CN112920266B

CN112920266B - 一种基于非洲猪瘟病毒p30基因的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112920266B
Application number: CN202110247112.7A
Authority: CN
Inventors: 冯春燕; 林祥梅; 王彩霞; 吴绍强; 于浩洋; 王勤; 刘晓飞; 仇松寅; 梅琳
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2021-03-05
Filing date: 2021-03-05
Publication date: 2021-09-10
Anticipated expiration: 2041-03-05
Also published as: CN112920266A

Abstract

本发明公开了特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原结合蛋白、抗体或活性片段，包括所述抗原结合蛋白、抗体或活性片段的非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒及其制备方法和应用。本发明的ELISA检测试剂盒生产方便，效果稳定，无非特异反应，包被量低，有利于试剂盒的大量生产；本发明所提供的非洲猪瘟病毒竞争ELISA方法具有快捷、灵敏、简便、特异等优点，在非洲猪瘟的临床检测中具有广泛的应用。

Description

一种基于非洲猪瘟病毒p30基因的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物领域，具体涉及一种基于非洲猪瘟病毒p30基因的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(Africanswinefevervirus，ASFV)感染引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，其以高热、皮肤充血及淋巴结内脏器官严重充血为特征，病程短，发病率和死亡率高。各品种的家猪、非洲和欧亚野猪、钝缘蜱等均可感染ASFV。ASF疫情对生猪产业、市场和贸易都有着重大的影响。现阶段，加强对ASFV的病原学、流行病学、疫病的诊断与控制等方面的综合性研究显得尤为迫切。

非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是目前已知的唯一的DNA虫媒病毒。病毒基因组为线性、共价封闭的双链DNA(dsDNA)分子。ASFV含有151～167个开放性阅读框(ORF)，成熟的病毒粒子中含有50种以上结构蛋白，并包括结构蛋白、基因转录和RNA加工所需的酶。ASFV的实验室诊断方法主要包括病原学检测方法、血清学检测方法及分子生物检测。OIE规定的ASFV的病原学检测方法主要有病毒的细胞培养和分离、直接免疫荧光、双抗夹心ELISA；血清学检测方法有间接ELISA、阻断ELISA和间接荧光抗体试验；分子生物学检测方法主要有普通PCR和荧光定量PCR等检测方法。但是各种方法各有其优缺点，病毒的分离培养操作复杂，耗时长，在实际应用中受到很大限制；PCR和荧光PCR以及新发展的LAMP、RPA、数字PCR等分子生物学检测方法，因其灵敏度高而导致假阳性概率增高；免疫荧光法在疫病早期检测灵敏度大大降低，双抗夹心ELISA方法需要抗原具有两个以上抗体结合部位，也会导致灵敏度下降。竞争ELISA方法具有快捷、灵敏、简便、特异等优点，在多种疫病的临床检测中有广泛的应用。

但是，目前能用于竞争ELISA方法的抗体在灵敏度和特异性上难以令人满意。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对非洲猪瘟病毒p30基因的竞争性单克隆抗体，含所述单克隆抗体的竞争ELISA检测试剂及其检测试剂盒，以及所述检测试剂或检测试剂盒在检测非洲猪瘟病毒中的应用，以解决现有检测技术的弊端。

第一方面，本发明提供一种特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；以及所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

其中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列如下：

MDLGLSLILSVTSGVYSQVQLHQSGAELARPGASVKLSCKASGYIFTDYWMQWVKQRPGQGLDWIGAIYPGDGDTRFTQRFKGRATLTVDKSSSTAYMQLSNLASEDSAVYYCSRSLYDYDRRLNYVMDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPL；

SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列如下：

MSVLTQVLGLLLLWLTGGRCDIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIFSNLAWFLQKEGKSPQLLVYNAKTSAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDIGSYYCQHHFGSPYTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSS。

第二方面，本发明提供一种特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗体或活性片段，所述抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰获得的保守性变异体。

优选地，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段、改形单克隆抗体、改形单克隆抗体片段中的一种。

进一步优选地，所述抗体为鼠单克隆抗体16G8，所述鼠单克隆抗体16G8的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

第三方面，本发明提供一种非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包括所述特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原结合蛋白、抗体或活性片段。

优选地，所述抗体为鼠单克隆抗体16G8，所述鼠单克隆抗体16G8的重链可变区和轻链可变区分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

