CN113533722A - 一种用于非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途 - Google Patents
一种用于非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及病毒检测的技术领域，具体公开了一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途。该试剂盒包括：包被能够与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液；以及该试剂盒的检测方法、判定方法和用途。本申请提供的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白及其试剂盒，能够用于非洲猪瘟病毒抗体的检测。
Description
技术领域
本申请涉及病毒检测的技术领域，更具体地说，它涉及一种用于非洲猪瘟病毒阻断 ELISA抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus， ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、出血性、烈性传染病，死亡率高达100％。ASF被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。 ASFV为有囊膜的双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员。其可感染家猪和野猪引起高热、广泛性出血热和高死亡率， 而对于非洲野猪，如疣猪和非洲丛林野猪则呈隐性感染。非洲钝缘蜱属(Ornithodoros) 的软蜱是ASFV的自然宿主和传播媒介。
ASF最早于1921年在肯尼亚被确认，目前主要在撒哈拉以南的非洲地区、意大利撒丁岛、高加索地区以及俄罗斯和东欧部分国家流行，给疫区国家的养猪业造成巨大的 经济损失。
然而，截至目前，我国以及其他国家均未批准非洲猪瘟疫苗的上市使用。未经严格程序批准生产经营使用的疫苗都是假疫苗，安全风险隐患极大。因此，研发用于非洲猪 瘟病毒抗体检测的试剂盒具有重要的现实意义。
发明内容
为了提高对非洲猪瘟病毒的检测和监控，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途。
第一方面，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，采用如下的技术方案：
一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，所述试剂盒包括：包被能够与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液。
通过采用上述技术方案，利用包被能够与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板制备的试剂盒，通过非洲猪瘟病毒P32重组蛋白与 非洲猪瘟病毒抗体的特异性结合，实现对非洲猪瘟病毒抗体的检测。
本申请利用阻断ELISA原理，以非洲猪瘟病毒P32重组蛋白作为抗原，利用包被 液将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被在酶标反应板上。将样本稀释液和待测样本加入酶 标反应板的样本孔中，若待测样本中存在特异性非洲猪瘟病毒抗体，将形成抗原-抗体 复合物，从而覆盖非洲猪瘟病毒P32重组蛋白表位。弃去多余的溶液，并利用浓缩洗液 洗涤。
然后继续向样本孔中加入含有酶标抗体的酶结合物，酶标抗体会与剩余的游离非洲 猪瘟病毒P32重组蛋白表位结合，从而形成抗原-酶标抗体复合物。其中，酶标抗体为 利用抗P32-辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体。利用浓缩洗液洗涤，去除过量的酶标 抗体。
再继续向样本孔中加入底物溶液(TMB)，避光反应后，继续加入终止液，完成显 色反应。显色反应的结果取决于待测样本中特异性抗体的含量：若待测样本中不存在抗 体时，将看到蓝色，加入终止液后变成黄色；若待测样本中不存在抗体时，没有显色反 应。最后利用酶标仪检测酶标反应板上各孔对应的OD450nm，将显色反应的结果转化为 数据，从而获得待测样本中非洲猪瘟病毒抗体的检测结果。
优选的，所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
通过采用上述技术方案，本申请提供了非洲猪瘟病毒P32重组蛋白，以该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白为抗原，其能够特异性结合非洲猪瘟病毒抗体，故能够对待测样本 中的非洲猪瘟病毒抗体进行检测。通过检测以及对检测结果的分析，能够计算出待测样 本中的非洲猪瘟病毒抗体。因此，本申请提供的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白可用于检测 非洲猪瘟病毒抗体，基于该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的特异性，可将其应用于非洲猪 瘟病毒抗体检测的研发，从而推动我国非洲猪瘟病毒抗体检测事业的发展。
利用包被液将上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被在酶标反应板上，制成包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板。将待测样本加入包被非洲猪瘟病毒P32重组 蛋白的酶标反应板后，当待测样本中含有非洲猪瘟病毒抗体时，酶标反应板上的非洲猪 瘟病毒P32重组蛋白能够与待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体特异性结合，形成抗原-抗 体复合物，并通过利用生物学手段对抗原-抗体复合物进行检测，从而能够检测获得待 测样本中的非洲猪瘟病毒抗体。
优选的，所述包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为2.5-5μg/mL。
在一个具体的实施方案中，所述包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为5μg/mL。
优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板中的包被温度为2～8℃。
