CN113501865A - 一种非洲猪瘟病毒p32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接elisa抗体检测的试剂盒 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒p32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接elisa抗体检测的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN113501865A
CN113501865A CN202110826564.0A CN202110826564A CN113501865A CN 113501865 A CN113501865 A CN 113501865A CN 202110826564 A CN202110826564 A CN 202110826564A CN 113501865 A CN113501865 A CN 113501865A
Authority
CN
China
Prior art keywords
swine fever
fever virus
african swine
recombinant protein
kit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110826564.0A
Other languages
English (en)
Inventor
杨若松
马增彬
葛辉
郭琦
张桂林
徐凤忠
张强
王学文
龚雅云
梁健平
蔡云虹
杨天意
张璐
田小
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bwt Beijing Biotechnology Co ltd
Bwt Tianjin Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Bwt Beijing Biotechnology Co ltd
Bwt Tianjin Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bwt Beijing Biotechnology Co ltd, Bwt Tianjin Biotechnology Co ltd filed Critical Bwt Beijing Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110826564.0A priority Critical patent/CN113501865A/zh
Publication of CN113501865A publication Critical patent/CN113501865A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/12011—Asfarviridae
    • C12N2710/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请涉及病毒检测的技术领域，具体公开了一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒。该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白用于特异性结合非洲猪瘟病毒抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示；该试剂盒包括所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白或包括包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板；该试剂盒还包括酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液；以及该试剂盒的检测方法、判定方法和用途。本申请提供的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白及其试剂盒，能够用于非洲猪瘟病毒抗体的检测。

Description

一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接 ELISA抗体检测的试剂盒
技术领域
本申请涉及病毒检测的技术领域，更具体地说，它涉及一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染家猪和野猪引起的一种急性、出血性、烈性传染病，死亡率高达100％。ASF被世界动物卫生组织(OIE)列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASFV为有囊膜的双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员。其可感染家猪和野猪引起高热、广泛性出血热和高死亡率，而对于非洲野猪，如疣猪和非洲丛林野猪则呈隐性感染。非洲钝缘蜱属(Ornithodoros)的软蜱是ASFV的自然宿主和传播媒介。
ASF最早于1921年在肯尼亚被确认，目前主要在撒哈拉以南的非洲地区、意大利撒丁岛、高加索地区以及俄罗斯和东欧部分国家流行，给疫区国家的养猪业造成巨大的经济损失。2018年8月，非洲猪瘟首次传入我国，随后迅速大范围蔓延，造成直接经济损失数百亿元，目前疫情呈现区域流行态势，对我国养猪业构成重大威胁。
然而，截至目前，我国以及其他国家均未批准非洲猪瘟疫苗的上市使用。未经严格程序批准生产经营使用的疫苗都是假疫苗，安全风险隐患极大。因此，研发用于非洲猪瘟病毒抗体检测的试剂盒具有重要的现实意义。
发明内容
为了提高对非洲猪瘟病毒的检测和监控，本申请提供一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒。
第一方面，本申请提供一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白，采用如下的技术方案：
一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白，所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白用于特异性结合非洲猪瘟病毒抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
通过采用上述技术方案，本申请提供了非洲猪瘟病毒P32重组蛋白，以该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白为抗原，其能够特异性结合非洲猪瘟病毒抗体，故能够对待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体进行检测。通过检测以及对检测结果的分析，能够计算出待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体。因此，本申请提供的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白可用于检测非洲猪瘟病毒抗体，基于该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的特异性，可将其应用于非洲猪瘟病毒抗体检测的研发，从而推动我国非洲猪瘟病毒抗体检测事业的发展。
