KR101025596B1

KR101025596B1 - 노로바이러스 검출용 항체, 및 이를 이용한 노로바이러스 검출방법

Info

Publication number: KR101025596B1
Application number: KR1020100027422A
Authority: KR
Inventors: 고광표; 지영미; 천두성; 정혜숙; 이회규; 박영빈
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2010-03-26
Publication date: 2011-03-30
Also published as: KR20100048974A

Abstract

본 발명은 노로바이러스의 캡시드 단백질의 항원결정부위(epitope), 이를 이용하여 제조된 항체, 상기 항체를 이용한 노로바이러스의 검출방법 또는 검출키트에 관한 것으로서, 상기 항체는 매우 민감하고 특이적으로 반응하므로, 식중독 검진 및 모니터링에 사용될 수 있는 중요한 진단의 기초재료이며, 앞으로 빠르고 신속한 노로바이러스 검출의 진단 키트의 개발로 이용될 것이다.

Description

노로바이러스 검출용 항체, 및 이를 이용한 노로바이러스 검출방법 {SPECIFIC FOR NOROVIRUS AND METHOD OF DETECTING VARIOUS NOROVIRUS}

본 발명은 노로바이러스의 캡시드 단백질의 항원결정부위(epitope), 이를 이용하여 제조된 항체, 상기 항체를 이용한 노로바이러스의 검출방법 또는 검출키트에 관한 것이다.

노로바이러스는 국내 전체 식중독의 최소 50% 이상의 원인체로 추정이 되는 중요한 병원성 미생물이다. 10개 미만의 매우 적은 수의 섭취에 의해서도 장염을 일으키는 foodborne 혹은 waterborne 병원성바이러스로서 신속하고 정확하며 민감한 진단이 매우 중요하다. 현재 주로 사용되고 있는 RT-PCR 등과 같은 분자학적 진단방법은 민감도가 높으나 유전적으로 다양한 모든 노로바이러스의 검출이 가능한 프라이머가 필요하며 수행 시 숙련된 기술자가 필요하다.

노로바이러스는 caliciviridae에 속하는 약 7.6 kb의 단일사슬 RNA 바이러스로써 3개의 ORF이 존재한다. 노로바이러스는 유전학적 또는 면역학적으로 매우 다양한 바이러스로 알려져 있다. 일반적으로 노로바이러스에 대한 항체는 인체에서 흔히 발견되지만 노로바이러스에 대한 면역학적 저항성은 나타나지 않는 것으로 알려져 있다. 그 이유는 노로바이러스에 대한 인체의 면역학적 저항성은 바이러스의 유전형에 따라 다르고, 바이러스의 유전형 종류는 매우 다양한 것으로 알려져 있다. 노로바이러스는 5가지의 genogroup (GI-GV)이 존재하며, 이중 2가지의 genogroup (GI 및 GII)이 인체에서 급성 장염을 일으키는 인체의 병원성 바이러스로 알려져 있다. 노로바이러스의 GI과 GII는 감염 및 분자생물학적, 역학적, 및 계통학적으로도 매우 상이하며, 현재까지 노로바이러스(GI 및 GII)의 캡시드 유전자의 염기서열에 따라 모두 31가지의 유전형으로 분류되고 있다.

인체 노로바이러스는 현재까지 배양방법 및 동물모델이 개발되어 있지 않은 이유로 바이러스의 보건학적 중요성은 매우 크나 인체의 감염요인, 면역반응, 바이러스의 분자생물학적 특징들에 관한 연구는 국내외에서 많이 수행되지 못했다. 현재까지 노로바이러스 관련 연구는 주로 분자역학 (molecular epidemiology) 조사나 노로바이러스의 human challenge 등의 방법들을 이용하여 수행되어 왔다. (Hutson, A. et al, 2004; Parino, T. A. et al, 1977). 그러나 2003년 쥐 노로바이러스 (murine norovirus)가 발견되어 murine macrophage RAW 264.7 세포주에서 배양이 가능하여 중요한 연구모델로 인식되어 졌다. (Karst, S. M, et al, 2003).

노로바이러스의 분자계통학적 분석 (phylogenetic analysis)은 주로 바이러스의 RdRp (RNA polymerase) 또는 캡시드 유전자 (ORF2)의 염기서열분석을 이용하여 수행되어 왔다.

