义。
″衍生自″汉他病毒血清型、毒株或分离物的抗原指包含由参比汉他病毒基因组编码的抗原序列的抗原。一般地，所述抗原包括一个或多个表位，通常具有与参比多肽基本同源的氨基酸序列，如下所述。因此，用术语″衍生自″判定分子来源，但不旨在限制制备该分子的方法，可以是(例如)化学合成或重组方法。
术语“类似物”和“突变蛋白”指保留了所需活性(如本文所述试验中的免疫反应性)的参比分子的生物活性衍生物。通常，术语“类似物”指具有天然多肽的序列和结构、并与天然分子相比具有一个或多个氨基酸添加、取代(性质通常为保守性)和/或缺失(只要这种修饰不破坏免疫反应性)的化合物，它们与参比分子“基本同源”，如下所述。已知各种分离物之间有许多保守区和可变区，通常，比对两条序列时，衍生自这些区的表位的氨基酸序列具有高度序列同源性，如氨基酸序列同源性大于50％，通常大于60％-70％。术语“突变蛋白”指具有一种或多种肽模拟物(“拟肽”)的肽。此种类似物或突变蛋白优选至少具有与天然分子相同的免疫反应性。制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域已知的，以下将进一步描述。
术语“类似物”和“突变蛋白”也包括对参比分子进行的有意突变。尤其优选的类似物包括性质上保守的取代物，即在侧链相关的氨基酸类型内发生取代。具体说，氨基酸通常分为四类：(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测：单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸对氨基酸进行类似的保守性取代，将不会对其生物活性有显著影响。例如，感兴趣的抗原可包括多达约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或甚至多达约15-25个、50个或75个保守或非保守氨基酸取代，或5-75之间任何整数的取代，只要该分子的所需功能仍保持不变。本领域的熟练技术人员参照本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，不难确定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。
“片段”指仅由完整全长多肽序列和结构的一部分组成的抗原。片段可包括天然多肽的C末端缺失和N末端缺失，和/或内部缺失。本文图7-12中显示了用于本试验的代表性G1片段。″免疫原性片段″指包含一个或多个表位，从而引发本文所述的一种或多种免疫应答的汉他病毒多肽片段。具体汉他病毒蛋白的″免疫原性片段″通常包括能确定表位的全长分子的至少约5-10个连续氨基酸残基，优选全长分子的至少约15-25个连续氨基酸残基，最优选全长分子的至少约20-50个或更多个连续氨基酸残基，或5个氨基酸-全长序列的任意整数，只要所研究的片段保持引发本文所述免疫应答的能力。
如上所述，″N抗原″指衍生自所研究汉他病毒的核衣壳蛋白的抗原。已知各种汉他病毒N蛋白的DNA和相应氨基酸序列。例如，图13-18中分别显示了HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的代表性N抗原的核苷酸序列和相应氨基酸序列。此外，编码大量分离物的N蛋白的S节段已经保存于GenBank，下面进一步描述。1995年1月5日公开的国际公开号WO95/00648中描述了其它序列。Hjelle等，J.Virol(1994)68：592-596描述了衍生自SNV、希望山(Prospect Hill)病毒(PHV)和PUUV的N抗原的氨基酸序列。
如上所述，用于本试验的N抗原包括全长或基本全长的蛋白，以及该蛋白的片段、融合物或突变体，其中包含一个或多个表位，以便保持与来自患有所研究具体汉他病毒感染的个体的生物样品中存在的抗体的反应性。例如，用于本文所述试验的N抗原可以是全长SNV N序列与另一种蛋白如另一种汉他病毒抗原的重组融合物，和/或与有助于重组表达的蛋白，如50kDa大肠杆菌(E.coli)麦芽糖结合蛋白、或人或酵母超氧化物歧化酶(SOD)蛋白的融合物。用于本试验的N蛋白的代表性免疫反应性片段是43个氨基酸的接近氨基末端的节段，对应的氨基酸序列是N多肽的17-59位(相对于SNVNM10编号)，氨基酸序列为QLVTARQKLKDAERAVELDPDDVNKSTLQSRRAAVSALETKLG(SEQ ID NO：39)。此片段包括N蛋白的免疫显性表位，抗此表位的抗体可与PUUV、SEOV和HTNV的N蛋白交叉反应(参见例如，Yamada等，J.Virol.(1995)69：1939-1943和1995年3月2日公开的国际公开号WO95/06250)。因此，此片段以及包含此序列的较大片段可用于本文所述试验。对N蛋白表位的描述也参见Lundkvist等，Clin.Diag.Lab.Immunol.(1995)2：82-86；和Gott等，Virus Res.(1991)19：1-16。
如上所述，“G1抗原”指衍生自所研究汉他病毒的称为G1的包膜糖蛋白的抗原。各种汉他病毒G1蛋白的DNA和相应氨基酸序列是已知的。本文图1-6显示了代表性G1区。此外，编码大量分离物的G1蛋白的M节段已经保存于GenBank，下面进一步描述。如上所述，用于本试验的G1抗原包括全长或基本全长的蛋白，以及该蛋白的片段、融合物或突变体，其中包含一个或多个表位，以便保持与来自患有所研究具体汉他病毒感染的个体的生物样品中存在的抗体的反应性。用于本文所述试验的G1抗原包括所研究G1抗原与图19所示人超氧化物岐化酶(SOD)序列的融合物，以帮助重组表达该抗原。本文图7-12中显示了来自许多汉他病毒血清型的G1蛋白的许多其它代表性免疫反应性片段。G1蛋白的另一代表性免疫反应性片段是一种31个氨基酸肽，其位于氨基酸59-89(相对于SNV NM H10编号)之间的节段，氨基酸序列为LKIESSCNFDLHVPATTTQKYNQVDWTKKSS(SEQ ID NO：40)。这部分G1蛋白构成了各种SNV分离物的SNV抗体识别的免疫反应性线性表位(Jenison等，J.Virol.(1994)68：3000-3006)。此片段以及包含此序列的较大片段可用于本文所述试验。
汉他病毒抗原的″免疫原性″序列指包含具有至少一种汉他病毒表位的氨基酸序列的分子，所述表位使该分子能够与所研究汉他病毒的抗体反应，以及在合适的宿主中刺激抗体的产生。″表位″指抗原上与特定B细胞和/或T细胞反应的位点，使所研究的汉他病毒表位能够与生物样品中汉他病毒抗体反应，并刺激抗体产生。该术语也可与“抗原决定簇”或“抗原决定位点”互换使用。表位可包含3个或多个氨基酸，它们具有独特的空间构象。通常，表位由至少5个这种氨基酸组成，更通常，由至少8-10个或更多个这种氨基酸组成。
可用许多本领域熟知的表位作图技术鉴定包含表位的给定多肽的区域。参见例如，《分子生物学方法中的表位作图法》(Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology)，第66卷(Glenn E.Morris编，1996)Humana Press，新泽西州Totowa。例如，可通过(如)以下方法确定线性表位：在固体支持物上同时合成大量肽，使肽对应于蛋白质分子的某部分，在肽仍然连接于支持物时使肽与抗体反应。这种技术是本领域已知的，参见例如美国专利号4,708,871；Geysen等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3998-4002；Geysen等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：178-182；Geysen等，(1986)Molec.Immunol.23：709-715，将所有文献以全文纳入本文作参考。类似地，通过测定氨基酸空间构象如x-射线晶体衍射和2维核磁共振不难鉴定构象表位。参见例如，《表位作图法》(Epitope Mapping Protocols)，上述。也可用标准抗原性和亲水性图鉴定蛋白质的抗原区域，如用(例如)购自OxfordMolecular Group的Omiga1.0版软件程序计算。此计算机程序采用Hopp/Woods法，Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78：3824-3828来测定抗原性特征，采用Kyte-Doolittle技术，Kyte等，J.Mol.Biol.(1982)157：105-132作亲水性图。
“免疫原性组合物”是包含至少一种免疫原性多肽(如N和/或G1汉他病毒抗原)的组合物。
“基本纯化的”通常指分离物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物)，以使该物质占其存在的样品中的大部分。一般地，样品中基本纯化的组分占该样品的50％、优选80％-85％、更优选90-95％。纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术是本领域熟知的，包括(例如)离子交换色谱、亲和色谱和根据密度沉降。