更优选地，所述抗原结合蛋白，抗体或活性片段为经标记物标记的抗原结合蛋白，抗体或活性片段；进一步优选地，所述标记物选自酶、荧光基团和化学发光基团。

作为本发明的优选方案，本发明提供的非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒包括包被ASFV p30蛋白的微孔板、酶标的鼠单克隆抗体16G8。

优选地，所述p30蛋白的包被量为0.1-8μg/mL；所述酶标的鼠单克隆抗体16G8使用时进行1:(2000-40000)的体积稀释，优选地，所述p30蛋白经原核表达获得。

进一步地，本发明的试剂盒还可以包括样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液和ASFV标准阳性血清、阴性血清。

第四方面，本发明提供所述非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒的制备方法，其中，酶标板的制备是用碳酸盐缓冲液稀释抗原，包被微孔酶标板，过夜；洗涤，加入5％BSA，封闭，洗涤，干燥。

作为本发明的优选方案，所述试剂盒的制备方法包括以下步骤：其中，酶标板的制备是用0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液将抗原稀释至1μg/mL，每孔100μL包被微孔酶标板，4℃过夜；洗涤液洗涤3次，每孔加入5％BSA 200μL，37℃封闭1h，洗涤液洗涤3次，干燥，真空包装。

第五方面，本发明提供所述特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原结合蛋白，抗体或活性片段，或所述非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒在检测样品中的非洲猪瘟病毒中的应用。

优选地，所述样品为环境样品、食品样品、血清样品或血液样品。

第六方面，本发明提供利用所述特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原结合蛋白，抗体或活性片段，或所述非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒体外检测样品中的非洲猪瘟病毒的方法。

作为本发明的优选方案，所述方法包括以下步骤：

(1)将所述样品加入到酶标微孔板中；(2)在酶标微孔板中加入经稀释液稀释后的经酶标的所述抗原结合蛋白、抗体或活性片段，并孵育；(3)显色后测定OD_450nm值，并计算PI值；以及(4)当PI值≤45％时，判定所述样品为阴性样品，当45％＜PI值＜50％时，判定所述样品为可疑样品。

作为本发明的优选方案，利用所述非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒检测非洲猪瘟病毒血清、血液样品的方法可以包括以下步骤：

步骤a、取出酶标板，使其恢复至室温；

步骤b、用稀释液将待检样品稀释2倍，并将稀释后的待检样品按照每孔100μL的加入量加入到酶标微孔板中，然后于37℃孵育1h，并用洗涤液洗涤5次，拍干或抽干；

步骤c、用稀释液将酶标单抗16G8稀释20000倍，并将稀释后的单抗按照100μL/孔的加入量加入到步骤b得到的微孔板中，然后于37℃孵育1h，并用洗涤液洗涤5次，拍干或抽干；

步骤d、每孔加入100μLTMB底物显色液，显色15min；

步骤e、每孔加入50μL浓度为2mol/L的H₂SO₄终止显色，然后测定OD_450nm值，并计算PI值；

步骤f、结果判定：当待检样品的PI值≥50％时，可判定待检样品为阳性样品；当待检样品的PI值≤45％时，可判定待检样品为阴性样品；当待检样品的PI值范围为45％＜PI值＜50％时，可判定待检样品为可疑样品。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供的针对非洲猪瘟病毒p30基因的单克隆抗体的效价高，性质稳定，可利用小鼠腹水制备，适于大量生产，并且可以与ASFV阳性血清竞争性结合包被抗原；

(2)酶标后的16G8抗体效价高，以此建立的非洲猪瘟竞争ELISA方法的重复性好，特异性好，敏感性高，与进口的同类商品化试剂盒相比，检测结果符合率可达100％；

(3)本发明提供的非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒中，包被抗原p30蛋白可以通过原核表达获得，生产方便，效果稳定，无非特异反应，包被量低，有利于试剂盒的大量生产；

