KR100593213B1 - 곤충세포발현 재조합 ｎ 단백질 및 ｎ 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 가성우역의 신속진단방법 - Google Patents

곤충세포발현 재조합 ｎ 단백질 및 ｎ 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 가성우역의 신속진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이러스성 동물전염병인 가성우역 (Peste-des-Petits-Ruminants;PPR)의 진단 방법에 관한 것이다.
보다 상세하게, 본 발명은 곤충세포에서 발현한 가성우역바이러스 재조합 Nucleocapsid(N) 단백질 및 N 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용하여 안전하고 간단하며 신속하게 가성우역 항체를 검출할 수 있는 새로운 진단방법에 관한 것이다.
가성우역 * 신속진단 * 단클론항체 * ELISA * 재조합 N 단백질 * 항체검출

Description

곤충세포발현 재조합 Ｎ 단백질 및 Ｎ 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 가성우역의 신속진단방법{Rapid Diagnostic Methods of Peste-des-Petits-Ruminants Using Recombinant Nucleocapsid Protein Expressed in Insect Cells and Monoclonal Antibody}
도 1a 및 도 1b는 본 발명의 발현벡터 pFastBac/PPRVN에 삽입된 가성우역바이러스 N 단백질 항원을 코딩하는 유전자 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 신규한 본 발명의 한단계반응 ELISA에 의해 진단하는 방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 가성우역바이러스 N 단백질 유전자를 삽입하여 작성한 재조합 발현벡터 pFastBac/PPRVN의 모식도이다.
도 4는 가성우역바이러스 재조합 N 단백질 항원의 발현여부를 N단백질에 대한 단클론항체로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 가성우역바이러스 재조합 N 단백질 항원의 발현여부를 웨스턴 블랏 (Western Blot) 방법으로 확인한 사진을 나타내는 도면이다.
레인 M : 단백질분자량 크기 마커
레인 1 : 재조합 N 단백질을 N단백질 단클론항체로 반응시킨 결과
레인 2 : 재조합 N 단백질을 가성우역 양성혈청으로 반응시킨 결과
도 6는 본 발명의 재조합 N 단백질 항원량을 N 단백질에 대한 단클론항체를 이용하여 간접 ELISA로 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 가성우역바이러스 N단백질에 대한 단클론항체 P-3H12가 N 단백질내 주된 에피톱(immunodominant epitope)에 반응하는 항체임을 나타내는 도면이다.
PPR 2-65, 2-66, 2-69, 2-73 및 2-81 : 가성우역양성 야외혈청시료
Pos Control: 가성우역 표준양성혈청
33-4, 38-4, P-3H12, P-13A9, P-14C6, P-9H10 및 P-11A6: N 단백질에 대한 단클론항체
도 8A는 ELISA 플레이트에 코팅할 재조합 N 단백질 항원의 적정농도를 간접 ELISA로 측정한 결과(적정희석농도는 화살표로 표시됨)를 나타내는 도면이고, 도 8B는 ELISA 플레이트에 코팅된 항원의 보존성을 나타내는 도면이다.
도 9은 페록시다제(Peroxidase)를 단크론항체 P-3H12에 결합시킨 후 단클론항체 페록시다제 컨쥬게이트 농도를 간접 ELISA로 측정한 도면이다.
도 10은 가성우역 음성시료를 대상으로 한단계반응 ELISA를 적용한 결과를 나타내는 도면이다.
도면 11은 본 발명의 ELISA를 이용하여 가성우역감염 산양에서 항체검출 한 결과와 종래의 표준 ELISA kit 검사결과를 비교한 도면이다.
본 발명은 바이러스성 동물전염병인 가성우역 (Peste-des-Petits-Ruminants;PPR)의 진단 방법에 관한 것으로서, 가성우역바이러스(Peste-des-Petits-Ruminants Virus;PPRV) 유래 곤충 세포발현 재조합 Nucleocapsid (N) 단백질 및 N 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 새로운 가성우역의 진단방법을 제공한다. 좀더 상세하게는, 본 발명은 가성우역바이러스의 N 단백질을 코딩하는 유전자를 곤충세포에서 발현시켜 제조한 재조합 N 단백질 항원을 코팅한 플레이트에서 페록시다제(Peroxidase)가 결합되어 있는 단클론항체와 검사대상 혈청을 30분간 동시 반응시킨 후, 반응산물의 발색 여부로서 가성우역감염여부를 판정하는 일단계반응 효소결합면역측정법(One-Step Reaction Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay; One-step ELISA)에 의한 가성우역의 진단방법에 관한 것이다.