提到多肽时，“分离的”指所指的分子与它天然存在于其中的整个生物体相分离和分开，或者基本上不存在同一类型的其它生物大分子。“分离的”多核苷酸指全部或部分没有通常在天然条件下与其结合的序列的核酸分子；或者指一种以其天然形式存在但与异源序列结合的序列；或者指从染色体脱离下来的分子。
″等效抗原决定簇″指来自汉他病毒的不同分离物或毒株的抗原决定簇，由于序列变异这些抗原决定簇不必相同，但变异发生在所研究汉他病毒序列的等效位置中。通常，在比对两条序列时，等效抗原决定簇的氨基酸序列具有高度序列同源性，如氨基酸序列同源性大于30％、通常大于40％，如大于60％，甚至大于80-90％。
“同源性”指两条多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分数。两个核酸序列或两个多肽序列在确定的分子长度内，当序列显示有至少约50％，优选至少约75％、更佳至少约80-85％、尤其佳至少约90％、最佳至少约95-98％序列相同性时，彼此“基本上同源”。如本文所述，基本同源也指与特定序列完全相同的序列。
通常，“相同性”指两条多核苷酸或多肽序列上核苷酸和核苷酸或者氨基酸和氨基酸准确相对应。通过排列其序列，可比较两个分子(参比序列和与参比序列的相同性％未知的序列)之间的序列信息，计算两条对比序列之间匹配的准确数量，将其除以参比序列的长度，然后乘以100，即可测定相同性百分数。使用易于获得的计算机程序可有助于分析，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(Atlas ofProtein Sequence and Structure、M.O.Dayhoff编辑，5Suppl.，3：353-358，National Biomedical Research Foundation，Washington，DC)，它采用了Smith和Waterman分析肽用的局部同源性算法(AdvancesinAppl.Math.，2：482-489，1981)。可从Wisconsin Sequence Analysis Package(第8版，从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)获得测定核苷酸序列相同性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。采用制造者建议的和参照Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gap penalty)测定核苷酸序列与参比序列的相同性百分数。
本发明建立相同性百分数的另一方法是采用版权属于爱丁堡大学、由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发、由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发行的MPSRCH程序包。可采用这套程序包中的Smith-Waterman算法，其中，在计分表中使用默认参数(例如，间隔开放罚分＝12，间隔延伸罚分＝1，间隔＝6)。从这批数据产生的“匹配”值反映出“序列相同性”。计算序列间的同一性百分数或相似性百分数的其它合适的程序通常在本领域中是已知的，例如，另一种排列对比程序是BLAST，也使用默认参数。例如，可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP：基因编码＝标准；过滤＝无；链＝两；截留＝60；期望值＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝高分(HIGHSCORE)；数据库＝无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。不难获得这些程序的详细描述。
或者，在同源区域之间形成稳定的双链体条件下进行多核苷酸杂交，接着用单链特异性核酸酶消化，然后测定消化片段的大小，从而测出同源性。在如(为具体的系统所定义的)严格条件下进行的Southern杂交实验中，可鉴别基本同源的DNA序列。确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所掌握的知识之内。例如，参见Sambrook等，同上；DNA Cloning，同上；Nucleic Acid Hybridization，同上。
本文用于描述核酸分子的“重组”指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作的缘故，该多核苷酸与与其天然相关的多核苷酸的全部或部分不相关。用于蛋白质或多肽的术语“重组子”指通过重组多核苷酸表达产生的多肽。通常，克隆感兴趣的基因，然后在转化的生物体中表达(如下所述)。宿主生物体在表达条件下表达外源基因，从而产生蛋白。
″抗体″指特异性结合于抗原中存在的感兴趣表位的分子。″特异性结合″指抗体以“锁钥”型相互作用识别表位并与其作用，在抗原和抗体间形成复合物，相反，非特异性结合可以在抗体与(例如)抗体与其反应的测试底物之间发生。因此，抗-汉他病毒G1抗体是特异性结合于汉他病毒G1蛋白的表位的分子。本文所用术语″抗体″包括获自多克隆和单克隆制剂的抗体以及：杂交(嵌合)抗体分子(参见例如，Winter等，Nature(1991)349：293-299和美国专利号4,816,567)；F(ab′)2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异源二聚体，参见例如，Inbar等，Proc Natl Acad Sci USA(1972)69：2659-2662；和Ehrlich等，Biochem(1980)19：4091-4096)；单链Fv分子(sFv)(参见例如，Huston等，Proc Nal Acad Sci USA(1988)85：5879-5883)；二元和三元抗体片段构建物；小抗体(参见例如，Pack等，Biochem(1992)31：1579-1584；Cumber等，JImmunology(1992)149B：120-126)；人源化抗体分子(参见例如，Riechmann等，Nature(1988)332：323-327；Verhoeyan等，Science(1988)239：1534-1536；和1994年9月21日公开的英国专利公开号GB2,276,169)；以及获自这些分子的任何功能片段，其中这些片段保持了母抗体分子的免疫结合特性。
本文所用术语″单克隆抗体″指含有均一抗体群体的抗体组合物。该术语不限制抗体的种类或来源，也不限制其制备方式。该术语包括完整的免疫球蛋白和片段如Fab、F(ab′)2、Fv和其它片段，以及具有母单克隆抗体分子的免疫结合特性的嵌合和人源化的均一抗体群体。
本文所用″固体支持物″指可连接大分子，如蛋白质、多肽、肽、多核苷酸的固体表面，如磁珠、乳胶珠、微量滴定板孔、玻璃平板、尼龙、琼脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅颗粒、硝酸纤维素膜等。
″免疫反应性″指所研究的抗原将与来自汉他病毒感染个体的生物样品中存在的抗汉他病毒抗体特异性反应。
″免疫复合物″指抗体结合于抗原上的表位时形成的组合。
在本文中，“生物样品”指分离自受检者的组织或体液样品，例如但不限于：血液，血浆，血清，粪便排泄物，尿，骨髓，胆汁，脊髓液，淋巴液，脑脊液，皮肤样品，皮肤、呼吸道、肠和泌尿生殖道的分泌物，眼泪，唾液，乳，血细胞，器官，活检组织，以及体外细胞培养组成物的样品，包括但不限于用培养基培养的细胞或组织产生的条件培养基(conditioned media)，如重组细胞和细胞成分。上面详述的样品不必是直接获自来源的形式。例如，分析前，可在临用前以(例如)加热、离心等处理样品。
本文所用术语″标记″和″可检测标记″指能够检测的分子，包括但不限于：放射性同位素、荧光剂、半导体纳米晶体、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、金溶胶、配体(如生物素、链霉抗生素蛋白或半抗原)等。术语″荧光剂″指能够在可检测范围内发出荧光的物质或其部分。可用于本发明的标记的具体例子包括但不限于：辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素、FITC、罗丹明、丹酰、伞形酮、二甲基吖啶鎓酯(DMAE)、得克萨斯红、鲁米诺、NADPH和α-β-半乳糖苷酶。
II.实施本发明的方式
在详细描述本发明之前，应理解本发明并非局限于特定的制剂或加工参数，显然，它们是可以变化的。还应理解本文所用的术语仅用于说明本发明的具体实施例，而并非对其限制。
虽然与本文所述内容相似或等效的许多方法和材料可用于实施本发明，但本文描述了优选的材料和方法。