(4)本发明所提供的非洲猪瘟病毒竞争ELISA方法具有快捷、灵敏、简便、特异等优点。

根据本发明的技术方案，在不改变蛋白的活性或功能的情况下，可以对氨基酸序列中的某些氨基酸残基进行保守取代，参见下面表1：

表1

残基	保守性替换	残基	保守性替换
				Ala	Ser	Leu	Ile；Val
Arg	Lys	Lys	Arg；Gln
				Asn	Gln；His	Met	Leu；Ile
Asp	Glu	Phe	Met；Leu；Tyr
				Gln	Asn	Ser	Thr；Gly
Cys	Ser	Thr	Ser；Val
				Glu	Asp	Trp	Tyr
Gly	Pro	Tyr	Trp；Phe
				His	Asn；Gln	Val	Ile；Leu
Ile	Leu；Val

此外，因为碱基的简并性，在不改变多核苷酸序列的活性或功能的情况下，可以对多核苷酸序列的碱基进行取代，参见下面表2：

表2

附图说明

图1为纯化的p30蛋白的洗脱峰图和SDS-PAGE检测鉴定图；

图2为单克隆抗体与p30蛋白的Western blot结果图，其中，A为单克隆抗体2C5的Westernblot结果，B为单克隆抗体8H7的Westernblot结果，C为单克隆抗体16G8的Westernblot结果；1、3、5为重组p30蛋白，2、4、6为pET15b空载体蛋白；

图3为单克隆抗体的免疫荧光鉴定结果图。

具体实施方式

下面对本发明做进一步说明，但不以任何方式限制本发明。

实施例

1.材料

胎牛血清、DMEM、HAT和HT均为美国Gibco公司产品。p30蛋白在本实验室进行表达和纯化。猪圆环病毒2型灭活疫苗(LG株)灭活阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(HuN4-F122株)灭活阳性血清、塞内卡灭活阳性血清、猪伪狂犬病活疫苗(Kartha-K61株)灭活阳性血清和100份ASFV阴性血清由本实验室保存。5份灭活非洲猪瘟阳性血清和40份待检灭活血清由波兰国家兽医研究所非洲猪瘟国家参考实验室保存。p30标准竞争试剂盒来自IDvet公司。骨髓瘤细胞SP2/0系为本实验室保存，Vero细胞为本实验室保存。Trizol购自Thermo公司，One step RNA RT-PCR Kit和rTaq购自TaKaRa公司，其他化学试剂均为分析纯。HRPConjugation Kit购自abcam公司。

SPF级6～8周龄BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；SPF仔猪购自北京市SPF猪育种管理中心；IgG亚类鉴定试剂盒为美国Sigma公司产品。

2.非洲猪瘟p30蛋白的获得与纯化

2.1引物设计

根据GenBank公布的p30基因参考序列筛选优势抗原表位序列，利用Primer5.0软件设计扩增引物，并分别在上下游引物中引入了XhoI和BamH I酶切位点，命名为p30U、p30L。

p30U：5’-ATACTCGAGGATTTTATTTTAAATATA-3’(SEQ ID NO:3)

p30L：5’-CGCGGATCCCTAAAACATTAAATGTAG-3’(SEQ ID NO:4)

扩增序列长度为615bp。上述引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

2.2重组表达质粒的构建及p30蛋白的表达纯化

对目的序列进行密码子优化并克隆至载体pET15b中，获得重组质粒pET15b-p30，把重组质粒转化E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落于含有氨苄霉素(终浓度为50μg/mL)的LB培养基中，37℃、225r/min摇床培养至对数生长期(OD600＝0.6～1.0)时，加入IPTG转入16℃，过夜诱导表达目的蛋白。表达的重组p30蛋白采用Ni-NTA琼脂糖树脂常规的纯化方法进行纯化，最后用250mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白，并用10ku超滤管浓缩洗脱液，将蛋白换液至PBS中，取10μL蛋白溶液进行SDS-PAGE检测。SDS-PAGE电泳结果(图1)显示，纯化后的目的蛋白大小为25kD，纯化后的蛋白呈单一条带，说明蛋白纯度较高。同时以BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度为2.5mg/mL，将p30蛋白分装后，-80℃保存备用。

以同样的方法将P30目的基因序列克隆到pFastBac1载体中，构建pFastBac1-ASFV-p30重组质粒，将测序正确的阳性重组质粒pFastBac1-ASFV-p30转化至DH10Bac感受态细胞，进行蓝白斑筛选，37℃培养48h后，挑选白色菌落用M13通用引物进行鉴定后扩大培养，随后使用质粒提取试剂盒提取重组质粒，命名为Bacmid-ASFV-p30，备用于重组杆状病毒。