가성우역 (Peste-des-Petits-Ruminants; PPR)은 산양, 면양, 소 등 반추류 동물에 감염되는 전염병으로 1942년 아프리카 서부지역에서 처음 발생 보고된 이후 아프리카 사하라사막이남의 아프리카지역과 중동국가에서 방글라데시에 이르는 아시아지역에 광범위하게 걸쳐 발생하고 있다. 이 질병에 감염된 동물은 구강내 및 입술 등 안면부위에 심한 괴사소견과, 호흡곤란 그리고 설사 등의 증상을 보인다. 대부분의 감염 동물은 설사로 인한 탈수로 폐사한다. 가성우역은 감수성 동물에서 전염성과 치사율이 매우 높아 발생 지역의 축산업에 막대한 피해를 주기 때문에 우리나라의 경우 제1종 법정가축전염병으로, 국제적으로는 국제수역사무국(OIE) 분류 A등급으로 분류하고 있는 고도의 위험성을 가진 악성전염병이다. 국내에서는 상기질병이 현재까지 발생된 적이 없기 때문에 동물의 해외전염병으로 구분되어 있다.
그러므로 가성우역의 특성상 그 발생이 의심될 경우 신속한 진단에 의하여 국가적 차원의 강력한 방역조치가 수행되어야만 가성우역으로 인한 축산업의 경제적 피해를 최소화할 수 있다.
가성우역은 감염동물로부터 가성우역바이러스 항원을 검출하는 방법(항원검사법)과 감염동물에서 감염으로 인하여 생성되는 면역산물인 가성우역 항체를 검사하는 방법 (항체검사법) 등 두 가지 방법에 의하여 진단이 이루어진다.
항원검사법으로는 폐사한 동물의 내부장기 조직, 구강내 병변조직 및 설사변 등을 검사시료로 하여 병원체분리 및 동정, 역전사효소 중합효소연쇄반응(RT-PCR)법, 항원검출 효소결합면역측정법 등이 이용되고 있으며, 생체안전도 3 등급 (Biosafety Level 3)의 특수 밀폐실험실에서 진단을 수행하여야만 한다.
항체검사법으로는 바이러스 중화시험법, 효소결합면역측정법 등이 이용되고 있다. 생체안전도(Biosafety Level; BSL) 3등급의 실험실을 필요로 하는 바이러스중화시험법과 달리, 효소결합면역측정법에 의한 진단은 일반 실험실에서도 수행 가능하다. 상기 목적으로 사용중인 종래의 효소결합면역측정법(ELISA)의 경우 불활화 바이러스, 재조합 헤마굴루티닌(Hemagglutinin;H) 또는 재조합 N 단백질 등이 항원으로 사용되고 있으며, 최소 3단계이상의 반응과 3시간이상의 검사시간이 소요된다.
이에, 본 발명자들은 일반 실험실에서 신속히 가성우역을 진단할 수 있는 방법으로서 재조합 단백질 항원을 사용한 효소결합면역측정법(ELISA)이 가장 효과적임을 깨닫고 종래의 ELISA법을 개선하고자 연구한 결과, 종래의 최소 3단계이상의 반응단계를 획기적으로 단축시키기 위하여 재조합 단백질 항원을 코팅한 ELISA 플레이트 및 페록시다제(Peroxidase)가 결합된 단클론항체를 제조하여 검사시료를 한단계반응의 ELISA방법으로도 가성우역 항체를 신속 정확하게 검출할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서 본 발명의 목적은 항원코팅 플레이트에서 한단계 항원-항체반응만으로 가성우역 항체를 검출할 수 있는 새로운 ELISA법에 의한 가성우역의 진단방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 가성우역 진단방법은 재조합 베큘로바이러스를 이용하여 발현한 재조합 N 단백질 항원이 코팅된 ELISA 플레이트에서 N 단백질에 대한 단클론항체 컨쥬게이트와 검사혈청시료간의 경합적 항원-항체반응에 의하여 가성우역에 대한 항체를 검출하는 한단계반응 ELISA법으로 가성우역을 진단함을 특징으로 한다.
본 발명의 재조합 베큘로바이러스(이하 Bacmid/PPRVN라 약칭함)는 게놈내에 가성우역바이러스(PPRV)의 N 단백질 유전자를 함유하고 있으며, 본 발명의 진단방법에 사용되는 진단항원을 생산함을 특징으로 한다. 상기의 바이러스에 의해 발현된 단백질 항원은 종래에 사용되는 ELISA항원인 재조합 N 단백질 항원과 달리, 아미노말단부위 앞에 6개의 Histidine이 융합시킨 형태의 PPRV N단백질을 생산하도록 작성함으로서 단백질 발현확인 및 정제가 용이하도록 하였다.
본 발명에 사용된 PPRV N 유전자는 1975년 아프리카의 나이지리아에서 분리된 PPRV Nigeria75/1주 유래로서, 그 유전자 서열은 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 L39878호로 등록되어 공지된 것이며, 본 명세서 내의 서열목록 중 서열번호 1에 표시하였고, 같은 유전자 서열 및 이에 대응하는 아미노산 서열을 도 1a 및 도 1b에 표시하였다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 58 kDa으로 서열번호 1의 525개의 아미노산으로 구성(도 1a 및 도 1b)되며, 상기 N 단백질은 숙주세포내에서 뉴클레오캡시드를 형성하는 주된 단백질로서 감염세포에서 바이러스 구조 단백질중 가장 많이 생산되기 때문에 강한 체액성 및 세포성 면역반응을 유발한다.