优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)。
优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的封闭液为0.2％BSA。
优选的，所述酶结合物的稀释度为1:250～1:2000。
通过对酶标反应板中非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度、包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被液、封闭液、包被温度以及酶结合物的稀释度进行检测，当上述参数 处于上述范围内时，利用本申请提供的试剂盒对于待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体的检 测结果越精确和高效。
第二方面，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的检测方法，采用如下的技术方案：
一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的检测方法，所述检测方法具体包括以下步骤：
(1)将样本稀释液分别与待测样本、标准阳性对照品、标准阴性对照品在酶标反应板的样本孔内混合，并于37℃的避光条件下反应；
(2)弃去步骤(1)各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
(3)分别向步骤(2)处理后的各孔内加入酶结合物，并于37℃的避光条件下反应；
(4)弃去步骤(3)处理后的各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
(5)分别向步骤(4)处理后的各孔内加入底物溶液，并于21℃的避光条件下反应；
(6)分别向步骤(5)处理后的各孔内加入终止液，并利用酶标仪检测各孔对应的OD450nm。
通过采用上述技术方案，首先利用样本稀释液对待测样本进行稀释，利用酶标 反应板上的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的特异性，使其与待测样本中的非洲猪瘟病 毒抗体结合，覆盖非洲猪瘟病毒P32重组蛋白表位，形成抗原-抗体复合物；然后加 入酶结合物，利用酶结合物中酶标抗体与剩余的游离非洲猪瘟病毒P32重组蛋白表位 结合，从而形成抗原-酶标抗体复合物。再继续向样本孔中加入底物溶液和终止液，最 后利用酶标仪检测酶标反应板上各孔对应的OD450nm，即可利用本申请提供的试剂盒进 行待测样本中非洲猪瘟病毒抗体的检测。
第三方面，本申请提供一种利用上述用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的 试剂盒和/或利用上述检测方法所获得的检测结果的判定方法，采用如下的技术方案：
利用上述用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒和/或利用上述检测 方法所获得的检测结果的判定方法，当S/N≤40％，待测样本的判定结果为阳性；当 40％＜S/N＜50％，待测样本的判定结果为可疑；当S/N≥50，待测样本的判定结果 为阴性。
第四方面，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的用途，采用如下的技术方案：
一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测猪的血液或血浆样本中的非洲猪瘟病毒抗体。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请提供了一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其包含包被能够与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板，利 用非洲猪瘟病毒P32重组蛋白与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合，该试剂盒可应用于非洲 猪瘟病毒抗体的检测试验中，利用该试剂盒来检测待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体的含 量。
2.本申请还提供了利用上述用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒对于待测样本的检测方法和判定方法。
3.该试剂盒可用于检测猪的血液或血浆样本中的非洲猪瘟病毒抗体。
4.通过对本申请提供的用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的质量研究，可知该试剂盒的敏感性、特异性和可重复性好，质量可控。
附图说明
图1为本申请检测方法中的ROC曲线。
具体实施方式
本申请提供了一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白，该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白用于特异性结合非洲猪瘟病毒抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，其共有566个 氨基酸。在本申请中，利用非洲猪瘟病毒P32基因序列合成质粒(pET-32a(+)-P32质粒)， 将质粒接种到目的菌(BL21)形成基因工程菌(pET-32a(+)-P32-BL21)，利用基因工程 菌表达P32重组蛋白并进行纯化，从而获得非洲猪瘟病毒P32重组蛋白。并利用非洲 猪瘟阳性血清(由华南农业大学提供)和阴性血清进行Western blot鉴定，该非洲猪瘟 病毒P32重组蛋白与非洲猪瘟标准阳性血清反应，出现特异性条带，而与阴性血清不反 应。过程中所涉及到的方法采用本领域所熟知的方法即可。
本申请还提供了一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，该试剂 盒包括上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白或包括包被上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的 酶标反应板。
上述试剂盒可以包括：包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液。 其中，酶结合物可以是浓缩酶结合物。上述试剂盒还可以包括酶结合物稀释液。该试剂 盒的规格可以是192份/盒，也可以是480份/盒，具体各组分的规格见表1。该试剂盒 的保存条件为2～8℃，有效期为12个月。
