KR101236203B1 - 구제역바이러스 ｓａｔ 2형 유전자재조합 단백질 항원, 단클론항체 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 구제역바이러스 SAT2형 유전자재조합 단백질과 단클론항체를 제작하고 이를 이용하여 구제역 SAT2형 항체를 검출하는 효소결합면역측정법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 진단항원으로서 기존의 불활화바이러스를 유전자재조합 단백질로 대체하여 일반실험실에서 안전하게 제작할 수 있는 형태의 진단항원을 개발하고 구제역바이러스 SAT2형에 대해서 중화역가를 보유한 단클론항체를 제작하여 구제역바이러스 SAT2형 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법을 제공함에 있다.
좀 더 상세하게는, 구제역바이러스 SAT2형 구조단백질에 해당하는 P1 유전자와 3C 단백분해효소 유전자를 하나의 발현벡터에 클로닝한 후에 곤충세포에서 발현하여 바이러스유사입자를 제작하고 중화 단클론항체는 바이러스의 중화 에피톱에 해당하는 펩타이드를 합성하여 마우스에 접종한 후 면역세포와 골수종유래 세포를 융합하여 제작하였다. 이렇게 만들어진 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 이용하여 새로운 형태의 효소결합면역측정법을 개발하였다.
본 발명의 진단방법은 일반실험실에서도 안전하게 생산할 수 있는 유전자재조합 단백질 진단항원을 이용한 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있으며 구제역바이러스 SAT2형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법을 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하다.

Description

구제역바이러스 ＳＡＴ 2형 유전자재조합 단백질 항원, 단클론항체 및 이를 이용한 진단방법 {Genetically engineered protein and monoclonal antibody of foot-and-mouth disease virus type SAT2 and their application to the diagnostic method}

본 발명은 진단항원으로서 기존의 불활화바이러스를 유전자재조합 단백질로 대체하여 일반실험실에서 안전하게 생산할 수 있는 형태의 항원을 개발하고 구제역바이러스 SAT2형에 대해서 특이적으로 결합하는 단클론항체를 선발하여 구제역바이러스 SAT2형 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법에 관한 것이다.

구제역은 소, 돼지, 양, 염소 등의 우제류 동물에 감염되는 매우 전염성이 높은 동물전염병이다. 일단 발생시에는 국제교역에 치명적인 영향을 미쳐서 상당한 경제적인 피해를 초래한다. 원인체는 구제역바이러스로서 8,500 염기쌍으로 구성된 단일가닥의 RNA를 함유하고 있으며 VP1, VP2, VP3, VP4 네 개의 단백질이 60개씩 모여서 바이러스 외피를 구성한다. 구제역은 7종의 혈청형으로 구분되는데 O형, A형, 아시아1형, C형, SAT(South African territories)1형, SAT2형, SAT3형이다.

구제역 검사에 있어서 확진검사로서는 항원검사가 필수적이나 항원검사시료가 없을 경우에는 혈청학적인 검사를 통해서 감염여부를 확인한다. 특히, 감염 후 숙주동물에서 형성되는 항체를 신속하게 검출하거나 백신접종후에 백신항체가를 정확하게 측정하려면 기존의 비구조단백질 항체검사법이 아닌 구조단백질 항체를 측정하는 검사법이 요구된다.

현재 구조단백질 항체를 검출하는 진단법으로서 국제수역사무국에서는 중화시험법을 표준진단법으로 권장하고 있으나 3일정도가 소요되고 고도의 생물안전차폐실험실에서 실시해야 하는 등 대량의 시료를 검사하기에는 어려움이 있어서 이를 극복하고자 효소결합면역측정법이 개발되었다. Hamblin 등(1986)은 불활화 구제역바이러스와 토끼 및 기니픽 다클론항체를 사용한 액상블로킹 방식(Liquid-phase blocking)의 효소결합면역측정법(LPB ELISA)을 개발하였으나 진단항원을 생산하려면 살이있는 바이러스를 취급해야하고 진단용 항체로서 다클론항체를 사용하기 때문에 생산시마다 항체역가의 차이가 발생하는 단점이 있다. 특히, 살아있는 바이러스를 취급하는 과정에서 바이러스의 유출로 인해서 구제역이 야외에 발생할 수 있는 위험성이 상존한다. Valarcher 등(2008)에 따르면 1987년과 1988년에 독일에서, 1993년에는 러시아에서 실험실내 구제역바이러스 유출로 인한 구제역 발생 예가 있었고, 2007년도 영국에서의 구제역 발생도 실험실에서 취급하던 구제역바이러스가 야외로 유출되어 발생한 예이다.