한편, 본 발명의 N 단백질에 대한 단클론항체는 가성우역바이러스 Nigeria75/1주로 면역된 발브시 마우스(balb/c mouse)의 림프구 유래로 PPRV N 단백질에 있는 강한 면역원성을 가진 에피톱(immunodominant epitope)에 반응하며 한단계반응 ELISA의 진단 항체 P-3H12임을 특징으로 한다. 또한 본 발명의 진단방법에서 사용된 상기의 단클론항체는 페록시다제가 결합되어 있음을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.
가성우역 진단을 위한 본 발명의 ELISA 진단방법은,
(1) 재조합 N 단백질 항원이 코팅되어 있는 ELISA plate에서 단클론항체 컨쥬게이트와 검사시료혈청간 경합반응하는 단계;
(2) 상기 플레이트 항원에 부착되지 않은 항체들을 세척하여 제거하는 단계;
(3) 효소반응을 위한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정함으로서 검사 혈청중의 가성우역 항체가를 측정하는 단계;
로 구성된 단계를 수행함을 특징으로 하며, 상기 과정은 도 2에 도식화하였다.
또한 본 발명의 ELISA는 곤충세포에서 발현한 가성우역바이러스 재조합 N 단백질 항원을 ELISA 플레이트의 웰에 코팅하여 제조하는 단계와 호스레디쉬 페록시다제(Horsradish Peroxidase, HRP)를 결합시킨 단클론항체 P-3H12 컨쥬게이트를 제조하는 단계를 포함한다. 이러한 ELISA법에 사용되는 실험과정, 시약 및 반응조건은 종래 당업계에 통상적으로 알려져 있는 것을 이용할 수 있다.
상기 방법의 효소결합면역측정법은 면역원성이 매우 강한 에피톱에 반응하는 단클론항체를 사용하기 때문에 그 민감도 및 특이도가 매우 뛰어나며, 항원으로 사용한 N 단백질은 가성우역바이러스에서 변이가 없는 가성우역바이러스의 단백질 부위이므로 모든 가성우역바이러스 감염에 대하여 신속히 진단이 가능하다는 이점이 있다. 또한, 상기 방법에 사용된 재조합 N 단백질은 그 아미노 말단에 6개의 히스티딘이 융합 발현되도록 제작함으로서 N 단백질의 발현 여부확인 및 N 단백질의 정 제가 용이하도록 하였다. 또한, 본 발명의 방법에서 사용하는 재조합 N 단백질 항원은 통상적인 방법으로 천연에서 분리하여 사용할 수 있는데, 본 발명에서는 가성우역바이러스 N 유전자부위를 클로닝한 후, 선택적으로 재조합 유전자를 구축하고, 이를 곤충세포 발현시스템에서 발현시켜 제조한 재조합 N 항원을 이용할 수 있다. 그러나, 반드시 이러한 방법에 한정되는 것은 아니며, 당업계에 공지된 재조합 단백질의 발현시스템, 예를 들면 대장균 발현시스템, 아데노바이러스발현시스템, 효모발현시스템 등을 이용하여 제조할 수도 있다.
또한, 상기 단클론항체는 일반적으로 가성우역바이러스 항원이나 재조합 N 단백질을 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B세포와 마우스 골수종유래세포의 융합세포 즉 하이브리도마 세포에 의해서 생산될 수 있다. 이러한 하이브리도마 세포는 당업계에 통상적인 방법, 예를 들어 HAT 선택법 등을 이용하여 제조될 수 있다. 또한, N 단백질 항원에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포들 중에서, N 단백질항원에 대한 결합능력이 우수하고, 면역원성이 강한 N 단백질상의 에피톱(epitope)에 반응하는 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선택하여 사용할 수 있다. 그러한 하이브리도마 세포의 예로는, 한국 세포주은행(Korean Cell Line Research)에 2004년 10월 11일자로 기탁된 기탁번호 KCLRF-BP-00104의 하이브리도마 세포주를 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 비교예 및 실험예를 통하여 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해 한정되는 것은 아니고, 당업계에서 통상적으로 주지 된 변형, 치환 및 삽입 등을 수행할 수 있으며, 이들 역시 본원 발명의 범위에 포함된다.
[실시예 1] 가성우역바이러스 RNA 추출
1975년 아프리카 나이지리아에서 분리된 가성우역바이러스 (Nigeria75/1, 프랑스 CIRAD-EMVT연구소)를 주화세포인 VERO (ATCC CCL81)세포주에 접종한 후, 배양상층액으로부터 RNeasy RNA extraction kit (Qiagen)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 전체 RNA를 추출하였다.
