CN109371043A - 田鼠巴贝虫2d33、2d36抗原蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开田鼠巴贝虫2D33和2D36抗原蛋白及其应用，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示，其编码基因序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示。本发明获得了田鼠巴贝虫的免疫反应谱，在特异性IgG抗体的蛋白芯片分析中，重组蛋白Bm2D33和Bm2D36均呈现出与急性阶段后鼠血清的免疫反应明显下降的效果，能够用于检测或诊断田鼠巴贝虫病从急性期转入慢性期的疾病转变进程。而且重组蛋白Bm2D33和Bm2D36在与恶性疟疾病人血清的交叉反应试验中表现出很高的特异性，特异性100％。

Description

田鼠巴贝虫2D33、2D36抗原蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及分子、细胞、蛋白质组学和免疫学研究领域，具体涉及田鼠巴贝虫免疫蛋白的制备和免疫 反应谱的获得，以及在候选诊断抗原和免疫保护疫苗筛选中的应用。

背景技术

巴贝虫病是由巴贝虫属原虫寄生在红细胞内所致的人畜共患的寄生虫病，通过蜱叮咬和输血进行传 播。从野生动物和家畜分离的巴贝虫有一百多种，其中有感染人的病例报道的主要包括：B.microti和相 关病原，B.divergens和相关病原,B.duncani和相关病原,B.venatorum。在2011年1月，巴贝虫病被列入国 家法定传染病。在美国，大多数巴贝虫病例都是田鼠巴贝虫引起的，有报道在1979年到2009年间，162例 输血相关的巴贝虫病例中有159份的病原体被鉴定是田鼠巴贝虫，田鼠巴贝虫是人类巴贝虫病的一个主要 病原体。人感染巴贝虫后的表现差异较大，在健康人中，大多呈现隐性感染；而在免疫缺陷病人中，如脾 切除，HIV患者，老人和孩子等则会病情严重甚至死亡。

目前，巴贝虫病的诊断方法包括：镜检血片，抗体检测和PCR检测及转接试验动物，但是，各检测方 法有相对的局限性。吉氏染色外周血涂片的油镜检查是巴贝虫病诊断的金标准，但通常情况下外周红细胞 感染百分比较低，而且形态与疟原虫属相似；PCR技术具有很高的敏感性和特异性，但不适用于低密度虫 血症和窗口期样本的检测；抗体的检测具有很高的敏感性，也适用于低密度的感染样本的检测，但是它同 样不能对窗口期的样本进行有效检测，而且在虫血症清除之后，抗体仍然会持续相当一段时间而呈现假阳 性。由于田鼠巴贝虫病的自限性和当前检测手段的局限性，在疾病筛查中非常容易被误诊或漏诊，以至造 成血制品的污染而形成疾病输血性传播。现有诊断抗原的缺陷在于，无法检测感染早期(窗口期)的样本， 也无法反应感染从急性期转入慢性期的疾病进程，比如目前文献报道中具有诊断效果的抗原BmSA1、BmP94、 BmIRA、BMN1-8、BM1542、Bm186等。

研究表明，抗体水平的检测对于隐性感染病例的筛查具有重要意义，在急性感染阶段，IgM抗体最先 产生并对寄生虫做出响应，而特定的IgG则与寄生虫数量的减少有关。然而，在巴贝虫病的感染进程中， 感染早期(窗口期)的样本不能有效检测，感染从急性期转入慢性期的过程中，抗原谱/免疫反应谱目前尚 不清楚，疾病进程得不到监测。通过免疫反应谱了解巴贝虫病的疾病进程，筛选能够反应疾病进程的标志 性抗原，对发展一种通量高，快速、敏感的田鼠巴贝虫诊断试剂以满足疾病检测和筛查的需求非常重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，针对目前田鼠巴贝虫病检测的局限性，提供一种或多种田鼠巴贝虫 的标志性抗原及其联合抗原，能够反应疾病从急性期转入慢性期的进程，能用作田鼠巴贝虫诊断试剂并具 有通量高、快速、准确的特点，可以满足疾病检测和筛查的需求。

本发明提供了一种分离的基因，可编码田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白，其序列如SEQID NO：3所示。

本发明提供一种田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白，由上述的分离的基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO： 4所示。

本发明提供了另一种分离的基因在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用，上述的一 种分离的基因可编码田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白，其序列如SEQ ID NO：3所示。所述的产品包括用于治 疗、预防的药物，用于检测、诊断的试剂条、试剂盒等。

本发明还提供了一种田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的 应用。尤其是用于检测或诊断田鼠巴贝虫病从急性期转入慢性期的进程。该田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白在 特异性IgG抗体反应中表现出与急性阶段后鼠血清免疫反应下降的特点，反应了从急性期转入慢性期的进 程。所述的田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白，由上述的分离的基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种抗体在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用，所述的抗体特异 性的结合上述的一种田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白。进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。

本发明还提供了一种试剂盒，含有上述的一种分离的基因、上述的田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白、或者 上述的抗体。

本发明提供了一种分离的基因，可编码田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白，其序列如SEQID NO：5所示。

本发明提供一种田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白，由上述的分离的基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO： 6所示。

本发明提供了另一种分离的基因在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用，上述的一 种分离的基因可编码田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白，其序列如SEQ ID NO：5所示。所述的产品包括用于治 疗、预防的药物，用于检测、诊断的试剂条、试剂盒等。

本发明还提供了一种田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的 应用。尤其是用于检测或诊断田鼠巴贝虫病从急性期转入慢性期的进程。该田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白在 特异性IgG抗体反应中表现出与急性阶段后鼠血清免疫反应下降的特点，反应了从急性期转入慢性期的进 程。所述的田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白，由上述的分离的基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

本发明还提供了一种抗体在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用，所述的抗体特异 性的结合上述的一种田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白。进一步的，所述的抗体为单克隆抗体。

本发明还提供了一种试剂盒，含有上述的一种分离的基因、上述的田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白、或者 上述的抗体。

本发明通过二维免疫印迹和质谱分析获得的87个田鼠巴贝虫蛋白，分割成128个田鼠巴贝虫ORFs基 因序列，运用融合克隆技术和麦胚无细胞蛋白表达系统对目的基因进行了克隆和表达，最后成功获得了87 个可溶蛋白。结合从田鼠巴贝虫cDNA文库筛选的重组蛋白Bm7，总计88个抗原通过蛋白芯片技术，与 正常小鼠血清和不同时期的感染后小鼠血清反应，获得了这些抗原的免疫反应谱，进而了解其在疾病进程 中的分布。

我们发现，在特异性IgG抗体反应中，筛选出了两个与急性阶段后鼠血清免疫反应下降的蛋白2D33 和2D36，可以用于反应田鼠巴贝虫病从急性期转入慢性期的疾病进程。利用该抗原蛋白2D33和2D36的 核苷酸序列，进行了大肠杆菌原核表达，成功得到了重组蛋白Bm2D33和Bm2D36，用田鼠巴贝虫感染的 鼠血清对该重组抗原进行评价，在特异性IgG抗体的蛋白芯片分析中，重组蛋白Bm2D33和Bm2D36均呈 现出与急性阶段后鼠血清的免疫反应明显下降的效果，能够用于检测或诊断田鼠巴贝虫病从急性期转入慢 性期的疾病转变进程。重组蛋白Bm2D33和Bm2D36在与恶性疟疾病人血清的交叉反应试验中表现出很高 的特异性，特异性100％。重组蛋白Bm2D33相比较于已报道的BmSA1(敏感性为0％)显示了较高的敏 感性，敏感性为62.5％。

本发明还提供一组田鼠巴贝虫的联合抗原蛋白，包括：

a)田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白、2D36抗原蛋白两者中的至少之一，其用作反应田鼠巴贝虫感染从急 性期转入慢性期的进程的诊断抗原

b)具有持续高免疫反应的田鼠巴贝虫抗原蛋白。

上述的一组田鼠巴贝虫抗原蛋白可以作为联合抗原，用于检测和诊断田鼠巴贝虫病，能反应感染从急 性期转入慢性期的疾病过程，并具有通量高、快速、敏感的优点，克服了现有诊断抗原的缺陷。其中，田 鼠巴贝虫2D33抗原蛋白和田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白在特异性IgG抗体反应中表现出与急性阶段后鼠血 清免疫反应下降的特点，反应了从急性期转入慢性期的进程。