노로바이러스의 국민보건상의 중요성은 더욱 인식되고 있다. 현재 노로바이러스의 진단방법의 경우에는 RT-PCR 등의 분자생물학적 방법과 항체를 이용한 진단법이 개발되어 사용되고 있다. 항체를 이용한 방법은 빠르고 상대적으로 적은시간에 많은 양의 샘플을 분석할 수 있는 장점이 존재하나 현재까지 존재하는 항체를 이용한 진단법에는 민감도(30%~70%)와 정확도(69~100%)가 상대적으로 낮다. 이러한 단점을 보완하기 위해서는 노로바이러스를 검출하는 효과적인 항체를 개발하는 것이 매우 중요하다. 노로바이러스는 높은 감염성과 환경에서의 강한 저항성 등으로 인하여, 임상 샘플과 환경 샘플에서 노로 바이러스의 신속하고 민감한 측정 및 진단방법 및 바이러스 typing 방법은 바이러스에 의한 질병의 예방에 매우 중요하다. 노로 바이러스의 진단방법으로는 전자현미경을 이용한 방법, 항체 등을 이용한 EIA 등의 면역학적 방법, RT-PCR 등을 이용한 분자생물학적 방법 등이 존재한다. RT-PCR을 이용한 분자생물학적 방법이 가장 흔하게 사용되는 바이러스 진단법이다. 현재까지 항체를 이용한 분석방법은 분자생물학적 방법에 비교하여 검출법에서 낮은 민감도를 나타내고 있으며 민감도와 정확성을 높이기 위해서는 적절한 항체의 확보가 필수적이다. 펩타이드를 이용한 항체는 작은 크기의 펩타이드를 다양한 링커를 이용하여 carrier protein에 붙여 항체의 생성을 높여주며 장점과 단점은 아래의 표 1에 나타내고 있다.

노로바이러스를 검출하는 kit의 종류 및 특성

Products	회사	방법	특성
Watcher norovirus	HKDNA Chips	RT-PCR	분자생물학적 반응 저해물질의 존재 High fause negative가 존재 높은 QA/QC가 필요함
MutaREAL Norovirus	ALPCO	Real-time RT-PCR
Norovirus analyte specific reagent (ASR)	Cepheid	Real-time RT-PCR
Loopamp norovirus kit	Eiken Chemical Co. Ltd	Loopamp
Nulcisens Basic Kits	Biomerieux	NASBA
RIDASCREEN norovirus	R-Biopham AG	ELISA	정확도와 민감도가 낮음
IDEIA norovirus	DAKO	ELISA
SRSV(II)-AD	Denka Seiken Co. Ltd	ELISA

최근에 항체를 이용한 검출법에 관련되어 상업적 키트를 평가하는 연구가 수행되었다. SRSV(II)-AD kit의 경우에는 NV3192 (anti-GI MAb)와 NS14 (anti-GII MAb)의 2가지의 항체가 이용되었고, 노로바이러스의 genogroup을 분별할 수가 없었으며 낮은 민감도 (70%)와 정확도 (69%)가 보고되었다. 많은 faulse positive 가 보고되었다. IDEIA NVL의 경우에는 다클론 항체를 이용하였으며 노로바이러스의 genogroup을 분별할 수 없고 낮은 민감도 (<30%)와 높은 specificity (100%)를 나타내었다. 이러한 2가지의 연구결과에 따르면 현재까지 국내외에 존재하는 항체관련 키트의 경우에는 RT-PCR의 분자생물학적 방법을 대치할 수 없는 것으로 결론지어진다.

본 발명은 노로바이러스의 캡시드 서열의 일부을 포함하는 노로바이러스의 캡시드 단백질의 항원결정부위(epitope)을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 노로바이러스의 캡시드 단백질의 항원결정부위(epitope)를 항원으로 하여 제조된 항체를 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 항체를, 노로바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대하여 양성반응을 탐지하여 노로바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 항체를 포함하는 노로바이러스 탐지용 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하고자, 노로바이러스의 캡시드 서열의 일부이며, SEQ ID NO: 1 내지 10에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 포함하는, 노로바이러스의 캡시드 단백질의 항원결정부위(epitope)를 제공한다.

또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 5, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 10에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩타이드를 특이적으로 인지하는 노로바이러스 특이적 항체를 제공하는 것이다.

상기 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 5, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 10에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 노로바이러스 캡시드의 항원결정부위를 포함하는 펩타이드를 항원으로 하여 제조되며, SEQ ID NO: 1 내지 10에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 펩티드를 특이적으로 인지하는 노로바이러스 특이적 항체에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 SEQ ID NO: 1 내지 5, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 10에 나타낸 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 노로바이러스 캡시드의 항원결정부위를 포함하는 펩타이드를 항원으로 토끼 또는 마우스에 주입하여 제조되는 것인 항체이다. 상기 노로바이러스 특이적 항체는 마우스의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 것인 항체일 수 있다.

상기 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체인 항체일 수 있다. 상기 다클론 항체는 SEQ ID NO: 1 내지 5, SEQ ID NO: 8, 및 SEQ ID NO: 10에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 노로바이러스 캡시드의 항원결정부위를 혼합하여 토끼에 투여하여 제조되는 다클론 항체인 것인 항체일 수 있다.

또한 본 발명은 따른 항체를, 노로바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대하여 양성반응을 탐지하여 노로바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 상기 양성반응은 효소 반응, 형광, 발광 또는 방사선을 검출하여 탐지하는 것이다.

상기 다클론 항체를 사용하여 모든 genotype의 노로바이러스의 탐지하는 것일 수 있다.