상기 종래기술에서 언급한 단점을 극복하고자 엄 등(2004)은 구제역바이러스 O형의 구조단백질전구체인 P1과 단백분해효소인 3C 유전자를 이용한 유전자재조합 단백질 항원을 제작하여 구제역 O형 항체진단법으로 적용하였다. 또한 고 등(2009)은 구제역 아시아1형에 대해서 동일한 전략으로 접근하여 유전자재조합 단백질 진단항원을 개발하였고 아시아1형 특이 단클론항체를 결합하여 아시아1형 특이 항체를 검출하는 진단기법 개발을 보고하였다.

다만, 구제역 7종의 혈청형중 아프리카에서 다발하는 SAT2형에 대해서는 아직까지 유전자재조합 진단항원을 이용한 항체진단기법이 소개된 예가 없다.

이에, 본 발명에서는 구제역바이러스 SAT2형 구조단백질전구체 P1과 3C 단백분해효소 유전자를 이용하여 배큘로바이러스 감염 곤충세포에서 진단항원의 인공발현을 시도하였다. 또한, 구제역바이러스 SAT2형에 특이적인 단클론항체를 경쟁반응용 항체로 제작하여 상기의 진단항원과 더불어 구제역 SAT2형 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법을 제공하고자 하였다.

보다 상세하게는, 구제역바이러스 SAT2형의 구조단백질전구체 P1 유전자와 3C 단백분해효소 유전자를 하나의 발현벡터에 클로닝한 후에 유전자재조합 배큘로바이러스 DNA를 제작하고 이를 곤충세포에서 발현하여 생성되는 단백질을 진단항원으로 사용하고 경쟁반응용 단클론항체는 바이러스의 중화 에피톱에 해당하는 펩타이드를 합성하여 마우스에 접종후 면역세포와 골수종유래 세포를 세포융합하여 제작하였다. 이렇게 만들어진 유전자재조합 단백질 진단항원과 단클론항체를 이용하여 경합방식의 새로운 형태의 효소결합면역측정법을 개발하였다.

본 발명의 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있으며 구제역바이러스 SAT2형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법과 기존의 LPB ELISA를 대체할 수 있는 신규 진단법으로서의 활용이 가능하다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 유전자재조합 방법으로 제작한 배큘로바이러스를 곤충세포에 감염시켜서 발현한 구제역바이러스 SAT2형 바이러스유사입자를 제공한다.

구제역바이러스 SAT2형에 특이적으로 결합하고 바이러스 중화역가를 보유한 단클론항체 2E42를 제공한다.

구제역바이러스 SAT2형 VP1 특이 펩타이드 부위를 마우스에 면역시키고, 이로부터 분리한 면역 B세포와 마우스 골수종유래세포간의 세포융합에 의해서 생산되어 구제역바이러스 SAT2형에 특이적으로 결합하는 단클론항체 2E42를 생산하는 융합세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00227)를 제공한다.

또한 상기 유전자재조합 단백질 진단항원과 단클론항체 2E42를 이용한 효소결합면역측정법으로, 검사혈청과 단클론항체 2E42간의 경합반응에 의하여 구제역바이러스 SAT2형 특이 항체를 검출하는 진단방법을 제공한다.

그 진단방법은 구체적으로

(a) 96웰 마이크로플레이트에 SAT2형 단클론항체 2B30 혹은 VP1 항혈청을 반응시키는 단계;

(b) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계;

(c) 진단항원으로서 구제역바이러스 SAT2형 유전자재조합 단백질을 반응시키는 단계;

(d) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단백질 항원을 세척하여 제거하는 단계;

(e) 검사혈청시료를 반응시키는 단계;

(f) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계;

(g) 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 SAT2형 특이 단클론항체를 경합적으로 반응시키는 단계;

(h) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; 및

(i) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청 중의 구제역바이러스 SAT2형 항체수준을 측정하는 단계; 로 구성될 수 있다.

본 발명에서는 구제역바이러스 아시아 1형의 구조단백질에 해당하는 P1 유전자와 3C 단백분해효소 부위의 유전자를 이용하여 제작한 진단항원과 경쟁반응용 단클론항체를 이용하여 새로운 형태의 효소결합면역측정법을 개발하였고 그 유효성을 평가한 결과 기존의 진단법과 대등한 결과를 나타내었다. 이와 같이 구제역 SAT2형 진단분야에 있어서 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체를 사용하여 기존의 불활화바이러스 진단항원과 항혈청을 사용한 진단법과 대등한 결과를 보여주었다는 것은 세계최초의 사례이다.