进一步的，上述的具有持续高免疫反应的田鼠巴贝虫抗原蛋白选自田鼠巴贝虫抗原蛋白2D41和Bm7 中的至少一个。更进一步的，上述的具有持续高免疫反应的田鼠巴贝虫抗原蛋白为田鼠巴贝虫抗原蛋白 2D41和Bm7。通过对巴贝虫感染确诊病人的血清检测发现，与已报道的BmSA1比较，Bm2D33(或Bm2D36) 和Bm2D41、Bm7组成的联合抗原的检出率均为62.5％，更具有诊断价值。

本发明还提供了上述的一组田鼠巴贝虫的联合抗原蛋白或其重组蛋白在制备治疗、诊断或者预防田鼠 巴贝虫病的制剂中的应用，尤其是能够满足检测或诊断从急性期转入慢性期的进程，以及高通量的诊断或 检测。

本发明还提供了特异性的结合上述的一组田鼠巴贝虫的联合抗原蛋白的一组抗体在制备治疗、诊断或 者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用。

本发明还提供了一种试剂盒，含有上述的一组田鼠巴贝虫的联合抗原蛋白、或者上述的一组抗体。

本发明从田鼠巴贝虫感染的疾病进程入手，建立了田鼠巴贝虫感染小鼠实验动物模型，通过二维电泳 蛋白免疫印迹鉴定虫血症高峰期、抗体高峰期的反应抗原，利用麦胚无细胞体系表达候选抗原，制备高通 量的蛋白芯片获得免疫反应谱，最后再对筛选的诊断抗原和候选疫苗进行评价。本发明之前，还没有出现 涉及田鼠巴贝虫疾病进程中免疫反应谱的获得及应用的公开报道。

附图说明

图1为田鼠巴贝虫粗提蛋白的二维免疫印迹杂交图。

图2为In-Fusion克隆PCR扩增的引物设计。

图3为目的基因PCR扩增电泳图。

图4为部分重组质粒的菌落PCR鉴定电泳图。

图5为转膜装置安装示意图。

图6为无细胞表达蛋白的Western-blot分析图，其中，M表示蛋白Marker。

图7为田鼠巴贝虫蛋白在IgG抗体中免疫反应的蛋白芯片图，其中，A代表田鼠巴贝虫蛋白2D3～2D54， B代表田鼠巴贝虫蛋白2D55～2D128；a～j分别表示：0,3,7,14,21,30,60,120,150,270dpi的鼠血清；1 表示阳性对照，2表示阴性对照，其他框代表筛选的田鼠巴贝虫候选抗原。

图8为田鼠巴贝虫蛋白在特异性IgG抗体中免疫反应的热图分析图，其中，以芯片免疫反应的荧光信 号强度的中位值聚簇，荧光范围是0～2500。

图9为田鼠巴贝虫蛋白在IgM抗体中免疫反应的蛋白芯片图，其中，A代表田鼠巴贝虫蛋白2D3～2D54 和Bm7，B代表田鼠巴贝虫蛋白2D55～2D128和Bm7；a～j分别表示：0,3,7,14,21,30,60,120,150,270dpi 的鼠血清；1表示阳性对照，2表示阴性对照，其他框代表筛选的田鼠巴贝虫候选抗原。

图10为田鼠巴贝虫蛋白在特异性IgM抗体中免疫反应的热图分析图，其中，以芯片免疫反应的荧光 信号强度的中位值聚簇，荧光范围是0～2500。

图11为PCR扩增目的基因片段的电泳结果图，其中，M：DNA标志物，1：2D97，2：2D33，3：2D36， 4：2D41。

图12为重组蛋白Bm2D33、Bm2D36、Bm2D41、Bm2D97的表达和可溶性分析的电泳结果图，其中， M：蛋白质标志物，1：重组克隆未诱导全菌，2：重组克隆未诱导上清，3：重组克隆未诱导沉淀，4：重 组克隆诱导全菌，5：重组克隆诱导上清，6：重组克隆诱导沉淀。

图13为纯化后的重组蛋白Bm2D33、Bm2D36、Bm2D41、Bm2D97的电泳结果图，其中，M：蛋白 质标志物，1：重组克隆未诱导全菌，2重组克隆诱导全菌，3：纯化后的重组蛋白，4：切除融合标签后的 重组蛋白。

图14为田鼠巴贝虫感染的鼠血清对重组抗原Bm2D33、Bm2D36、Bm2D41、Bm2D97、Bm7的ELISA 评价结果。

图15为田鼠巴贝虫病人血清对各重组抗原以及组合抗原的ELISA评价，其中，A代表各重组抗原与 巴贝虫病人血清的ELISA反应，B代表组合抗原与巴贝虫病人血清的ELISA反应，n＝8。

图16为各重组抗原与疟疾病人血清的交叉反应结果，其中，A表示重组抗原与间日疟疾病人血清的 ELISA反应，B表示重组抗原与恶性疟疾病人血清的ELISA反应，n＝10。

图17为疟疾疫区200份现场发热病人样本的ELISA评估。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例， 而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获 得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1动物血清来源

1、实验动物与虫株

实验动物采用6～8周龄的BALB/c小鼠，购自中国科学院上海实验动物研究中心。

田鼠巴贝虫虫株为Babesia microtiPRA-99T，由中国医学科学院实验动物学研究所提供，本实 验接种传代液氮保存。

2、血清收集

将从液氮取出的含田鼠巴贝虫标准虫株的虫血平衡至室温，并用无菌的0.9％生理盐水按1:1的比例稀 释并混合均匀。用1ml无菌注射器吸取稀释后的虫血200μl，注射入BALB/c小鼠腹腔内，使田鼠巴贝虫 在小鼠体内复苏。通过镜检观察田鼠巴贝虫的病原体并计数，在虫血症达到高峰前(未出现溶血现象，红 细胞的感染率大约40％)，摘眼球采集全血至抗凝管中，收集染虫的抗凝全血。

同时采集正常BALB/c小鼠的抗凝全血，并以1:1比例与收集的感染抗凝全血混合，使虫血密度达到 20％，用生理盐水等比稀释后，各接种200μl到10只正常BALB/c小鼠的腹腔内。小鼠接种前记为0天 (0days post-infection，0dpi)，即正常小鼠，次日记为感染后1天(1dpi)，并开始观察记录。自1dpi开 始至30dpi，每天通过尾尖采血，以及下文中提到的每个尾静脉采血时间点采血，制作薄血片，观察田鼠 巴贝虫的病原体形态和记录红细胞的感染情况。在小鼠接种前一周(正常小鼠全血)和接种后的3天、7 天、14天、21天、30天、60天、120天、150天、270天分别尾静脉采集全血约200μl，1g/L浓度的肝 素钠与血液1：10混合抗凝。采集的尾静脉全血室温下离心，3500rpm，10min，分别收集血清，-20℃保 存备用。

实施例2田鼠巴贝虫粗蛋白的免疫印迹杂交和分析鉴定

田鼠巴贝虫虫株为Babesia microtiPRA-99T，由中国医学科学院实验动物学研究所提供。将田 鼠巴贝虫接种于BALB/c小鼠，抗凝取全血，分离红细胞，裂解、离心后收集沉淀，通过镜检确定为巴贝 虫虫体。通过免疫组学技术，如图1所示，将田鼠巴贝虫的粗蛋白分别与7dpi和30dpi的小鼠血清做免 疫印迹杂交，并通过质谱分析，鉴定了87个田鼠巴贝虫蛋白，其中包括8个被7dpi的小鼠血清鉴定的蛋 白。

实施例3田鼠巴贝虫抗原免疫反应谱的获得

1、实验材料与方法

1.1载体和菌株

大肠埃希菌(E.coli)DH5α购自北京天根生化科技有限公司。线性化载体pEU-E01-His-TEV-MCS-N2 (限制性内切酶酶切位点Xho I，BamH I)和田鼠巴贝虫基因组DNA由本实验保存提供。

1.2实验仪器与试剂

(1)主要仪器：

PCR仪；恒温金属浴；垂直层流洁净工作台；全温震荡培养箱；电热恒温培养箱；台式高速冷冻离心； 小型离心机；NanoDrop2000(超微量紫外/可见光分光光度计)；高压蒸汽灭菌锅；脱色摇床；恒温混匀器； 85-2型恒温磁力搅拌器；核酸电泳仪；蛋白电泳系统：BIO-RAD；凝胶成像仪：BIO-RAD；生物芯片点 样仪：PersonalArrayerTM16；生物芯片扫描仪。