상기 단클론 항체는 로타바이러스의 유전형에 특이적으로 반응하여 특정 유전형의 로타바이러스를 검출할 수 있다. 예를 들면, SEQ ID NO: 1 에 기재된 아미노산을 갖는 펩타이드에 대한 항체는 genogroup I 및 II를 탐지하고, SEQ ID NO: 2 에 기재된 아미노산을 갖는 펩타이드에 대한 항체는 genogroup I 및 II를 탐지하고, EQ ID NO: 4 에 기재된 아미노산을 갖는 펩타이드에 대한 항체는 Genogroup I을 탐지하는 것일 수 있다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은, 국내 및 국외에서 유행하는 노로바이러스의 염기서열을 이용하여 펩타이드항원을 인공적으로 제조하고, 토끼와 쥐를 이용하여 노로바이러스에 특이적으로 반응할 수 있는 단클론 및 다클론 항체를 제작한다. 확보된 GI 및 GII의 노로바이러스의 각각의 서브타입 별로 아미노산 서열을 생물정보학 도구를 사용하여 비교 분석하였다. 특히 노로바이러스의 항원성과 밀접하게 연관이 있는 캡시드 단백질의 아미노산서열을 Clustal W방법을 이용한 multiple alignment를 수행하여 캡시드단백질의 보존적인 부분을 규명하였다. 그리고 항원성 및 친수성(hydrophilicity)의 특성을 분석하여 약 10개의 아미노산 부위를 선정하였으며 이중 친수성이 강한 7가지 펩타이드를 제작한다. 또한 상기 펩타이드 항원을 사용하여, 토끼와 쥐에서 각각 다클론 항체 및 단클론 항체를 제조한다. 상기 본 발명에 따라 제작된 단클론 및 다클론항체의 노로바이러스와의 반응성을 평가하기 위하여 노로바이러스의 VLP를 제조하고 VLP, 분변 등과 제조된 항체와의 면역학적 반응을 웨스턴 블랏팅 및 EIA를 사용하여 평가한다. 본 발명에서 제작된 펩타이드 다클론항체는 모두 노로바이러스의 GI 및 GII와 특이적으로 반응하는 것을 웨스턴 블랏 및 ELISA 분석법으로 모두 확인을 하엿다. 또한 단클론항체의 경우 웨스턴 블랏으로 확인한 결과 최소 3가지의 단클론항체가 노로바이러스와 특이적으로 반응하는 것을 나타내었으며, EIA로 테스트를 해 본 결과 최소 1개의 단클론항체가 노로바이러스와 특이적으로 반응하였다.

캡시드 유전자의 염기서열은 바이러스 항원과 밀접한 관계를 가지고 있어 분자계통학적 분류방식의 대상으로 많이 사용되고 있다. 노로바이러스 캡시드 단백질은 크게 S, P1, P2의 3 단백질 도메인으로 구성되어 있으며 S 도메인은 보존영역이고 P1과 P2의 단백질 서열의 변화에 따라 항원다양성(antigenic diversity)이 발생하는 것으로 알려져 있다. 노로바이러스 캡시드 유전자 (ORF2)의 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석의 예 (phylogenetic analysis)를 도 1에 나타냈으며, 노로바이러스의 캡시드 유전자 (a) 및 발현 단백질 (b)의 구조를 도 2에 기재하였다.

항체를 이용한 검출법은 이러한 분자생물학적 분석법의 한계를 극복하고 빠르고 간편하며 상대적으로 낮은 수준의 정도관리가 필요한 검출법이라고 할 수 있다. 항체를 사용하영 새로운 노로바이러스 진단기법을 개발하기 위해서는 민감하고 특이적인 단클론 및 다클론 항체가 반드시 필요하며 기반이라고 할 수 있다. 그러므로 다양한 유전형의 노로바이러스와 반응하는 항체를 개발하는 것이 면역학적 분석방법의 핵심이다. 이러한 노로바이러스와 반응하는 특이적인 단클론 및 다클론 항체의 개발은 진단법뿐 만이 아니라 바이러스의 전사, 복제 등의 연구에 사용될 수 있는 중요한 연구재료로 사용이 가능하다.

노로바이러스는 전 세계적으로 비세균성 식중독의 90%이상 그리고 전체 식중독의 50%이상의 원인체로 알려진 매우 중요한 병원성 바이러스이다. 이와 같이 노로바이러스는 국내외의 식중독의 중요한 원인체로 중요성이 점자 증대되고 있으나, 민감하고 특이적으로 반응하는 항체가 개발되어 있지 않고 표준화된 진단법이 부재하여 진단 및 연구에 매우 어려움이 있다.

노로바이러스는 현재 5가지의 genogroup (GI-GV)과 31가지의 유전형이 알려져 있고, 이중 GI 과 GII가 사람에게 흔하게 감염하는 것으로 알려 저 있다. 이와 같이 노로바이러스는 유전학적 및 면역학적 특성이 매우 다양한 병원성 미생물이다.

본 발명은 노로바이러스의 캡시드 항원결정부위를 선택적으로 인지하는 물질을 생산하는 방법과, 항체를 생산하는 생산주를 제공한다.