3.p30单克隆抗体的制备与筛选

3.1间接ELISA检测方法的建立

采用方阵滴定法确定间接ELISA所用包被抗原和抗体的最适工作浓度。将纯化的p30抗原稀释至1mg/mL后，用包被缓冲液(0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液)分别作1:400、1:600、1:800、1:1000、1:1200和1:1400稀释，然后每孔100μL抗原稀释液包被ELISA板，4℃过夜，BALB/c小鼠阳性血清和阴性血清均分别作1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600和1:3200倍比稀释，同时设立sp2/0细胞培养上清及空白对照，选择OD₄₅₀值在1.0左右，P/N比值最大的抗原稀释浓度为最适工作浓度。结果显示，抗原的最佳稀释度为1:1000(蛋白终浓度为1μg/mL)。

3.2抗p30蛋白单克隆抗体(m Ab)杂交瘤细胞株的建立

以p30蛋白为免疫原，按照常规方法免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠，取免疫小鼠的脾细胞与生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0按照常规方法融合。以p30蛋白为包被抗原，采用建立的间接ELISA方法检测融合细胞上清中的特异性抗体。选择抗体效价高，呈单个克隆生长，细胞状态良好的细胞进行亚克隆培养，直至抗体分泌稳定，阳性孔的比例大于95％时，进行扩大培养。

3.3腹水的制备及效价测定

通过间接ELISA方法共筛选得到3株单克隆抗体细胞16G8、2C5、8H7，将三株杂交瘤细胞扩大培养，常规处理后腹腔注射经不完全弗氏佐剂处理的Balb/c小鼠制备腹水，应用间接ELISA方法测定腹水的效价均可以达到1:10⁶以上。采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水中的mAb。采用Western Blot测定mAb的反应原性。Western blot结果表明，2C5、8H7、16G8三株单抗均能与原核表达的p30蛋白之间存在反应原性，而与pET15b空载体无反应。

3.4三株单克隆抗体的稳定性鉴定

应用间接ELISA对筛选到的2C5、8H7、16G8杂交瘤细胞第10代、第20代、第30代、第40代和第50代培养上清的效价进行测定，确定杂交瘤细胞的稳定性。结果显示，2C5、8H7、16G8杂交瘤细胞能稳定分泌单抗，且效价基本保持在同一水平。

3.5单克隆抗体的免疫荧光鉴定

将Bacmid-ASFV-p30转染SF9细胞，包装出重组杆状病毒后，用P3代病毒侵染Hi5细胞，根据细胞数目铺96孔板，继续培养48h后，吸弃培养基上清，PBS洗涤两次，用4％多聚甲醛室温固定细胞15min；PBS洗涤3次，每孔加入100μL羊血清，37℃封闭1h；吸弃封闭液，每孔加入100μL细胞上清进行孵育，同时设小鼠阴性血清为阴性对照，37℃孵育1h；PBS洗涤3次；每孔加入1:1000稀释的Alexa Fluor488标记的山羊抗小鼠IgG在37℃避光孵育1h；PBS洗涤3次后进行DAPI染色，在荧光显微镜下观察结果。如图3所示，2C5、8H7、16G8的细胞上清均可以明显的观察到绿色荧光，而阴性对照无绿色荧光，表明这三株单抗均能够特异性识别p30蛋白。

3.6单克隆抗体的亚型鉴定

应用Sigma公司的亚类鉴定试剂盒鉴定单抗腹水的IgG亚类，具体操作按照试剂盒说明书进行。经亚型鉴定，2C5、8H7的抗体亚型为IgG1/k型，16G8单克隆抗体的亚类为IgG2b/k型。

4.ASFV p30单抗竞争ELISA方法的建立

4.1试剂配制

(1)包被液：0.05mol/L、pH9.6的碳酸盐缓冲液。

(2)洗涤液：pH7.4、0.1MPBS，0.05％Tween-20。

(3)封闭液：以洗涤液配制5％BSA溶液。

(4)稀释液：即为封闭液。

(5)TMB：A液：0.02％H₂O₂，用pH5.0的0.1M柠檬酸-0.2M磷酸氢二钠溶液稀释；

B液：0.4‰TMB-HCl，用50mM、pH2.8的柠檬酸钠溶液溶解。

分别取50μLA液、B液混合避光保存，备用。(也可以用商品化的TMB显色液)

