RU2484478C1 - Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания - Google Patents
Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания Download PDFInfo
- Publication number
- RU2484478C1 RU2484478C1 RU2012119409/15A RU2012119409A RU2484478C1 RU 2484478 C1 RU2484478 C1 RU 2484478C1 RU 2012119409/15 A RU2012119409/15 A RU 2012119409/15A RU 2012119409 A RU2012119409 A RU 2012119409A RU 2484478 C1 RU2484478 C1 RU 2484478C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antibodies
- hantaan
- hemorrhagic fever
- kda
- hantavirus
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), и может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии. Способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках. Предлагаемый способ позволяет повысить эффективность и специфичность обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявить предикторы тяжелого течения заболевания. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к области медицины и касается диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС). Может быть использовано в клинической лабораторной диагностике, иммунологии.
Значительный прогресс в лабораторной диагностике ГЛПС наметился после внедрения различных вариантов иммуноферментного анализа с определением антител класса G и М. Эти методы позволяют определить общее количество антител без определения специфических антител к определенным компонентам хантавируса.
В настоящее время для серологической диагностики ГЛПС используется диагностикум производства ИПиВЭ (г.Москва), позволяющий обнаружить антитела класса G к вирусу ГЛПС уже на первой неделе с начала заболевания в реакции непрямой иммунофлуоресценции (1). Однако в данном случае для подтверждения диагноза необходимо протестировать вторую сыворотку, отобранную через 5-7 дней после первой.
Прототипом нашего изобретения является иммуноблот анализ, используемый для выявления антител к различным компонентам вирусов, свободно циркулирующих в сыворотке крови, с использованием в качестве твердой фазы нитроцеллюлозных мембран (НЦМ) (2).
Недостатком этого метода при диагностике геморрагической лихорадки является недостаточная специфичность.
Задачей изобретения является повышение эффективности обнаружения антител к антигенам хантавируса при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и выявление предикторов тяжелого течения заболевания.
Поставленная задача достигается тем, что способ включает электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, при этом антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия. При обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.
Способ осуществляется следующим образом.
Антигенный препарат хантавируса подвергают очистке и концентрированию при помощи изопикнического ультрацентрифугирования в 30% растворе калия бромида при 24000 об/мин в течение 20 часов при 20°С. После окончания центрифугирования содержимое отсасывают со дна пробирки при помощи перистальтического насоса через увикорд. Материал, содержащий максимальное поглощение при длине волны 280 нм, объединяют и проводят электрофоретическую разгонку в 5% растворе агарозы, содержащей 0,1% додецилсулфата натрия. Вырезают фрагменты агарозы, содержащие антиген, элюируют забуференным физраствором. Элюированный антиген подвергают диск-электрофорезу по Laemmli (3) для определения полипептидного состава антигенных препаратов хантавируса.
Электрофорез проводят при комнатной температуре при силе тока 7 мА/пластинка до внедрения белков в концентрирующий гель. Основной режим фракционирования - 30 мА/пластинка. Продолжительность электрофореза составляет 4-6 часов в зависимости от концентрации полиакриламидного геля (ПААГ).
Выявление белкового спектра после фракционирования антигенных препаратов в ПААГ проводят, как после переноса белков на мембранные фильтры, так и непосредственно после электрофореза.
Белки после фракционирования фиксируют в водном растворе, содержащем 40% спирта (этанола или изопропанола-2) и 7% уксусной кислоты в течение суток. Фиксированный гель дважды промывают по 30 минут в дистиллированной воде при постоянном покачивании и проводят окрашивание 0,04% кумаси G-250 в 3,5% растворе хлорной кислоты в течение полутора часов. Затем гель погружают в 5% водный раствор уксусной кислоты для избавления от избытка красителя до полного обесцвечивания фона.