본 발명에 따른 항원결정부위를 발현하는 세포를 항원으로 이용하여 통상의 방법으로 제조가능하다. 일례로, 노로바이러스 특이적 항체 제조방법은, (a) 노로바이러스의 캡시드 항원결정부위, 상기 항원결정부위를 포함하는 펩티드, 상기 항원결정부위를 발현하는 세포를 동물에 주입하여 면역화 시키는 단계, (b) 상기 항원결정부위에 특이적인 항체를 생산하는 비장세포를 수득하는 단계 및 (c) 상기 비장세포를 골수종세포와 융합시켜, 상기 특이적 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 단계를 포함하는 항체를 생산하는 생산주 제조방법으로 통하여 실시가능 하다. 상기 생산주는 생체외(in vitro)에서 배양하거나, 생체내 주입하여 항체를 분리할 수 있다. 일례로, 마우스의 복강내에 삽입하고 복수로부터 분리, 정제한다. 단클론 항체의 분리 및 정제는 배양 상층액 또는 복수를 이온교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항 면역글로불린 칼럼 또는 프로테인 A 컬럼 등의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수가 있다.

또한, 본 발명은 상기 항체를, 노로바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대하여 양성반응을 탐지하여 노로바이러스를 검출하는 방법, 또는 상기 항체를 포함하는 노로바이러스 검출 키트에 관한 것이다.

상기 검출수단은 유세포측정, 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA) 및 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 실시하기 위한 통상의 물질 일 수 있다. 즉, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP(horse radish peroxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC(Fluoresceinthiocarbamyl ethylenediamine)가, 발광물질로는 루미놀(luminol), 이소루미놀 및 루시게닌(lucigenin)이, 방사선 동위원소로는 125I, 3H, 14C 및 131I가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지수단에 의한 표지여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광 또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인가능하다. 일예로 상기 항체는 ELISA 키트 또는 스트립 키트로 제조될 수 있다.

본 연구는 노로바이러스의 표면에 해당하는 캡시드 단백질의 보존적이고 항원성을 나타내는 10-15개의 펩타이드 항원을 제조하고 쥐와 토끼를 사용하여 단클론 항체 및 다클론 항체를 제조하였다. 이러한 단클론 및 다클론 항체의 제작은 노로바이러스의 신속하고 정확하게 검체를 확인할 수 있는 도구로써 사용이 가능하다. 이러한 항체는 노로바이러스의 생물학적 특성을 연구할 수 있는 기본적인 도구를 제공할 뿐만 아니라 진단 등에 응용이 가능한 중요한 기능을 가지고 있다.

본 발명에서 검출된 9개의 노로바이러스 유행주의 켑시드 아미노산의 서열과 Genebank에 등록된 국외 노로바이러스 25개 주의 켑시드 아미노산 서열을 생물정보학 도구를 이용하여 보존적인 아미노산 부위를 성공적으로 확보해 내었으며, 이와 함께 항원적인 특성이 있는지 표면에 존재가 가능한 지를 연구하였다. 본 발명에서 보존적인 부위로 찾아 낸 부위는 GI 노로바이러스 캡시드 부위인 S 도메인에서 2개, P1-1 도메인에서 1개 그리고 P1-2 도메인에서 3개 총 6개가 얻어졌으며 GII 노로바이러스에서는 S 도메인에서 2개, P1-2 도메인에서 3개 총 5개가 후보군을 얻었다. 이중에서 약 3개의 펩타이드는 강한 소수성을 나타냄으로 항체생산에 제약이 있으므로 배제되었다. 그러므로 7개의 후보 펩타이드 서열을 확보, 제조 및 투입하여 단클론 및 다클론 항체를 쥐와 토끼를 이용하여 제조하고 평가하였다. 제조된 단클론 및 다클론 항체의 면역학적 반응성을 보기위하여 먼저 제조한 펩타이드와의 반응성을 테스트하였다. 그 결과를 보면 모든 종류의 단클론 및 다클론 항체의 경우에는 각기 투입한 펩타이드와는 특이적으로 강하게 반응하는 것을 확인할 수 있었다.

그리고 다음 단계로 제작된 항체와 노로바이러스의 반응성을 분석하기 위하여, 노로바이러스 GI과 GII의 VLP을 항원으로 하여 웨스턴 블랏을 수행한 결과 GI 및 GII의 노로바이러스와 반응하는 최소 3개의 단클론 항체를 제조하였다. 그리고 본 발명에서 제작한 2가지의 다클론 항체의 경우 모두 노로바이러스와 강한 반응성을 나타내었고 유전형을 구분이 가능하였다. 이러한 결과는 본 발명의 단클론 및 다클론 항체 모두가 노로바이러스와 매우 민감하고 특이적으로 반응하는 것을 알 수 있다. 그러므로 본 발명에서 개발된 단클론항체 및 다클론항체는 앞으로 식중독 검진 및 모니터링에 사용될 수 있는 중요한 진단의 기초재료이며, 앞으로 빠르고 신속한 노로바이러스 검출의 진단 키트의 개발로 이용될 것으로 예상된다.