本发明基于发现了准确检测汉他病毒感染的新型诊断方法。该方法采用包含免疫显性表位的汉他病毒重组N和G1抗原，和/或这些抗原的抗体，这些抗原来自至少六种不同的汉他病毒血清型，包括HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。在某些实施方式中，该试验包括(例如)六种重组G1抗原(和/或六种G1抗原的抗体)(每种抗原来自各上述血清型)和/或六种重组N抗原(每种抗原来自各上述血清型)。在其它实施方式中，该试验可包括(例如)衍生自这六种血清型中任何一种的至少一种重组N抗原(产生能与另外五种血清型的一种或多种交叉反应的抗体)和六种重组G1抗原，每种抗原来自各上述六种血清型。例如，该试验可包括来自SNV的N抗原(和/或N抗原的抗体)。该试验也包括G1抗原(和/或G1抗原的抗体)，优选来自所有六种血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。或者，该试验可包括来自这六种血清型中任何一种的G1抗原(和/或其抗体)和这六种血清型各自的六种N抗原(和/或其抗体)。在另一实施方式中，该实验可包括(例如)来自这六种血清型中三种的三种G1抗原(和/或其抗体)和来自这六种血清型中另外三种的三种N抗原(和/或其抗体)。或者，该实验可包括两种G1抗原(和/或其抗体)和四种N抗原(和/或其抗体)，或者四种G1抗原(和/或其抗体)和两种N抗原(和/或其抗体)，或者一种G1抗原(和/或其抗体)和五种N抗原(和/或其抗体)，或者五种G1抗原(和/或其抗体)和一种N抗原(和/或其抗体)，或者四种G1抗原(和/或其抗体)和四种N抗原(和/或其抗体)，或者五种G1抗原(和/或其抗体)和五种N抗原(和/或其抗体)等等。不难理解，可采用重组G1和N抗原(和/或其抗体)的任何组合，只要代表了六种血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。
本发明试验也可采用衍生自表1所述的多种汉他病毒毒株或后来鉴定的其它毒株的其它汉他病毒抗原。
来自六种血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒N和/或G1抗原(和/或其抗体)任选地与其它汉他病毒蛋白和/或抗体联用，可诊断多种已知汉他病毒血清型引起的感染。而且，可调整该试验以便可以鉴定引起感染的具体汉他病毒血清型。例如，来自各种HPS-和HFRS-相关性汉他病毒感染者的生物样品与SNV N抗原反应，但不一定与SNV G1抗原反应。因此，能够与SNV N抗原反应但不与SNV G1抗原反应说明感染了汉他病毒但并非SNV，等。不难理解，各种抗原和抗原组合(或这些抗原的抗体)可用于本诊断试验。
该方法可用于检测人和啮齿动物群体的汉他病毒感染。该方法可检测血样中的汉他病毒感染，所述血样包括但不限于全血、血清和血浆。因此，可用该方法诊断对象，如人或啮齿类对象的汉他病毒感染，以及检测捐献血样中的汉他病毒污染。可筛选个体捐献样品或集合样品的等份中是否存在汉他病毒，可在混合前清除被汉他病毒污染的样品或集合样品。以此方式，可提供基本没有汉他病毒污染的血液供给品。
为了进一步理解本发明，以下更详细地讨论了汉他病毒以及用于本发明组合物和方法的各种汉他病毒抗原和抗体。
汉他病毒抗原
如上所述，汉他病毒家族的病毒属于布尼亚病毒属，该病毒是有包膜的负链RNA病毒。病毒基因组的RNA分成三部分，由通常分别称为S、M和L的小、中和大3个基因组片段组成。M节段编码一个开放阅读框中的两种包膜糖蛋白，称为G1和G2。S节段编码核衣壳蛋白，称为N，基因组的L节段编码RNA依赖性RNA聚合酶。
发现世界上几种不同汉他病毒与特定啮齿类宿主相关(见表1)。如上所述，衍生自至少六种主要汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的N和/或G1抗原可用于本发明。经鉴定属于这些血清型的来自许多分离物的N和G1抗原的序列和编码这些抗原的核酸序列是已知的。本文图1-12中描述了可产生G1抗原的代表性序列。虽然图中描述的G1抗原包括N-末端甲硫氨酸，但本文所用G1肽不必包含此甲硫氨酸，尤其是通过合成方法产生时。本文所用G1抗原可包含全长G1蛋白或G1蛋白的免疫原性片段。尤其有用的是至少包含对应于氨基酸59-89(相对于SNV NM H10编号)代表的31个氨基酸序列区域(LKIESSCNFDLHVPATTTQKYNQVDWTKKSS(SEQ ID NO：40)的片段。G1蛋白的这个区域构成了免疫反应性线性表位，在本文图7-12显示的各G1免疫原性片段中发现了这个区域。在本文感兴趣的六种汉他病毒血清型中此序列不同。因此，应该理解，“对应于”此序列的非-SNV汉他病毒氨基酸序列是属于相同区域的非SNV汉他病毒的氨基酸节段，并显示出与此序列同源，但不必与此序列100％相同。不难通过参照本文图7-12鉴定其它五种汉他病毒血清型中的相应区域。
包含对应于SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的氨基酸序列的免疫原性G1抗原可包括(例如)31个氨基酸，长达全长G1分子，如31-500个氨基酸，优选31-250个氨基酸，甚至更优选31-150个氨基酸，如31-50...60...70...75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86...90...100...200...300...400...500个氨基酸，长达全长G1分子，或这些范围内的任意整数个氨基酸。而且，本文所用G1抗原可缺少所有或一部分跨膜结合结构域和/或包膜C末端中发现的胞质尾。因此，本发明考虑了采用保留跨膜结合结构域和胞质尾的包膜多肽，以及缺少所有或一部分跨膜结合结构域和/或胞质尾的抗原，以及G1蛋白的相邻部分。用本领域熟知的计算机程序和算法(如Kyte-Doolittle技术，Kyte等，J.Mol.Biol.(1982)157：105-132)不难确定所述结构域的位置。
熟知可产生G1抗原的其它序列。例如，G1序列可衍生自各种HTNV序列，如保存在NCBI登录号为NC_005219、AF345636、D25532、D25529、D00377、D00376、AF288645、AF366569、AF035831、Y00386、U38177、U37729、M14627和L08753的序列。G1序列可衍生自各种SNV序列，如保存在NCBI登录号为L37903、L25783、AF030552、AF030551和U02471的序列。G1序列可衍生自各种ANDV序列，如保存在NCBI登录号为NC_003467和AF291703的序列。G1序列可衍生自各种SEOV序列，如保存在NCBI登录号为AF458104、AB027521、AF288654、AF288652、AF288650和S47716的序列。G1序列可衍生自各种PUUV序列，如保存在NCBI登录号为NC_005223、AY526218、U14136、U22418、L08754、L08755、X61034、X55129和M29979的序列。G1序列可衍生自各种DOBV序列，如保存在NCBI登录号为NC_005234、AJ410616、AY168578、AY168577和L33685的序列。
本文图13-18中描述了可产生N抗原的代表性序列。如上G1抗原所述，N抗原可以或可以不包含N末端甲硫氨酸。本文所用N抗原可包含全长N蛋白或N蛋白的免疫原性片段。尤其有用的是至少包含对应于N多肽17-59位(相对于SNV NM H10编号)的43个氨基酸序列区域(QLVTARQKLKDAERAVELDPDDVNKSTLQSRRAAVSALETKLG(SEQ ID NO：39)的片段。N蛋白的此区域包含免疫显性表位，抗此表位的抗体能与PUUV、SEOV和HTNV的N蛋白交叉反应。
在六种感兴趣的汉他病毒血清型中此序列不相同。因此，应理解，“对应于”此序列的非-SNV汉他病毒的氨基酸序列是属于相同区域的非SNV汉他病毒的氨基酸节段，并显示出与此序列同源，但不必与此序列100％相同。不难通过参照本文图13-18鉴定其它五种汉他病毒血清型中的相应区域。
包含对应于SEQ ID NO：39所示氨基酸序列的氨基酸序列的免疫原性N抗原可包括(例如)43个氨基酸，长达全长N分子，如43-350个氨基酸，优选43-300个氨基酸，更优选43-200个氨基酸，甚至更优选43-100个氨基酸，如43-60...70...80...90...100...200...300...400，长达全长N分子，或这些范围内的任意整数个氨基酸。
熟知可产生N抗原的其它序列。例如，N序列可衍生自多种HTNV序列，如保存在NCBI登录号为AB127998、AB027101、AB027523、AB027097、D25533、AF288646、AF288644、AF427324、AF427323、AF427322、AF427320、AF427319、AF427318、AF366568、AY017064、AF321095、AF321094、AF288296、U37768和M14626的序列。N序列可衍生自多种SNV序列，如保存在NCBI登录号为NC_005216、L37904、L25784、L33816、L33683和U02474的序列。N序列可衍生自多种ANDV序列，如保存在NCBI登录号为NC_003466、AF325966、AF0044660和AF291702的序列。N序列可衍生自多种SEOV序列，如保存在NCBI登录号为NC_005236、AF488708、AF488707、AY273791、AB027522、AF329390、AF288655、AF288653、AF288643、AF406965、AY006465的序列。N序列可衍生自多种PUUV序列，如保存在NCBI登录号为NC_005224、AY526219、AJ314601、AJ314600、AJ314599、AJ314598、AJ314597、AF442613、AF367071、AF367070、AF367068、AF367067、AF367066、AF367065、AF367064、AJ277030、AJ277076、AJ277075、AJ277034、AJ277033、AJ277032、AJ277031、AJ238791、AJ238790、AJ238789、AJ238788、X61035、AB010731、AB010730、U14137、AF294652、U22423、L08804、L11347和M32750的序列。N序列可衍生自多种DOBV序列，如保存在NCBI登录号为NC_005233、AJ616854、AJ410619、AJ410615、AJ131673、AJ131672、AJ269550、AJ269549、AJ009775、AJ009773、AY168576和L41916的序列。