表1本申请的试剂盒中各组分的规格
其中，浓缩洗液可以是浓缩洗液(20×)，使用前，应于室温下将浓缩洗液(20×)充分混合，以确保浓缩洗液完全溶解，然后用蒸馏水或去离子水将浓缩洗液(20×)稀 释20倍，制成工作洗液(1×)。
其中，浓缩酶结合物可以是浓缩酶结合物(10×)，使用前，应用酶结合物稀释液将浓缩酶结合物(10×)稀释10倍，制成工作酶结合物(1×)。
其中，包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中，非洲猪瘟病毒P32 重组蛋白的浓度为2.5-5μg/mL。优选的，包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反 应板中，非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为5μg/mL。
其中，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液可以是PBS(pH＝7.2)、Tris-HCl(pH＝8)、CB(pH＝9.4)。优选的，将所述非洲猪瘟病毒 P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液为PBS(pH＝7.2)。
其中，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时的包被温度可以是2～8℃、15～25℃。优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时的 包被温度为2～8℃。
其中，将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板的过程中，利用包被液包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白后，还需要用到封闭液。将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白 包被于酶标反应板时，使用的封闭液可以是0.2％BSA、2％BSA、5％脱脂奶粉、10％新 生牛血清。优选的，将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的封闭液 为0.2％BSA。
本申请还提供了上述用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的检测方法，该检测方法具体包括以下步骤：
(1)将样本稀释液分别与待测样本、标准阳性对照品、标准阴性对照品在酶标反应板的样本孔内混合，并于37℃的避光条件下反应；
(2)弃去步骤(1)各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
(3)分别向步骤(2)处理后的各孔内加入酶结合物，并于37℃的避光条件下反 应；
(4)弃去步骤(3)处理后的各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
(5)分别向步骤(4)处理后的各孔内加入底物溶液，并于21℃的避光条件下反 应；
(6)分别向步骤(5)处理后的各孔内加入终止液，并利用酶标仪检测各孔对应 的OD450nm。
本申请利用阻断ELISA原理，以非洲猪瘟病毒P32重组蛋白作为抗原，利用包被 液将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被在酶标反应板上。将样本稀释液和待测样本加入酶 标反应板的样本孔中，若待测样本中存在特异性非洲猪瘟病毒抗体，将形成抗原-抗体 复合物，从而覆盖非洲猪瘟病毒P32重组蛋白表位。弃去多余的溶液，并利用浓缩洗液 洗涤。
然后继续向样本孔中加入含有酶标抗体的酶结合物，酶标抗体会与剩余的游离非洲 猪瘟病毒P32重组蛋白表位结合，从而形成抗原-酶标抗体复合物。其中，酶标抗体为 利用抗P32-辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体。利用浓缩洗液洗涤，去除过量的酶标 抗体。
再继续向样本孔中加入底物溶液(TMB)，避光反应后，继续加入终止液，完成显 色反应。显色反应的结果取决于待测样本中特异性抗体的含量：若待测样本中不存在抗 体时，将看到蓝色，加入终止液后变成黄色；若待测样本中不存在抗体时，没有显色反 应。
本申请还提供了利用上述用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒和/ 或利用上述检测方法所获得的检测结果的判定方法，具体如下：当S/N≤40％，待测 样本的判定结果为阳性；当40％＜S/N＜50％，待测样本的判定结果为可疑；当S/N≥50， 待测样本的判定结果为阴性。
另外，本申请提供的用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒可用于检测猪的血液或血浆样本中的非洲猪瘟病毒抗体。
以下结合制备例1-13和实施例1-2对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1-5
制备例1-5分别提供了一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其不同之处在于包被于酶标反应板中的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度，分别为 10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。
利用该试剂盒的检测方法具体包括以下步骤：
(1)非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被：利用磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)将非洲猪 瘟病毒P32重组蛋白分别稀释至不同浓度；分别向酶标反应板的样本孔中加入不同浓度 的稀释液100μL；加样完毕后盖上盖板膜，室温下放置过夜，放置时间可以是12-15h， 本申请中控制放置时间为15h；用工作洗液(1×)洗涤酶标反应板3次；向处理后的每 孔中加入150μL封闭液(0.2％BSA)，室温孵育1.5h；用工作洗液(1×)洗涤酶标反应 板3次，利用吸水纸吸干多余的水分；