[실시예 2] 가성우역바이러스 N 단백질 유전자 cDNA 합성, 증폭 및 클로닝
가성우역바이러스 N 단백질 유전자의 cDNA합성은 상기 실시예 1에서 추출한 전체 RNA와 하기 리버스 프라이머(reverse primer)(서열번호 3)를 cDNA합성을 위한 RT primix kit (Bioneer)의 튜브에 첨가하여 제조사의 매뉴얼에 따라 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 그 다음, 첫 번째 가닥 cDNA, 하기 포워드 프라이머(forward primer)(서열번호 2) 및 리버스 프라이머(reverse primer)(서열번호 3)를 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction; PCR)을 위한 PCR premix kit(Bioneer)의 튜브에 첨가하여 95℃에서 10분간 열처리한 후 94℃ 1분, 58℃ 1분, 72℃에서 1분을 1 사이클로하여 PCR 증폭기 (PE 9600;Perkin Elmer)에서 30 사이클 반복하여 PCR 증폭을 실시하고, 마지막으로 72℃ 5분간 DNA합성을 실시하였다.
상기의 PCR을 위하여 국제유전자은행(NCBI, Genbank) 등록번호 제 L39878호 로 등록된 가성우역바이러스 N 유전자 서열을 이용하여 하기의 PCR용 프라이머를 제작하였다.
(Forward primer): 5'-AA GGCGCC ATGGCGACTCTCCTCAAAAG-3'
(Reverse primer): 5'-AA GAGCTC TCAGCTGAGGAGATCCTTGT-3'
상기 프라이머 서열들은 이후의 베큘로바이러스 발현벡터를 작성하기 위하여 의도적으로 제한효소 작용부위가 삽입되었는데, 구체적으로 포워드 프라이머는 5'말단의 ATG상류에 NarI 제한효소 작용부위를, 리버스 프라이머는 5'말단의 종료코돈상류에 Sac1 제한효소 작용부위를 삽입되었다. 상기에서 증폭된 N 유전자 cDNA단편은 제한효소처리없이, 바로 pGEM-Teasy(Promega사, USA)플라스미드에 클로닝하여 "pGEM/PPRVN"을 작성하고, 자동염기서열분석기(ABI 377, USA)를 사용하여 삽입된 유전자의 염기서열을 서열번호 1의 공지된 염기서열(도 1a 및 도 1b)과 비교 분석함으로서 N 유전자 cDNA의 올바른 삽입여부를 확인하였다.
[실시예 3] 가성우역바이러스 N 유전자 발현벡터 작성
상기 실시예 2의 pGEM/PPRVN 벡터를 Nar1 및 Sac1으로 처리하여 1587bp의 DNA 단편을 추출하였다. 그 다음, 베큘로바이러스 폴리헤드린프로모터(PPH)를 가지며 6개의 Histidine(6xHis)이 융합형태로 발현될 수 있도록 제작된 pFastBacTM HT A 플라스미드(Invitrogen사, USA)를 Nar1 및 Sac1 제한효소로 처리하여 상기 1,587 bps의 DNA단편을 삽입하므로서, 가성우역바이러스 N 유전자 베큘로바이러스 발현벡터 pFastBac/PPRVN을 제작하였다. 베큘로바이러스 발현벡터는 도 3과 같다.
[실시예 4] 곤충세포이용 발현, 공동형질감염(Cotransfection) 및 재조합 베큘로바이러스 작성
재조합 베큘로바이러스 Bacmid/PPRVN는 Bac-to-Bac 베큘로바이러스발현시스템(Invitrogen사, USA)을 이용하여 작성하였다. 상기 실시예 3에서 작성한 pFastBac/PPRVN 벡터를 DH10Bac 대장균에 형질도입하여 Bacmid/PPRVN DNA를 작성하였다. Bacmid/PPRVN DNA 5㎍을 100㎕ 무혈청 그레이스 배지에 첨가한 용액과, 마찬가지로 6㎕ 셀펙틴(Cellfectin)(Invitrogen사)을 100㎕ 무혈청 그레이스 배지에 첨가한 용액을 혼합하여 실온에서 30분간 방치하였다. 그 다음, 직경 35mm 세포배양용 페트리디쉬 웰에 미리 배양된 Spodoptera frugiperda(S-f21) 세포주 (GibcoBRL, 2 x 106 세포)를 무혈청 그레이스배지로 간단하게 세척한 후 상기 제조된 혼합물을 첨가하여 27℃에서 5시간 배양함으로서 공동형질감염시켰다. 그런 다음, 공동형질감염시킨 혼합물을 제거하고, 10% 우태아혈청이 함유된 새 그레이스 배지를 2㎖ 가하여 27℃에서 4일 내지 6일간 배양하면서 세포변성효과 (Cytopathic effect;CPE) 출현여부를 관찰하였다. 형질감염시킨 세포의 배양상층액을 수확하여 재조합 베큘로바이러스를 순수 분리하기 위하여 플라크 시험법(Plaque Assay)을 실시하였다. 