重组N和G1抗原可以是单独产物，或是多种N和G1抗原、与或不与来自这六种血清型中一种或多种的其它汉他病毒抗原，以及衍生自除HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV以外的血清型的抗原的融合物。例如，融合物可包含来自上述六种血清型的G1抗原。此融合物可单独使用或与第二种融合物联用，第二种融合物包含来自这六种血清型中一种或多种的一个或多个N抗原。相似地，融合物可包含来自上述六种血清型的N抗原，此融合物可单独使用或与第二种融合物联用，第二种融合物包含来自这六种血清型中一种或多种的一种或多种G1抗原。或者，可以一种融合物或多种融合物提供所有N和G1抗原。不难理解，本发明融合蛋白可取多种形式，只要存在来自HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的N和/或G1抗原。如果产生了融合物，那么不需要以天然病毒中发现的相同顺序组织多肽。因此，例如，可将G1多肽融合于N多肽的N末端或C末端等。其它可能的融合蛋白包括人或酵母超氧化物岐化酶(SOD)蛋白或SOD蛋白片段与汉他病毒G1和/或N多肽的融合物。表达为人SOD融合抗原的重组蛋白的例子参见Barr等，Vaccine(1987)5:90-101；Pichuantes等，Proteins Struct.Fuct.Genet.(1989)6：324-327；Pichuantes等，J.Biol.Chem.(1990)23：13890-13898。
可用标准技术获得用于本发明的抗原。例如，可用本领域熟知的重组方法方便地产生汉他病毒抗原。参见例如，1995年1月5日公开的国际公开号WO95/00648；1995年3月2日公开的国际公开号WO95/06240；和Hjelle等，J.Virol(1994)68：592-596，其中描述了用重组方法产生汉他病毒抗原。
可根据汉他病毒基因组的已知序列设计寡核苷酸探针，用探针检测编码本发明所用抗原的汉他病毒基因组的基因组或cDNA文库。然后，可用标准技术进一步分离基因，和(如果需要)用限制性酶在全长序列的所需部分上突变基因。
相似地，可用已知技术，如酚抽提从感染组织中直接分离汉他病毒基因(参见例如，1995年1月5日公开的国际公开号WO95/00648)，可进一步操作序列以产生任何所需变化。参见例如，Sambrook等，同上，其中描述了用于获得和分离DNA的技术。最后，可用合成方法根据已知序列产生编码汉他病毒抗原的基因。可用所需具体氨基酸序列的合适密码子设计核苷酸序列。通常选择将要表达该序列的宿主的优选密码子。通常通过以下方法组装完整序列：使标准方法制备的寡核苷酸重叠，组装成完整的编码序列。参见例如，Edge，Nature(1981)292：756；Nambair等，Science(1984)223：1299；Jay等，J.Biol.Chem.(1984)259：6311。
多核苷酸可包含天然存在的或可包含天然情况下不存在的人工序列的多种多肽的编码序列。如果需要，可用标准分子生物学技术连接这些多核苷酸形成融合蛋白的编码序列。
一旦制备或分离了编码序列后，可将此序列克隆入任何合适的载体或复制子中。本领域技术人员已知许多克隆载体，选择合适的克隆载体只是选择的问题。合适载体包括但不限于：与合适控制元件连接时能够复制的质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或病毒。然后，将编码序列置于合适的控制元件的控制下，合适的控制元件取决于用于表达的系统。因此，可将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和(任选)操纵子的控制下，以便通过合适的转化子将感兴趣的DNA序列转录成RNA。编码序列可以或可以不含有在后续翻译后加工中可被宿主去除的信号肽或前导序列。参见例如，美国专利号4,431,739；4,425,437；4,338,397。
如果存在，信号序列可以是与感兴趣的汉他病毒多肽相连的天然前导物。例如，如果表达的汉他病毒多肽是G1抗原，那么可包括所有或一部分天然G1前导序列。或者，可存在异源信号序列，其可提高分泌效率。本领域已知许多代表性前导序列，包括但不限于：酵母α-因子前导物、TPA信号肽、Ig信号肽等。本领域熟知这些和其它前导序列的序列。
除了控制序列以外，可能想要加入调控序列，以相对于宿主细胞生长调节该序列的表达。本领域技术人员已知调控序列，例子包括响应于化学或物理刺激，包括在调控化合物存在下开放或关闭基因表达的序列。载体中也可存在其它类型的调控元件。例如，本文中可用增强子元件提高构建物的表达水平。例子包括SV40早期基因增强子(Dijkema等，(1985)EMBO J.4：761)，衍生自劳氏肉瘤病毒的长末端重复(LTR)的增强子/启动子(Gorman等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：6777)和衍生自人CMV的元件(Boshart等，(1985)Cell41：521)，如CMV内含子A序列中所含元件(美国专利号5,688,688)。表达盒还可包括用于在合适的宿主细胞中自发复制的复制起点、一个或多个可选择标记、一个或多个限制性位点、可能是高拷贝数和强效的启动子。
构建一表达载体，使具体编码序列位于带有合适调控序列的载体中，编码序列相对于控制序列的定位和方向应使编码序列能在控制序列的“控制”下转录(即结合于DNA分子的控制序列的RNA聚合酶转录编码序列)。可能需要修饰编码感兴趣分子的序列以达到此目的。例如，在一些情况下，可能需要修饰该序列，使其可以合适方向连接于控制序列；即维持阅读框。可在插入载体前将控制序列和其它调控序列连接于编码序列。或者，可将编码序列直接克隆入已经含有控制序列和合适的限制性位点的表达载体。
如上所述，也可能需要产生感兴趣多肽的突变体或类似物。用于本发明组合物的汉他病毒多肽的突变体或类似物可通过以下方法制备：缺失编码感兴趣分子的序列的一部分、插入序列、和/或取代序列中的一个或多个核苷酸。本领域技术人员熟知用于修饰核苷酸序列的技术，如定点诱变等。参见例如，Sambrook等，同上；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82：448；Geisselsoder等，(1987)BioTechniques5：786；Zoller和Smith(1983)Methods Enzymol.100：468；Dalbie-McFarland等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79：6409。
为了帮助重组表达，可将感兴趣分子表达为融合蛋白，如与(如)50kDa大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的融合物、与人或酵母超氧化物岐化酶(SOD)或其片段的融合物，或表达为泛素融合蛋白。
可在本领域熟知的多种系统中表达该分子，包括昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统。例如，昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统是本领域技术人员已知的，参见例如，Summers和Smith，得克萨斯农业实验站公报(Texas AgriculturalExperiment Station Bulletin)1555期(1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒的形式购自Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥(″MaxBac″试剂盒)等。相似地，本领域熟知细菌和哺乳动物细胞表达系统，参见例如，Sambrook等，同上。酵母表达系统也是本领域已知的，参见例如，《酵母遗传工程》(Yeast GeneticEngineering)(Barr等编，1989)Butterworths，London。