(2)将非洲猪瘟病毒阳性血清、阴性血清纵向连续稀释，血清稀释度为1：20， 向步骤(1)处理后的每孔中加入200μL稀释后的血清，并将酶标反应板置于37℃的避 光条件下反应45min；
(3)弃去步骤(2)各孔内的溶液，用工作洗液(1×)洗涤酶标反应板3次，利用 吸水纸吸干多余的水分；
(4)将酶结合物加入步骤(3)处理后的每孔中，加入量为100μL；酶结合物中， 酶标抗体的稀释度分别为1:250、1:500、1:1000、1:2000；并将酶标反应板置于37℃的 避光条件下反应30min；
(5)弃去步骤(4)处理后的各孔内的溶液，用工作洗液(1×)洗涤酶标反应板3 次，利用吸水纸吸干多余的水分；
(6)向步骤(5)处理后的每孔中加入100μL底物溶液，并将酶标反应板置于21℃ 的避光条件下反应15min；
(7)向步骤(6)处理后的每孔中加入100μL终止液；并利用酶标仪检测各孔对 应的OD450nm。
制备例1-5对应的检测结果如表2所示。
表2制备例1-5的检测结果
如表2所示，当酶标反应板中非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为5μg/mL，酶结 合物稀释度为1：500时，非洲猪瘟病毒标准阴性对照品OD450nm值/非洲猪瘟病毒标准 阳性对照品OD450nm值(ODnC/ODPC值)最大。因此，本申请提供的用于非洲猪瘟病毒 阻断ELISA抗体检测的试剂盒中，样品稀释液的最佳抗原包被浓度为5μg/mL，最佳酶 结合物稀释度为1：500。
制备例6-10
制备例6-10分别提供了一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，利用该试剂盒的检测方法与制备例2中的检测方法大致相同，其不同之处在于：
1.制备例6-7与制备例2的不同之处在于：
(1)酶结合物稀释度为1：500；
(2)制备例6-7中，用来包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被液分别为Tris-HCl(pH＝8)、碳酸盐缓冲液(pH＝9.4)。
(3)非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被温度为15～25℃，包被时间为15h。
2.制备例8-10与制备例2的不同之处在于：
(1)酶结合物稀释度为1：500；
(2)制备例8-10中，用来稀释非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被液分别为磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)、Tris-HCl(pH＝8)、碳酸盐缓冲液(pH＝9.4)。
(3)非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被温度为2～8℃，包被时间为15h。
制备例6-10对应的检测结果如表3所示。
表3制备例2以及制备例6-10的检测结果
如表3所示，通过三种包被液以及三种包被液在不同包被温度下的检测结果，可知制备例8中，当以磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)作为包被液，且包被温度控制在2～8℃时， 非洲猪瘟病毒标准阴性对照品OD450nm值/非洲猪瘟病毒标准阳性对照品OD450nm值 (ODnC/ODPC值)最大。因此，本申请提供的用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测 的试剂盒中，非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的最佳包被液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)，并 且最佳包被温度应控制在2～8℃。
制备例11-13
制备例11-13分别提供了一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，利用该试剂盒的检测方法与制备例8中的检测方法基本相同，其不同之处在于：制备例 11-13中所使用的封闭液分别为2％BSA、5％脱脂奶粉、10％新生牛血清。
制备例11-13对应的检测结果如表4所示。
表4制备例8以及制备例11-13的检测结果
如表4所示，通过对比利用4种不同封闭液获得的检测结果，可知制备例8中，以0.2％BSA作为封闭液，非洲猪瘟病毒标准阴性对照品OD450nm值/非洲猪瘟病毒标准阳 性对照品OD450nm值(ODnC/ODPC值)最大。因此，本申请提供的用于非洲猪瘟病毒阻 断ELISA抗体检测的试剂盒，包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白时选择的最佳封闭液为 0.2％BSA。
实施例
实施例1-3
实施例1-3分别利用制备例8提供的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒对待测样本进行检测。实施例1-3的不同之处在于各实施例的检测样本，分别 为血液样本、血浆样本、血浆样本。上述样本均取自不同的家猪。该试剂盒具体包括如 表5所示的组分和规格。
表5实施例1-3的试剂盒中各组分的规格
该试剂盒的检测方法具体包括以下步骤：
(1)加样：向酶标反应板的样本孔中加入样本稀释液50μL；取待测样本、标准阳 性对照品和标准阴性对照品各50μL，分别加入样本孔中，形成待测样本孔、标准阳性 对照品孔和标准阴性对照品孔；每孔分别设置2个；
(2)利用盖板膜盖上经过步骤(1)处理获得的酶标反应板，并置于37℃的避光 条件下反应45min；
(3)在室温下将浓缩洗液(20×)充分混合，然后用去离子水将浓缩洗液(20×) 稀释20倍，制成工作洗液(1×)；将经过步骤(2)避光反应后的待测样本孔、标准阳 性对照品孔和标准阴性对照品孔内的溶液弃去；向每孔中加入工作洗液(1×)300μL， 然后弃去工作洗液(1×)；重复洗涤3次，利用吸水纸吸干多余的水分；
(4)用酶结合物稀释液将浓缩酶结合物稀释10倍，制成工作酶结合物(1×)；向 步骤(3)洗涤后的待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔内加入100μL 工作酶结合物(1×)；
(5)利用盖板膜盖上经过步骤(4)处理获得的酶标反应板，并置于37℃的避光 条件下反应30min；
(6)将步骤(5)避光反应后的待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔内的溶液弃去；向每孔中加入工作洗液(1×)300μL，然后弃去工作洗液，重复洗涤 3次；利用吸水纸吸干多余的水分；