Также проводят дополнительное окрашивание с помощью азотнокислого серебра для выявления полисахаридов и повышения чувствительности окрашивания белковых зон с целью снижения фонового окрашивания и придания полученным дискретам черного цвета. Для этого гель выдерживают 3-е суток в дистиллированной воде при комнатной температуре с ежедневной сменой, далее воду сливают, гель перемешивают в растворе формалина (0,15 мкл на 350 мл H2O), выдерживают 30 минут при 37°С, дважды промывают дистиллированной водой по 20 минут, погружают в свежеприготовленный окрашивающий раствор на 15 минут (4 мл 20% водного раствора AgNO3), титруют раствором, содержащим 7,5 мл 0,36% NaOH и 3 мл 10% NH4OH до полного исчезновения бурого осадка, объем раствора доводят до 100 мл дистиллированной водой, гель дважды промывают дистиллированной водой по 10 минут (350 мл на гель), погружают в проявляющий раствор, содержащий 2,5 мл 1% лимонной кислоты и 1 мл 37% раствора формалина. После появления черного окрашивания гель промывают два раза 5% раствором тиосульфата натрия. Окрашенный гель протоколируют при помощи оптического сканирования.
Для выявления антител класса IgG в сыворотке крови и в циркулирующих иммунных комплексах больных к хантавирусу инактивированный, лиофильно высушенный антигенный препарат хантавируса растворяют в лизирующей смеси, содержащей 1% додецилсульфата натрия и 2-меркаптоэтанола. Антигенный препарат кипятят 3 минуты в водяной бане и разгоняют в 12,5% полиакриламидном геле по Laemmli (3). По окончанию электрофореза гель выдерживают 30 минут в буфере для переноса (0,025М трис, 0,191М глицин, 20% метанол), собирают полусухой сендвич (semi-dry).
По окончанию электрофореза разделенный антигенный препарат переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,45 мкм (нм) в течение 45 минут при силе тока 100 мА. После окончания переноса антигена мембрану промывают последовательно дистиллированной водой, фосфатно-солевой буфер с твином (ФСБТ), блок раствором, ФСБТ и высушивают. Далее мембрана нарезается на стрипы шириной 2-3 мм, которые помещают в специальные лоты-ванночки. В лоты вносят 2 мл ФСБТ, выдерживают 5 минут и вносят сыворотку в разведении 1:50 - 1:100. Инкубируют на шейкере 2 часа при комнатной температуре, затем промывают ФСБТ 4 раза по 1 минуте. Далее вносят конъюгат против антител класса IgG человека, меченный щелочной фосфатазой, инкубируют 1 час на шейкере. Затем промывают 4 раза ФСБТ по 1 минуте, вносят субстратный раствор, содержащий бром-хлор-индол-фосфат нитросиний тетрозоль (BCIP-NBT) и инкубируют 30 минут. Далее промывают дистиллированной водой 3 раза, высушивают, окрашенные стрипы приклеивают на бумагу, сканируют и денситометрируют. Учет результатов иммуноблотинга проводят при помощи оптического сканирования в отраженном свете на сканере SHARP JX-330 «Pharmacia Biotech» (Швеция).
Далее выделяются ЦИК из сыворотки крови, для этого используют 7%-ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярным весом 6000, который обеспечивает выделение двух фракций: «быстро» (18 часов-ЦИК-1) и «медленно» (72 часа-ЦИК-2) - преципитирующих ЦИК. Для этого сыворотки крови смешивают в соотношении 1:1 с 7%-ным раствором ПЭГ. Далее смесь инкубируют при +6 - +2°С в течение 18 и 72 часов. Преципитат осаждают центрифугированием при 5000g в течение 20 минут и четырежды промывают десятикратным объемом 7%-ным раствором ПЭГ в 0,05М боратном буфере, рН 8,8. Далее препараты ЦИК диссоциируют температурным воздействием при +60°С в течение 3-х часов и проводят иммуноблот анализ для выявления антител класса IgG.
Нами проведены исследования динамики образования антител к хантавирусам и определение их диагностической значимости у больных ГЛПС при различных формах тяжести методом иммуноблот анализа.