본 발명의 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있어서 간편하게 구제역바이러스 SAT2형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법이나 기존에 불활화바이러스를 사용하는 LPB ELISA를 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하다.

본 발명의 진단법은 기존 진단법과는 달리 생바이러스를 취급하지 않기 때문에 바이러스 취급에 따른 불의의 사고로 바이러스가 유출되어 질병이 발생할 수 있는 우려를 사전에 차단할 수 있다.

결과적으로 유전자재조합 단백질 진단항원을 이용함으로써 일반실험실에서도 손쉽게 구제역바이러스 SAT2형 진단항원을 생산할 수 있어서 긴급방역상황에서 신속한 진단액 공급이 가능하고 궁극적으로 구제역의 국내유입을 차단하여 국내 축산업의 보호에 기여할 수 있다.

도 1에서 (가)는 SAT2 유전자 P1과 3C를 클로닝 벡터에 삽입하여 제한효소로 절단한 그림이며 (나)는 전이벡터에 삽입하여 동일한 제한효소로 처리한 후의 그림이다. (다)는 최종적으로 유전자재조합 베큘로바이러스 유전자를 제작하여 PCR로 확인한 도면이다. (가)와 관련하여 Stratagene cloning vector (BamHI & SpeI) 아미노산 변경부위: A491V, Y164H; (나)와 관련하여 pFastBacDual vector (BamHI & SpeI); (다)와 관련하여 Recombinant bacmid (M13F(-40)/M13R)에 해당한다.
도 2는 형광항체법으로 비감염세포(가)와 유전자재조합 베큘로바이러스를 접종한 곤충세포(나)에서 SAT2 VP1 혈청으로 반응성 차이를 관찰한 도면이다. (가)와 관련하여 정상 Sf9 세포; (나) 유전자재조합 배큘로바이러스 접종 Sf9 세포에 해당한다.
도 3은 유전자재조합 P1과 3C를 곤충세포에서 발현한 후에 SAT2형 구제역바이러스 VP1, VP2, VP3 항혈청으로 단백질 발현여부를 확인한 도면이다. 1과 관련하여 유전자재조합 P13C 단백질; 2와 관련하여 불활화바이러스(LPB ELISA 진단항원)에 해당한다.
도 4는 좌측에서 염화세슘 농도구배(5-40%)로 초고속원심분리한 후에 원심분리튜브의 상층으로부터 0.5ml씩 취한 샘플에 대한 웨스턴블롯팅 분석한 결과이고 우측에서 7-11번 분획샘플을 모아서 초고속원심분리후 형성된 침전물에 대해서 전자현미경으로 관찰한 바이러스 유사입자 그림이다. 이때 빨간화살표는 온전한 형태의 25nm 크기바이러스 유사입자이고 검정색 화살표는 10nm 크기 펜타머 바이러스 유사입자이다. 좌측은 염화세슘 농도구배(5-40%)로 초고속원심분리한 후에 원심분리튜브의 상층으로부터 0.5ml씩 취한 샘플에 대한 웨스턴블롯팅 분석에 해당한다. 우측은 7번, 8번, 9번 샘플을 모아서 초고속원심분리후 형성된 침전물에 대해서 전자현미경으로 관찰한 바이러스 유사입자(빨간화살표는 온전한 형태의 25nm 크기의 바이러스 유사입자이고 검정색 화살표는 10nm 크기의 펜타머 바이러스 유사입자임)에 해당한다.
도 5는 기존 진단법인 LPB ELISA를 적용하여 본 발명의 유전자재조합 단백질 진단항원과 불활화바이러스간의 양성혈청과 음성혈청간의 반응성 차이를 관찰한 도면이다. 기존진단법인 LPB ELISA 키트에 포함된 대조혈청을 적용하여 유전자재조합 단백질 항원과 불활화바이러스 진단항원간의 반응성 비교한 것이다.
도 6은 형광항체법으로 정상 IBRS-2 세포(가)와 SAT2형 구제역바이러스를 접종한 IBRS-2 세포(나)에서 SAT2 단클론항체 2E42로 반응성 차이를 관찰한 도면이다. (가)는 정상 Sf9 세포에 해당한다. (나)는 SAT2(ZIM 5/81) 접종 IBRS-2 세포에 해당한다.
도 7은 본 발명의 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체 2E42를 결합하여 확립한 효소결합면역측정법으로 구제역 표준연구소인 영국 퍼브라이트연구소에서 입수한 표준혈청(강양성, 약양성, 컷오프, 음성혈청)에 대한 반응성 차이을 보여주는 도면이다.
도 8은 국내에서 사육중인 소, 돼지, 염소 각 88두를 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법으로 측정한 결과를 반응저해도(%) 분포도로 표시한 도면이다.
도 9는 SAT2형 구제역바이러스를 불활화하여 염소에 접종한 후에 일자별로 채채취한 혈청을 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법과 기존진단법인 LPB ELISA간의 초기항체 검출율을 비교한 결과이다.