(7)向步骤(6)洗涤后的待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔内加入100μL底物溶液；利用盖板膜将经过上述处理后的酶标反应板盖上，并置于21℃ 的避光条件下反应15min；
(8)向步骤(7)处理后的待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔内加入100μL终止液；并利用酶标仪检测各孔对应的OD450nm。
检测试验
利用下述检测方法对实施例1-3测出的数据进行计算，判断实施例1-3中所检测的待测样本中所含非洲猪瘟病毒抗体的情况，从而判断其样本本体是否感染非洲猪瘟病毒。
(一)检测方法
1.进行实施例的检测试验时，需要在同一次试验中同时满足以下条件，该试验有效；否则，该次实验无效，试验应重新进行。
(1)标准阴性对照品平均OD450nm值大于0.70(ODNC＞0.7000)；
(2)标准阳性对照品平均OD值(ODPC)小于标准阴性对照品平均OD值(ODNC)的 30％(ODPC/ODNC＜30％)。
2.待测样本的S/N值的计算方法，其计算公式具体如下：
3.检测结果的判定
检测结果的判定标准如表6所示。
表6检测结果的判定标准
| 序号 | 判定标准 | 检测结果 |
| 1 | S/N≤40％ | 阳性 |
| 2 | 40％＜S/N＜50％ | 可疑 |
| 3 | S/N≥50％ | 阴性 |
临界值的确定：
利用上述试剂盒对15个已知非洲猪瘟阳性样本、35个已知非洲猪瘟阴性样本进行检测，并对检测结果进行ROC曲线分析，确定阴性、阳性判定的临界值。
15个已知非洲猪瘟阳性样本、35个已知非洲猪瘟阴性样本的检测结果如表7所示。根据对检测结果的分析，所得的ROC曲线如图1所示，ROC曲线的相关数据如表8、 表9所示。
表7 15个已知非洲猪瘟阳性样本、35个已知非洲猪瘟阴性样本的检测结果
表8 ROC曲线相关数据(一)—曲线下的面积
表9 ROC曲线相关数据(二)—曲线的坐标
通过对ROC曲线结果的分析，可知临界值在50.05％，“敏感度”值为0，“1－特 异性”值为1，达到最优标准，所以设置判定临界值为50％。然而由于上述样本数据 中缺少S/N值介于40％-50％之间的数据，故将介于40％-50％之间的S/N值，视为可 疑结果。因此，最终确定判定标准为：当S/N≤40％，待测样本的判定结果为阳性； 当40％＜S/N＜50％，待测样本的判定结果为可疑；当S/N≥50，待测样本的判定结 果为阴性。
4.检测时的注意事项
(1)试验过程应遵守农业农村部关于非洲猪瘟检测相关的规定。
(2)本试剂盒成分无生物传染性，应当视为具有潜在生物传染性样品对待、操作和处理，注意生物安全。
(3)试剂盒使用前各试剂应恢复至室温。使用后放回2～8℃保存。
(4)浓缩洗液、浓缩酶结合物和终止液相同批号的稀释液可互换，不同试剂使用时应防止交叉污染。
(5)底物溶液不能暴露于强光或接触氧化剂。
(6)终止液(0.5M)对人体有害，通过皮肤接触造成皮肤过敏，避免接触皮肤。
(7)浓缩洗液20×稀释前，如发现有结晶，应加热使其溶解后再使用。
(8)移液时，应尽量准确，防止产生气泡。
(9)应严格遵守各操作步骤规定的时间和温度。
(10)试验废弃物的处置须符合国家和地方有关规定。
(二)检测结果
根据实施例1-3的检测结果以及表6的判定标准，分别对实施例1-3的检测结果进行S/N值的计算，并检测结果进行判定，判定结果如表10所示。
表10实施例1-3检测结果的判定
| 实施例 | S/N值 | 判定结果 |
| 1 | 21.4％ | 阳性 |
| 2 | 45.1％ | 可疑 |
| 3 | 58.8％ | 阴性 |
实施例1-3的检测样本分别为血液样本、血浆样本、血浆样本。根据表10的S/N 值并结合表6的判断标准，实施例1的检测结果为阳性，可知实施例1对应的样本本体 感染了非洲猪瘟病毒；实施例3的检测结果均为阴性，可知实施例3对应的样本本体未 感染非洲猪瘟病毒；而实施例2检测结果为可疑，可知根据目前的检测结果暂不能判断 其对应的样本本体是否感染非洲猪瘟病毒，需要经过进一步检测，才能进行判断。
本申请利用包被上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板制成试剂盒来检测待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体的含量，通过非洲猪瘟病毒P32重组蛋白与非洲猪瘟病 毒抗体的特异结合，从而可应用于非洲猪瘟病毒抗体的检测试验中。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员 在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本 申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 百沃特（天津）生物技术有限公司
百沃特（北京）生物技术有限公司
<120> 一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 566
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala
1 5 10 15
Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr
20 25 30
Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Ala Gly
35 40 45
Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys Gly Gly
50 55 60
Thr Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Thr Ala Cys Cys Thr Gly Gly
65 70 75 80
Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Ala
85 90 95
Thr Cys Ala Ala Thr Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala Gly Ala Ala Thr
100 105 110