즉, 2 x 106 개의 S-f21세포를 직경 35mm 세포배양용 페트리디쉬 웰에 단층으로 도포한 후, 상기의 수확한 배양상층액 100㎕를 접종하였으며, 27℃에서 1시간동안 감작한 후, 1.5% 저융점 아가로스가 포함된 Grace's 배지를 그 위에 층을 이루도록 도포(Overlay)하여 3일내지 4일간 27℃에서 배양하여 나타난 단일 플라크들을 취하였다. 그런 다음, 취한 플라크 산물들을 새로운 S-f21 곤충세포에 감염시켜 3일내지 4일간 배양하여 CPE 출현여부를 관찰하였다. 상기 CPE를 나타내는 감염 세포들을 취하여 가성우역바이러스 N 단백질에 대한 단클론항체를 이용한 간접 형광항체법 및 웨스턴블랏법으로 N 단백질을 발현여부를 확인한 후, 배양상층액을 취하여 재조합 베큘로바이러스 Bacmid/PPRVN를 선발하였다. 도 4는 재조합 베큘로바이러스 감염세포에서의 재조합 N 단백질의 발현여부를 단클론항체를 이용하여 간접형광항체법으로 확인한 결과이며, 도 5는 상기의 발현 단백질을 단클론항체 및 가성우역 양성혈청을 이용한 웨스턴 블랏(Western blot)으로 확인한 결과이다.
[실시예 5] 재조합 N 단백질 항원 제조 및 N 단백질 코팅한 플레이트 제조
상기 실시예 4의 재조합 베큘로바이러스 Bacmid/PPRVN에 의한 곤충세포에서의 재조합 N 단백질의 발현 및 N 단백질 항원의 제조는 다음과 같이 실시하였다. 즉, 미리 S-f21 곤충세포를 단층배양시킨 175-cm2 세포배양용 플라스크에 0.1 MOI 농도의 재조합 베큘로바이러스를 첨가하여 27℃에서 90분간 감염시킨 후 그 감염세포들을 수확하여, 미리 2 x 106/㎖농도의 S-f21 곤충세포 200㎖를 회전배양 (Spinner culture) 용기에 가한 다음 27℃에서 4일에서 5일간 배양하였다. 그 후, 상기의 회전배양한 감염세포들을 수확하여 500 xg에서 20분간 원심하여, 상층액은 제거한 후 감염세포 펠렛(Pellet)만을 수확하였다. 그 다음, 0.5% Triton X-100, protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Biochemicals, Germany)을 함유하는 0.01 M phospahte buffered Saline 용액(곤충세포배양원액의 1/20 량)을 상기의 감염세포 펠렛에 가하여 실온에 5분간 방치한 후, 초음파처리기로 세포를 파쇄하여 재조합 N 단백질이 추출되도록 하였다. 마지막으로, 500×g에서 20분간 원심하여 상층액만을 수확하여 재조합 N 단백질 항원을 제조하였다. 제조된 단백질 항원은 효소결합면역측정법 항원으로 사용하였다.
도 6은 상기 제조항원을 하기 실시예 6의 단클론항체 P-3H12를 이용하여 항원량을 간접 ELISA방법에 의하여 측정한 결과이다. 도 6에서 보는 바와 같이 제조한 N 단백질 항원을 12,800배 희석한 농도에서도 단클론항체 P-3H12와의 반응성(흡광도 0.2이상)을 나타내는 고농도의 항원이 제조되었음을 알 수 있었다.
[실시예 6] 가성우역바이러스 N 단백질에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마(KCLRF-BP-00104)의 제작
단클론항체를 작성하기 위하여 농축 정제한 가성우역바이러스 (Nigeria75/1, 프랑스 CIRAD-EMVT연구소)를 이용하였다. 즉, 고역가의 가성우역바이러스를 Vero 세포에 감염시킨 후 약 5일 후에 배양상층액만을 수확하여 5000×g에서 30분간 원심분리하여 세포성분을 제거하였다. 상기의 감염세포배양 상층액 1ℓ에 폴리에틸렌 글리콜[Polyethylene glycol 800 (PEG 8000)] 23g 및 염화나트륨(Sodium chloride) 70g을 가하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 상기의 배양액을 5000×g에서 30분간 원심분리하여 배양상층액을 제거하고, 침전물을 차가운 0.01M PBS 10㎖에 부유함으로서 가성우역바이러스를 농축하였다. 상기의 농축 바이러스는 25% (w/v) Sucrose용액을 이용하여 100,000×g에서 90분간 초원심분리(Beckmann, USA)하여 정제하였다. 정제된 바이러스는 GenQantII (Phamacia Biotech, USA)로 정량하여 농도가 0.1 mg/㎖가 되도록 조정하였다.