(2)主要试剂与材料

PCR产物纯化：AxyPrep DNA clean-up Kit(Axygen，美国)；PCR产物切胶纯化：AxyPrep DNA凝胶 回收试剂盒(Axygen，美国)；In-Fusion克隆连接：In-FusionTMAdvantage PCR Cloning Kit(Clontech， 美国)；大肠杆菌培养：液态、固态LB培养基(自配)；氨苄青霉素粉末(储存液50mg/ml，Sigma，美 国)；菌落PCR：2×Taq PCR MasterMix(北京天根生物技术公司)；质粒抽提：AxyPrep质粒DNA小量 试剂盒(Axygen，美国)；DNase/RNase-Free Water(北京索莱宝科技有限公司)；麦胚无细胞蛋白表达： Wheat GermWEPRO7240H Expression Kit(CellFree Sciences，美国)；SDS-PAGE电泳：SDS-PAGE凝胶试剂盒(BIO-RAD，美国)；蛋白预染Marker(Thermo Scientific，立陶宛)；5×蛋白上样缓冲液(碧云天)； SDS-PAGE电泳缓冲液(碧云天)；R250考马斯亮蓝染液(按常规方法自配)；脱色液(按常规方法自配)；Western blot：硝酸纤维膜(NC膜，PALL，美国)；转膜液(碧云天)；BSA(Sigma，美国)；Penta-His Antibody (BSA free，Qiagen，德国)；HRP goatanti-mouse IgG(Sigma，美国)；30％过氧化氢(上海凌峰化学试剂 有限公司)；DAB(Sigma，美国)；蛋白芯片：蛋白芯片点样上样液(北京博奥晶典生物有限公司)；晶芯 围杂交湿盒等材料(北京博奥晶典生物有限公司)；晶芯微阵列光学级环氧基片(北京博奥晶典生物有限 公司)；BSA(Sigma，美国)；Alexa Fluor 546goat anti-mouse IgM(μ-chain)(Invitrogen，美国)；Alexa Fluor 546 goat anti-human IgG(H+L)(Invitrogen，美国)。

1.3实验方法

1.3.1设计引物

将田鼠巴贝虫免疫相关蛋白用SMART分析，根据序列所包含的ORF，将实施例2鉴定的87个蛋白 分割成128个基因片段(2D1～128)。采用In-Fusion克隆技术进行无缝克隆，引物设计如图2所示，在基 因特异的正向引物5′端加pEU-F：5′-GGGCGGATATCTCGAG-3′序列，在基因特异的反向引物的5′ 端加pEU-R：5′-GCGGTACCCGGGATCC-3′序列。田鼠巴贝虫基因特异的引物设计使用软件 PrimerPremier5.0。n-Fusion克隆目的基因信息和引物序列如表1所示

表1 128个基因片段(2D1～128)基因信息和引物序列

1.3.2目的序列的扩增

PCR扩增的反应体系和反应条件如表2，表3所示：

表2目的片段PCR扩增的反应体系

表3目的片段PCR扩增的反应条件

注：*表示退火温度可根据不同基因片段的引物TM值不同进行优化

对以上获得的PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶电泳进行片段大小鉴定，将有正确目的条带的产物送至 华大基因进行测序。如果含有杂带，需进行割胶纯化后，再送测序。

PCR扩增的128个田鼠巴贝虫基因，最终成功获得了113个目的基因的DNA产物，其中包括9个被 7dpi鼠血清鉴定的基因片段，扩增率为88.3％，电泳结果如图3所示。

1.3.3In-Fusion克隆

重组质粒构建和阳性克隆的筛选，步骤如下：(1)将5μl PCR产物加入2μlClonging Enhancer溶液中， 混匀后放入PCR仪中，37℃反应15min，再80℃反应15min；(2)In-Fusion克隆的连接反应体系如表4 所示，混匀后放入PCR仪中进行连接反应，条件为50℃连接15min；(3)将连接产物置于冰上，热激转 化法并将产物全部转入感受态细胞DH5α中，37℃氨苄抗性LB固体培养基上培养16～18h；(4)在每个 平板上分散挑取4个单菌落，分别溶于10μl无抗性的LB液体培养基中，取2μl该菌液作为菌落PCR的 模板，菌落PCR的反应体系和反应条件如表5、表6所示；(5)用1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴 定，将条带大小正确的菌落所对应的菌液(每个基因尽量挑选两个以上正确克隆)转接入3ml的氨苄抗性LB培养基中，37℃震荡培养16～18h；(6)每个菌落的培养液各吸取1ml，送华大基因测序；剩余菌液取 500μl加500μl 50％甘油保种，-80℃保存备用；(7)对测序正确的重组质粒，通过保存的菌种接种，进行 扩大培养并提取质粒。由于下一步的麦胚无细胞蛋白表达体系要求重组质粒浓度需达到150ng/μl以上，所 以本研究每个重组质粒做两个平行的菌液培养。质粒抽提过程详见Axygen质粒DNA小量提取试剂盒操作 手册。(8)使用NanoDrop2000对提取的质粒浓度进行测定，做好记录，并保存于-80℃备用。

表4 In-fusion克隆连接反应体系

表5菌落PCR反应体系

表6菌落PCR扩增的反应条件

通过In-Fusion克隆技术，最终成功构建了109个序列正确的重组质粒，包括9个(克隆率100％)被 7dpi鼠血清鉴定的基因片段，总克隆率达到96.5％。部分重组质粒的菌落PCR鉴定结果如图4所示。

1.3.4无细胞表达

参照Wheat Germ WEPRO7240H Expression Kit的使用说明，对构建成功的目的基因进行体外转录和翻 译表达，操作步骤如下：(1)进行体外转录，转录反应的体系如表7所示，混匀后PCR仪内反应，条件为 37℃转录6h；(2)翻译表达体系的配制，体系如表8所示；(3)将206μl 1×SUB-Amix×SGC加入96孔 板中，再把配好的翻译反应体系缓慢地加入至板孔底部，保持分层状态，置于恒温金属浴中，15℃反应20h； (4)将翻译产物混匀后转移到PCR管中，-80℃保存备用。

表7体外转录反应体系

表8体外翻译反应体系

通过使用麦胚无细胞蛋白表达系统的体外转录和翻译，111个重组质粒(包括两个全基因合成的序列) 共成功表达蛋白87个，其中包括7个被7dpi鼠血清鉴定的基因片段所表达的蛋白。

1.3.5蛋白免疫印迹分析

对目的基因的无细胞表达情况，本实验采用蛋白免疫印迹(Western-blot)技术进行分析，操作如下： (1)SDS-PAGE凝胶的配制：本实验使用的SDS-PAGE凝胶是使用BIO-RAD公司生产的聚丙烯酰胺凝胶 预混试剂，配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，凝胶凝固后放于4℃保存备用；(2)上样样品制备：取12μl 无细胞表达的蛋白产物，加入3μl 5×蛋白缓冲上样液，充分混匀，沸水浴煮5～10min；(3)蛋白电泳： 制备好的样品和蛋白Marker各取10μl上样，80V电泳30min，再120V电泳60min；(4)转膜，操作如 下：1)将裁减合适的NC膜置于甲醇中激活30～60s，然后和滤纸一起转移至转膜液中浸泡；2)将凝胶、 NC膜、滤纸按图5所示排放(黑色一侧为负极，白色一侧为正极)，加紧固定接入电泳槽，加满转膜液后 接通电泳，在冰浴条件下，220mA转膜90min；3)封闭：取出NC膜，放入孵育盒，经清水漂洗后，用 3％BSA(PBS稀释)4℃封闭过夜；4)洗涤：倒掉封闭液，NC膜用PBST漂洗3次，每次5min；5)一 抗孵育：将Penta-His抗体用PBS按1∶2000的比例稀释，置于摇床上室温孵育1h；6)洗涤：倒掉一抗 孵育液，NC膜用PBST漂洗3次，每次5min；7)二抗孵育：将HRP标记的羊抗鼠抗体用PBS按1∶4000 的比例稀释，置于摇床上室温孵育1h；8)洗涤：倒掉二抗孵育液，NC膜用PBST漂洗3次，每次5min； 9)显色：按DAB∶PBS∶30％H₂O₂＝2mg∶3ml∶0.9μl的比例配制显色液，经孵育后的NC膜浸泡于显 色液中(显色时注意避光)，待出现目的条带时立即漂洗来终止反应，并用滤纸将NC膜吸干；10)拍照记 录，并将显示后的NC膜用滤纸包裹4℃保存。