第二方面，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，采用如下的技术方案：
一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白或包括包被上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板。
通过采用上述技术方案，利用包含本申请提供的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白或包括包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板制备的试剂盒，均可实现对非洲猪瘟病毒抗体的检测。
利用包被液将上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被在酶标反应板上，制成包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板。将待测样本加入包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板后，当待测样本中含有非洲猪瘟病毒抗体时，酶标反应板上的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白能够与待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体特异性结合，形成抗原-抗体复合物，并通过利用生物学手段对抗原-抗体复合物进行检测，从而能够检测获得待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体。该酶标反应板可用于制备非洲猪瘟病毒抗体检测的试剂盒。
优选的，所述试剂盒包括：包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液。
通过采用上述技术方案，本申请利用间接ELISA原理，以非洲猪瘟病毒P32重组蛋白作为抗原，利用包被液将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被在酶标反应板上。将样本稀释液和待测样本加入酶标反应板的样本孔中，若待测样本中存在特异性非洲猪瘟病毒抗体，将形成抗原-抗体复合物。
然后继续向样本孔中加入含有酶标抗体的酶结合物，酶标抗体会与非洲猪瘟病毒抗体结合，从而形成抗原-抗体-酶标抗体复合物。其中，酶标抗体为利用抗多物种辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体。利用浓缩洗液洗涤，去除过量的酶标抗体。
再继续向样本孔中加入底物溶液，避光反应后，继续加入终止液，完成显色反应。显色反应的结果取决于待测样本中特异性抗体的含量：若待测样本中存在抗体时，将看到蓝色，加入终止液后变成黄色；若待测样本中不存在抗体时，没有显色反应。最后利用酶标仪检测酶标反应板上各孔对应的OD450nm，将显色反应的结果转化为数据，从而获得待测样本中非洲猪瘟病毒抗体的检测结果。
优选的，所述包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为2.5-5μg/mL。
优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)。
优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的封闭液为0.2％BSA。
优选的，所述酶结合物的稀释度为1:30000～1:60000。
在一个具体的实施方案中，所述酶结合物的稀释度可以是1:30000、1:40000、1:50000、1:60000、1:30000～1:40000、1:30000～1:50000、1:40000～1:50000、1:40000～1:60000、1:50000～1:60000。
通过对酶标反应板中非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度、包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被液、封闭液以及试剂盒中酶结合物的稀释度进行检测，当上述参数处于上述范围内时，利用本申请提供的试剂盒对于待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体的检测结果越精确和高效。
第三方面，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒的检测方法，采用如下的技术方案：
一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒的检测方法，所述检测方法具体包括以下步骤：
(1)将样本稀释液分别与待测样本、标准阳性对照品、标准阴性对照品在酶标反应板的样本孔内混合，并于21℃的避光条件下反应；
(2)弃去步骤(1)各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
(3)分别向步骤(2)处理后的各孔内加入酶结合物，并于21℃的避光条件下反应；
(4)弃去步骤(3)处理后的各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
(5)分别向步骤(4)处理后的各孔内加入底物溶液，并于21℃的避光条件下反应；
(6)分别向步骤(5)处理后的各孔内加入终止液，并利用酶标仪检测各孔对应的OD450nm。
通过采用上述技术方案，首先利用样本稀释液对待测样本进行稀释，利用酶标反应板上的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的特异性，使其与待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体结合，形成抗原-抗体复合物；然后加入酶结合物，利用酶结合物中酶标抗体与非洲猪瘟病毒抗体的结合，从而形成抗原-抗体-酶标抗体复合物。再继续向样本孔中加入底物溶液和终止液，最后利用酶标仪检测酶标反应板上各孔对应的OD450nm，即可利用本申请提供的试剂盒进行待测样本中非洲猪瘟病毒抗体的检测。
第四方面，本申请提供一种利用上述用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒和/或利用上述检测方法所获得的检测结果的判定方法，采用如下的技术方案：
利用上述用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒和/或利用上述检测方法所获得的检测结果的判定方法，当S/P≤30％时，待测样本的检测结果为阴性；当30％＜S/P＜40％时，待测样本的检测结果为可疑；当S/P≥40％时，待测样本的检测结果为阳性。