농축정제한 가성우역바이러스항원은 불완전 프로인트어쥬반트(Incomplete Freund Adjuvant)와 동량으로 균질하게 혼합한 다음, 혼합액 0.05㎖를 발브시 마우스(Balb/c mouse)의 발바닥(Foot-pad)에 접종하였다. 면역 후, 10~15일 사이에 슬와 임파절(Popliteal lymph node)을 채취하여 세포융합에 사용하였다.
세포융합은 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 상기 채취한 림프구를 무혈청 배지(Serum Free Mdeium; SFM)로 세척한 후, 마우스 골수종양세포주(SP2/0-Ag14 mouse myeloma cell line)와 5:1 내지 10:1 비율로 혼합한 후 PEG1500을 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포는 HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine) 증식배지(10% 우태아혈청을 첨가한 D-MEM)에 적당히 희석한 후 미리 마우스복강세포를 배양되어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100㎕씩 분주하여 37℃, 5% 이산화탄소 배양기내에서 배양하였다.
N 단백질에 대한 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 선발은 다음과 같이 실시하였다. 상기 세포융합의 결과로 하이브리도마세포가 증식한 웰의 배 양상층액을 수거하여 간접 ELISA로 검사하였을 때, 상기 실시예 5의 재조합 N 단백질 항원에 양성반응을 보이는 웰의 하이브리도마 세포들을 마우스복강세포가 배양된 96웰 플레이트에 웰당 0.5개의 세포가 포함되도록 첨가하고 단일클론(clone)이 형성될 때까지 배양하였다. N 단백질에 대한 항체를 생산하면서 단 하나의 클론만이 증식하는 웰의 하이브리도마를 선발하였다. 상기 선발된 하이브리도마 세포를 발브시 마우스(Balb/c mouse)의 복강에 접종하여 생성시킨 복수를 채취하여 실험에 사용하였다. 본 실험에서 선발된 가성우역바이러스 N 단백질에 대한 단클론항체 생산 세포주의 특성은 하기 표 1에 표시하였다.
실시예 6의 가성우역바이러스 N 단백질에 대한 단클론항체의 특성
단클론항체 (하이브리도마) 면역원 Isotype 반응 에피톱(epitope)의 위치
P-3H12 가성우역바이러스 IgG2a, ĸ N 단백질
P-13A9 가성우역바이러스 IgG2b, ĸ N 단백질
P-9H10 가성우역바이러스 IgG1, ĸ N 단백질
P-11A6 가성우역바이러스 IgG2b, ĸ N 단백질
P-14C6 가성우역바이러스 IgM, ĸ N 단백질
[실시예 7] 한단계반응 ELISA의 진단 항체용 단클론항체 P-3H12 선발
상기 실시예 6의 단클론항체들 중에서, 면역원성이 강한 N 단백질 에피톱에 반응하는 단클론항체를 선발하기 위하여 상기 실시예 5의 재조합 N 단백질 항원 및 N 단백질에 대한 단클론항체를 이용하여 경합적 효소결합면역측정법을 다음과 같이 실시하였다. 상기 실시예 5의 재조합 N 단백질 항원을 0.01M PBS로 1:1500배 희석 하여 ELISA 플레이트의 웰에 50㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간동안 흡착시켰다. 그 다음, ELISA 플레이트에 부착하지 않은 산물들은 0.05% 트윈 20(Tween 20)이 함유된 0.002M PBS (PBST) 세척용액으로 3회 세척하여 제거하였다. 그 후, 블로킹 완충용액(0.01M PBS에 0.05% 트윈20 및 3% 스킴밀크를 첨가한 용액)으로 적정하게 희석한 단클론항체와 400배 희석한 검사혈청을 동량 혼합하여 각 혈청 당 두 웰씩 반복하여 웰당 50㎕씩 분주하고 37℃에서 1시간동안 반응하게 하였다. 이때 표준 양성혈청과 표준음성혈청을 모든 플레이트마다 첨가하여 반응의 평가기준으로 삼았다. 상기 반응이 끝난 후, PBST로 3회 세척하고 항-마우스 면역글로불린 페록시다제 컨쥬게이트(anti-mouse IgG+IgA+IgM Peroxidase conjugate;KPL사)를 불로킹 완충용액으로 2000배되게 희석하여 각 웰에 50㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간동안 반응하게 하였다. 상기 반응이 끝난 후, ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 OPD (O-PhenyleneDiamine) 용액(Sigma사)을 각 웰에 50㎕씩 분주한 후, 실온에서 10분간 발색시켰다. 그 후 1.25M 황산용액을 웰당 100㎕씩 분주함으로서 발색반응을 중지시키고 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 반응의 결과 판정에서, 단클론항체와 항-마우스 면역글로불린 페옥시다제만을 첨가한 웰보다 50%이상 발색이 저해된 웰(PI 값이 50이상)은 가성우역 항체 양성반응이 일어난 것으로 결정하였다.