蛋白的免疫印迹分析结果如图6所示，其中有几个由该系统表达的蛋白电泳时发生了迁移。田鼠巴贝 虫基因片段的高通量克隆和表达结果总结如表9所示：

表9田鼠巴贝虫基因片段的高通量克隆和表达

1.3.6蛋白芯片的制备和免疫杂交得到免疫反应谱

本实验以光学级环氧基片为载体，将以上实验获中获得的麦胚无细胞表达蛋白(2D3～2D128)和本实 验室之前从cDNA文库中筛选的Bm7(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)，通过使用芯片点样仪进行蛋白 样品的点样。实验以BmSA1作为阳性蛋白对照，以无质粒的麦胚无细胞翻译体系和PBST作为阴性控制 组，芯片制备的具体操作如下：(1)样品制备：取蛋白芯片点样上样液与表达蛋白液各6μl混匀，吸取10 μl加至384孔板中，离心后置于冰上备用；(2)仪器准备：擦洗点样仪的超声池和工作台面，并在超声池 内加ddH₂O至刻度线；加湿器用ddH₂O将加至刻度线；倒掉废液瓶内的废液，注满清洗瓶内的ddH₂O； 启动仪器和相应的操作软件，完成模式匹配和自检；(3)围栏粘贴：实验选用2×6孔(9cm×9cm) 围栏，使用围栏粘贴和压紧工具，将围栏黏贴于环氧基片上，置于芯片样仪点样区内，准备点样；(4)参 数设置：标定384孔板的初始位置后，依次设置针架、玻片、预点样玻片、点阵、样品、清洗等参数；本 实验设置10×10的蛋白矩阵，每个蛋白样本重复点样2次，每个蛋白点样10个矩阵；(5)点样和保存： 确认各项工作是否准备就绪，点击“开始”进行点样；点样完成的玻片可进行下一步杂交实验或密封于湿 盒内4℃保存备用；注意：点样后的玻片应静置半小时以上，使蛋白充分与玻片结合。

蛋白芯片的免疫杂交首先需要优化血清和荧光二抗的稀释度，确定最佳的反应体系，杂交实验具体过 程如下:(1)封闭：在以上制备的蛋白芯片的每个矩阵的围栏内加入50μl 3％BSA(PBS稀释)，置于杂 交湿盒中，4℃封闭过夜；在清洗前，将杂交湿盒放入37℃恒温箱再封闭1h；(2)清洗：甩干芯片上的 封闭液，置于去离子水中冲洗一次，再用PBST摇床震荡洗涤3次，每次5min，1000g离心3min甩干； (3)孵育一抗：将感染田鼠巴贝虫后不同时期的10只混合小鼠血清(0、3、7、14、21、30、60、120、 150、270dpi)按1∶100的比例用PBST进行稀释并混匀，分别取50μl依次加入到每个蛋白矩阵内，置 于杂交湿盒中，37℃反应1h；(4)清洗：清洗操作同步骤(2)；(5)孵育二抗：将Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG或Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgM抗体按1∶200用PBST进行稀释混匀，取50μl加入每个蛋白矩阵内，置于杂交湿盒中，37℃反应1h(加入二抗后，操作注意避光)；(6)清洗：清洗操作 同步骤(2)；(7)扫描：将杂交后的蛋白芯片放置于芯片扫描仪中，设置ScanArrayExpress software version 4.0(PerkinElmer)的适当参数，选择λ＝532nm的波长进行芯片扫描。保存图片并读取数据；(8)数据分析： 以扣除背景后待检测样本的荧光强度均值与扣除背景后阴性样本的荧光强度均值的比值≥2作为阳性样本 参考。使用Multi-arrayexperiment viewer(MeV)软件进行蛋白芯片的热图绘制和分析；通过蛋白芯片杂交 的获得的每个蛋白的免疫反应谱，通过R语言(www.r-project.org/)进行层次聚类，距离算法和聚类方法分 别采用欧氏距离和ward.D2法。

在特异性IgG抗体反应中，大多数田鼠巴贝虫蛋白与0，3，7dpi的鼠血清都呈现非常弱的免疫反应 (图7:a～c)，而与14～150dpi的鼠血清则呈现很高的免疫反应(图7:d～i)，在270dpi时免疫反应程度有 所下降(图7:j)。每个蛋白的特异性IgG抗体免疫反应谱如图8所示，通过R语言分析和hclust功能聚簇， 88个蛋白共被分为4组，分别为Group1(11个蛋白)，Group2(47个蛋白),Group3(29个蛋白)和Group4 (仅1个纯化的原核表达的重组蛋白)，分别代表高、中等、较低和极高免疫反应组。结合蛋白的免疫反 应谱和分组情况，分别从四组中筛选出与14dpi～270dpi的鼠血清有持续高免疫反应的4个蛋白2D5、2D29、 2D41(氨基酸序列如SEQ ID NO.8)和Bm7。此外，还从Group3中筛选出两个与急性阶段后鼠血清免疫 反应显著下降的蛋白2D33(氨基酸序列如SEQ ID NO.4)和2D36(氨基酸序列如SEQ IDNO.6)。

在特异性IgM抗体反应中，大多数田鼠巴贝虫蛋白除了与14，21，30dpi的鼠血清呈现较强的的免 疫反应外(图9:d～f)，而与其他时期的鼠血清则都呈现很低的免疫反应。每个蛋白的特异性IgM免疫反应 谱如图10所示，通过R语言分析和hclust功能聚簇，88个蛋白共被分为4组，分别为Group1(19个蛋 白)，Group2(50个蛋白),Group3(18个蛋白)和Group4(1个重组蛋白)。根据免疫反应谱，前三组 之间并没有表现出不同，仅仅有一个筛选自Group3的蛋白2D97(氨基酸序列如SEQ ID NO.2)与早期的 3dpi和7dpi的鼠血清呈现较高的免疫反应，该蛋白可以作为早期诊断抗原的候选。

实施例4田鼠巴贝虫候选生物标记2D33，2D36，2D41，2D97的原核表达、纯化和评价

1实验材料与方法

1.1质粒、菌株

大肠埃希菌(E.coli)DH5α、BL21(ED3)均购自北京天根生化科技有限公司。质粒pET21a、pET28a、 pET42a均由本实验室保存提供，质粒pSmart1购自常州天地人和生物有限公司。

1.2样本收集和伦理声明

8份田鼠巴贝虫病人血清样本由复旦大学基础医学院程训佳老师课题组提供。间日疟和恶性疟病人血 清样本各10份由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所陈军虎老师提供。实验还从疟疾疫区腾冲现 场收集了200份发热病人样本，通过吉姆萨染色镜检样本的病原体，均为阴性；通过核酸检测，发现间日 疟阳性样本14个，恶性疟阳性4个，其中包含一例共感染。来自苏州医学院的正常人血清样本作为阴性 对照。血液样本的采集由中国疾病预防控制中心国家寄生虫病预防控制所的科研伦理委员会批准。所有参 与提供样本的个体都签署了知情同意书，并对收集样本的用途、潜在风险、和利益给出了说明。

1.3实验仪器与试剂

(1)主要仪器

PCR仪；垂直层流洁净工作台；全温震荡培养箱；电热恒温培养箱；台式高速冷冻离心；小型离心机； NanoDrop2000(超微量紫外/可见光分光光度计)；高压蒸汽灭菌锅；核酸电泳仪；蛋白电泳系统；凝胶成像 仪；超声破碎仪；蛋白层析纯化系统；酶标仪。

(2)主要试剂与材料

PCR产物纯化：AxyPrep DNA clean-up Kit(Axygen，美国)；BamH1、Xho1限制性内切酶和Buffer3， NEB，美国；无缝克隆：In-Fusion HD Cloning Kits(Clontech，美国)；大肠杆菌培养：液态、固态LB培 养基Nacl 10g，Tryptone 10g，Yeast Extract 5g，(Agar15g)加去离子水定容至1L。氨苄青霉素粉末(储 存液50mg/ml，Sigma，美国)；卡那霉素抗生素粉末(储存液10mg/ml，Sigma，美国)；菌落PCR：2× Taq PCR MasterMix(北京天根生物技术公司)；质粒抽提：AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen，美 国)；IPTG粉末(储存液1mol/L,Sigma,美国)；PMSF粉末(储存液1mol/L,Sigma,美国)；包涵体蛋白纯 化：PAGE胶蛋白微量回收试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；GST纯化系统：1ml GSTrap HP 纯化柱，GE公司，瑞典；Buffer A:PBS pH7.4；Buffer B:(洗脱液):1mMDTT,10mM GlutathionepH7.4； Ni柱纯化系统：5ml HisTrap FF纯化柱，GE公司，瑞典；Buffer A:20mM Tris,50mMNaCl,pH 8.0；Buffer B(洗脱液):20mM Tris,50mM NaCl,500mM imidazole,pH 8.0；蛋白标签切除：SUMO蛋白酶试剂(上 海索莱宝生物科技有限公司)；His蛋白纯化介质填料，GE公司，瑞典；蛋白浓度测定：Branford试剂盒 (北京天根生物有限公司)；ELISA实验：HRP goatanti-mouse IgG(Sigma，美国)；HRP goat anti-mouse IgM (Sigma，美国)；HRP goatanti-human IgG(Sigma，美国)；HRP goat anti-human IgM(Sigma，美国)；免 疫保护性试验：Freund's complete adjuvant(Sigma Aldrich,美国)；Freund's incompleteadjuvant(Sigma Aldrich, 美国)。