(6)终止液：2M H₂SO₄溶液。

4.2标准ASFV阳性血清及标准ASFV阴性血清的制备

为减少ELISA试剂盒实际检测过程中不同操作人员和不同检测批次间的误差，本发明研制了标准ASFV抗体阳性对照血清和标准ASFV抗体阴性对照血清，用于检测方法的优化和结果判定标准的确定。

4.2.1标准阳性血清的制备

选择6周龄SPF仔猪，用碘酒消毒注射部位皮肤。第一次免疫，用注射器吸取弗氏完全佐剂(FCA)5ml与等量纯化后的重组p30蛋白(2.5mg/mL)进行乳化，采用肌肉注射的方式对仔猪进行多点免疫。间隔10-14天后，进行第二次免疫，吸取8ml弗氏不完全佐剂与等量纯化后的重组p30蛋白乳化后，以同样的方式多点肌肉注射免疫仔猪。间隔7-10天后，前腔静脉采血，分离血清，采用ELISA方法检测血清效价，抗体效价可达到1:100以上时，心脏采血，分离到的血清即为阳性血清，加入万分之一的硫柳汞防腐，0.5ml分装后，-20℃保存备用。

4.2.2标准阴性血清的制备

取经检验合格的SPF猪，心脏采血，分离的血清即为阴性血清，加入万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml分装于无菌管中，-20℃保存备用。

4.3酶标抗体的制备及筛选

采用abcam公司的HRP conjugation Kit，按照试剂盒操作步骤对纯化的p30单抗2C5、8H7、16G8进行HRP标记，获得所需酶标抗体2C5-HRP、8H7-HRP、16G8-HRP。

将p30蛋白以1μg/mL的包被浓度每孔100μL，4℃包被过夜；次日倒掉包被液，洗涤液洗涤3次，拍干，每孔加入200μL洗涤液配制的5％BSA溶液，37℃封闭1h，洗涤液洗涤3次；将标准阴、阳性血清用封闭液进行1:10稀释，每孔100μL，37℃孵育1h后，洗涤液洗涤5次；分别将HRP标记的2C5-HRP、8H7-HRP和16G8-HRP做1:10000倍和1:20000倍稀释，每孔加入100μL，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次，拍干；每孔加入100μL TMB显色液，室温显色15min；每孔加入50μL终止液终止反应，酶标仪在450nm读数。计算不同酶标抗体的N/P值。

结果如表3所示，选择N/P值最高的作为最佳竞争酶标抗体，16G8-HRP在1:10000倍稀释和1:20000倍稀释时的N/P值均为最高，因此，选择16G8-HRP进行p30竞争ELISA检测方法的优化与建立。

表3酶标抗体的筛选结果

4.4抗原最佳包被浓度和待检样品最佳稀释度的确定

按照棋盘滴定法，将p30蛋白分别以0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL和8μg/mL的包被浓度每孔100μL抗原包被液，4℃过夜，次日倒掉包被液，洗涤液洗涤3次，拍干，每孔加入200μL洗涤液配制的5％BSA溶液，37℃封闭1h，洗涤液洗涤3次，将标准阴、阳性血清进行倍比稀释，从0、1:2稀释至1:32，自上而下分别加入96孔酶标微孔板中，每孔100μL，37℃孵育1h后，洗涤液洗涤5次；用封闭液1:10000稀释酶标抗体16G8-HRP，每孔100μL，37℃孵育1h；洗涤液洗涤5次，拍干；每孔加入100μLTMB显色液，室温显色15min；每孔加入50μL终止液终止反应，酶标仪在450nm读数。根据N/P值选择最佳抗原包被浓度和最佳酶标抗体稀释度。

结果显示，当抗原包被浓度为1μg/mL，血清稀释度为1:2时，N/P值最大，且在10以上，因此确定抗原最佳包被浓度为1μg/mL，样品的最佳稀释度为1:2。

4.5酶标抗体最佳稀释度的优化

方法同4.4，将酶标抗体16G8-HRP进行稀释1:2000、1:5000、1:10000、1:20000、1:40000。以标准阴、阳性血清按照确定的最佳抗原包被浓度和最佳待检样品稀释度，在其他条件相同的情况下进行最佳酶标抗体稀释度的优化实验，反应完毕，利用酶标仪读取450nm的吸光值，计算N/P值，选择N/P值最高时的酶标抗体稀释度确定为最佳酶标抗体稀释度，即为最佳酶标抗体稀释度1:20000。