第五方面，本申请提供一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒的用途，采用如下的技术方案：
一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒的用途，所述试剂盒用于检测猪的血液、血浆、肉汁、滤纸干血片、唾液(单个或混合)和口腔拭子样本中的非洲猪瘟病毒抗体。
通过采用上述技术方案，本申请提供的试剂盒可对多种待测样本进行检测，拓宽了用于检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂盒的检测样本的范围，从而为待测样本的取样和检测提供了更大的便利，进一步促进了对非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒的研发。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1.本申请提供了一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白，其可与非洲猪瘟病毒抗体特异性结合，从而可应用于非洲猪瘟病毒抗体的检测试验中。
2.利用上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白或包被该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板制成试剂盒，利用该试剂盒来检测待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体的含量。同时，本申请还提供了该试剂盒对于待测样本的检测方法和判定方法。
3.该试剂盒可用于对多种待测样本的检测，即可用于血液、血浆、肉汁、滤纸干血片、唾液(单个或混合)和口腔拭子样本中的非洲猪瘟病毒抗体，拓宽了用于检测非洲猪瘟病毒抗体的试剂盒的检测样本的范围，从而为待测样本的取样和检测提供了更大的便利，进一步促进了对非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒的研发。
4.通过对本申请提供的用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒的质量研究，可知该试剂盒的敏感性、特异性和可重复性好，质量可控。
附图说明
图1为本申请检测方法中的ROC曲线。
具体实施方式
本申请提供了一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白，该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白用于特异性结合非洲猪瘟病毒抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示，其共有566个氨基酸。在本申请中，利用非洲猪瘟病毒P32基因序列合成质粒(pET-32a(+)-P32质粒)，将质粒接种到目的菌(BL21)形成基因工程菌(pET-32a(+)-P32-BL21)，利用基因工程菌表达P32重组蛋白并进行纯化，从而获得非洲猪瘟病毒P32重组蛋白。并利用非洲猪瘟阳性血清(由华南农业大学提供)和阴性血清进行Western blot鉴定，该非洲猪瘟病毒P32重组蛋白与非洲猪瘟标准阳性血清反应，出现特异性条带，而与阴性血清不反应。过程中所涉及到的方法采用本领域所熟知的方法即可。
本申请还提供了一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，该试剂盒包括上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白或包括包被上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板。
上述试剂盒可以包括：包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液。其中，酶结合物可以是浓缩酶结合物。上述试剂盒还可以包括酶结合物稀释液。该试剂盒的规格可以是192份/盒，也可以是480份/盒，具体各组分的规格见表1。该试剂盒的保存条件为2～8℃，有效期为12个月。
表1 本申请的试剂盒中各组分的规格
Figure BDA0003173826300000051
Figure BDA0003173826300000061
其中，浓缩洗液可以是浓缩洗液(20×)，使用前，应于室温下将浓缩洗液(20×)充分混合，以确保浓缩洗液完全溶解，然后用蒸馏水或去离子水将浓缩洗液(20×)稀释20倍，制成工作洗液(1×)。
其中，浓缩酶结合物可以是浓缩酶结合物(10×)，使用前，应用酶结合物稀释液将浓缩酶结合物(10×)稀释10倍，制成工作酶结合物(1×)。
其中，包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中，非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为2.5-5μg/mL。优选的，包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中，非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为2.5μg/mL。
其中，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液可以是PBS(pH＝7.2)、Tris-HCl(pH＝8)、CB(pH＝9.4)。优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液为PBS(pH＝7.2)。
其中，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时的包被温度可以是2～8℃、15～25℃。优选的，将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时的包被温度为2～8℃。
其中，将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板的过程中，利用包被液包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白后，还需要用到封闭液。将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的封闭液可以是0.2％BSA、2％BSA、5％脱脂奶粉、10％新生牛血清。优选的，将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的封闭液为0.2％BSA。
其中，酶结合物的稀释度为1:30000～1:60000。
本申请还提供了上述用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒的检测方法，该检测方法具体包括以下步骤：
(1)将样本稀释液分别与待测样本、标准阳性对照品、标准阴性对照品在酶标反应板的样本孔内混合，并于21℃的避光条件下反应；
(2)弃去步骤(1)各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