Thr Gly Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly Cys Thr Ala Thr Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala
130 135 140
Cys Thr Gly Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr Ala Thr
145 150 155 160
Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Cys Gly Cys
165 170 175
Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly
180 185 190
Gly Ala Thr Ala Thr Ala Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala
195 200 205
Gly Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Gly
210 215 220
Ala Ala Thr Ala Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Thr Gly
225 230 235 240
Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala
245 250 255
Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Thr
260 265 270
Thr Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Thr Ala Gly Ala Gly Ala
275 280 285
Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Ala Ala
290 295 300
Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr
305 310 315 320
Ala Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Ala Ala Thr Gly
325 330 335
Ala Ala Thr Gly Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Thr
340 345 350
Thr Gly Ala Ala Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Ala Gly
355 360 365
Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Ala Gly
370 375 380
Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys
385 390 395 400
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr Gly Cys Gly Cys Thr Thr
405 410 415
Gly Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Cys
420 425 430
Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala
435 440 445
Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly Ala Thr
450 455 460
Thr Thr Thr Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Thr Thr Ala
465 470 475 480
Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala Thr Ala Ala Cys Thr Ala Thr Ala Thr
485 490 495
Thr Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala
500 505 510
Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly
515 520 525
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr
530 535 540
Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Thr
545 550 555 560
Ala Ala Ala Cys Thr Thr
565
Claims (10)
1.一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被能够与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液。
2.根据权利要求1所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
3.根据权利要求2所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为2.5-5μg/mL。
4.根据权利要求3所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板中的包被温度为2～8℃。
5.根据权利要求3所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液为磷酸盐缓冲液（pH=7.2）。
6.根据权利要求3所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的封闭液为0.2%BSA。
7.根据权利要求1所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：所述酶结合物的稀释度为1:250~1:2000。
8.如权利要求2-7任一所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
（1）将样本稀释液分别与待测样本、标准阳性对照品、标准阴性对照品在酶标反应板的样本孔内混合，并于37℃的避光条件下反应；