4.6最佳封闭液的确定

方法同上，分别使用10％牛血清、5％BSA、5％脱脂奶粉、1％明胶作为封闭液于37℃封闭1h，其他条件按照已确定的最佳条件进行试验，检测标准阴、阳性血清样品，反应完毕，利用酶标仪读取450nm的吸光值，计算N/P值，将N/P值最高时的条件确定为最佳封闭条件，即最佳封闭液为5％BSA于37℃封闭1h。

4.7最佳显色时间的确定

按照上述确定的最佳反应条件进行试验，加入TMB显色溶液后，室温分别避光显色5min、10min、15min和20min，其他条件不变的情况下，检测标准阴、阳性血清样品，反应完毕，利用酶标仪读取450nm的吸光值，计算N/P值，将N/P值最高时的反应条件确定为最佳显色时间，即TMB最佳作用时间为室温作用15min。

4.8竞争ELISA方法阴阳性血清判定标准的确定

使用所建立的单抗c-ELISA方法对5份已知阳性血清和100份阴性血清分别检测3次，根据下述公式计算各已知背景血清样品的抑制率(PI)，来确定本发明c-ELISA的阴阳性血清界限。

检测结果显示，5份阳性血清的PI％值均大于50％，100份阴性血清的PI％值均小于45％。因此，确定本研究所建立的单抗c-ELISA阴阳性血清样品的判定标准为：血清PI≥50％时，可判定为阳性；血清PI≤45％时，可判定为阴性；血清PI范围为45％＜PI＜50％时，可判定为可疑。

4.9重复性检测

根据批内和批间的变异系数来评价c-ELISA方法的稳定性。批内误差：使用同一批次包被的酶标板对2份血清做检测，每份血清设置6个重复，计算其变异系数表示批内误差。批间误差：取4次不同时间包被的酶标板，同时对一份阳性血清进行检测，每块板上设置两个重复孔，计算其批间变异系数表示批间误差。

批内重复实验结果显示，变异系数值分别为1.13％和1.35％；批间重复实验结果显示，变异系数为1.988％。批内变异系数及批间变异系数均小于10％，由此判断单抗c-ELISA方法具有较好稳定性。

4.10单抗c-ELISA的特异性评价

按照前面确定的c-ELISA操作程序，分别检测ASFV标准阳性血清、pcv2疫苗灭活阳性血清、PRRSV疫苗灭活阳性血清、塞内卡灭活阳性血清、PRV疫苗灭活阳性血清，根据显色结果和公式计算抑制率，由抑制率的高低来评价单抗c-ELISA的特异性。

检测结果显示pcv2疫苗灭活阳性血清、PRRSV疫苗灭活阳性血清、塞内卡灭活阳性血清、PRV疫苗灭活阳性血清的PI％值均低于50％，ASFV标准阳性血清的PI％高于50％(表4)。由此可以判定16G8单抗竞争性ELISA方法能够将猪的几种常见病与ASFV相区分。

表4单抗c-ELISA特异性检测结果

血清种类	抑制率(PI％)
		ASFV标准阳性血清	91.35
pcv2疫苗灭活阳性血清	9.75
		PRRSV疫苗灭活阳性血清	10.22
塞内卡灭活阳性血清	10.31
		PRV疫苗灭活阳性血清	8.79
ASFV标准阴性血清	0

4.11单抗c-ELISA的灵敏度评价

将标准阳性血清和阴性血清分别做梯度倍比稀释1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280，使用优化后的c-ELISA进行检测。根据检测结果表5所示，确定其最低抗体识别浓度为1:640倍稀释。

表5单抗c-ELISA敏感性试验结果

4.12临床样品的检测

使用优化后的c-ELISA反应条件，对40份待检灭活猪血清进行检测，并与IDvet公司的c-ELISA试剂盒检测结果进行比较。

检测结果见表6。单抗c-ELISA检测出的阳性样本数为3份，阴性样品为37份，IDvet公司的c-ELISA试剂盒检出阳性阳本3份，阴性阳本37份，两种检测方法的检测结果一致，符合率达到100％。由此可以看出，本公开的P30 c-ELISA试剂盒可以达到与已有的商品化试剂盒相同的检测效果。