(3)分别向步骤(2)处理后的各孔内加入酶结合物，并于21℃的避光条件下反应；
(4)弃去步骤(3)处理后的各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
(5)分别向步骤(4)处理后的各孔内加入底物溶液，并于21℃的避光条件下反应；
(6)分别向步骤(5)处理后的各孔内加入终止液，并利用酶标仪检测各孔对应的OD450nm。
本申请利用间接ELISA原理，以非洲猪瘟病毒P32重组蛋白作为抗原，利用包被液将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被在酶标反应板上。将样本稀释液和待测样本加入酶标反应板的样本孔中，若待测样本中存在特异性非洲猪瘟病毒抗体，将形成抗原-抗体复合物。弃去多余的溶液，并利用浓缩洗液洗涤。
然后继续向样本孔中加入含有酶标抗体的酶结合物，酶标抗体会与非洲猪瘟病毒抗体结合，从而形成抗原-抗体-酶标抗体复合物。其中，酶标抗体为利用抗多物种辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体。利用浓缩洗液洗涤，去除过量的酶标抗体。
再继续向样本孔中加入底物溶液(TMB)，避光反应后，继续加入终止液，完成显色反应。显色反应的结果取决于待测样本中特异性抗体的含量：若待测样本中存在抗体时，将看到蓝色，加入终止液后变成黄色；若待测样本中不存在抗体时，没有显色反应。
本申请还提供了利用上述用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒和/或利用上述检测方法所获得的检测结果的判定方法，具体如下：当S/P≤30％时，待测样本的检测结果为阴性；当30％＜S/P＜40％时，待测样本的检测结果为可疑；当S/P≥40％时，待测样本的检测结果为阳性。
另外，本申请提供的用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒可用于检测猪的血液、血浆、肉汁、滤纸干血片、唾液(单个或混合)和口腔拭子样本中的非洲猪瘟病毒抗体。
以下结合制备例1-18和实施例1-7对本申请作进一步详细说明。
制备例
制备例1-5
制备例1-5分别提供了一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，其不同之处在于包被于酶标反应板的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度不同，分别为10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL。
利用该试剂盒的检测方法具体包括以下步骤：
(1)非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被：利用磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)将非洲猪瘟病毒P32重组蛋白分别稀释至不同浓度；分别向酶标反应板的样本孔中加入不同浓度的稀释液100μL；加样完毕后盖上盖板膜，室温下放置过夜，放置时间可以是12-15h，本申请中控制放置时间为15h；用工作洗液(1×)洗涤酶标反应板3次；向处理后的每孔中加入150μL封闭液(0.2％BSA)，室温孵育1.5h；用工作洗液(1×)洗涤酶标反应板3次，利用吸水纸吸干多余的水分；
(2)将非洲猪瘟病毒阳性血清、阴性血清纵向连续稀释，血清稀释度如表2所示，向步骤(1)处理后的每孔中加入200μL稀释后的血清，并将酶标反应板置于21℃的避光条件下反应45min；
(3)弃去步骤(2)各孔内的溶液，用工作洗液(1×)洗涤酶标反应板3次，利用吸水纸吸干多余的水分；
(4)将酶结合物加入步骤(3)处理后的每孔中，加入量为100μL；酶结合物中，酶标抗体的稀释倍数为1:50000；并将酶标反应板置于21℃的避光条件下反应30min；
(5)弃去步骤(4)处理后的各孔内的溶液，用工作洗液(1×)洗涤酶标反应板3次，利用吸水纸吸干多余的水分；
(6)向步骤(5)处理后的每孔中加入100μL底物溶液，并将酶标反应板置于21℃的避光条件下反应15min；
(7)向步骤(6)处理后的每孔中加入100μL终止液；并利用酶标仪检测各孔对应的OD450nm。
制备例1-5对应的检测结果如表2所示。
表2 制备例1-5的检测结果
Figure BDA0003173826300000081
Figure BDA0003173826300000091
如表2所示，当酶标反应板中非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为2.5μg/mL，血清稀释度为1：20时，非洲猪瘟病毒标准阳性对照品OD450nm值/非洲猪瘟病毒标准阴性对照品OD450nm值(ODPC/ODNC值)最大，且非洲猪瘟病毒标准阳性对照品OD450nm值趋于稳定。因此，本申请提供的用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒中，样品稀释液的最佳抗原包被浓度为2.5μg/mL，最佳血清稀释度为1：20。
制备例6-10
制备例6-10分别提供了一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，利用该试剂盒的检测方法与制备例3中的检测方法大致相同，其不同之处在于：
1.制备例6-7与制备例3的不同之处在于：
(1)血清稀释度为1：20；
(2)制备例6-7中，用来包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被液分别为Tris-HCl(pH＝8)、碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)。
(3)非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被温度为15～25℃，包被时间为15h。
2.制备例8-10与制备例3的不同之处在于：
(1)血清稀释度为1：20；
(2)制备例8-10中，用来包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被液分别为磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)、Tris-HCl(pH＝8)、碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)。
(3)非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的包被温度为2～8℃，包被时间为15h。
制备例6-10对应的检测结果如表3所示。
表3 制备例3以及制备例6-10的检测结果
Figure BDA0003173826300000092
Figure BDA0003173826300000101