也已知与上述系统一起使用的许多合适宿主细胞。例如，本领域已知哺乳动物细胞系，包括获自美国典型培养物保藏中心的永生化细胞系，例如但不限于：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚肾细胞、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、Madin-Darby牛肾(″MDBK″)细胞等。相似地，细菌宿主如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和链球菌(Streptococcus spp.)可与本发明构建物一起使用。用于本发明的酵母宿主包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，白假丝酵母(Candida albicans)、麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、脆弱克鲁维酵母菌(Kluyveromycesfragilis)、乳糖克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)、Pichia guillerimondii、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)等。与杆状病毒表达载体一起使用的昆虫细胞包括但不限于埃及伊蚊(Aedes aegypti)、苜蓿夜蛾(Autographa californica)、桑蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等。
可用本领域熟知的各种基因递送技术将包含感兴趣核苷酸序列的核酸分子稳定地整合到宿主细胞基因组中或维持在合适宿主细胞中的稳定附加型(episomal)元件上。参见例如，美国专利号5,399,346。
根据所选的表达系统和宿主，通过在能够表达蛋白质的条件下培养用上述表达载体转化的宿主细胞，产生该分子。然后从宿主细胞中分离表达蛋白并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中，可直接从培养基中纯化产物。如果没有分泌，可从细胞裂解物中分离产物。本领域技术人员能够选择合适的培养条件和回收方法。
本文将汉他病毒抗原用作诊断物，以检测生物样品中是否存在抗病毒的反应性抗体。而且，可用该抗原测定是哪种汉他病毒类型产生了感染。也可用该抗原产生用于诊断的抗体。
汉他病毒抗体
可用汉他病毒抗原产生汉他病毒-特异性多克隆和单克隆抗体。汉他病毒-特异性多克隆和单克隆抗体能特异性结合汉他病毒抗原。可通过将汉他病毒抗原给予哺乳动物如小鼠、兔、山羊或马产生多克隆抗体。收集免疫动物的血清，通过(例如)以下方法从血浆中纯化抗体：用硫酸铵沉淀、然后进行层析(优选亲和层析)。本领域已知产生和加工多克隆抗血清的技术。
也不难产生抗蛋白质上存在的汉他病毒-特异性表位的单克隆抗体。来自用汉他病毒抗原免疫的哺乳动物如小鼠(参见例如，Kohler和Milstein，Nature(1975)256:495-497)或兔(参见例如，全文纳入本文作参考的美国专利号5675，063)的正常B细胞可与(例如)HAT-敏感性小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤。可用RIA或ELISA鉴定产生汉他病毒-特异性抗体的杂交瘤，并通过在半固体琼脂中克隆或有限稀释来分离。用另一轮筛选来分离产生汉他病毒-特异性抗体的克隆。
可能需要提供嵌合抗体。可由小鼠单克隆抗体分子形成人和非人氨基酸序列组成的嵌合抗体，以降低它们在人体中的免疫原性(Winter等，(1991)Nature349：293；Lobuglio等，(1989)Proc.Nat.Acad.Sci.USA86：4220；Shaw等，(1987)J Immunol.138：4534；和Brown等，(1987)Cancer Res.47：3577；Riechmann等，(1988)Nature332：323；Verhoeyen等，(1988)Science239：1534；和Jones等，(1986)Nature321：522；1992年12月23日公开的EP公开号519,596；和1994年9月21日公开的英国专利公开号GB2,276,169)。
可用已知技术产生能够显示出母单克隆抗体分子的免疫结合特性的抗体分子片段如F(ab′)2、Fv和sFv分子。Inbar等，(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA69：2659；Hochman等，(1976)Biochem15：2706；Ehrlich等，(1980)Biochem19：4091；Huston等，(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA85(16)：5879；以及Huston等的美国专利号5,091,513和5,132,405；和Ladner等的4,946,778。
或者，可用噬菌体展示系统在体外扩展单克隆抗体分子群体。Saiki等，(1986)Nature324：163；Scharf等，(1986)Science233：1076；美国专利号4,683,195和4,683,202；Yang等，(1995)J Mol Biol254：392；Barbas，III等，(1995)Methods：Comp.Meth Enzymol8：94；Barbas，III等，(1991)Proc Natl Acad Sci USA88：7978。
一旦产生后，就可通过已知技术用噬菌体展示文库提高Fab分子的免疫结合亲和力。参见例如，Figini等，(1994)J.Mol.Biol.239：68。可分离或合成选自噬菌体展示文库的Fab分子的重链和轻链部分的编码序列，并将其克隆入任何合适的载体或复制子用于表达。可采用任何合适的表达系统，包括上述表达系统。
抗汉他病毒表位的抗体尤其可用于检测样品，如汉他病毒感染者的血清样品中是否存在汉他病毒或汉他病毒抗原。汉他病毒抗原的免疫测定可单独采用一种抗体或几种抗体，或者将其与汉他病毒抗原联用。汉他病毒抗原的免疫测定可采用(例如)抗汉他病毒表位的单克隆抗体、抗一种汉他病毒多肽的表位的单克隆抗体的组合、抗不同汉他病毒多肽的表位的单克隆抗体、抗相同汉他病毒抗原的多克隆抗体、抗不同汉他病毒抗原的多克隆抗体、或单克隆和多克隆抗体的组合。免疫测定方案可基于(例如)采用(例如)标记抗体的竞争、直接反应或夹心型试验，以下进一步描述。标记可以是(例如)荧光剂、化学发光剂或放射性物质。
还可用汉他病毒抗体通过免疫亲和柱分离汉他病毒颗粒或抗原。可通过(例如)吸附或共价连接将该抗体连接于固体支持物，使该抗体保持其免疫选择活性。任选地，可包含间隔基团以使该抗体的抗原结合位点保持可及性(accessible)。然后可用固定的抗体结合生物样品如血液或血浆中的汉他病毒颗粒或抗原。通过(例如)改变pH从柱基质上回收结合的汉他病毒颗粒或抗原。
汉他病毒诊断试验
如上所述，免疫原性汉他病毒抗原和该抗原的抗体可用于鉴定汉他病毒感染的试验。一般地，可通过样品中是否存在汉他病毒的抗体来确定生物样品中是否存在汉他病毒，虽然在合适情况下，可检测是否存在病毒蛋白并将其用作样品中汉他病毒的指标。该试剂可用于检测血样中的汉他病毒，血样包括但不限于全血、血清和血浆。可用该抗原和抗体检测对象如人或啮齿类对象的汉他病毒感染，以及检测捐献血样中的汉他病毒污染。因此，可筛选个体捐献样品或集合样品的等份中是否存在汉他病毒，可在混合前清除被汉他病毒污染的样品或集合样品。以此方式，可提供基本没有汉他病毒污染的血液供给品。“基本没有汉他病毒”指用本文所述试验，优选用下面更完整描述的条带免疫印迹试验不能检测到汉他病毒的存在。
本文所用试验包括Western印迹；凝集试验；酶标记和介导的免疫试验，如ELISA；生物素/抗生物素蛋白型试验；放射性免疫试验；免疫电泳；免疫沉淀，条带免疫印迹试验等。该反应通常包括揭示标记如荧光剂、化学发光剂、放射性物质、酶标记或染料分子，或者用于检测抗原和抗体或与其反应的抗体之间形成复合物的其它方法。
上述试验通常包括从抗原-抗体复合物结合的固相支持物上分离未结合的液相抗体或抗原。可用于实施本发明的固体支持物包括基材如硝酸纤维素(如膜或微量滴定孔形式)；聚氯乙烯(如板或微量滴定孔)；聚苯乙烯胶乳(如株或微量滴定板)；聚偏二氟乙烯；重氮化纸；尼龙膜；活化珠，磁性响应珠等。
在本发明的一个方面，用来自至少这六种汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒G1和/或N抗原捕获和/或检测样品中的抗汉他病毒抗体。在本发明的另一方面，汉他病毒抗原的抗体可用于捕获和/或检测样品中的汉他病毒抗原。“捕获”分析物(即样品中的抗-汉他病毒抗体或汉他病毒抗原)指通过结合捕获分子可将分析物与样品的其它组分分开。一般地，捕获分子直接或间接连接于固体支持物。一般地，检测分子直接或间接连接于可检测标记。