表6本发明c-ELISA与IDvet试剂盒的样品检测结果

4.13酶标板的制备

将p30抗原用包被液按最佳包被浓度(1μg/mL)稀释，每孔100μL加入96孔酶标微孔板中，4℃过夜；次日倒掉孔中液体，洗涤液洗涤3次，最后一次拍干，然后每孔加入200μL封闭液(5％BSA)，37℃封闭1h。洗涤液洗涤3次，干燥，真空包装。

4.14ASFVc-ELISA检测试剂盒的操作步骤

4.14.1将待检样品用样品稀释液1:2稀释，每孔加入100μL稀释后的待检血清，同时设置标准阴性、阳性对照，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次；然后每孔加入100μL 1:20000稀释的酶标单抗，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次后每孔加入100μL TMB底物显色液，室温显色15min，2mol/LH₂SO₄ 50μL/孔终止显色，测定OD_450nm值并根据公式计算血清抑制率。

4.14.2结果判定：当被检血清的PI≥50％时，可判定为阳性；当被检血清PI≤45％时，可判定为阴性；当被检血清的PI范围为45％＜PI＜50％时，可判定为可疑。

5单克隆抗体序列的测定

5.1杂交瘤细胞RNA的提取

16G8杂交瘤细胞长至单层时，弃掉培养液并使用3mL无菌PBS吹打并计数，收集1×10⁶个细胞至1.5mL离心管中，800r/min离心5min，弃上清后以RNA提取试剂盒按照说明书操作步骤提取杂交瘤细胞的RNA。

5.2杂交瘤细胞提取RNA的RT-PCR扩增与鉴定

设计简并引物14条(其中VH-F 4条，VH-R 2条，VL-F 6条，VL-R 2条)，总计20对。

表7单克隆抗体重链和轻链RT-PCR扩增引物

引物	序列(5'至3')
		mVL-F1	ATGGAGACAGACTCCTGCTAT(SEQ ID NO:5)
mVL-F2	ATGGATTTTCAGGTGTTTTCAG(SEQ ID NO:6)
		mVL-F3	ATGRAGTCACAKACGGTCTTYRTA(SEQ ID NO:7)
mVL-F4	ATGAGGKCCCHGCTYTYCTKGGR(SEQ ID NO:8)
		mVL-F5	ATGAAGTTGCCTGTGCTGTTG(SEQ ID NO:9)
mVL-F6	ATGATGAGTCCTGCCTTCC(SEQ ID NO:10)
		mVL-R1	ACTGGATGGTGGGAGGA(SEQ ID NO:11)
VL-R2	CCCAAGCTTACTTGGGAAGATGGA(SEQ ID NO:12)
		mVH-F1	ATGGRATGSAGCTGMATSCTCTT(SEQ ID NO:13)
mVH-F2	ATGRACTTCGGGYCTKGGTTTT(SEQ ID NO:14)
		mVH-F3	ATGGCTGTCTTGGGGCTCTTCT(SEQ ID NO:15)
mVH-F4	ATGGRCAGTACHTYY(SEQ ID NO:16)
		mVH-R1	AYCTCCACACRCCAGTGGATAGAC(SEQ ID NO:17)
VH-R2	CCCAAGCTTRCCARKGGATRA(SEQ ID NO:18)

注：R＝A/G，S＝C/G，Y＝C/T，M＝C/A，K＝T/G，H＝A/T，D＝G/T/A

以提取的RNA为模板，引物见表3，反应体系50μL(10×One Step RNA PCR Buffer5μL，MgCl₂(25mM)10μL，dNTP Mixture(10mM)10μL，RNase Inhibitor(40U/μL)1μL，AMVRTase XL(5U/μL)1μL，AMV-Optimized Taq(5U/μL)1μL，F等量混合引物1.5μL，R等量混合引物1.5μL，模板4μL，ddH₂O15μL)，反应程序(50℃反转录30min，94℃预变性2min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增35个循环，最后72℃延伸10min)。最后取8μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察RT-PCR扩增结果，鉴定后选取合适引物对VH和VL进行大量扩增(本步骤重复两次)。使用2％琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，然后使用胶回收试剂盒回收VH和VL目的基因。