如表3所示，通过三种包被液以及三种包被液在不同包被温度下的检测结果，可知制备例8中，当以磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)作为包被液，且包被温度控制在2～8℃时，非洲猪瘟病毒标准阳性对照品OD450nm值/非洲猪瘟病毒标准阴性对照品OD450nm值(ODPC/ODNC值)最大，且非洲猪瘟病毒标准阳性对照品OD450nm值趋于稳定。因此，本申请提供的用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒中，非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的最佳包被液为磷酸盐缓冲液(pH＝7.2)，并且最佳包被温度应控制在2～8℃。
制备例11-13
制备例11-13分别提供了一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，利用该试剂盒的检测方法与制备例8中的检测方法基本相同，其不同之处在于：制备例11-13中所使用的封闭液分别为2％BSA、5％脱脂奶粉、10％新生牛血清。
制备例11-13对应的检测结果如表4所示。
表4 制备例8以及制备例11-13的检测结果
Figure BDA0003173826300000102
如表4所示，通过对比利用4种不同封闭液获得的检测结果，可知制备例8中，以0.2％BSA作为封闭液，非洲猪瘟病毒标准阳性对照品OD450nm值/非洲猪瘟病毒标准阴性对照品OD450nm值(ODPC/ODNC值)最大，且非洲猪瘟病毒标准阳性对照品OD450nm值趋于稳定。因此，本申请提供的用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，包被非洲猪瘟病毒P32重组蛋白时选择的最佳封闭液为0.2％BSA。
制备例14-18
制备例14-18分别提供了一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，利用该试剂盒的检测方法与制备例8中的检测方法基本相同，其不同之处在于：制备例14-18中酶结合物中的酶标抗体的工作浓度，分别按照1:10000、1:20000、1:30000、1:40000、1:60000对酶结合物中的酶标抗体进行稀释，
制备例14-18对应的检测结果如表5所示。
表5 制备例8以及制备例14-18的检测结果
Figure BDA0003173826300000111
如表5所示，通过对比利用6种不同酶标抗体浓度获得的检测结果，可知制备例8中，酶标抗体浓度为1:50000时，非洲猪瘟病毒标准阳性对照品OD450nm值/非洲猪瘟病毒标准阴性对照品OD450nm值(ODPC/ODNC值)最大，且非洲猪瘟病毒标准阳性对照品OD450nm值趋于稳定。因此，本申请提供的用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，酶结合物中的最佳酶标抗体浓度为1:50000。
实施例
实施例1-7
实施例1-7分别利用制备例8提供的一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒对待测样本进行检测。实施例1-7的不同之处在于各实施例的检测样本，具体分别为血液样本、血浆样本、肉汁样本、滤纸干血片样本、唾液样本(单个)、唾液样本(混合)以及口腔拭子样本。上述样本均取自不同的家猪。该试剂盒具体包括如表6所示的组分和规格。
表6 实施例1-7的试剂盒中各组分的规格
Figure BDA0003173826300000112
Figure BDA0003173826300000121
该试剂盒的检测方法具体包括以下步骤：
(1)加样：向酶标反应板的样本孔中加入样本稀释液；取待测样本、标准阳性对照品和标准阴性对照品，分别加入样本孔中，形成待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔；每孔分别设置2个；
(2)利用盖板膜盖上经过步骤(1)处理获得的酶标反应板，并置于21℃的避光条件下反应；
(3)在室温下将浓缩洗液(20×)充分混合，然后用去离子水将浓缩洗液(20×)稀释20倍，制成工作洗液(1×)；将经过步骤(2)避光反应后的待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔内的溶液弃去；向每孔中加入工作洗液(1×)300μL，然后弃去工作洗液(1×)；重复洗涤3次，利用吸水纸吸干多余的水分；
(4)用酶结合物稀释液将浓缩酶结合物稀释10倍，制成工作酶结合物(1×)；向步骤(3)洗涤后的待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔内加入100μL工作酶结合物(1×)；
(5)利用盖板膜盖上经过步骤(4)处理获得的酶标反应板，并置于21℃的避光条件下反应30min；
(6)将步骤(5)避光反应后的待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔内的溶液弃去；向每孔中加入工作洗液(1×)300μL，然后弃去工作洗液，重复洗涤3次；利用吸水纸吸干多余的水分；
(7)向步骤(6)洗涤后的待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔内加入100μL底物溶液；利用盖板膜将经过上述处理后的酶标反应板盖上，并置于21℃的避光条件下反应15min；
(8)向步骤(7)处理后的待测样本孔、标准阳性对照品孔和标准阴性对照品孔内加入100μL终止液；并利用酶标仪检测各孔对应的OD450nm。
针对实施例1-7检测的样本不同，检测方法中的不同之处如表7所示，具体为加样时的加入量、避光反应时间以及样本前处理。
表7 实施例1-7的检测方法的不同之处
Figure BDA0003173826300000131
检测试验
利用下述检测方法对实施例1-7测出的数据进行计算，判断实施例1-7中所检测的待测样本中所含非洲猪瘟病毒抗体的情况，从而判断其样本本体是否感染非洲猪瘟病毒。
(一)检测方法
1.进行实施例的检测试验时，需要在同一次试验中同时满足以下条件，该试验有效；否则，该次实验无效，试验应重新进行。
(1)标准阳性对照品平均OD450nm值大于0.350(ODPC＞0.350)；
(2)标准阳性对照品平均OD值(ODPC)/标准阴性对照品平均OD值(ODNC)大于3(ODPC/ODNC＞3)。
2.待测样本的S/P值的计算方法，其计算公式具体如下：
Figure BDA0003173826300000141
3.检测结果的判定标准
(1)血液样本、血浆样本、肉汁样本以及滤纸干血片样本检测结果的判定标准如表8所示。
表8 血液样本、血浆样本、肉汁样本以及滤纸干血片样本检测结果的判定标准
序号 判定标准 检测结果
1 S/P≤30％ 阴性
2 30％＜S/P＜40％ 可疑
3 S/P≥40％ 阳性
临界值的确定：
利用上述试剂盒对15个已知非洲猪瘟阳性样本、35个已知非洲猪瘟阴性样本进行检测，并对检测结果进行ROC曲线分析，确定阴性、阳性判定的临界值。
15个已知非洲猪瘟阳性样本、35个已知非洲猪瘟阴性样本的检测结果如表9所示。根据对检测结果的分析，所得的ROC曲线如图1所示，ROC曲线的相关数据如表10、表11所示。
表9 15个已知非洲猪瘟阳性样本、35个已知非洲猪瘟阴性样本的检测结果
Figure BDA0003173826300000142
Figure BDA0003173826300000151
表10 ROC曲线相关数据(一)—曲线下的面积