본 발명은 구제역바이러스 SAT2형 유전자재조합 단백질 항원, 단클론항체 및 이를 이용한 우제류의 진단방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는 구제역바이러스 SAT2형 유전자재조합 단백질 및 SAT2형 단클론항체를 이용한 구제역 SAT2형 항체검출을 위한 효소결합면역측정법에 관한 것이다.

바람직하게는 상기 유전자재조합 단백질은 구제역바이러스 SAT2형 P1 유전자 및 3C 유전자를 함유한 베큘로바이러스를 이용하여 곤충세포에서 생산되는 단백질일 수 있다.

그리고 상기 단클론항체는 구제역바이러스 SAT2형 감염개체 또는 백신개체의 혈청내 항체와 경쟁반응을 하는 2E42일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 단클론항체를 생산하는 융합세포주에 관한 발명이다(기탁번호KCLRF-BP-00227).

또한 본 발명은

(a) 96웰 마이크로플레이트에 구제역바이러스 SAT2형 단클론항체 혹은 VP1 항혈청을 반응시키는 단계;

(b) 상기 플레이트에 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하는 단계;

(c) 진단항원으로서 구제역바이러스 SAT2형 유전자재조합 단백질을 반응시키는 단계;

(d) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단백질 항원을 세척하여 제거하는 단계;

(e) 검사혈청시료를 반응시키는 단계;

(f) 상기 플레이트에 부착되지 않은 검사혈청시료를 세척하여 제거하는 단계;

(g) 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 SAT2형 중화 단클론항체(2E42)를 경합적으로 반응시키는 단계;

(h) 상기 플레이트에 부착되지 않은 단클론항체를 세척하여 제거하는 단계; 및

(i) 효소반응에 의한 발색반응의 흡광도를 측정하여 검사혈청 중의 구제역바이러스 SAT2형 항체 수준을 측정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 구제역바이러스 SAT2형 항체 검출방법에 관한 것이다.

이하에서 도면에 대해 구체적으로 설명한다.

도 1에서 (가)는 SAT2 유전자 P1과 3C를 클로닝 벡터에 삽입하여 제한효소로 절단한 그림이며 (나)는 전이벡터에 삽입하여 동일한 제한효소로 처리한 후의 그림이다. (다)는 최종적으로 유전자재조합 베큘로바이러스 유전자를 제작하여 PCR로 확인한 그림이다.

도 2는 형광항체법으로 비감염세포(가)와 유전자재조합 베큘로바이러스를 접종한 곤충세포(나)에서 SAT2 VP1 혈청으로 반응성 차이를 관찰한 그림이다.

도 3은 유전자재조합 P1과 3C를 곤충세포에서 발현한 후에 SAT2형 구제역바이러스 VP1, VP2, VP3 항혈청으로 단백질 발현여부를 확인한 그림이다.

도 4는 좌측에서 염화세슘 농도구배(5-40%)로 초고속원심분리한 후에 원심분리튜브의 상층으로부터 0.5ml씩 취한 샘플에 대한 웨스턴블롯팅 분석한 결과이고 우측에서는 7-11번 분획샘플을 모아서 초고속원심분리후 형성된 침전물에 대해서 전자현미경으로 관찰한 바이러스 유사입자 그림이다. 이때 빨간화살표는 온전한 형태의 25nm 크기바이러스 유사입자이고 검정색 화살표는 10nm 크기 펜타머 바이러스 유사입자이다.

도 5는 기존 진단법인 LPB ELISA를 적용하여 본 발명의 유전자재조합 단백질 진단항원과 불활화바이러스간의 양성혈청과 음성혈청간의 반응성 차이를 관찰한 그림이다.