1.4实验方法

1.4.1引物设计与合成

根据筛选的生物标记蛋白2D97，2D33，2D36，2D41的核酸序列(核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、 3、5、7)，用PREMIER 5.0软件分别为蛋白的原核表达设计特异性引物。所用载体分别为pET42a、pET21a、 pSmart1、pET28a，限制性内切酶切位点均选用BamH1和Xho1。实验利用无缝克隆技术，在特异性引物 的5′端分别引入载体序列：F：5′-GGGATATCGGGGATCC和R：5′-GGTGGTGGTGCTCGAG，引物 序列如表10所示。引物由华大基因公司合成。

表10田鼠巴贝虫重组克隆的引物序列

注：下划线斜体部分为酶切位点序列

1.4.2原核表达载体的构建

目的基因的扩增分别以稀释100倍的含目的基因的pEU-E01重组质粒为模板，进行PCR扩增，反应 体系和反应条件如表2，表3所示。同时用限制性内切酶Xho1和BamH1将载体质粒进行双酶切处理，双 酶切体系如表11所示，反应条件为37℃过夜。用1％琼脂糖凝胶对PCR产物和酶切产物进行电泳鉴定。 若产物条带单一，可直接用PCR清洁试剂盒对产物进行纯化；若产物含有杂带，则需对目标条带进行切胶 纯化。

表11双酶切的酶切反应体系

连接反应体系见表12。将反应物混合后，37℃反应15min，再50℃反应15min，完成载体和目的 基因的连接。将连接产物全部转入感受态细胞E.coliDH5α中，在相应抗性的LB固态培养基上培养16～1 8h。菌落PCR鉴定使用通用引物T7promoter primer:5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和T7Termina tor Primer:5’-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。筛选的阳性克隆经相应抗性的液体LB培养基培养后，提 取质粒并送至华大基因测序。菌落PCR的反应体系和反应条件如表5,6所示。

表12连接反应体系

以含2D97、2D33、2D36、2D41基因片段的pEU-E01重组质粒为模板，进行PCR反应，电泳检测结 果显示，扩增的目的片段大小与理论相符，分别约为984、432、519和687bp，如图11所示，其中，M 表示DNA标志物，1表示2D97，2表示2D33，3表示2D36，4表示2D41。成功扩增的目的片段经纯化 后，分别连接到酶切后的载体pET42a、pET21a、pSmart1、pET28a，重组质粒经阳性克隆筛选和测序鉴定 与目的基因序列一致，成功构建了重组质粒。

1.4.3重组蛋白诱导表达和可溶性分析

将成功构建的重组质粒Bm2D97、Bm2D33、Bm2D36、Bm2D41分别转化到E.coliBL21(DE3)感 受态细胞中，挑取单克隆菌落于相应抗性LB培养基中培养，37℃条件下220rpm震荡培养过夜。取500μl 的培养菌液加入500μl 50％的灭菌甘油中，混匀后置于-80℃中保存菌种。再将培养过夜的菌液按5％的接 种量转接到2管相应抗性的培养基中震荡培养3～4h(吸光度A600值达到0.6～0.8)，分别取其中一管用终浓 度为0.1mmol/L(Bm2D33)和1mmol/L(Bm2D36，Bm2D41，Bm2D97)的IPTG进行诱导，另一管作为 对照组不诱导，37℃条件下培养4h。诱导表达后，各取1ml菌液12000rpm离心1min，弃上清，收集 菌体。用PBS将菌体重悬，在200w，3s开，5s关的条件下，用超声仪超声20次。分别留取40μl超声 后全液，剩余全液12000rpm离心1min，分离上清和沉淀，并将沉淀用960μl的PBS再次重悬。分别取 全液、上清和沉淀各40μl加入到10μl 5×蛋白上样缓冲液中，沸水浴中煮样品10min，制备蛋白上样液。 通过12％的SDS-PAGE对蛋白的表达及其可溶性进行分析。电泳条件如前所述，电泳结束后，用考马斯 亮蓝溶液染色1h，再用脱色液脱色至可见清晰的蛋白条带，拍照保存电泳图。

4个重组质粒分别转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞表达后，经终浓度1mmol/LIPTG诱导，2D97、 2D36基因获得包涵体表达，2D41基因获得可溶性表达，蛋白分子量分别为38KDa(表观分子量为55KDa)、 19KDa和39KDa(含SUMO-tag 13KDa,表观分子量为20KDa)；经终浓度0.1mmol/L IPTG诱导， 2D33(GST-tag 26kDa)基因获得可溶性表达，蛋白分子量为42KDa；4个重组蛋白分别被命名为Bm2D97、 Bm2D36、Bm2D41和Bm2D33，它们的氨基酸序列分别与2D97、2D36、2D41和2D33一致。SDS-PAGE 电泳分析结果如图所示(如图12)。图12中，M表示蛋白质标志物，1表示重组克隆未诱导全菌，2表示 重组克隆未诱导上清，3表示重组克隆未诱导沉淀，4表示重组克隆诱导全菌，5表示重组克隆诱导上清，6表示重组克隆诱导沉淀。

1.4.4重组蛋白的纯化

(1)重组蛋白的大量表达：1)菌株复苏：将确定可诱导表达的保存菌种接种到相应抗性的3ml LB 培养基中，220rpm，37℃震荡培养过夜；2)扩大培养：将培养过夜的菌液按5％的接种量转接到50ml 相应抗性的培养基中，220rpm，37℃震荡培养3h(吸光度A600值达到0.6～0.8)，再将该菌液按照5％的接 种量扩大培养至1L的LB培养基中，按照小量表达的条件进行诱导表达；3)收菌：4℃条件下，4000rpm 离心15min，收集菌体，重复此步骤至1L菌液的菌体被全部收集；4)菌体处理：将收集的菌体用40～45 ml的bufferA重悬后，4℃条件下4000rpm离心15min清洗菌体，弃上清，菌体再次用bufferA重悬， 并加入终浓度为1mM的蛋白酶抑制剂PMSF，-80℃保存备用。

(2)不可溶蛋白割胶纯化：对包涵体表达的蛋白Bm2D36和Bm2D97，采用生工生物工程有限公司 的PAGE胶蛋白微量回收试剂盒，对目的蛋白进行纯化回收，纯化步骤如下：1)将大量表达的包涵体蛋 白的菌体室温下溶解，在400w，5s开，10s关的条件下，用超声仪超声99次后，4℃，15000g离心30 min(升速6，降速2)，弃上清，沉淀用适量的bufferA重悬，每800μl一份分装到1.5ml的离心管中，-80℃ 保存备用；2)取1)中分装的沉淀悬浮物，加入200μl 5×蛋白上样缓冲液，混匀后沸水浴中煮10min， 制成蛋白上样液；3)配置12％的SDS-PAGE分离胶和5％浓缩胶，配制浓缩胶时不加梳子，将制好的蛋白 上样液铺在浓缩胶上进行电泳；4)蛋白胶经染色和脱色后，将目的条带从整个块胶完整的切下来，放入 50ml的离心管中，用ddH₂O清洗三次；5)将胶条切成小段置于离心管中，用组织研磨仪将胶体研磨成细 小的碎片，加入A溶液4ml后，脱色摇床上室温震荡16～18h；6)室温条件下，12000rpm离心15min， 吸取上清到50ml离心管中，再加入20ml预冷的B溶液，混匀后4℃静置30min；7)室温条件下，12000 rpm离心15min，弃上清，保留管底的白色沉淀，并将离心管置于通风橱中，使残留液体挥发干净；8) 用适量的PBS溶液溶解沉淀后，取20μl制备蛋白上样液，用SDS-PAGE电泳分鉴定蛋白样品。蛋白溶液 于-80℃保存备用。