（2）弃去步骤（1）各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
（3）分别向步骤（2）处理后的各孔内加入酶结合物，并于37℃的避光条件下反应；
（4）弃去步骤（3）处理后的各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
（5）分别向步骤（4）处理后的各孔内加入底物溶液，并于21℃的避光条件下反应；
（6）分别向步骤（5）处理后的各孔内加入终止液，并利用酶标仪检测各孔对应的OD450nm。
9.利用权利要求1-7任一所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒和/或利用权利要求8所述的检测方法所获得的检测结果的判定方法，其特征在于：
当S/N≤40%，待测样本的判定结果为阳性；当40%＜S/N＜50%，待测样本的判定结果为可疑；当S/N≥50，待测样本的判定结果为阴性。
10.如权利要求1-7任一所述的一种用于非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测的试剂盒的用途，其特征在于：所述试剂盒用于检测猪的血液或血浆样本中的非洲猪瘟病毒抗体。
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Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104483490A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-04-01 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒及应用 |
| CN105647971A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-06-08 | 青岛农业大学 | 一种非洲猪瘟p30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法 |
| CN110698543A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-01-17 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接elisa试剂盒 |
| CN111607000A (zh) * | 2019-02-26 | 2020-09-01 | 浙江海隆生物科技有限公司 | 一种重组的非洲猪瘟病毒p30亚单位可溶性融合蛋白及其制备方法和应用 |
| CN111929433A (zh) * | 2019-08-30 | 2020-11-13 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 一种非洲猪瘟病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法 |
| CN112424366A (zh) * | 2019-06-17 | 2021-02-26 | 巴伊沃爱普有限公司 | 用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体及其用途 |
| CN112920266A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-06-08 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种基于非洲猪瘟病毒p30基因的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用 |
-
2021
- 2021-07-21 CN CN202110827644.8A patent/CN113533722A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104483490A (zh) * | 2014-12-09 | 2015-04-01 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种猪瘟病毒阻断elisa抗体检测试剂盒及应用 |
| CN105647971A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-06-08 | 青岛农业大学 | 一种非洲猪瘟p30蛋白重组杆状病毒表达载体及其制备方法 |
| CN111607000A (zh) * | 2019-02-26 | 2020-09-01 | 浙江海隆生物科技有限公司 | 一种重组的非洲猪瘟病毒p30亚单位可溶性融合蛋白及其制备方法和应用 |
| CN112424366A (zh) * | 2019-06-17 | 2021-02-26 | 巴伊沃爱普有限公司 | 用于生产用于诊断非洲猪瘟的抗原的重组载体及其用途 |
| CN111929433A (zh) * | 2019-08-30 | 2020-11-13 | 洛阳普泰生物技术有限公司 | 一种非洲猪瘟病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法 |
| CN110698543A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-01-17 | 武汉科前生物股份有限公司 | 一种用于非洲猪瘟病毒抗体检测的双抗原间接elisa试剂盒 |
| CN112920266A (zh) * | 2021-03-05 | 2021-06-08 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种基于非洲猪瘟病毒p30基因的竞争性单克隆抗体、试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FANGFENG YUAN ET AL: "Development of a Blocking Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Detection of Antibodies against African Swine Fever Virus", 《PATHOGENS》 * |
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