도 6은 형광항체법으로 정상 IBRS-2 세포(가)와 SAT2형 구제역바이러스를 접종한 IBRS-2 세포(나)에서 SAT2 단클론항체 2E42로 반응성 차이를 관찰한 그림이다.

도 7은 본 발명의 유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체 2E42를 결합하여 확립한 효소결합면역측정법으로 구제역 표준연구소인 영국 퍼브라이트연구소에서 입수한 표준혈청(강양성, 약양성, 컷오프, 음성혈청)에 대한 반응성 차이을 보여주는 도면이다. 컷오프 혈청의 반응저해도가 40%이었기 때문에 본 발명의 양음성판정기준은 반응저해도 40%로 결정하였다.

도 8은 국내에서 사육중인 소, 돼지, 염소 각 88두를 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법으로 측정한 결과를 반응저해도(%) 분포도로 표시한 도면이다. 돼지와 염소에서는 모두 반응저해도 40%이하의 값을 보여주었고 소 혈청에서만 2두에서 40%이상의 반응저해도를 나타내었다.

도 9는 SAT2형 구제역바이러스를 불활화하여 염소에 접종한 후에 일자별로 채채취한 혈청을 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법과 기존진단법인 LPB ELISA간의 초기항체 검출율을 비교한 결과로서 동등한 결과를 나타내었다.

이하에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명한다.

[실시예 1] 유전자재조합 구제역바이러스 SAT2형 단백질 발현

구제역바이러스 SAT2형(ZIM5/81; 유전자은행 호 EF134951)을 감염시킨 IBRS-2 세포에서 RNeasy extraction 키트(Qiagen사)를 사용하여 바이러스 RNA를 추출하였다. 상보적인 DNA는 Random hexamer와 AccuPower RT Premix (바이오니아)를 사용하여 제작하였고, cDNA를 주형으로 nPfu DNA polymerase (Enzynomics사)를 적용하여 유전자를 증폭하였다. P1 유전자의 순방향 프라이머는 5' GCA GGA TCC ATG GGA GCG GGA CAG TCA TCA GCA 3'이고 역방향 프라이머는 5' GCC ACT AGT TTA TTG TTT CTC GAC GCC AAT 3'이다 단백분해효소인 3C 유전자의 순방향 프라이머는 5' GAT TCT CGA GAT GAG CGG TGC CCC CCC GAC CGA C 3'이고 역방향 프라이머는 5' AAC AGC ATG CTA CTC ATG GTG TGG TTC AGG GTC 3'이다. 유전자 증폭기를 사용하여 상기의 프라이머에 대한 유전자를 증폭하였고 조건은 다음과 같다. 즉, 95에서 2분간 변성을 시키고 나서 9530초, 55 30초, 72 2분을 기본 사이클로 해서 35회 반복하였다. 마지막에는 72에서 10분간 연장증폭하였다. 그 결과는 도 1(가)에서와 같이 확인되었고 증폭한 유전자는 전이벡터인 pFastBacDual 벡터(Invitrogen사)에 삽입하였다. 이렇게 제작된 전이벡터는 도 1(나)와 같이 확인되었고 이 벡터를 배큘로바이러스 유전자 bacmid DNA를 함유하고 있는 대장균에 형질전환하여 유전자재조합 베큘로바이러스 핵산을 도 1(다)와 같이 확인하였다. 핵산 추출후 곤충세포(Sf9)에 주입하여 재조합배큘로바이러스를 제작하였다.

세포배양 플라스크에서 배양한 곤충세포에 재조합배큘로바이러스를 접종한 후에 세포변형이 관찰되면 냉동 및 융해를 3회반복하여 세포를 파쇄하고 10,000 x g 30분 원심분리하여 상층액을 취하여 진단항원으로 사용하였다.

단백질 발현여부를 확인하기 위하여 형광항체법을 실시하였다. 슬라이드에 구제역바이러스 SAT2형을 접종한 후에 세포변성이 관찰되면 인산완충용액으로 3회 세척후 건조하고나서 아세톤과 메탄올을 동량으로 혼합한 액으로 세포를 10분간 고정하였다. 이후에 인산완충용액으로 세척한 후에 SAT2 VP1 펩타이드 혈청으로 37에서 1시간 반응시켰다. 다시 인산완충용액으로 세척한 후에 FITC 결합된 항마우스 항체를 이차항체로 1시간동안 반응시켜서 형광여부를 관찰하였다. 그 결과, 도 2 (나)에서 보는 바와 같이 SAT2 VP1 펩타이드 항혈청을 이용한 형광항체법에서 양성반응성이 확인되었다.