도 1은 노로바이러스 캡시드 유전자 (ORF2)의 염기서열에 기초한 분자계통학적 분석의 예 (phylogenetic analysis)를 나타내는 도면이다.
도 2는 노로바이러스의 캡시드 유전자 (a) 및 발현 단백질 (b)의 구조를 나타내는 모식도이다.
도 3a 내지 도 3j은 항원성은 항원 펩타이드 prediction 프로그램을 이용하였으며, 펩타이드별로 예시적인 상동성 및 항원성 부위선정 화면을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4j는 친수성/소수성을 확인하기 위하여 펩타이드 property calculator program에 대입하여 펩타이드 생성 가능성을 확인한 분석결과이다.
도 5는 본 발명의 일예에 따른 단클론 항체를 제조하는 구체적인 방법의 개략도이다.
도 6은 본 발명의 일예에 따른 웨스턴 블랏을 통한 61개의 항체의 반응성 분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 일예에 따른 웨스턴 블랏을 통한 GI, GII 유전형에 대한 반응의 특이성 분석결과이다.
도 8은 본 발명의 일예에 따른 국내 유행 노로바이러스의 VLP에 대한 전자현미경 사진이다.

하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 목적일 뿐, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

실시예1 : 펩타이드 항원결정부위 결정

GI과 GII의 각 유전형의 서브타입을 megalign으로 상동성 지역을 조사하고 그 부위에 항원성이 높게 나타나는 지역을 선정하는 절차로 진행하였다.

먼저 유전형 I과 유전형 II내 서브타입들을 Megalign을 실행하여 각 캡시드 단백질 부위의 도메인별로 약 10개 이상의 보존적인 아미노산서열을 상동성 지역으로 선정하였다.

이와 같이 선정된 지역을 중심으로 각 지역의 아미노산 서열을 Kolaskar and Tongaonkar (Kolaskar. A. S. et al, 1990)의 방법으로 항원적인 펩타이드(antigenic peptides)를 예상 / 표시해주는 프로그램[하버드대학교 암백신센터 홈페이지(http://bio.dfci.harvard.edu/CVC/) 내 bioinformatics tool 중 항원 펩타이드 prediction 프로그램(http://bio.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.pl)]에 대입하여 상동성을 나타내는 지역에서 항원성을 나타내는 지역을 찾아서 비교 / 일치한다. 이 프로그램의 정확도는 약 75%정도로 알려져 있다.

상동성과 항원성을 나타내면서 서로 일치되는 지역을 선정한 다음 이 펩타이드 서열의 친수성 / 소수성을 확인하기 위하여 펩타이드 property calculator program (http://www.innovagen.se/custom-펩타이드-synthesis/펩타이드-property-calculator /펩타이드-property-calculator.asp) 에 대입하여 확인하였다.

항원성은 항원 펩타이드 prediction 프로그램을 이용하였으며, 도 3에서 각각의 펩타이드별로 나타내었다. 선정과정 중 최초에는 국내유행주를 포함하여 배열하였으며 최종적인 확인은 국외 여러 노로바이러스 유형과 비교하여 확인하였다. 선정된 펩타이드에 친수성/소수성을 확인하기 위하여 펩타이드 property calculator program에 대입하여 펩타이드 생성 가능성을 확인하였다(도 4) 이 프로그램에서 나타난 소수성이 상당히 높게 나온 펩타이드들에 대해서는 선정을 하지 않았다. 최종적으로 이 단계에서 분석한 것으로 선정된 펩타이드가 10개 되었다. 노로바이러스는 캡시드 단백질 부분중에서 펩타이드 선택은 S 도메인에서 GI과 GII를 모두 포함하는 것 하나와 각각 GI과 GII에 특화된 부위를 하나씩 찾았다. P1-1부위에서는 GI에 특화된 부위를 선정하였고 P1-2부위에서 GI과 GII에 각각 특화된 부위를 6개를 선정하였다 (표 3). 이중에서 6KO, 7KO 그리고 9KO가 강한 소수성으로 항체제조에서 제외되었다.

실시예 2: 노로바이러스 펩타이드 단/ 다클론 항체의 제작

상기 표 3에서 나타낸 펩티드중에서, 6KO, 7KO 그리고 9KO가 강한 소수성으로 항체제조에서 제외되었고 총 7개의 펩타이드를 pre-activated KLH와 pre-activated BSA에 conjugation을 시켜서 면역학적 반응성이 나타나도록 하였다. 이와 같이 제조된 conjugated 펩타이드를 쥐와 토끼에 투입하여 단클론 항체 및 다클론 항체를 각각 제조하였다. 단클론 항체 및 다클론 항체를 성공적으로 생성하였다. 각 펩타이드에서 생성된 단클론 항체 및 다클론 항체에 관한 사항을 표 4에 기술하였다. 다클론 항체의 경우 토끼를 사용하여 2가지를 제조하였으며, 단클론 항체는 7가지 종류 59개의 단클론 항체세포를 조사하였다.

2.1 쥐에서 단클론 항체의 제작

위에서 언급한 펩타이드 항원을 각각 2마리의 쥐에 투입하여 단클론 항체를 제조하였다. 그 과정을 설명하면 확보된 항원을 첫 번째 면역화로서 항원과 동량 (각기 250 정도 되게 한다)의 complete Freund's adjuvant (Sigma)를 혼합 후 emulsion을 만들어 생후 6주령의 암컷 BALB/c 마우스의 복강 내 (intraperitoneal injection, ip)에 주입하였다. 1마리당 50의 항원을 주사하며 6마리를 대상으로 실시하였다. 두 번째 면역화로서 2주 후에 같은 요령으로 주사하였다. 단, incomplete Freund's adjuvant (Sigma)를 사용하며, 항원의 양을 30% 줄인 양 즉, 35으로 하되 volume은 1차 면역화 때와 동량으로 하였다. 세 번째 면역화 또한 두 번째 면역화 과정과 동일한 방법으로 실시하되, 항원의 양을 25으로 줄여 투여하였다.