Для выполнения поставленных задач было обследовано 226 больных ГЛПС. В зависимости от тяжести течения болезни все больные были разделены на 3 группы. Первую группу составили 24 человека с легким течением болезни, вторую группу - 105 человек со среднетяжелым течением и третью группу - 97 человек с тяжелым течением.
Результаты исследований частоты выявления спектра хантавирусных антител класса IgG у больных ГЛПС методом иммуноблот анализа представлены в таблице 1.
Результаты анализа на наличие серологических маркеров хантавируса у больных различными формами тяжести ГЛПС показали, что частота выявления антител класса IgG к поверхностным белкам (молекулярной массы 58 кДа и 72 кДа) в сыворотке крови и в составе ЦИК-1 у наблюдаемых больных была 100%, носила стабильный характер и не зависела от тяжести инфекционного процесса (табл.1).
Антитела к нуклеокапсидному белку 45 кДа не были обнаружены ни в одной из тестируемых сывороток, как в свободном виде, так и в составе ЦИК-1.
Анализ выявления специфического спектра антител в составе ЦИК-2 показал, что доминирует по частоте выявление антител к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа, 72 кДа. Тем не менее, каких-либо корреляционных взаимосвязей частоты обнаружения антител и тяжести инфекционного процесса выявлено не было.
Наименьшая частота индикации антихантавирусных антител в ЦИК-2 была к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа. Максимальная частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа наблюдалась у больных тяжелой формой заболевания, которая составила 100%, начиная с лихорадочного периода.
У больных легкой формой антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа в лихорадочном периоде не определялись, в олигурическом периоде - лишь у 46,1% больных, в полиурическом - у 73,2%. У больных среднетяжелой формой заболевания частота их обнаружения была выше - 37,2%, 66,6% и 78,2% соответственно. Частота выявления антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45кДа у больных тяжелой формой заболевания была достоверно выше частоты выявления антител у больных легкой и среднетяжелой формами заболевания (р<0,01).
В результате проведенного иммуноблот анализа в циркулирующих иммунных комплексах у больных ГЛПС на ранних сроках заболевания обнаруживаются антитела к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа только у больных тяжелой формой (100% случаев) и не обнаруживаются у больных с легким течением болезни.
Таким образом, выявление антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания позволяет диагностировать тяжелые формы болезни уже в самом начале болезни на ранних сроках.
Пример 1.
Больной К., 32 года. Диагноз: ГЛПС тяжелое течение. Поступил на 4-й день болезни с жалобами на лихорадку до 39 С°, головную боль, рвоту, нарушение зрения в виде «тумана» перед глазами, боли в поясничной области, снижение диуреза. В анализах крови: лейкоцитоз 15×109/л, тромбоцитопения, повышение мочевины - 25 ммоль/л, креатинин - 600 мкмоль/л.
Больному проводили исследование сыворотки на выявление антител класса IgG к хантавирусам в сыворотке крови и в составе циркулирующих иммунных комплексов.
Проводили электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса (фиг.1), определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, также антитела класса IgG определяли в циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.
В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1 выявили антитела класса IgG к поверхностным белкам молекулярной массой 58кДа и 72 кДа. В составе ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к белкам массой 45 кДа, 58 кДа и 72 кДа. Выявление антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Наличие антител в составе ЦИК-2 к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в ранние сроки заболевания свидетельствовали о тяжелом течении болезни.
Пример 2.
Больная Ф. 27 лет. Поступила на 3 день болезни с жалобами на повышение температуры до 38 С°, головную боль, слабость. Уменьшение диуреза не отмечала. В анализах крови лейкоцитов - 6×109/л, тромбоцитов 190 тыс в мкл, мочевина - 6 ммоль/л, креатинин - 110 мкмоль/л.
Проведено исследование сыворотки крови на наличие антихантавирусных антител в сыворотке крови и в ЦИК методом иммуноблот анализа.