재조합단백질이 성공적으로 발현되었음을 확인하였기 때문에 또 다른 확인방법으로서 웨스턴블롯팅을 적용하였다. 즉, 단백질 샘플을 Xcell SureLock mini-cell 장치 (Invitrogen사)를 이용하여 NuPAGE Novex Bis-Tris gels (Invitrogen사)에서 사용자 매뉴얼에 따라서 전기영동을 실시하였다. 분리된 단백질들을 nitrocellulose membrane에 전이하였고 샘플희석용액 [Tris-buffered saline containing 0.05% Tween 20 (TBST) & 5% skim milk] 으로 실온에서 1시간동안 블록킹한 후에 구제역바이러스 SAT2 VP1, VP2, VP3 항혈청을 사용하여 샘플희석용액으로 1:100 희석한 후에 1시간동안 반응시켰다. 세척액 (Tris-buffered saline containing 0.05% Tween 20) 으로 3회세척한 후에 alkaline phosphatase가 결합된 염소 항토끼 항체를 샘플희석용액으로 1:1,000 희석하여 첨가하였다. 실온에서 1시간동안 반응시킨 후에 세척액으로 5회 세척하였고, 발색은 BCIP/NBT 용액으로 실시하였다. 도 3과 같이 구조단백질전구체인 P1 밴드는 전혀 없고 VP1 밴드만 관찰되었기 때문에 3C 단백분해효소에 의해서 P1이 절단되었음을 확인하였다. 또한, VP2와 VP3 항혈청에서도 밴드를 확인하였기 때문에 SAT2 구조단백질이 발현되어 VP1, VP2, VP3 등 단위단백질로 절단되었음을 알 수 있었다. 발현단백질을 염화세슘 농도구배(5-40%)로 초고속원심분리(100,000×g, 6시간)한 후에 원심분리 튜브의 상층부부터 0.5ml씩 취한 샘플에 대해서 웨스턴블롯팅을 한 결과, 도 4와 같이 25nm 크기의 개별 단백질 60개로 이루어진 온전한 형태의 바이러스유사입자와 더불어 10nm 크기의 펜타머(pentamer, 개별 단백질 5개로 구성)바이러스 유사입자가 관찰되었다.

[실시예 2] 유전자재조합 단백질의 항원성 평가

유전자재조합 단백질의 진단항원으로서의 적합성을 평가하기위하여 기존 진단법인 LPB ELISA에 포함되어있는 대조혈청(강양성, 약양성, 음성혈청)을 사용하여 불활화바이러스 항원과 본 발명의 유전자재조합 단백질간의 항원성을 평가해 본 결과, 도 5에서와 같이 세가지 대조혈청에 대해서 유전자재조합 단백질은 불활화 구제역바이러스 SAT2형 항원과 동등한 양상의 반응성을 나타내었다.

[실시예 3] 구제역바이러스 SAT2형 단클론항체를 생산하는 융합세포주 제작

구제역바이러스 SAT2형 ZIM 5/81(유전자은행 번호 EF134951) 아미노산서열을 토대로하여 VP1 139번부터 162번 아미노산에 해당하는 부위의 펩타이드 (CTS TAI RGD RAV LAA KYA NAK HEL P)를 펩트론(대전, 대한민국)에서 제작하였다. 펩타이드 합성후에는 KLH에 결합하였고 이를 마우스에 4회 복강접종하였고 5회째 정맥주사한 후에 비장을 채취하여 세포융합에 사용하였다.

세포융합은 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 일반적인 방법으로 다음과 같이 실시하였다. 상기 채취한 림프구를 무혈청 배지(Serum Free Medium)로 세척한 후, 마우스 골수종 유래세포주(SP2/0-Ag14 mouse myeloma cell line)와 5:1 비율로 혼합한 후 폴리에틸렌글리콜 1500을 첨가하여 융합하였다. 융합이 완료된 세포는 증식배지[D-MEM, HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine), 10% 우태아혈청]에 적당히 희석한 후 미리 마우스 복강세포가 배양되어 있는 96웰 마이크로플레이트에 100 씩 분주하여 37, 5% 이산화탄소 배양기 내에서 배양하였다.