一般地，固体支持物首先在合适的结合条件下与固相组分(如至少这六种汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒G1和/或N抗原和/或抗汉他病毒抗体)反应，反应条件应足以使该组分固定在支持物上。有时，可通过先偶联于结合特性更好的蛋白增强在支持物上的固定。合适的偶联蛋白包括但不限于：大分子如血清白蛋白，包括牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝素、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵清蛋白和本领域技术人员熟知的其它蛋白。可用于使抗原或抗体结合于支持物的其它分子包括多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物等。这些分子和偶联这些分子的方法是本领域普通技术人员熟知的。参见例如，Brinkley，M.A.Bioconjugate Chem.(1992)3：2-13；Hashida等，J.Appl.Biochem.(1984)6：56-63；以及Anjaneyulu和Staros，International J.ofPeptide and Protein Res.(1987)3：117-124。
固体支持物与固相组分反应后，可通过洗涤从支持物上去除任何未固定的固相组分，然后在合适的结合条件下将结合于支持物的组分与怀疑含有配体组分(即汉他病毒抗原或抗体)的生物样品相接触。通过洗涤去除任何未结合的配体后，可在合适的结合条件下加入第二种结合物部分，其中第二种结合物能够选择性结合于结合的配体。然后，可用本领域熟知技术检测是否存在第二种结合物。
更具体说，可采用ELISA法，其中用至少这六种汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒G1和/或N抗原和/或本发明抗体包被微量滴定板孔。然后将含有或怀疑含有抗-汉他病毒免疫球蛋白分子或汉他病毒抗原的生物样品加入包被的孔中。足以使抗原-抗体结合的一段孵育时间后，可洗涤该板以去除未结合部分，加入可检测标记的第二种结合分子。使第二种结合分子与任何捕获样品反应，洗涤该板，用本领域熟知方法检测是否存在第二种结合分子。
在一个具体形式中，采用ELISA抗原夹心形式。在这种情况下，用至少这六种汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒G1和/或N抗原包被固体支持物。然后在允许抗汉他病毒抗体(如果存在)结合一种或多种汉他病毒抗原形成抗原/抗体复合物的条件下将该样品与支持物相接触。去除未结合的试剂，加入能与结合的抗原/抗体复合物反应的酶标记的抗原，如标记的汉他病毒N和/或G1抗原。用酶底物产生信号。
在另一种形式中，用种类特异性抗-同种型抗体(如抗-人IgM抗体、抗-人IgG抗体、抗-人IgA抗体等)包被固体支持物。然后在允许样品中存在的抗体与抗-同种型抗体结合的条件下将支持物与样品相接触。然后去除未结合的抗体，用本发明的标记的汉他病毒抗原检测是否存在结合的抗汉他病毒抗体。该标记一般是酶标记，如HRP、AP。
在另一实施方式中，不难用包含抗抗体配体的抗体的第二种结合物检测生物样品中是否存在结合的汉他病毒配体。本领域已知许多抗-人免疫球蛋白(Ig)分子，不难用本领域技术人员已知的方法将它们与可检测的酶标记，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或脲酶偶联。然后，用合适的酶底物产生可检测信号。在其它相关实施方式中，可用本领域技术人员已知的方法实施竞争型ELISA技术。
已知检测样品中抗-汉他病毒抗体的其它形式，本发明汉他病毒抗原的组合可与采用汉他病毒抗原的任何已知形式一起使用。参见例如，Lee等，J.Infect.Dis.(1978)137：298-308；Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146：638-644；Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146：645-651；Lundkvist等，Clin.Diagnos.Lab.Immunol.(1995)2：82-86；Chu等，Virology(1994)198：196-204；Elgh等，J.Med.Virol(1995)45：146-150；Hjelle等，J Clin.Microbiol.(1997)35：600-608；Bharadwaj等，J.Infect.Dis.(2000)182：43-48；Yee等，J.Wildl Dis.(2003)39：271-277)。
至少这六种汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒G1和/或N抗原可用于IgM捕获ELISA，如下所述。将抗-人IgM抗体(如山羊抗-人IgM抗体)连接于固体支持物，将该支持物与准备测定其中是否存在汉他病毒的人IgM的样品接触，接触条件应允许抗-汉他病毒IgM(如果存在)与连接于固体支持物的一种或多种抗-人IgM抗体结合，形成抗体/抗体复合物。在能够与抗体/抗体复合物中的抗汉他病毒IgM结合形成抗体/抗体/抗原复合物的条件下加入至少这六种汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒G1和/或N抗原。去除未结合抗原，在能够与结合的抗原结合的条件下加入可检测标记的抗-汉他病毒抗体。通过是否存在连接于固体支持物的结合性抗-人IgM抗体/人抗-汉他病毒IgM/抗原复合物的可检测标记的抗汉他病毒抗体来确定样品中是否存在汉他病毒的IgM。或者，可选择性标记汉他病毒抗原本身，这种方法无需可检测标记的抗-汉他病毒抗体。
至少这六种汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒G1和/或N抗原也可用于间接IgG ELISA，如下所述。将抗原的特异性抗体连接于固体支持物，将该支持物与至少这六种汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒G1和/或N抗原相接触，接触条件应能够使抗原与结合于支持物的抗-汉他病毒抗体结合形成抗体/抗原复合物。去除未结合抗原，将该支持物与准备测定其中是否存在汉他病毒的人IgG的样品接触，接触条件应允许人抗-汉他病毒IgG(如果存在)与抗体/抗原复合物中的抗原结合。可用可检测标记的抗-人IgG抗体检测是否存在结合的抗-汉他病毒IgG。
虽然一些上述试验形式称为“ELISA”(酶联免疫吸附试验)试验，本领域技术人员应理解，可能采用可检测标记，而非“酶联”结合部分，在许多情况下可能需要可检测标记。本文中描述了其它合适的可检测标记，它们是本领域熟知的。
也可在溶液中进行试验，以便在沉淀条件下使汉他病毒抗原或抗体和对这些分子特异的配体形成复合物。在一个具体实施方式中，可用本领域已知的偶联技术如直接化学方法或间接偶联将该分子连接于固相颗粒(如琼脂糖珠等)。然后在合适的结合条件下将包被的颗粒与怀疑含有汉他病毒抗体或抗原的生物样品相接触。结合的抗体之间交联后会形成复合聚集体，这些聚集体可通过洗涤和/或离心而从样品中沉淀和分离。可用多种标准方法如上述免疫诊断方法分析反应混合物，以测定是否存在复合物。
在又一实施方式中，可提供免疫亲和基质，其中(例如)将来自怀疑含有汉他病毒抗体的生物样品的多克隆抗体群体固定在基材上。可用固定的抗原对样品进行初始亲和纯化。因此，得到的样品制剂仅含有抗-汉他病毒部分，避免亲和支持物可能出现非特异性结合特性。本领域已知能够高产率并且良好保持抗原结合活性地固定免疫球蛋白(完整蛋白或特定片段)的许多方法。一旦固定免疫球蛋白分子提供了免疫亲和基质后，在合适的结合条件下将标记分子与结合的抗体相接触。从免疫亲和支持物上洗去任何非特异性结合的汉他病毒抗原后，可用本领域已知方法通过测定标记确定是否存在结合的抗原。
在本发明尤其优选的实施方式中，用固定在测试条带上的至少这六种汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒G1和/或N抗原以条带免疫印迹试验(SIA)检测生物样品中的汉他病毒抗体。SIA技术是本领域熟知的，它结合了传统的Western技术和点印迹技术，如
Figure S05819934920061221D000301
(Chiron Corp.，Emeryville，CA)SIA。在这些试验中，将汉他病毒抗原作为单个、分离的部分(如作为条带或点)固定在膜状支持物上。因此，“分离地固定”在膜状支持物上指该抗原作为单独组分存在并未混合，以便评价各抗原的反应性或缺少反应性。然后，将怀疑含有汉他病毒的抗体的生物样品与测试膜反应。通过联用抗-人免疫球蛋白酶-偶联物与生色酶底物观察生物样品中抗-汉他病毒的反应性。测试膜上也可存在内标如抗-人IgM抗体和抗-人IgG抗体。该试验可手工进行或用于自动化形式。
可用于实施条带免疫印迹试验的固体支持物包括但不限于：膜支持物衍生自多种初级(primary)聚合物，包括纤维素、聚酰胺(尼龙)、聚丙烯腈、聚偏二氟乙烯、聚砜、聚丙烯、聚酯、聚乙烯和由上述物质的组合或衍生物组成的复合树脂。尤其优选的是衍生自纤维素的支持物，如硝酸纤维素膜，以及尼龙膜。基材通常包括以惰性塑料底板作为支持物的所需膜。