그리고 마지막으로 2주 후에 항원(3차 투여 시와 동일한 양)을 PBS에 혼합하여 이를 꼬리의 정맥 (미정맥, intravenous injection, iv)에 주사하였다. 항원의 투여를 거듭할수록 항원의 양을 줄이는 것은 해당 항원에 대한 특이도 높은 B 림프구들의 선택적인 확장을 유도하기 위함이며, 마지막 투여를 미정맥을 통해 하는 것은 특이도 높은 B 림프구들을 비장으로 유도하기 위함이다. 마지막 면역화 후 3일 뒤에 세포융합과정을 수행하여 단클론 항체를 생산하는 세포를 제조하였다. 단클론 항체를 제조하는 구체적인 방법은 도 5에 정리되어 있다.

2.2 토끼에서 다클론 항체의 제조

위에서 제조된 10가지의 펩타이드 항원을 모두 혼합하여 토끼에 투여하여 다클론 항체를 제조하였다. 위에서 확보된 펩타이드 항원을 토끼 (뉴질랜드 화이트)에 투여하였다. 1차 투여 시에는 항원을 1/400 PBS로 준비하여 동량의 complete Freund's adjuvant (Sigma)를 혼합 후 emulsion을 만들어 소량씩 등 부위 여러 부위 (10여 부위, 한 부위에 많이 양이 투여되면 화농-pus가 형성될 수 있으며, 심할 경우 육아종이 유발된다)에 피하 주사하였다. 2주 후 2차 투여부터는 1차 투여와 방법은 같으나 incomplete Freund's adjuvant (Sigma)를 이용하였다. 3차 투여는 2차 투여 시와 동일하며, 마지막 4차 투여 시 이정맥에 100 정도로 혈관 내 직접 투여하였다.

마지막 투여 후 이정맥을 통하여 채혈하여 아래와 같은 방법으로 항체가를 검사한 뒤 높은 수준에 이르면(ELISA 테스트 결과 해당 혈청을 1000배 이상 희석하여 측정이 가능한 역가가 나옴을 확인하였다.) 토끼를 마취한 후 전혈을 채혈하여 37에서 30-60분간 정치시키면 혈액 세포들이 응고되어 혈병을 형성하며, 이를 제거한 후 혈장을 확보하였다. 준비된 혈장은 4, 10000g, 10분간 원심분리 후 상층액을 취하여 아래와 같이 항체를 분리/정제하였다.

2.3 항원 투여 중의 혈청 항체가 검사 (항체 titering )

3차 면역화 후 4일 뒤에 꼬리 미정맥에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 인산염 완충액 (PBS)에 희석하여 효소면역측정법 (ELISA, Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)을 사용하여 항체가 형성되는 것을 결정하였다. 측정된 흡광도 (optical density, O.D)값이 음성대조군의 마우스(항원을 주입하지 않은 쥐의 혈청)의 그것과 비교하여 양호한 결과가 얻어질 경우 면역화가 성공한 것으로 보고 세포 간 융합 준비를 하였다. 항체가가 낮으면 2주후에 다시 면역화를 시도하였다.

2.4 Feeder cell 준비

D.W.에 sucrose를 11.6%로 녹여 멸균 (autoclave, 121, 15분) 후 50씩 분주하여 냉장고 (4)에 보관하였다. 골수종세포 (myeloma)와 비장 세포의 융합 18시간 이전에, 12주령 이상의 마우스(암수 및 strain은 관계없으나 Balb/c 암컷을 기준으로 삼겠음)의 복부 피부를 벗겨 낸 후 복근 속 복강 내로 8의 4, 11.6% sucrose (Sigma) 용액을 주입한 후 복강을 마사지 하여 복강 내 대식세포들의 유리를 촉진하였다. 이후 이를 회수하여 (약 6 이상) 1300 rpm으로 원심분리한 후 pellet을 PBS 혹은 RPMI-1640 (Sigma) 배지를 이용한 세척한 후 1X HAT (hypoxanthine aminopterine tymidine, Sigma), 20% FBS (fetal bovine serum, Sigma), RPMI-1640에 적절히 풀어 세포배양용 96 well plate (Nunc)에 분주한 후 37 CO2 incubator (Binder)에서 배양하였다.

Feeder cell을 미리 준비하는 것은 융합과정 중 여러 단계를 거치면서 손상을 입은 융합세포들이 feeder cell들이 분비하는 다양한 cytokine들에 의한 치유를 촉진함과 아울러 지나친 세포희석으로 인한 성장 저해를 억제하기 위함이었다.