В результате проведенного иммуноблот анализа в сыворотке крови в составе ЦИК-1, ЦИК-2 выявлены антитела класса IgG к поверхностным белкам с молекулярной массой 58 кДа и 72 кДа. Выявленние антихантавирусных антител подтверждает диагноз ГЛПС. Отсутствие в составе ЦИК-2 антител к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа свидетельствовало о легком течении болезни.
Список использованной литературы
1. Магазов Р.Ш. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (актуальные проблемы эпидемиологии, патогенеза, диагностики, лечения и профилактики) / Р.Ш.Магазов (под ред. Акад. АН РБ Магазова Р.Ш.). - Уфа, Изд-во «Гилем», 2006. - 250 с.
2. Иванов А.П. Система иммуноферментного анализа с использованием биотинилированных моноклональных антител для типирования антигенов хантавирусов / А.П.Иванов // Вопр. вирусол. - 1996. - №6. - С.236-265.
3. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the bacteriophage / U.K. Laemmli // - Nature. London. - 1970, T4. V.227, pp.680-685.
Claims (2)
1. Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом, включающий электрофоретическое определение полипептидного состава антигенного препарата хантавируса, определение антител к хантавирусу в сыворотке крови методом иммуноблот анализа, отличающийся тем, что антитела класса IgG определяют в циркулирующих иммунных комплексах с использованием антигенного препарата, подвергнутого очистке и концентрированию методом изопикнического ультрацентрифугирования в самоорганизующемся градиенте плотности бромида калия.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при обнаружении антител класса IgG к нуклеокапсидному белку с молекулярной массой 45 кДа в медленнопреципитирующих циркулирующих иммунных комплексах диагностируют тяжелые формы геморрагической лихорадки с почечным синдромом на ранних сроках.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012119409/15A RU2484478C1 (ru) | 2012-05-11 | 2012-05-11 | Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012119409/15A RU2484478C1 (ru) | 2012-05-11 | 2012-05-11 | Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2484478C1 true RU2484478C1 (ru) | 2013-06-10 |
Family
ID=48785823
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012119409/15A RU2484478C1 (ru) | 2012-05-11 | 2012-05-11 | Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2484478C1 (ru) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2180754C2 (ru) * | 2000-04-10 | 2002-03-20 | Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН | Способ получения диагностикума хантавирусов |
| US20110053140A1 (en) * | 2004-06-18 | 2011-03-03 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Methods and reagents for diagnosing hantavirus infection |
| RU2431148C1 (ru) * | 2010-05-05 | 2011-10-10 | Евгений Александрович Ткаченко | Способ получения "диагностикума геморрагической лихорадки с почечным синдромом культурального, поливалентного для непрямого метода иммунофлюоресценции" |
-
2012
- 2012-05-11 RU RU2012119409/15A patent/RU2484478C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2180754C2 (ru) * | 2000-04-10 | 2002-03-20 | Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии СО РАМН | Способ получения диагностикума хантавирусов |
| US20110053140A1 (en) * | 2004-06-18 | 2011-03-03 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Methods and reagents for diagnosing hantavirus infection |
| RU2431148C1 (ru) * | 2010-05-05 | 2011-10-10 | Евгений Александрович Ткаченко | Способ получения "диагностикума геморрагической лихорадки с почечным синдромом культурального, поливалентного для непрямого метода иммунофлюоресценции" |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| PARK S.M. et. al. A soluble and heat-resistant form of hantavirus nucleocapsid protein for the serodiagnosis of HFRS. // J Virol Methods. - 2008 Jan - V.147(1) - P.1-9. * |