도 7은 단클론항체를 이용하여 상기 경합적 ELISA로 단클론항체가 결합하는 N 단백질 에피톱의 면역원성을 비교 평가한 것이다. 단클론항체중 33-4 및 38-4는 Nigeria75/3주유래의 종래에 작성된 단클론항체로서 대조 항체로 사용한 것이며, 나머지 5종은 상기 6에서 작성한 단클론항체이다. 도 7B에서 보는 바와 같이 단클 론항체 P-3H12에 반응하는 에피톱의 면역원성이 가장 우수하였다. 단클론항체 P-3H12를 생산하는 하이브리도마 세포주에 대하여 한국 세포주은행에 이 클론을 기탁하였으며, 이 기관으로부터 2004년 10월 11일자로 KCLRF-BP-00104의 기탁번호를 부여받았다.
[실시예 8] 재조합 N 단백질이 코팅된 ELISA 플레이트의 제조
상기 실시예 5에서 제조한 재조합 N 단백질 항원을 0.01M PBS 완충용액으로 1500배 희석하여 ELISA 플레이트 (Nunc사 Maxisorp 제품)의 96웰에 웰당 50㎕씩 분주하여 37℃에서 1시간동안 코팅하였다. 반응이 끝난후 0.01M PBS로 3회 세척하여 부착되지 않은 산물들을 제거하였다. 그 다음, 3배 희석한 단백질 안정화 용액(Solubilization solution, Sigma사, USA)을 웰당 50㎕씩 분주하여 실온에서 1시간동안 불로킹 처리한 후 건조하여 항원코팅 ELISA 플레이트를 제조하였으며, 가성우역 진단에 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.
도 8a은 상기 제조한 재조합 N단백질 항원의 적정농도를 간접 ELISA로 측정한 결과이고, 도 8b는 항원코팅 ELISA 플레이트를 일정기간 4℃에서 보관한 후 표준 가성우역혈청을 이용하여 코팅항원의 보존성을 ELISA로 확인한 결과이다. 도 8b에서 보는 바와 같이 최소한 100일이상 코팅 항원은 항원성의 상실없이 장기간 보존되고 있음을 나타내었다.
[실시예 9] 단클론항체(P-3H12) 호스레디쉬페록시다제 컨쥬게이트 제조
상기 단클론항체 P-3H12는 Immunopure(A/G)TM IgG Purification kit (PIERCE사, USA)를 사용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 정제하였다. 그런 다음 정제된 단클론항체 (1.2mg/300㎕)는 Peroxidase labeling kit (Roche사)를 사용하여 페록시다제와 컨쥬게이트시켰다. 상기의 단클론항체 페록시다제 컨쥬게이트는 상기 페록시다제 항체 라벨링 키트에서 제공하는 안정화완충용액(Stabilization solution)과 동량으로 혼합하여 액체질소에서 급격히 얼린 후 -70℃에서 보관하였다.
도 9는 상기에서 페록시다제를 결합시킨 단클론항체 컨쥬게이트량을 상기 실시예 8의 항원코팅 ELISA 플레이트를 이용하여 간접 ELISA로 측정한 것을 나타낸 결과이다. 도 9에서 보는 바와 같이 단클론항체 컨쥬게이트를 400배 희석한 농도(흡광도 1.0)가 본 발명의 ELISA를 위한 적정한 농도로 측정되었다.
[실시예 10] 가성우역 진단을 위한 한단계반응 ELISA방법
일단계 효소결합면역측정법은 항원코팅 ELISA 플레이트 및 단클론항체 페록시다제 컨쥬게이트를 사용하는 효소결합면역측정법으로서 가성우역 항체를 검출하는 방법은 다음과 같다.
상기 실시예 5의 항원코팅 ELISA에 블로킹 완충용액(상기 실시예 7 기재)으로 400배 희석한 상기 실시예 9의 단클론항체-페록시다제 컨쥬게이트와, 불로킹 완충용액으로 10배 희석한 검사혈청을 동량으로 혼합한 후 각 혈청당 2 웰에 웰당 50㎕씩 분주하여 37℃에서 30분동안 반응하게 하였다. 상기 반응이 끝난 후, ELISA 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 OPD (O-PhenyleneDiamine) 용액(Sigma사)을 각 웰에 50㎕씩 분주한 후, 실온에서 10분간 발색시켰다. 그 후 1.25M 황산용액을 웰당 50㎕씩 분주함으로서 발색반응을 중지시키고 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 상기 반응의 결과 판정에서, 단클론항체-페옥시다제만을 첨가한 웰보다 50%이상 발색이 저해된 웰, 즉 발색저해도(Percent Inhibition, PI)가 50이상인 경우 가성우역 항체 양성반응으로 판정하였다.