(3)可溶蛋白的亲和纯化：可溶蛋白Bm2D33采用GST亲和纯化系统，Bm2D41采用Ni柱纯化系 统，具体操作如下：1)将大量表达可溶蛋白的菌体室温下溶解，在400w，5s开，10s关的条件下， 用超声仪超声99次后，4℃，15000g离心30min(升速6，降速2)，将上清转移到新的50ml的离心管 中，再重复离心一次，收集上清液；2)用水冲洗纯化柱，待UV值稳定(大约5个柱体积),再用约5个 柱体积buffer A平衡纯化柱，UV值清零；3)将蛋白上清液通过压力泵上样到平衡后的纯化柱后，用buffer A冲洗除去非特异结合蛋白，待UV值降至基线以下，分别用10％、30％、50％、80％、100％梯度的buffer B冲洗(GST纯化时直接用100％的buffer B冲洗)，视出峰情况收集目的蛋白；4)将收集的不同组分的 蛋白进行SDS-PAGE电泳，鉴定目的蛋白及其纯度；5)收集蛋白后用100％的buffer B再冲洗5个柱体积， 充分除去亲和介质上结合蛋白，之后再分别用水和20％乙醇充分冲洗并保存。

(4)蛋白融合标签的切除：Bm2D41蛋白含有SUMO融合标签，需要切除以进行下一的功能验证实 验。酶切实验采用柱上酶切的方式，配置酶切体系如表13所示，将酶切体系与1ml His蛋白纯化介质填料 充分混合，4℃摇床震荡酶切16h。4℃，500g离心5min，收取上清液即为酶切后的目的蛋白液，经 SDS-PAGE电泳鉴定后，分装保存于-80℃备用。填料的处理和保存方式同以上纯化柱的处理。

表13 SUMO蛋白酶酶切体系

蛋白浓度的测定采样Branford法，具体操作参照试剂盒说明书。包涵体蛋白Bm2D97和Bm2D36用 PAGE胶蛋白微量回收试剂盒纯化，经SDS-PAGE电泳分析，成功获得了单一条带的重组蛋白(图13所 示)。可溶性蛋白Bm2D41和Bm2D33用亲和介质纯化，经SDS-PAGE电泳分析，获得了条带相对单一的 融合蛋白。纯化后的Bm2D41蛋白，经SUMO蛋白酶酶切体系切除蛋白融合标签，获得目的条带相对单 一的重组蛋白(图13所示)。图13中，M表示蛋白质标志物，1表示重组克隆未诱导全菌，2表示重组 克隆诱导全菌，3表示纯化后的重组蛋白，4表示切除融合标签后的重组蛋白。

1.4.5重组蛋白的评价

本实验通过ELISA实验技术对重组蛋白进行评价，除Bm2D97使用IgM抗体(包括HRPgoat anti-mouse IgM和HRP goat anti-human IgM)检测外，其余重组抗原均使用IgG抗体(包括HRP goat anti-mouse IgG和HRP goat anti-human IgG)进行检测。通过实验优化蛋白包被浓度、血清以及二抗稀释度。 优化后的最佳包被浓度重组蛋白Bm2D97、Bm2D33、Bm2D36、Bm2D41、Bm7分别为2μg/ml、2μg/ml、 2μg/ml、1μg/ml、5μg/ml，田鼠巴贝虫的粗蛋白和已报道的BmSA1作为参照，最佳包被浓度分别为1μg/ml 和5μg/ml。ELISA实验方法同2.2.3.6。

(1)田鼠巴贝虫感染的鼠血清对重组抗原的评价

重组蛋白Bm2D97、Bm2D33、Bm2D36、Bm2D41、Bm7按以上包被浓度包被,分别用感染田鼠巴贝虫 后3天、7天、14天、21天、30天、60天、120天、150天、270天的小鼠血清和正常小鼠血清各10份(1： 100稀释)孵育,二抗HRP goat anti-mouse IgM和HRP goat anti-mouseIgG均按1：5000稀释后孵育,以此评 价重组抗原的免疫反应趋势。

在特异性IgM抗体的蛋白芯片分析中，筛选的无细胞表达蛋白2D97,经原核表达和纯化后获得重组抗 原Bm2D97，用不同感染阶段的小鼠血清评价，呈现出与早期的3dpi鼠血清有较高的免疫反应。重组抗 原的免疫反应趋势如图14所示。从特异性IgG抗体的蛋白芯片分析结果中，筛选的无细胞表达蛋白2D41 和Bm7，经原核表达和纯化后，与不同感染阶段的小鼠血清反应，重组抗原Bm2D41和Bm7都呈现出了 持续高的免疫反应；筛选的无细胞表达蛋白2D33和2D36表达纯化后，用不同感染阶段的小鼠血清评价， 重组抗原Bm2D33和Bm2D36表现出急性阶段后反应下降的免疫反应趋势。重组抗原的免疫反应趋势如图 14所示。

(2)田鼠巴贝虫病人血清对重组抗原的评价

重组蛋白Bm2D97、Bm2D33、Bm2D41、Bm7、BmSA1按以上包被浓度,分别用8份巴贝虫病人血 清和10份正常人血清(1：100稀释)孵育,二抗HRP goat anti-human IgM和HRPgoat anti-human IgG均按1： 10000稀释后孵育,以此评价重组蛋白作为候选诊断抗原的敏感性。

使用正常人和巴贝虫病人血清对重组抗原Bm2D97、Bm2D33、Bm2D41、Bm7和BmSA1进行ELISA 分析，结果如图15所示，其中Bm2D33和Bm2D41相比较于已报道的BmSA1(敏感性为0％)显示了较 高的敏感性，分别为62.5％和50％。在对组合抗原的ELISA分析中，多抗原组合Bm2D33+Bm2D41+Bm7 相比较于Bm2D33+Bm2D41显示了更高的敏感性，两个组合抗原的敏感性分别为62.5％和25％，结果如图 15所示。

(3)重组抗原与疟疾病人血清的交叉反应

同(2)中的重组抗原包被和二抗孵育，一抗分别用10份间日疟和恶性疟病人血清和10份正常人血 清(1：100稀释)孵育,以此评价重组抗原与疟疾病人血清的交叉反应。

使用正常人和疟疾病人血清对各个重组抗原进行ELISA分析，结果如图16所示，Bm7、BmSA1、 Bm2D33、Bm2D41和Bm2D97针对间日疟样本检测的特异性分别为90％、80％、70％、60％和30％；针 对恶性疟样本检测的特异性分别为100％、80％、100％、80％和60％。在与疟疾病人血清的交叉反应中， Bm7和Bm2D33显示了很高的特异性，尤其是针对恶性疟病人血清的特异性为100％。

(4)疟疾疫区现场发热病人样本的评估

200份发热病人血液样本,使用DNA提取试剂盒提取DNA,用PCR技术检测编码田鼠巴贝虫的18S rRNA的特异片段。在对200份发热病人样本核酸的研究中，发现间日疟阳性14个，恶性疟阳性4个，其 中包括1个间日疟和恶性疟核酸共感染的样本。在对200份样本的田鼠巴贝虫核酸检测中，发现10个阳 性样本，但没有发现巴贝虫和疟原虫核酸的共感染。重组蛋白Bm2D97、Bm2D33、Bm2D41、Bm7、田 鼠巴贝虫的粗蛋白和BmSA1按以上优化浓度包被,分别用200份发热病人和45份正常人血清(1：100稀 释)孵育,二抗孵育同(2)。结合核酸检测结果，分析疟疾疫区的田鼠巴贝虫病潜在传播风险。

在对200份疟疾疫区发热病人血清样本的研究中，使用田鼠巴贝虫粗提蛋白、BmSA1、Bm7、Bm2D33、 Bm2D41和Bm2D97重组抗原进行ELISA分析,结果如图17所示，在200份血清中，分别有32和34份 阳性血清被持续高反应的重组抗原Bm2D41和Bm7检测为阳性，其中阳性血清中分别包括1份、2份田鼠 巴贝虫分子阳性，和各7份的疟原虫分子阳性；有32份阳性血清重组抗原Bm2D33检测为阳性，其中阳 性血清中分别包括2份田鼠巴贝虫分子阳性和9份疟原虫分子阳性；有27份阳性血清被重组抗原Bm2D97 检测为阳性，其中阳性血清中分别包括1份田鼠巴贝虫分子阳性和10份疟原虫分子阳性；重组蛋白BmSA1 和田鼠巴贝虫粗提蛋白作为对照，分别检测到38和58份阳性血清，其中阳性血清中分别包括1份、3份 田鼠巴贝虫分子阳性，和14份、9份的疟原虫分子阳性。此外，研究还发现，如表14所示：在检测出的 阳性样本中，田鼠巴贝虫分子阴性而抗体阳性的样本所占比例的最高，约72％～85％。