2.5 비장세포와 골수종세포의 융합 ( Cell fusion )

세포융합 방법은 Kohler와 Milstein 방법에 따라서 PEG (polyethylene glycol, Sigma)를 fusogen으로 이용하였다. 세포융합 2주전부터 계대해온 골수종세포 (myeloma, Sp2/0-Ag14, HGPRT-, 한국세포주은행, 세포의 수가 7-8×10⁵/㎖정도 되면 1/2로 희석 계대하여 다음 날의 실험에 이용한다)와 항체가 (항체 titer)가 높게 나타난 마우스의 비장세포 (splenocyte)를 미리 준비한 후 이들을 혼합하여 FBS가 첨가되지 않은 세포배양용 배지로 세척한 후, 미리 가열한 (37) 1의 polyethylene glycol을 이용하여 1분간에 걸쳐 서서히 저어주면서 융합시켰다. 융합 후 수분에 걸쳐 천천히 1X HAT 배지 (20% FBS, RPMI-1640)를 첨가해 주면서 융합과정을 마쳤다. 이러한 전과정은 37 항온수조 (water bath)를 이용하여 시행하였다. 전날 준비한 feeder cell이 깔린 96 well plate에 well 당 1개의 colony가 생길 정도의 농도로 세포를 HAT가 첨가된 배지로 희석하여 분주하였다. 분주된 96well plate들은 37 CO₂incubator에 넣어 7일간 배양하며 스크리닝 단계에 접어들 때까지 incubator를 열지 않았다.

2.6 항원과의 특이성의 선별과정

세포융합을 실시한 후 1주일 (7일)이 경과하면, 각각의 96 well plate를 꺼내어 inverted microscopy에 올려 세포군 (cell colony)의 형성 여부 및 그 정도 (colony의 크기)를 관찰하여 각 well에 표시하였다. 표시된 well 중 colony의 크기가 전체 well 면적의 25%내외를 차지하는 것들만을 골라 특이성 검사 대상으로 삼았다. 형성되는 colony들의 형태학적 모습은 완전한 부유성, 포도상의 군집성, 부분적인 부착성, 완전한 부착성 등 다양한 형태가 나타나므로 각기 형태에 대한 세포 밀도 등을 감안하여 선별한 후 분류하였다.

2.7. 단/ 다클론 항체의 ELISA 을 이용한 특이성 검사

해당 항원 용액을 10/의 농도로 100씩 96 well plate에 분주하고 37, 60분 반응시켰다. 희석액으로는 0.05M sodium bicarbonate용액을 사용하였다. 반응액을 제거하고 세척액 (PBS, 0.05% Tween 20) well당 200 씩 첨가한 후 다시 제거하는 과정을 3회 반복하였다. 세척 후 각 well에 차단액 (blocking solution, 1% BSA가 함유된 PBS)을 200 첨가하고 37, 30분 반응하였다. 차단액 반응액을 제거하고 상기 세척액을 well당 200씩 첨가한 후 다시 제거하는 과정을 3회 반복하였다. 단클론 항체 (MAb)용액을 well당 100씩 분주하고 음성대조군용 well에 희석액을 100 분주한 다음 37에서 60분간 반응시켰다. 반응액을 제거하고 상기 세척액을 well당 200씩 첨가한 후 다시 제거하는 과정을 3회 반복하였다. 항-마우스 IgG에 HRP (Horse reddish peroxidase)가 융합된 시약을 well당 100씩 분주하고 37에서 60분간 반응시켰다. 반응액을 제거하고 상기 세척액을 well당 200 씩 첨가한 후 다시 제거하는 과정을 3회 반복하였다.

효소기질 용액 (o-phenylenediamine 0.4/ in phosphate citrate buffer pH 5.0))을 100씩 분주하고 암실의 상온 에서 30분간 반응시켰다. 492 nm (yellow)에서 흡광도값을 확인하여 음성대조군의 흡광도의 3배 이상 되는 흡광도 값을 양성 반응의 최소치로 기준하여 음성, 양성으로 판정하였다. 각 펩타이드에서 생성된 단클론 항체들 중 O.D값이 1이 초과되는 것만을 선정하였다. 6KO, 7KO 그리고 9KO는 강한 소수성으로 항체제작이 안되었다 (표 4).

클론 항체는 생성된 GI, GII 다클론항체를 각각 7개의 펩타이드와 반응을 하여 그 결과를 확인하였다. GI 다클론 항체가 GII 다클론 항체보다 역치값이 더 높게 나왔다(그림 11).

실시예 3: 웨스턴 블랏을 통한 최적의 항체 선별

3.1. 항체 1차 스크리닝

61개 항체에 대한 1차 선별을 위하여 노로바이러스 GI-4와 GII-3 캡시드 단백질 한번에 섞어서 총 20ug/ul를 맞추어 10% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)을 시행하여 멤브레인으로 이동시켜 제작된 항체 61개(단클론 cell line 배양액:59개, 다클론 항체 :2개)를 각각 반응하였다. 그 결과 1ko-b, 2ko-e, 4ko-b, 5ko-7, 8ko-1, 10ko-5, polyAb-GI, polyAb-GII에서 양성 band를 확인하였다(도 6)

3.2. GI , GII 유전형에 대한 반응의 특이성 분석

1차 스크리닝을 통하여 선별된 8종의 항체를 GI-4와 GII-3 캡시드 단백질를 각각 10% SDS-PAGE를 실행한 후에 항체의 항원 반응에 대한 특이성을 비교 분석하였다. GI-4형의 캡시드 항원에 대하여 1ko-b, 4ko-b, polyAb-GI, polyAb-GII 총 4종의 항체가 양성반응을 나타내었으며 GII-3 의 항원에 대해서는 1ko-b, polyAb-GI, polyAb-GII 3종의 항체가 양성반응을 나타내었다.