Figure BDA0003173826300000152
表11 ROC曲线相关数据(二)—曲线的坐标
Figure BDA0003173826300000153
Figure BDA0003173826300000161
Figure BDA0003173826300000171
通过对ROC曲线结果的分析，可知临界值在40.67％时，“敏感度”值为1，“1－特异性”值为0，达到最优标准，所以设置判定临界值为40％。然而由于上述样本数据中缺少S/P值介于30％-40％之间的数据，故将介于30％＜S/P＜40％之间的S/P值，视为可疑结果。因此，最终确定判定标准为：S/P≤30％，则判定结果为阴性；30％＜S/P＜40％，则判定结果为可疑；S/P≥40％，则判定结果为阳性。
(2)唾液样本以及口腔拭子样本检测结果的判定标准如表12所示。
表12 唾液样本以及口腔拭子样本检测结果的判定标准
序号 判定标准 检测结果
1 S/P≤25％ 阴性
2 S/P≥25％ 阳性
4.检测时的注意事项
(1)试验过程应遵守农业农村部关于非洲猪瘟检测相关的规定。
(2)本试剂盒成分无生物传染性，应当视为具有潜在生物传染性样品对待、操作和处理，注意生物安全。
(3)试剂盒使用前各试剂应恢复至室温。使用后放回2～8℃保存。
(4)浓缩洗液、浓缩酶结合物和终止液相同批号的稀释液可互换，不同试剂使用时应防止交叉污染。
(5)底物溶液不能暴露于强光或接触氧化剂。
(6)终止液(0.5M)对人体有害，通过皮肤接触造成皮肤过敏，避免接触皮肤。
(7)浓缩洗液20×稀释前，如发现有结晶，应加热使其溶解后再使用。
(8)移液时，应尽量准确，防止产生气泡。
(9)应严格遵守各操作步骤规定的时间和温度。
(10)试验废弃物的处置须符合国家和地方有关规定。
(二)检测结果
根据实施例1-7的检测结果以及表8、表12的判定标准，分别对实施例1-7的检测结果进行S/P值的计算，并检测结果进行判定，判定结果如表13所示。
表13 实施例1-7检测结果的判定
Figure BDA0003173826300000181
Figure BDA0003173826300000191
实施例1-4的检测样本分别为血液样本、血浆样本、肉汁样本以及滤纸干血片样本。根据表13的S/P值并结合表8的判断标准，实施例1和实施例2的检测结果均为阴性，可知实施例1和实施例2对应的样本本体未感染非洲猪瘟病毒；实施例4的检测结果为阳性，可知实施例4对应的样本本体感染了非洲猪瘟病毒；而实施例3检测结果为可疑，可知根据目前的检测结果暂不能判断其对应的样本本体是否非洲猪瘟病毒，需要经过进一步检测，才能进行判断。
实施例5-7的检测样本分别为唾液样本(单个)、唾液样本(混合)以及口腔拭子样本。根据表13的S/P值并结合表12的判断标准，实施例5和实施例6的检测结果均为阴性，可知实施例5和实施例6对应的样本本体未感染非洲猪瘟病毒；实施例7的检测结果为阳性，可知实施例7对应的样本本体感染了非洲猪瘟病毒。
本申请利用包被上述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板制成试剂盒来检测待测样本中的非洲猪瘟病毒抗体的含量，通过非洲猪瘟病毒P32重组蛋白与非洲猪瘟病毒抗体的特异结合，从而可应用于非洲猪瘟病毒抗体的检测试验中。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 百沃特（天津）生物技术有限公司
百沃特（北京）生物技术有限公司
<120> 一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒
<130> 1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 566
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Thr Cys Ala
1 5 10 15
Thr Cys Thr Thr Cys Ala Ala Ala Ala Cys Gly Gly Ala Thr Thr Thr
20 25 30
Ala Ala Gly Ala Gly Cys Ala Thr Cys Thr Cys Ala Cys Ala Ala Gly
35 40 45
Thr Thr Gly Thr Gly Thr Thr Thr Cys Ala Thr Gly Cys Cys Gly Gly
50 55 60
Thr Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Thr Ala Cys Cys Thr Gly Gly
65 70 75 80
Thr Thr Thr Thr Cys Thr Gly Thr Thr Gly Ala Gly Ala Thr Thr Ala
85 90 95
Thr Cys Ala Ala Thr Ala Gly Cys Gly Gly Thr Ala Gly Ala Ala Thr
100 105 110
Thr Gly Thr Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Gly Cys Thr Ala Thr Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Ala Gly Thr Ala
130 135 140
Cys Thr Gly Thr Thr Ala Ala Gly Thr Ala Thr Gly Ala Thr Ala Thr
145 150 155 160
Thr Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Ala Thr Gly Cys Thr Cys Gly Cys
165 170 175
Ala Thr Cys Thr Ala Thr Gly Cys Ala Gly Gly Ala Cys Ala Gly Gly
180 185 190
Gly Ala Thr Ala Thr Ala Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Ala
195 200 205
Gly Gly Cys Thr Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Ala Thr Gly Gly
210 215 220
Ala Ala Thr Ala Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Thr Gly
225 230 235 240
Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala
245 250 255
Gly Gly Cys Gly Gly Ala Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Thr
260 265 270
Thr Cys Ala Ala Cys Ala Thr Cys Cys Thr Thr Ala Gly Ala Gly Ala
275 280 285
Gly Cys Ala Ala Thr Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Ala Ala