| PARK S.M. et. al. A soluble and heat-resistant form of hantavirus nucleocapsid protein for the serodiagnosis of HFRS. // J Virol Methods. - 2008 Jan - V.147(1) - P.1-9. RABONI S.M. et. al. Hantavirus infection in Brazil: development and evaluation of an enzyme immunoassay and immunoblotting based on N recombinant protein. // Diagn Microbiol Infect Dis. - 2007 May - V.58(1) - P.89-97. SANDMANN S. et. al. Detection of human hantavirus infections in Lithuania. // Infection. - 2005 Apr - V.33(2) - P.66-72. * |
| RABONI S.M. et. al. Hantavirus infection in Brazil: development and evaluation of an enzyme immunoassay and immunoblotting based on N recombinant protein. // Diagn Microbiol Infect Dis. - 2007 May - V.58(1) - P.89-97. * |
| SANDMANN S. et. al. Detection of human hantavirus infections in Lithuania. // Infection. - 2005 Apr - V.33(2) - P.66-72. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bevanger et al. | Agglutinins and antibodies to Francisella tularensis outer membrane antigens in the early diagnosis of disease during an outbreak of tularemia | |
| Invernizzi et al. | Antinuclear antibodies in primary biliary cirrhosis | |
| Figueiredo et al. | Evaluation of an enzyme-linked immunosorbent assay based on Araraquara virus recombinant nucleocapsid protein | |
| CN105859843A (zh) | 呼吸道合胞病毒抗原制备方法及利用该抗原制备的呼吸道合胞病毒抗体的快速检测试剂盒 | |
| Huldt et al. | Echinococcosis in northern Scandinavia | |
| CN106596964B (zh) | 用于诊断蠕虫感染的新型测定 | |
| WO2012131394A1 (en) | Method for determining exposure to mycobacteria | |
| Tanner et al. | IMMUNOCHEMICAL STUDY OF THE ANTIGENS OF TRICHINELLA SPIRALIS: I. IDENTIFICATION AND ENUMERATION OF ANTIGENS | |
| RU2484478C1 (ru) | Способ обнаружения антител к хантавирусу при геморрагической лихорадке с почечным синдромом и прогнозирование тяжелых форм заболевания | |
| CN115057924B (zh) | 一种抗HPV病毒的特异性IgY抗体及其制备方法和用途 | |
| RU2314534C1 (ru) | Способ диагностики ревматических увеитов | |
| Dasgupta et al. | Lymphatic filariasis in man: demonstration of circulating antigens in Wuchereria bancrofti infection | |
| Simpson et al. | Comparison of immunodiffusion and enzyme linked immunosorbent assay in the detection of abnormal antibodies in pigeon breeder's disease. | |
| CN108893476A (zh) | 田鼠巴贝虫2d97抗原蛋白及其应用 | |
| JPH11500226A (ja) | 抗体産生の検出 | |
| Durojaiye et al. | Counter immunoelectroosmophoresis in the diagnosis of infectious bursal disease of poultry | |
| RU2410699C1 (ru) | Способ получения диагностикума эритроцитарного сибиреязвенного антигенного для обнаружения антител к протективному антигену | |
| JP2012239438A (ja) | バルトネラ・ヘンセラエ抗原の調製方法、および該方法により得られるバルトネラ・ヘンセラエ調製抗原 | |
| Harinath et al. | Field evaluation of ELISA using Wuchereria bancrofti mf ES antigen for bancroftian filariasis | |
| CN109371043A (zh) | 田鼠巴贝虫2d33、2d36抗原蛋白及其应用 | |
| RU2061957C1 (ru) | Способ ранней диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом | |
| RU2726484C1 (ru) | Способ диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки, иммуноферментная диагностическая тест-система для его осуществления | |
| RU2450276C1 (ru) | Способ дифференциальной диагностики увеитов при болезни бехтерева и ревматоидном артрите | |
| RU2754340C1 (ru) | Тест-система и способ дифференцированного выявления антител к SARS-CoV-2 | |
| RU2431675C1 (ru) | Способ получения антигенного препарата из mycobacterium tuberculosis с расширенным спектром серопозитивных фракций в реакции иммуноблотинга |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140512 |