表14疟疾疫区200份现场发热病人样本的PCR和ELISA阳性结果分析

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发 明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 复旦大学，中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120> 田鼠巴贝虫2D33、2D36抗原蛋白及其应用

<130> CPC-NP-18-101028-1

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 984

<212> DNA

<213> 2D97

<400> 1

cacttatatt cgctaaaacg gtttcaagtg gatagtgtcg tggttgatgc cgtttaccat 60

gcggaaaata attttataac tgcatctact gaccaaacct attacttaac tagtgtaaac 120

gagactgata ttcaacagct agatcaacta ctcgaattag gtgaatggca tgaagtgccc 180

agtgaaatcg aagaacctcc tgataaacaa gagatagaaa acacatctga agaagaaaca 240

attaataaga atgaatctga tgaattattt aagtctagta taactccgtt cattatacga 300

gacggttata tttactttaa atttgtcgat atggccaacg aatcccaagg tgttgaaatt 360

gacaaatgcg tatttatcgc cgacgcttct aagaatgaat tagccattct gatcaaaggt 420

gaagtacagg aacatgaaat gttcatattt tccctaccta ctaaacaaga ctttgattat 480

tggaaaaaca atctagtgga acatgggttg aatgagcaac aaaatgatat gaataacgat 540

gatggcaaat tttaccgttc caattctggc aagattaatc aacaagcttg tgtggtgacc 600

aaaggccaaa tgcaattgtt caaagactat aatgatgacg tttcggagcc attgataaca 660

tacgtaagct catcaacaaa agtttctata aatgaggaaa aacgggaaat tattatggaa 720

tccacgtcta cgcatggaaa taggagcaga attactttgg attgcaccaa tccgaaggaa 780

ttcgtaaggt ggaaatcggc gttgattttg gctggattta tatctggtaa ctcagtcaat 840

agcgataaca taaatggact caaaaagtat gttttcccaa taaaactctt taaaacatct 900

gataacaatg atagtggaag gagggctttt gtaattaaat ccaattatgt ggcattgtat 960

atcagcagca cttctaaaga tcca 984

<210> 2

<211> 328

<212> PRT

<213> 2D97

<400> 2

His Leu Tyr Ser Leu Lys Arg Phe Gln Val Asp Ser Val Val Val Asp

1 5 10 15

Ala Val Tyr His Ala Glu Asn Asn Phe Ile Thr Ala Ser Thr Asp Gln

20 25 30

Thr Tyr Tyr Leu Thr Ser Val Asn Glu Thr Asp Ile Gln Gln Leu Asp

35 40 45

Gln Leu Leu Glu Leu Gly Glu Trp His Glu Val Pro Ser Glu Ile Glu

50 55 60

Glu Pro Pro Asp Lys Gln Glu Ile Glu Asn Thr Ser Glu Glu Glu Thr

65 70 75 80

Ile Asn Lys Asn Glu Ser Asp Glu Leu Phe Lys Ser Ser Ile Thr Pro

85 90 95

Phe Ile Ile Arg Asp Gly Tyr Ile Tyr Phe Lys Phe Val Asp Met Ala

100 105 110

Asn Glu Ser Gln Gly Val Glu Ile Asp Lys Cys Val Phe Ile Ala Asp

115 120 125

Ala Ser Lys Asn Glu Leu Ala Ile Leu Ile Lys Gly Glu Val Gln Glu

130 135 140

His Glu Met Phe Ile Phe Ser Leu Pro Thr Lys Gln Asp Phe Asp Tyr

145 150 155 160

Trp Lys Asn Asn Leu Val Glu His Gly Leu Asn Glu Gln Gln Asn Asp

165 170 175

Met Asn Asn Asp Asp Gly Lys Phe Tyr Arg Ser Asn Ser Gly Lys Ile

180 185 190

Asn Gln Gln Ala Cys Val Val Thr Lys Gly Gln Met Gln Leu Phe Lys

195 200 205

Asp Tyr Asn Asp Asp Val Ser Glu Pro Leu Ile Thr Tyr Val Ser Ser

210 215 220

Ser Thr Lys Val Ser Ile Asn Glu Glu Lys Arg Glu Ile Ile Met Glu

225 230 235 240

Ser Thr Ser Thr His Gly Asn Arg Ser Arg Ile Thr Leu Asp Cys Thr

245 250 255

Asn Pro Lys Glu Phe Val Arg Trp Lys Ser Ala Leu Ile Leu Ala Gly

260 265 270

Phe Ile Ser Gly Asn Ser Val Asn Ser Asp Asn Ile Asn Gly Leu Lys

275 280 285

Lys Tyr Val Phe Pro Ile Lys Leu Phe Lys Thr Ser Asp Asn Asn Asp

290 295 300

Ser Gly Arg Arg Ala Phe Val Ile Lys Ser Asn Tyr Val Ala Leu Tyr

305 310 315 320

Ile Ser Ser Thr Ser Lys Asp Pro

325

<210> 3

<211> 432

<212> DNA

<213> 2D33

<400> 3

ggattagaag atgctgtagc gggaacggag ttactggtag ctaaagatgg tgatgatatt 60

gaggaattga aagtggaggt aatgcgagac atatcttcaa tatttgactg tgttgatcga 120

tccggagtgg gggtttactt gatggctagt accctagggt cactagaggc tttacttcaa 180

tttataaatg ggcaaaagat accagtattt tgtgtcaaca ttggggcagt gcaaaagaag 240

gatgtcaaga aggctagcat aatgttggag aaaaggccag aatatgcggc tatacttgca 300

tttgacgtca aagttacaca agatgcagaa aaggaggccg aaacgttggg agttacaatt 360

ttttgtgctg atatcattta ccacctctct gataggttca ccaagcacat ggaggagcag 420

agggaactat ac 432

<210> 4

<211> 144

<212> PRT

<213> 2D33

<400> 4

Gly Leu Glu Asp Ala Val Ala Gly Thr Glu Leu Leu Val Ala Lys Asp

1 5 10 15

Gly Asp Asp Ile Glu Glu Leu Lys Val Glu Val Met Arg Asp Ile Ser

20 25 30

Ser Ile Phe Asp Cys Val Asp Arg Ser Gly Val Gly Val Tyr Leu Met

35 40 45

Ala Ser Thr Leu Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Gln Phe Ile Asn Gly

50 55 60

Gln Lys Ile Pro Val Phe Cys Val Asn Ile Gly Ala Val Gln Lys Lys

65 70 75 80

Asp Val Lys Lys Ala Ser Ile Met Leu Glu Lys Arg Pro Glu Tyr Ala

85 90 95

Ala Ile Leu Ala Phe Asp Val Lys Val Thr Gln Asp Ala Glu Lys Glu

100 105 110

Ala Glu Thr Leu Gly Val Thr Ile Phe Cys Ala Asp Ile Ile Tyr His

115 120 125

Leu Ser Asp Arg Phe Thr Lys His Met Glu Glu Gln Arg Glu Leu Tyr

130 135 140

<210> 5

<211> 519

<212> DNA

<213> 2D36

<400> 5

atgggtggag ctgtccctct atcaaattac atctcaccga tcacaaacgc cgtatctaac 60

acaatggaga aactcattaa ttctcaattg ggctatacaa tgctatacgg aatacctgtt 120

atctttgggc ttagacagat cagccgctat aatagactcg ctaaattgag attcgatgac 180

attgggtacc agataaggcg ggcggattcg ataggcaata ggtggattgc ctgcaagtac 240

tttttcgttg gtaccgtact agcaccacta actggctgtg caatcgcata caaaatatac 300

gcttgttcac ttggcgaaaa ttaccaagtg aacaagttga tctttcacga catcaccagg 360

caatttggaa atggcatccg cattgctaat gacatacaaa ccgaatttat ccgggaaaat 420

ttgacggtgg ataacagaat atccgaatcg tttaagcgta tgtctacgga gctcaagcag 480

gacgccagca aggtgaaaag taaacttggt ttaatttaa 519

<210> 6

<211> 172

<212> PRT

<213> 2D36

<400> 6

Met Gly Gly Ala Val Pro Leu Ser Asn Tyr Ile Ser Pro Ile Thr Asn

1 5 10 15

Ala Val Ser Asn Thr Met Glu Lys Leu Ile Asn Ser Gln Leu Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Leu Tyr Gly Ile Pro Val Ile Phe Gly Leu Arg Gln Ile Ser