290 295 300
Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Ala Thr
305 310 315 320
Ala Gly Cys Cys Ala Thr Gly Ala Ala Ala Cys Thr Ala Ala Thr Gly
325 330 335
Ala Ala Thr Gly Cys Ala Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Thr Thr
340 345 350
Thr Gly Ala Ala Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Thr Thr Gly Ala Gly
355 360 365
Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala Thr Cys Ala Gly
370 375 380
Ala Gly Ala Cys Ala Cys Cys Cys Ala Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys
385 390 395 400
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr Gly Cys Gly Cys Thr Thr
405 410 415
Gly Cys Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Gly Thr Gly Cys
420 425 430
Ala Ala Cys Ala Cys Ala Thr Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Thr Ala
435 440 445
Thr Gly Gly Ala Ala Ala Gly Gly Cys Ala Cys Cys Thr Gly Ala Thr
450 455 460
Thr Thr Thr Ala Ala Cys Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Thr Thr Ala
465 470 475 480
Gly Ala Gly Cys Ala Cys Ala Thr Ala Ala Cys Thr Ala Thr Ala Thr
485 490 495
Thr Cys Ala Ala Ala Cys Ala Ala Thr Thr Thr Ala Thr Gly Gly Ala
500 505 510
Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Thr Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly
515 520 525
Ala Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Thr
530 535 540
Ala Ala Gly Ala Cys Thr Cys Ala Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Thr
545 550 555 560
Ala Ala Ala Cys Thr Thr
565

Claims (10)

1.一种非洲猪瘟病毒P32重组蛋白，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白用于特异性结合非洲猪瘟病毒抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白或包括包被权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板。
3.根据权利要求2所述的一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板、酶结合物、标准阳性对照品、标准阴性对照品、样本稀释液、浓缩洗液、底物溶液、终止液。
4.根据权利要求3所述的一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：所述包被所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的酶标反应板中的非洲猪瘟病毒P32重组蛋白的浓度为2.5-5μg/mL。
5.根据权利要求4所述的一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的包被液为磷酸盐缓冲液（pH=7.2）。
6.根据权利要求4所述的一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：将所述非洲猪瘟病毒P32重组蛋白包被于酶标反应板时，使用的封闭液为0.2%BSA。
7.根据权利要求3所述的一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒，其特征在于：所述酶结合物的稀释度为1:30000~1:60000。
8.如权利要求2-7任一所述的一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法具体包括以下步骤：
（1）将样本稀释液分别与待测样本、标准阳性对照品、标准阴性对照品在酶标反应板的样本孔内混合，并于21℃的避光条件下反应；
（2）弃去步骤（1）各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
（3）分别向步骤（2）处理后的各孔内加入酶结合物，并于21℃的避光条件下反应；
（4）弃去步骤（3）处理后的各孔内的溶液，用浓缩洗液洗涤，并去除多余水分；
（5）分别向步骤（4）处理后的各孔内加入底物溶液，并于21℃的避光条件下反应；
（6）分别向步骤（5）处理后的各孔内加入终止液，并利用酶标仪检测各孔对应的OD450nm。
9.利用权利要求2-7任一所述的一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒和/或利用权利要求8所述的检测方法所获得的检测结果的判定方法，其特征在于：
当S/P≤30%时，待测样本的检测结果为阴性；当30%＜S/P＜40%时，待测样本的检测结果为可疑；当S/P≥40%时，待测样本的检测结果为阳性。
10.如权利要求2-7任一所述的一种用于非洲猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的试剂盒的用途，其特征在于：所述试剂盒用于检测猪的血液、血浆、肉汁、滤纸干血片、唾液（单个或混合）和口腔拭子样本中的非洲猪瘟病毒抗体。