이러한 결과는 본 발명을 통하여 GI, GII 보존된 영역과 GI, GII형의 차이가 있는 영역에서 각각 고안된 펩타이드 들이 의도한 GI, GII 유전형에 특이적으로 반응하는 것을 보여준다. 다만 polyAb GI과 GII는 GI, GII 유전형에 보존적으로 존재하는 펩타이드인 1ko를 모두 항원으로 사용하여 생산하였고 이러한 결과 GI, GII 항원에 모두 반응한 것이다(도 7)

실시예 4: ELISA 를 통한 항체 선별

최종적으로 제작된 펩타이드 항체는 7개의 캡시드 펩타이드에 대한 단클론 펩타이드 항체 클론 59종과 합성된 펩타이드 항원을 GI, GII 그룹으로 섞어서 제작한 다클론 펩타이드 항체 2종 이였으며 총 61종의 항체를 대상을 항원항체반응을 수행하였다.

4.1. 항원으로 사용할 노로바이러스 VLP 정제

노로바이러스의 정제를 위해 sucrose density gradient ultracentrifugation을 실시한 후 micro fraction collector를 이용하여 분획을 채취한 후 재조합단백질에 fusion 된 6X histidine에 대한 항체로 바이러스가 존재하는 분획을 결정하고 이를 초원심분리를 통해 농축 정제한다. 정제한 VLP의 확인을 위해서 정제한 VLP를 증류수에 희석한 후 2% PTA 용역으로 염색한 후 TEM을 이용하여 관찰한 결과 전형적인 모양의 노로바이러스 VLP를 확인할 수 있었다. 국내 유행 노로바이러스의 VLP에 대한 전자현미경 사진을 도 8에 나타냈다.

4.2. ELISA 를 통한 항체 선별

GI-4, GII-3와 GII-6형의 VLP로 제작된 항원플레이트에 단클론 펩타이드 항체 클론 soup를 1:5로 희석 후 항원 항체반응을 수행 한 결과 항원 2 ko-e에서 항체 GII-3에 대하여 양성반응을 나타내었다. 또한 다클론 항체의 경우에도 항원 항체 반응 결과 polyAb-GI은 양성반응을 나타내는 것으로 보였다. 몇 개의 단클론 항체는 Western에서는 양성반응을 보였으나 ELISA에서는 보이지 않았으며 이는 epitope이 virus particle의 표면에 존재하지 않고 내부에 존재하기 때문인 것으로 생각되어진다. 그러나 두개의 다클론항체 및 최소 1개의 단클론항체가 노로바이러스와 반응하는 것으로 보인다 (표 5). 웨스턴블랏이나 ELISA 등의 방법 중에 한가지라도 양성이 나오더라도 노로바이러스의 탐지방법으로 적용이 가능하며, 웨스턴블랏은 단백질이 denature되어 있는 상태이고 ELISA는 바이러스가 입자를 이루고 있는 상태라 두가지다 모두 적용이 가능하다. 다클론항체의 경우 노로바이러스 전부의 탐지가 가능하였다.

본 발명에서 제조된 노로바이러스 항체의 경우에는 펩타이드를 이용하여 제작한 다클론항체를 이용하면 모든 종류의 노로바이러스의 탐지가 가능하며 제조된 4가지의 단클론 항체의 경우에는 노로바이러스의 유전형에 특이적으로 반응하여 유전형의 검출 및 구분이 가능하다(1ko-b: genogroup I 및 II; 2ko-e: genogroup I 및 II ; 4ko-b: Genogroup I; 다클론항체 GI: genogroup I; 다클론항체 GII: genogroup II)

서열목록 전자파일 첨부

Claims

노로바이러스의 캡시드 서열의 일부이며, SEQ ID NO: 4의 펩타이드로 구성된, 노로바이러스의 캡시드 단백질의 항원결정부위(epitope)인 펩타이드.
제1항의 펩타이드를 특이적으로 인지하는 노로바이러스의 genogroup I 유전형에 특이적인 단클론 항체.
제2항에 있어서, 상기 항체는 마우스의 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 것인 단클론 항체.
제2항 또는 제3항에 따른 항체를, 노로바이러스를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대하여 양성반응을 탐지하여 노로바이러스를 검출하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 양성반응은 효소 반응, 형광, 발광 또는 방사선을 검출하여 탐지하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 탐지는 노로바이러스의 유전형에 특이적으로 반응하여 특정 유전형의 노로바이러스를 검출하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 특정 유전형은 노로바이러스의 genogroup I인 방법.
제2항 또는 제3항에 따른 항체를 포함하는 노로바이러스 탐지용 키트.