35 40 45

Arg Tyr Asn Arg Leu Ala Lys Leu Arg Phe Asp Asp Ile Gly Tyr Gln

50 55 60

Ile Arg Arg Ala Asp Ser Ile Gly Asn Arg Trp Ile Ala Cys Lys Tyr

65 70 75 80

Phe Phe Val Gly Thr Val Leu Ala Pro Leu Thr Gly Cys Ala Ile Ala

85 90 95

Tyr Lys Ile Tyr Ala Cys Ser Leu Gly Glu Asn Tyr Gln Val Asn Lys

100 105 110

Leu Ile Phe His Asp Ile Thr Arg Gln Phe Gly Asn Gly Ile Arg Ile

115 120 125

Ala Asn Asp Ile Gln Thr Glu Phe Ile Arg Glu Asn Leu Thr Val Asp

130 135 140

Asn Arg Ile Ser Glu Ser Phe Lys Arg Met Ser Thr Glu Leu Lys Gln

145 150 155 160

Asp Ala Ser Lys Val Lys Ser Lys Leu Gly Leu Ile

165 170

<210> 7

<211> 687

<212> DNA

<213> 2D41

<400> 7

ggtatcgaaa ctgttggtgg cgtcatgact aagattatcc cccgtaacac tgtggttcca 60

acaaagaaat cacaaatgtt ctctacttat atggacaatc aaaccaccgt cactatccaa 120

gtttaccaag gagaacgttc aatgacacaa cacaatactc tgctcggaag atttgacctt 180

actggtattg cccctgcacc tcgtaacact cctcaaatca atgtcacatt tgaaatcgac 240

actaatggca ttgtgagtgt atcagctgag gataaaggta gtggtaagag tcagaaaatt 300

accataaccg cggaacaagg caggttatca aaggctgaga ttgaaagaat gatcgaagag 360

tcggagagat atgctcagga ggataaggaa atgatggaac gtgttgaatc caagaatacg 420

cttgatggtt acatcgctag tatgaagagg agtgtggaag ataaggataa gttggctgat 480

aagattgagg aagatgacaa gaccacaatt ttgaacgcct tgaaagatgc tgagacgtgg 540

cttttccaaa atccagaggc ggatactgat gagtataaat ccaaactcaa gtcactggaa 600

gaaatttgta atcctattat acaaaaattg taccagggca atgcagccgg ggaatccaat 660

tatgattctt acggggatga gttatga 687

<210> 8

<211> 228

<212> PRT

<213> 2D41

<400> 8

Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val Met Thr Lys Ile Ile Pro Arg Asn

1 5 10 15

Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser Gln Met Phe Ser Thr Tyr Met Asp

20 25 30

Asn Gln Thr Thr Val Thr Ile Gln Val Tyr Gln Gly Glu Arg Ser Met

35 40 45

Thr Gln His Asn Thr Leu Leu Gly Arg Phe Asp Leu Thr Gly Ile Ala

50 55 60

Pro Ala Pro Arg Asn Thr Pro Gln Ile Asn Val Thr Phe Glu Ile Asp

65 70 75 80

Thr Asn Gly Ile Val Ser Val Ser Ala Glu Asp Lys Gly Ser Gly Lys

85 90 95

Ser Gln Lys Ile Thr Ile Thr Ala Glu Gln Gly Arg Leu Ser Lys Ala

100 105 110

Glu Ile Glu Arg Met Ile Glu Glu Ser Glu Arg Tyr Ala Gln Glu Asp

115 120 125

Lys Glu Met Met Glu Arg Val Glu Ser Lys Asn Thr Leu Asp Gly Tyr

130 135 140

Ile Ala Ser Met Lys Arg Ser Val Glu Asp Lys Asp Lys Leu Ala Asp

145 150 155 160

Lys Ile Glu Glu Asp Asp Lys Thr Thr Ile Leu Asn Ala Leu Lys Asp

165 170 175

Ala Glu Thr Trp Leu Phe Gln Asn Pro Glu Ala Asp Thr Asp Glu Tyr

180 185 190

Lys Ser Lys Leu Lys Ser Leu Glu Glu Ile Cys Asn Pro Ile Ile Gln

195 200 205

Lys Leu Tyr Gln Gly Asn Ala Ala Gly Glu Ser Asn Tyr Asp Ser Tyr

210 215 220

Gly Asp Glu Leu

225

<210> 9

<211> 217

<212> PRT

<213> Bm7

<400> 9

Met His Ile Asn Tyr Lys Leu Ile Ile Thr Gly Leu Val Ser Ile Ala

1 5 10 15

Leu Ala Thr Ser Ile Thr Leu Ala Val Ile Tyr Leu Pro Asn Arg Ser

20 25 30

Cys Pro Gly Asn Asn Gly Val Gly Gly Gly Ser Gly Asp Asn Asn Ser

35 40 45

Gly Ile Ile Pro Asn Asp Pro His Pro Cys Cys Asn Asn Leu Arg Gln

50 55 60

Lys Pro Gln Tyr Gln Thr Lys Pro Glu Asn Glu Leu Val Asn Asp Asp

65 70 75 80

Arg Asp Leu Asn Phe Asn Lys Ile Arg Gly Gly Lys Gln Ile Ile Thr

85 90 95

Phe Thr Val Pro Ser Ile Asp Asp Leu Lys Asn Lys Arg Leu Ser Asp

100 105 110

Ser Glu Phe Ile Leu Ser Glu Lys Ala Asn Pro Leu Ile Ser Ser Gly

115 120 125

Asp Ser Lys Asn Val Ile Val Phe Glu Val Lys Asn Asp Asn Glu Lys

130 135 140

Leu Met Gly Ser Val Glu Val Gly Gln Trp Glu Val Thr Ile Thr Thr

145 150 155 160

Ser Cys Ile Arg Arg Ile Val Ile Phe Asp Ser Asn Glu Val Ser Asp

165 170 175

Asn Ile Pro Met Tyr Ile Tyr Ile Val Asp Tyr Phe Glu Gly Gly Asn

180 185 190

Ser Thr Val Ser Lys Phe Phe Phe Ala Asn Asn Arg Trp Asn Ala Asp

195 200 205

Phe Thr Asn His Thr Pro Asn Ala Ala

210 215

Claims (11)

1.一种分离的基因，其特征在于，其序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示。

2.一种田鼠巴贝虫抗原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6所示。

3.如权利要求1所述的一种分离的基因在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用。

4.如权利要求2所述的一种田鼠巴贝虫抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用。

5.一种特异性的结合如权利要求2所述的一种田鼠巴贝虫抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用。

6.如权利要求3-5任一项所述的应用，其特征在于，用于检测或诊断田鼠巴贝虫病从急性期转入慢性期的进程。

7.一种试剂盒，其特征在于，含有如权利要求1所述的一种分离的基因、如权利要求2所述的一种田鼠巴贝虫抗原蛋白、或者特异性的结合如权利要求2所述的一种田鼠巴贝虫抗原蛋白的抗体。

8.一组田鼠巴贝虫的联合抗原蛋白，其特征在于，包括：

a)田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白、2D36抗原蛋白两者中的至少之一；所述田鼠巴贝虫2D33抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述田鼠巴贝虫2D36抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；

b)具有持续高免疫反应的田鼠巴贝虫抗原蛋白；优选的，所述具有持续高免疫反应的田鼠巴贝虫抗原蛋白选自田鼠巴贝虫2D41抗原蛋白和Bm7中的至少一个；所述田鼠巴贝虫2D41抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，和所述Bm7的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。

9.如权利要求8所述的一组田鼠巴贝虫的联合抗原蛋白在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用。

10.特异性的结合如权利要求8所述的一组田鼠巴贝虫的联合抗原蛋白的一组抗体在制备治疗、诊断或者预防田鼠巴贝虫病的产品中的应用。

11.一种试剂盒，含有如权利要求8所述的一组田鼠巴贝虫的联合抗原蛋白、或者如权利要求10所述的的一组抗体。