구제역바이러스 SAT2형에 대한 단클론항체를 생산하는 융합세포주의 선발은 다음과 같이 실시하였다. 상기 세포융합의 결과로 융합세포가 증식한 웰의 배양 상층액을 수거하여 펩타이드 항원을 이용한 간접 효소결합면역측정법을 실시하여 양성반응을 보이는 웰의 융합세포들을 마우스 복강세포가 배양된 96웰 플레이트에 웰당 0.8개의 세포가 포함되도록 첨가하고 단일클론(clone)이 형성될 때까지 배양하였다. 구제역바이러스 아시아1형에 대한 항체를 생산하면서 단 하나의 클론만이 증식하는 웰을 선발하였다. 이렇게 선발된 융합세포주를 발브씨 마우스의 복강에 접종하여 생성시킨 복수를 채취하여 IgG 항체만을 ImmunoPure IgG 정제 키트(Pierce, 미국)로 정제하여 실험에 사용하였다. 최종선발한 단클론항체인 2E42는 IgG1이고 도 6과 같이 형광항체법에서 바이러스 항원과의 반응성을 확인하였다.

[실시예 4] 유전자재조합 단백질 항원과 SAT2형 단클론항체를 이용한 효소결합면역측정법 확립 및 유효성 평가

유전자재조합 단백질 항원과 단클론항체 2E42를 이용하여 구제역바이러스 SAT2형 항체를 검출하기 위한 효소결합면역측정법은 다음과 같다.

96웰 마이크로플레이트에 SAT2형 항원을 포집할 수 있는 항체로서 또 다른 단클론항체 2B30 혹은 VP1 항혈청을 탄산완충용액(Carbonate buffer, pH 9.6)에 2200배 희석하여 96웰 마이크로플레이트(Maxisorp)에 웰당 50씩 분주하여 4에서 16시간 정치하였다. 이튿날, 코팅한 마이크로플레이트를 세척액[0.05% 트윈 20(Tween 20)이 함유된 10mM 인산완충용액(phosphate buffered buffer)]으로 3회 세척하여 부착되지 않은 항체를 세척하여 제거하고 나서 구제역바이러스 SAT2형 유전자재조합 단백질 항원을 블로킹용액(10mM 인산완충용액에 0.05% 트윈 20 및 5% 탈지유 첨가한 용액)으로 1:16으로 희석하여 웰당 50씩 분주한 다음 37에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 3회 세척하여 부착되지 않은 단백질 항원을 세척하여 제거하고 나서 검사혈청을 블로킹용액으로 1:5로 희석하여 웰당 50씩 분주한 다음 37에서 1시간 동안 반응시켰다. 세척액으로 다시 3회 세척하여 항원에 결합하지 않은 혈청내 항체를 제거한 후, 호스레디쉬 페록시다제 효소가 결합된 SAT2형 단클론항체인 2E42를 블로킹용액으로 2/ml 농도로 희석하여 웰당 50씩 분주한 다음 37에서 1시간동안 반응시켰다. 세척액으로 5회 세척하고 나서, 발색제로서 오피디(O-Phenylenediamine) 용액과 0.015% 과산화수소수를 첨가하여 15분 내외로 반응시켰다. 혈청이 배제된 대조군의 흡광도가 1.2 내외의 값을 보일 것으로 추정되는 시점에서 1.25N 황산용액을 50/well 첨가하여 발색반응을 정지시킨 다음, 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 최종결과는 혈청없이 단클론항체만을 첨가한 웰의 흡광도 대비 검사웰의 흡광도 억제도를 환산하여 분석하였다. 상기 반응의 결과판정에서 단클론항체 대조웰의 흡광도보다 50% 이상 반응이 저해된 웰, 즉 반응저해도(Percentage Inhibition, PI)가 50% 이상인 경우 구제역바이러스 SAT2형 항체 양성반응으로 판정하였다.

반응저해도 (%) = 100×[(대조웰 흡광도-검사혈청 흡광도)/대조웰 흡광도]

이때, 대조웰 흡광도는 혈청없이 단크론항체 2E42만 첨가된 웰의 흡광도이다.

[시험예 1] 국제표준혈청을 적용한 본 발명의 진단법 유효성 평가 및 양음성판정기준 설정

영국 퍼브라이트에서 확보한 SAT2형 표준혈청(강양성, 약양성, 컷오프, 음성혈청)에 대해서 본 발명의 진단법을 적용한 결과, 반응저해도 40%를 기준으로 정확하게 혈청을 구분할 수 있었다.