施加于膜的抗原量因所研究抗原而不同。通常，施加于条带的抗原量约为20-500ng/条带，优选50-250ng/条带，更优选75-150ng/条带。本领域技术人员不难确定产生可用结果所需的抗原量。或者，可存在两个浓度，如低浓度和高浓度的抗原。因此，例如，可提供浓度如上所述的SNV N抗原，也可以在一个或多个额外条带中提供，浓度约为(如)25-200ng，(如)50-150ng，(如)100ng/条带。高水平对照的存在量足够高，高于产生高度阳性结果的程度，如200-500ng，具体是250-350ng，如300ng/条带。很显然，施加于测试条带的抗原的浓度因所用具体抗原而不同，本领域技术人员不难测定该浓度。
抗免疫球蛋白抗体，如抗-人IgM抗体、抗-人IgG抗体和/或抗-人IgA抗体存在的浓度可以是一个或两个(一低一高)。例如，抗-IgG抗体存在的浓度约为50-250ng/ml，更优选约75-200ng/ml，最优选约100-185ng/ml。伴随低浓度的抗-IgG，也可存在较高浓度的抗-IgG抗体，以提供另一内标，如浓度约为400-1200ng/ml，更优选约为450-1000ng/ml，最优选约为500-950ng/ml。
膜支持物与所需抗原和Ig分子反应后，通过洗涤去除膜上任何未固定的固相组分，然后在合适的结合条件下，将结合于膜的组分与怀疑含有汉他病毒抗体的生物样品相接触。洗涤去除任何未结合抗体后，在合适的结合条件下加入第二种结合物部分，其中第二种结合物能够选择性结合于结合的抗体。可用本领域熟知的技术检测是否存在第二种结合物。
在尤其优选的实施方式中，不难用包含抗抗体配体的抗体的第二种结合物检测生物样品中是否存在结合的抗-汉他病毒抗原配体。本领域已知许多抗-人免疫球蛋白(Ig)分子，如市售的山羊抗-人Ig或兔抗-人Ig。本文所用Ig分子是IgG、IgA或IgM类型的分子。不难用本领域技术人员已知的方法将Ig分子偶联于可检测的酶标记，如辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和脲酶等。用合适的酶底物产生可检测信号。
而且，可用抗人重链和轻链抗体的偶联物使SIA能够检测IgG和IgM应答。此设计可用于提高在感染早期检测抗体应答的灵敏度。
可在试剂盒中提供上述试验试剂，包括汉他病毒抗原和/或其抗体、具有结合试剂的固体支持物以及其它检测试剂，试剂盒中包括合适的说明书和其它必需试剂，以如上所述进行试验。该试剂盒也可包括对照制剂(阳性和/或阴性)，当试验形式需要时还包括标记试剂，如果该标记不直接产生信号还包括信号产生试剂(如酶底物)。试剂盒中通常包括进行该实验的说明书(如书面式说明书、录音式说明书、VCR说明书、CD-ROM说明书等)。试剂盒也可包括(取决于所用具体试验)其它包装试剂和材料(即洗涤缓冲液等)。可用这些试剂盒进行标准试验，如上述标准试验。
III.实验
下面是实施本发明的具体实施方式举例。仅为展示目的举例，而不意于在任何方面限制本发明。
尽力确保有关所用数字的准确性(如数量、温度等)，当然也允许实验误差和偏差。
实施例1
汉他病毒重组G1蛋白的克隆和表达
如下所述制备表2所示汉他病毒G1抗原。用对应于各毒株感兴趣区域的寡核苷酸组合合成编码重组G1抗原(包括HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的G1蛋白的80-83位氨基酸)的核苷酸片段。表2中指出了重组抗原中的G1蛋白序列部分。将这些片段退火、连接并克隆入亚克隆载体，通过DNA测序验证了正确的核苷酸序列。通过限制性核酸内切酶处理切下感兴趣区域，将其与ADH2/GAPDH启动子片段克隆入pBS24.1。质粒pBS24.1是广泛用于表达各种重组蛋白的高拷贝数的表达载体(Pichuantes等，J.Biol.Chem.(1990)23：13890-13898；Pichuantes等，“在酵母中表达异源基因产物”(Expression of heterologous gene products in yeast)，《蛋白工程：设计和生产的指南》(Protein engineering：a guide to design and production)ClelandJL，Craik C编(1996)纽约州纽约，Wiley-Liss，Inc.，129-161页)。它含有用于自发复制的反向重复(IR)序列和2μ、用于保证转录中止的α-因子终止子以及用于选择的leu2-d和URA3。此载体中也存在产生氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因和ColEl复制起点，用于在大肠杆菌中进行选择和自发复制。
对于SOD融合构建物，将感兴趣区域克隆入遗传工程改造的已经含有ADH2/GAPDH启动子和人SOD基因的pBS24.1载体中。用于克隆汉他病毒重组抗原的人SOD的核苷酸序列和氨基酸序列见Hallewell等，Bio/Technology(1987)5：363-366。将得到的质粒转化入酿酒酵母菌株AD3，用SDS-PAGE和免疫印迹分析监测重组蛋白的表达。产生的各种SOD/G1融合物包括图7-12所示G1序列，它与图19所示SOD序列的C末端融合。SEQ ID NO：42-47代表了SOD/G1融合物。
按照以下方案产生SOD融合物。虽然此讨论详细描述了SNV G1/SOD融合物的产生，但以相同方式产生其余融合物。由于不稳定性和可变表达阻碍了全长G1的扩展部分的表达，所以将SNV G1的较小(82-aa)部分(相对于分离物NM H10的起始甲硫氨酸的残基35-117)用于与图19所示人超氧化物岐化酶(SOD)序列融合。通过PCR从pFCV-M-1275(Yamada等，J.Virol(1995)69：1939-1943)合成小G1片段，所用引物在5′-端引入NcoI位点、在3′-端引入SalI位点和两个终止密码子。用268bp的NcoI/SalI消化片段取代pSOD/HIV2PR113的347bp插入物(Pichuantes等，J.Biol.Chem.(1990)265：13890-13898)，产生构建物pSOD/G1。将pSOD/G1的603bp的StuI/SalI片段连接入载体pSI1/PR179(Pichuantes等，Proteins Struct.Fund.Genet.(1989)6：324-327)，以提供ADH2/GAPDH启动子。然后将得到的构建物的2093bp的BamHI/SalI盒引入酵母表达载体pBS24.1，产生最终的表达构建物pSOD/SNV-G1。在蛋白酶缺陷型(prbl1122，肽4-3)酿酒酵母菌株AB122中该蛋白表达为23kD的SOD-G1融合物(Pichuantes等，《蛋白工程原理和实践》(Protein Engineering Principles andPractice)(1996)第5章，129-161页，Cleland和Craik编，Wiley-Liss，Inc.，纽约)。在此构建物中表达的G1的82-aa部分跨越了免疫显性表位，还含有一些侧翼序列。图11B中显示了该抗原的SNV G1部分的序列。
表2.酿酒酵母中表达的汉他病毒G1抗原
汉他病毒抗原 氨基酸序列＊ SEQ ID NO    构建物 分子量(kDa)
HTNV G1 S34-H113 14           重组，非融合 9.1
SOD/HTNV G1 S34-H113 42           重组，SOD融合 26.1
PUUV G1 R39-T121 16           重组，非融合 9.4
SOD/PUUV G1 R39-T121 43           重组，SOD融合 26.4
SEOV G1 K32-H111 18           重组，非融合 9.4
SOD/SEOV G1 K32-H111 44           重组，SOD融合 26.3
DOBV G1 N34-H116 20           重组，非融合 9
SOD/DOBV G1 N34-H116 45           重组，SOD融合 26
SNV G1 G35-P117 22           重组，非融合 9.3
SOD/SNV G1 G35-P117 46           重组，SOD融合 26.2
ANDV G1 G35-P117 24           重组，非融合 9.3
SOD/ANDV G1 G35-P117 47           重组，SOD融合 26.2
*所产生蛋白质的氨基酸序列中，在G1序列的N-末端也包括甲硫氨酸(M)。
实施例2
汉他病毒重组N蛋白的克隆和表达
如下所述制备表3所示汉他病毒N抗原。通过PCR用汉他病毒重组质粒DNA作为模板扩增PUUV、SEOV、SNV和ANDV的汉他病毒核衣壳蛋白基因。表3中指出了重组蛋白中汉他病毒N蛋白序列的部分。化学合成HTNV和DOBV的核衣壳基因。主要以如上所述方法进行克隆和表达。图13-18中显示了所产生的各种N抗原，图19中显示了与N抗原/SOD融合物的N末端直接毗连的SOD序列。
表3.酿酒酵母中表达的汉他病毒N抗原
汉他病毒抗原 氨基酸序列＊ SEQ ID NO    构建物 分子量(kDa)
HTNVN M1-L429 26           重组，非融合 48.5
SOD/HTNV N M1-L429 48           重组，SOD融合 65.3
PUUVN M1-I433 28           重组，非融合 49.8