[시험예 1]. 가성우역음성 반추동물의 혈청에의 적용.
국내 사육중이며 가성우역음성으로 확인된 소 및 산양 510두로부터 채취한 혈청을 대상으로 상기 실시예 10에 기재된 본 발명의 진단방법으로 검사하였다.
도 10은 본 발명의 한단계반응 ELISA에 의하여 상기 검사시료를 조사한 결과이며, 검사시료 510점중 508점이 음성 (PI 50이하)으로 판정되었다. 그러므로 본 발명의 진단방법인 한단계반응 ELISA의 특이도는 99.6%이었다.
[시험예2] 가성우역 실험감염 산양에서의 진단효율 비교.
세계적으로 존재하는 가성우역바이러스의 4가지 유전형 바이러스를 인공적으로 감염시킨 산양 (각 유전형당 3두 사용)으로부터 일정간격으로 채취한 혈액을 대상으로 본 발명의 일단계반응 ELISA법을 수행하였다. 각 혈청에 대한 검사결과를 현재 농업식량기구(FAO) 및 국제수역사무국(OIE)의 공식인정키트인 종래의 ELISA법과 비교하였다.
도 11은 상기 가성우역감염 실험산양에서 본 발명의 일단계반응 ELISA로 가성우역항체를 조사한 결과를 나타낸다. 종래의 ELISA법과 유사하거나 그 이상으로 신속하게 가성우역 항체를 진단할 수 있었기 때문에, 감염동물에서 가성우역진단을 수행하는 데 민감도가 우수함을 보여주고 있다.
이상의 실시예 및 시험예를 통하여 살펴본 바와 같이, 본 발명의 일단계반응 ELISA법은 진단의 특이도와 민감도가 우수하면서도 종래의 ELISA방법보다 진단시간을 획기적으로 단축하였다. 또한, 본 발명은 강한 면역원성을 보이는 N 단백질 에피톱에 반응하는 단클론항체를 사용하므로 가성우역진단에 있어서 항체검출 특이도와 민감도가 뛰어나다.
또한, 본 발명의 ELISA 진단방법은 검사시간이 1시간 이내로 매우 짧고, 검사방법이 단순하여 진단 검사를 수행하기가 용이하기 때문에 대단위 혈청시료를 신속히 검사하는데 적합하며, 가성우역이 아프리카 및 아시아의 많은 국가에서 축산업에 큰 피해를 입히고 있어 향후 가성우역의 근절차원에서 가성우역바이러스 H 또는 F 구조단백질 서브유니트 재조합백신 (Subunit recombinant vaccine)을 예방목적으로 사용할 경우, 야외 감염된 동물과 백신접종한 동물간의 감별도 가능하다.
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Claims (9)

  1. 삭제
  2. 가성우역 바이러스(PPRV) 유래 곤충 세포발현 재조합 N 단백질 항원 및 상기 N 단백질에 특이적인 단클론항체를 이용한 가성우역 진단방법에 있어서,
    1) 고형지지체에 부착된 재조합 N 단백질 항원에 페록시다제가 결합된 단클론항체와 검사시료 혈청을 경합시키는 단계;
    2) 반응잔여물을 세척용 완충용액을 사용하여 제거하는 단계; 및
    3) 효소반응을 통한 기질의 발색반응에 의한 흡광도를 측정하여, 검사시료중의 가성우역항체를 측정하는 단계;
    를 포함함을 특징으로 하는 한 단계 항원-항체 반응의 ELISA에 의한 가성우역의 진단방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 재조합 N 단백질 항원은 가성우역바이러스 N 단백질 전체유전자가 삽입된 재조합 베큘로바이러스를 가지고 곤충세포로부터 6개의 히스티딘(Histidine)이 융합한 형태로 생산됨을 특징으로 하는 진단방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 ELISA는 상기 제 3항 기재의 재조합 N 단백질 항원을 코팅 완충용액으로 희석하여 부착시킨 ELISA 플레이트를 사용한 것임을 특징으로 하는 진단방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 벡터는 가성우역바이러스 N 단백질을 코딩하는 서열번호 1의 유전자를 포함하는 벡터임을 특징으로 하는 방법.
  6. 가성우역바이러스 PPRV Nigeria75/1항원을 동물에 접종하고, 그로부터 채취한 면역세포를 암세포와 융합하여 제조함을 특징으로 하는 하이브리도마 세포주 (KCLRF-BP-00104).
  7. 제 6항에 의한 하이브리도마 세포주(KCLRF-BP-00104)로부터 발현됨을 특징으로 하는 N 단백질에 대한 단클론항체.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 ELISA는 제 7항에 의한 단클론항체를 사용한 것임을 특징으로 하는 가성우역의 진단방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 ELISA는 페록시다제와 결합된 상태의 단클론항체를 사용한 것임을 특징으로 하는 가성우역의 진단방법.
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