[시험예 2] 음성혈청을 이용한 특이도 평가

국내에서 사육중인 소, 돼지, 염소 각 88두를 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법으로 측정한 결과를 도 8에서와 같이 반응저해도(%) 분포도로 표시하였다. 돼지와 염소에서는 모두 반응저해도 40%이하의 값을 나타내었고 소 혈청에서만 2두에서 40%이상의 반응저해도를 나타내었다. 총 264두 중에서 2두에서만 양성반응을 보였기 때문에 99.2% 특이도를 보여주었다.

[시험예 3] 불활화바이러스 실험접종 염소혈청에 대한 진단법의 유효성 평가

본 발명의 진단법의 초기항체검출율을 평가하기위하여 염소에 SAT2형 불활화바이러스를 접종한 후에 일자별(0, 4, 7, 10, 14, 21, 28)로 채취한 혈청을 대상으로 본 발명의 효소결합면역측정법과 기존진단법인 LPB ELISA간의 초기항체 검출율을 비교한 결과, 접종후 7일째에는 4두중 2두에서 양성전위가 시작되어 10일째에는 4두모두 양성으로 판정되었다. 이는 기존진단법인 LPB ELISA와도 동일하였다.

이상에서 첨부된 도면을 참조한 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하였다. 그러나 이는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니고, 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물이 존재한다. 또한 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되고, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

구제역 7종의 혈청형 중 아프리카에서 다발하는 SAT2형에 대해서는 현재까지 유전자재조합 진단항원을 이용한 항체진단기법이 소개된 예가 없다.

이에, 본 발명에서는 구제역바이러스 SAT2형 구조단백질전구체 P1과 3C 단백분해효소 유전자를 이용하여 배큘로바이러스 감염 곤충세포에서 진단항원의 인공발현을 시도하였다. 또한, 구제역바이러스 SAT2형에 특이적인 단클론항체를 경쟁반응용 항체로 제작하여 상기의 진단항원과 더불어 구제역 SAT2형 항체를 신속하게 검출하는 새로운 진단방법을 제공하였으므로 산업상이용가능성이 우수하다.

또한 본 발명의 진단방법은 경합방식의 효소결합면역측정법으로서 소, 돼지, 염소 등 축종에 상관없이 동일한 방식으로 검사할 수 있어서 간편하게 구제역바이러스 SAT2형 감염여부를 판정하거나 백신접종시 백신항체역가를 신속하게 측정할 수 있기 때문에 표준검사법인 바이러스중화시험법이나 기존에 불활화바이러스를 사용하는 LPB ELISA를 대체할 수 있는 신규 진단법으로의 활용이 가능하다.

그러므로 본 발명의 진단법은 기존 진단법과는 달리 생바이러스를 취급하지 않기 때문에 바이러스 취급에 따른 불의의 사고로 바이러스가 유출되어 질병이 발생할 수 있는 우려를 사전에 차단할 수 있다. 결과적으로 유전자재조합 단백질 진단항원을 이용함으로써 일반실험실에서도 손쉽게 구제역바이러스 SAT2형 진단항원을 생산할 수 있어서 긴급방역상황에서 신속한 진단액 공급이 가능하고 궁극적으로 구제역의 국내유입을 차단하여 국내 축산업의 보호에 기여할 수 있다고 할 수 있으므로 산업상이용가능성이 매우 우수하다.

한국세포주연구재단 KCLRFBP00227 20100107

<110> Korea (National Veterinary Research and Quarantine Service) <120> Genetically engineered protein and monoclonal antibody of foot and mouth disease virus type SAT2 and their application to the diagnostic method for Artiodactyla <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of P1 gene <400> 1 gcaggatcca tgggagcggg acagtcatca gca 33 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of P1 gene <400> 2 gccactagtt tattgtttct cgacgccaat 30 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer of 3C gene <400> 3 gattctcgag atgagcggtg cccccccgac cgac 34 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer of 3C gene <400> 4 aacagcatgc tactcatggt gtggttcagg gtc 33

Claims (5)

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4. 구제역바이러스 SAT2형 유전자재조합 단백질 및 SAT2형 단클론항체를 이용한 구제역 SAT2형 항체검출을 위한 효소결합면역측정법에 있어, 상기 단클론항체를 생산하는 융합세포주(기탁번호 KCLRF-BP-00227).
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