SOD/PUUV N M1-I433 49           重组，SOD融合 66.7
SEOVN M1-L429 30           重组，非融合 48.4
SOD/SEOV N M1-L429 50           重组，SOD融合 65.3
DOBVN M1-L429 32           重组，非融合 48.5
SOD/DOBV N M1-L429 51           重组，SOD融合 65.3
SNV N M1-L429 34           重组，非融合 48.4
SOD/SNV N M1-L429 52           重组，SOD融合 65.4
ANDV N M1-L428 36           重组，非融合 48.4
SOD/ANDV N M1-L428 53           重组，SOD融合 65.2
实施例3
汉他病毒重组蛋白的纯化
用裂解缓冲液(50mM Tris，0.15M NaCl，1mM EDTA，pH8)以Dino-Mill设备裂解转化的酿酒酵母细胞，从而纯化如上所述重组产生的汉他病毒蛋白。用1-3M尿素的裂解缓冲液溶液将裂解物洗涤数次，通过将pH提高到11.5使蛋白质溶解，然后进行凝胶过滤层析。重组ANDV G和DOBV G蛋白的纯化也包括硫酸铵沉淀和用PBS、0.1％SDS、1mM EDTA溶解。
实施例4
用汉他病毒重组蛋白产生多克隆抗体
用SOD与HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的G1抗原的纯化的重组融合物以及SEOV、DOBV、SNV和ANDV的重组非融合N蛋白(参见上述表2和3)产生兔多克隆抗体。免疫两只兔，产生50ml抗血清。然后用Western印迹分析在4-20％Tris甘氨酸凝胶上测定多克隆抗体对重组蛋白的抵抗作用。已证明六种G1抗原各自产生的抗体能够与不同亚型的G1抗原交叉反应。相似地，已证明四种N蛋白各自产生的抗体能够与不同亚型的N抗原交叉反应。
实施例5
条带免疫印迹试验(SIA)
将如上所述来自六种血清型的重组G1抗原和N抗原(含有或不含SOD序列)用于SIA，如
Figure S05819934920061221D000351
试验(Chiron Corp.，Emeryville，CA)。膜由以惰性塑料底板作为支持物的硝酸纤维素组成。将各自来自HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的六种G1抗原和各自来自HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的六种N抗原以分离的条带施加于硝酸纤维素条带，浓度为75-150ng/条带。作为内标的其它条带含有低水平(水平I，50-150ng/条带)和高水平(水平II，250-350ng/条带)的纯化的人IgG。
根据生产商说明书进行试验步骤。所有步骤均在室温下进行。对各条带进行编号，然后放入单独试管中，向试管中加入用样品稀释剂缓冲液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)，其中含有牛蛋白稳定剂和去污剂，0.1％叠氮化钠和0.05％硫酸庆大霉素作为防腐剂)以1:50稀释的人血清。温和振荡该试管4-4.5小时，吸除溶液，将1ml新鲜稀释剂加入各试管。振荡该试管30分钟，吸除溶液，将由洗涤缓冲液浓缩液(50X)(磷酸盐缓冲的去污剂溶液，含有0.01％硫柳汞作为防腐剂)制备的1ml洗涤缓冲液加入各试管。将各试管的内容物注入一个洗涤容器中，通过涡旋洗涤这些条带20秒。倾析出洗涤缓冲液，加入30ml新鲜缓冲液，重复该过程。吸除残余溶液，加入20ml偶联溶液(含有牛蛋白稳定剂的过氧化物酶-标记的山羊抗-人IgG(重链和轻链)，含有0.01％硫柳汞作为防腐剂)。将该容器以110rpm旋转9-11分钟，倾析出偶联溶液，洗涤步骤重复三次。再吸除残余溶液，加入20ml底物/显影剂(4-氯-1-萘酚的甲醇/磷酸盐缓冲的过氧化氢溶液)，然后以110rpm旋转15-20分钟。倾析出溶液，用蒸馏水洗涤该条带两次。将显影条带面朝上放在吸水纸上，避光干燥30分钟。
仅当反应性大于或等于水平I IgG对照条带(定义为1+反应性)时，认为该血清与给定抗原有反应活性。等于水平II IgG对照条带的反应性被认为是3+反应性。介于水平I和水平II IgG对照条带的反应性强度被认为是2+，强于水平II条带的反应性被认为是4+。
因此，本发明公开了检测汉他病毒感染的新方法。虽然详细描述了本发明的优选实施方式，但应理解，显然可作出一些改变，而不背离本文所述本发明的构思和范围。
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Claims (10)

1.一种用于检测汉他病毒感染的免疫诊断测试试剂盒，所述测试试剂盒包括：
(a)至少六种汉他病毒重组抗原，其中所述至少六种汉他病毒重组抗原包括来自汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的G1和/或N抗原的组合，其中存在各血清型的至少一种抗原，所述G1抗原是由选自下组的氨基酸序列组成的一种或多种抗原：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，所述N抗原是由选自下组的氨基酸序列组成的一种或多种抗原：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ED NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53；
(b)和进行所述免疫诊断测试的说明书。
2.如权利要求1所述的免疫诊断测试试剂盒，其特征在于，至少一种G1抗原来自各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV，至少一种N抗原来自各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。
3.如权利要求1所述的免疫诊断测试试剂盒，其特征在于，至少一种N抗原来自各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。
4.一种检测汉他病毒感染的免疫诊断测试试剂盒，所述测试试剂盒包括：
(a)至少六种不同的抗体，其中各所述抗体至少对六种汉他病毒抗原之一特异，这六种汉他病毒抗原包括汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的G1和/或N抗原的组合，其中存在对各血清型的至少一种抗原特异的至少一种抗体，所述G1抗原是由选自下组的氨基酸序列组成的一种或多种抗原：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，所述N抗原是由选自下组的氨基酸序列组成的一种或多种抗原：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID  NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ED NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：53；和
(b)进行所述免疫诊断测试的说明书。
5.如权利要求4所述的免疫诊断测试试剂盒，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
6.一种包含至少六种汉他病毒重组抗原的固体支持物，其中所述至少六种汉他病毒重组抗原包括汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的G1和/或N抗原的组合，其中存在各血清型的至少一种抗原，所述G1抗原是由选自下组的氨基酸序列组成的一种或多种抗原：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47，所述N抗原是由选自下组的氨基酸序列组成的一种或多种抗原：SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ED NO：52和SEQ ID NO：53。
7.如权利要求6所述的固体支持物，其特征在于，至少一种G1抗原来自各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV，至少一种N抗原来自各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。
8.如权利要求6所述的固体支持物，至少一种N抗原来自各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。
9.如权利要求6所述的固体支持物，其特征在于，所述固体支持物是硝酸纤维素条带。
10.一种检测汉他病毒的免疫诊断测试试剂盒，所述测试试剂盒包括：
(a)如权利要求6-9中任一项所述的固体支持物；和
(b)进行所述免疫诊断测试的说明书。 
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