5.3VH和VL的连接转化与鉴定

将回收纯化的VH和VL目的基因与pMD-19T连接，反应体系如下：5μL SolutionⅠ，0.5μL pMD19-T，4.5μL回收纯化的PCR产物。16℃连接过夜(12h)。

取Trans 5α感受态细胞各50μL于冰上融化后，加入连接产物混匀，冰浴30min，于42℃水浴热激45s，再冰浴2-3min。加入600μL的LB液体培养基，37℃220r/min摇床复苏培养60min后，取100μL菌液均匀涂布于LB固体培养基(AMP抗性)，于37℃温箱中培养12-15h，观察转化单菌落的出现。挑取4-6个单菌落于1.5mL离心管(600μL的AMP抗性LB液体培养基)，于37℃220r/min摇床中培养，并设立对照。

37℃培养4小时后，每个离心管取2.0μL菌液进行菌液PCR鉴定，反应体系20μL(rTaq酶(5U/μL)0.2μL，10×PCR buffer 2.0μL，dNTP(2.5mM)2.0μL，M13-F(10μM)1.0μL，M13-R(10μM)1.0μL，菌液2.0μL，ddH₂O 9.8μL)，反应程序(95℃预变性4min，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，扩增32个循环，最后72℃延伸10min)。最后取8μL产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增结果，选取阳性克隆菌液送至测序。

选择16G8单克隆抗体轻、重链基因克隆经鉴定后的3个阳性克隆为测序样品，获得抗体可变区核苷酸序列，使用DNAStar和IgBLAST软件进行比对，结果显示：3个轻链可变区基因均长426bp，编码142个氨基酸；3个重链可变区基因序列均长456bp，编码152个氨基酸。

重链可变区具有如下面SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：

轻链可变区具有如下面SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列：

序列表

<110> 中国检验检疫科学研究院

<120> 一种基于非洲猪瘟病毒p30基因的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用

<130> 19824-K-CAIQ-WCX

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 152

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asp Leu Gly Leu Ser Leu Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly Val Tyr

1 5 10 15

Ser Gln Val Gln Leu His Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly

20 25 30

Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asp

35 40 45

Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp

50 55 60

Ile Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Phe Thr Gln Arg

65 70 75 80

Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala

85 90 95

Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Ser Arg Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Arg Arg Leu Asn Tyr Val Met

115 120 125

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr

130 135 140

Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu

145 150

<210> 2

<211> 142

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Val Leu Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr

1 5 10 15

Gly Gly Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn

35 40 45

Ile Phe Ser Asn Leu Ala Trp Phe Leu Gln Lys Glu Gly Lys Ser Pro

50 55 60

Gln Leu Leu Val Tyr Asn Ala Lys Thr Ser Ala Glu Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Ser Leu Lys Ile Asn

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His His Phe

100 105 110

Gly Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser

130 135 140

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atactcgagg attttatttt aaatata 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgcggatccc taaaacatta aatgtag 27

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagacag actcctgcta t 21

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggattttc aggtgttttc ag 22

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgragtcac akacggtctt yrta 24

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgaggkccc hgctytyctk ggr 23

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaagttgc ctgtgctgtt g 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgatgagtc ctgccttcc 19

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

actggatggt gggagga 17

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccaagctta cttgggaaga tgga 24

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atggratgsa gctgmatsct ctt 23

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgracttcg ggyctkggtt tt 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggctgtct tggggctctt ct 22

<210> 16

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atggrcagta chtyy 15

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ayctccacac rccagtggat agac 24

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cccaagcttr ccarkggatr a 21

Claims

1.特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.特异性结合非洲猪瘟病毒p30蛋白的抗体或活性片段，其中，所述抗体或活性片段包含至少一个重链可变区和至少一个轻链可变区，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述轻链可变区具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求2所述的抗体或活性片段，其中，所述抗体或活性片段为单克隆抗体和/或基因工程抗体；所述基因工程抗体选自单链抗体、单链抗体片段、嵌合单克隆抗体、嵌合单克隆抗体片段中的一种。

4.非洲猪瘟病毒竞争ELISA检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括权利要求1的抗原结合蛋白，或权利要求2或3所述的抗体或活性片段。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其中，所述抗原结合蛋白、抗体或活性片段为经标记物标记的抗原结合蛋白、抗体或活性片段。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，所述标记物选自酶、荧光基团和化学发光基团。