CN202110826564.0A 2021-07-21 2021-07-21 一种非洲猪瘟病毒p32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接elisa抗体检测的试剂盒 Pending CN113501865A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110826564.0A CN113501865A (zh) 2021-07-21 2021-07-21 一种非洲猪瘟病毒p32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接elisa抗体检测的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110826564.0A CN113501865A (zh) 2021-07-21 2021-07-21 一种非洲猪瘟病毒p32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接elisa抗体检测的试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113501865A true CN113501865A (zh) 2021-10-15

Family

ID=78013652

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110826564.0A Pending CN113501865A (zh) 2021-07-21 2021-07-21 一种非洲猪瘟病毒p32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接elisa抗体检测的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113501865A (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110873792A (zh) * 2019-11-29 2020-03-10 江苏省农业科学院 非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒
CN111072774A (zh) * 2019-10-14 2020-04-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 抗非洲猪瘟p30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111072774A (zh) * 2019-10-14 2020-04-28 中国农业科学院兰州兽医研究所 抗非洲猪瘟p30蛋白单域抗体和检测非洲猪瘟病毒的elisa试剂盒
CN110873792A (zh) * 2019-11-29 2020-03-10 江苏省农业科学院 非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GALLARDO,C.等: "Accession NO.: HM745390.1，African swine fever virus isolate Ken08WH/4 p32 protein (CP204L) gene，partial cds", 《GENBANK DATABASE》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113009154B (zh) 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用
CN113009153B (zh) 一种基于磁微粒化学发光的新冠病毒中和抗体检测试剂盒及其应用
CN111929433B (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法
EP1238279B1 (en) Helicobacter pylori antigens in blood
CN104263838B (zh) 单增李斯特菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
CN108956987B (zh) fiber2蛋白及其重组蛋白在检测鸭血清中鸭2型腺病毒抗体方面的应用
CN107727854A (zh) 一种鸡传染性支气管炎病毒蛋白芯片抗体检测试剂盒及其应用
Zhang et al. An isothermal molecular point of care testing for African swine fever virus using recombinase-aided amplification and lateral flow assay without the need to extract nucleic acids in blood
JP5198710B2 (ja) 免疫学的測定方法
CN108802368B (zh) 一种酶联免疫检测牛流产衣原体的试剂盒
CN102146445B (zh) 一种诊断马泰勒虫的检测试剂盒及制备与使用方法
Viswanathan Detection of phytoplasmas associated with grassy shoot disease of sugarcane by ELISA techniques/Nachweis von Phytoplasmen, die mit der „grassy shoof “-Krankheit an Zuckerrohr assoziiert sind, mit Hilfe von ELISA-Methoden
CN113501865A (zh) 一种非洲猪瘟病毒p32重组蛋白、及用于非洲猪瘟病毒间接elisa抗体检测的试剂盒
CN113533722A (zh) 一种用于非洲猪瘟病毒阻断elisa抗体检测的试剂盒及其检测方法、判定方法和用途
JP4298850B2 (ja) Ｃ型肝炎ウィルス（ｈｃｖ）検出方法
CN111896744B (zh) 一种羊棘球蚴抗体elisa检测试剂盒及其制备方法和应用
EP3240907B1 (en) Ultra-rapid detection of helicobacter pylori in gastric mucosal biopsies
CN106350597B (zh) 羊新疆巴贝斯虫未定种的诊断试剂盒及检测方法
CN106353496A (zh) 布鲁氏菌荧光偏振（fpa）检测试剂盒
CN111537736A (zh) 一种鸡毒支原体抗体的间接elisa检测试剂盒及检测方法
CN110346567A (zh) 小反刍兽疫病毒抗体检测试剂盒
JP2004525626A (ja) ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより歯周病原性細菌を検出するためのオリゴヌクレオチド・プローブ
CN114350852B (zh) 一种动物源活病毒定量检测方法
CN110579607A (zh) 一种fadv a病毒间接elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN112444626B (zh) 一种非洲猪瘟病毒抗体elisa检测试剂盒及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20211015

RJ01 Rejection of invention patent application after publication