CN106596964B - 用于诊断蠕虫感染的新型测定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种诊断上有用的载体，其包含用于在来自受试者的样品中特异性捕获来自多腔棘孢的p21的抗体的装置；包含所述诊断上有用载体的试剂盒，优选还包含用于检测任何捕获的抗体的工具；包括以下步骤的方法：检测来自受试者的样品中来自多花地棘球菌的p21的抗体的存在或不存在；来自多房棘球绦虫或其变体的p21用于增加诊断可靠性，优选用于检测棘球绦虫感染的测定的灵敏度，优选用于区分棘球绦虫感染与粒细胞球蛋白感染的用途；来自多房棘球绦虫的分子量为21kDa的多肽，通过使用凝胶电泳根据分子量分离多棘球绦虫的提取物，或其变体或所述多肽的抗体而获得。

Description

用于诊断蠕虫感染的新型测定
发明领域
本发明涉及包含用于特异性捕获来自受试者的样品中的针对来自多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的p21的抗体的工具的诊断上有用的载体；包含所述诊断上有用的载体的试剂盒，其优选还包含用于检测任何捕获的抗体的工具；包括在来自受试者的样品中检测针对来自多房棘球绦虫的p21的抗体的存在或不存在的步骤的方法；来自多房棘球绦虫的p21或其变体用于增加诊断可靠性，优选用于增加检测棘球绦虫(Echinococcus)感染的测定的灵敏度，优选用于区分多房棘球绦虫感染与细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)感染的用途；来自多房棘球绦虫以21kDa的分子量电泳的多肽或其变体或针对所述多肽的抗体，所述多肽可以通过使用凝胶电泳根据分子量分离来自多棘球绦虫的提取物来获得。
发明背景
蠕虫感染或寄生虫感染(也被称为蠕虫病)是可传播至哺乳动物例如人、狗、狐狸和狼的宏观寄生虫疾病，其特征在于蠕虫(例如棘球绦虫类型的绦虫)对机体的感染。多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫是世界上的主要寄生虫中的两种。超过一百万人在任何一次感染它们中的一种。
存在两种主要类型的棘球绦虫感染：囊型棘球绦虫病和泡型棘球绦虫病。人体感染发生在摄入卵后。幼虫在宿主肠中释放，穿透肠绒毛并迁移至各种器官。
这种疾病经常开始没有症状，并且这可能持续一年。发生的症状和体征随后取决于孢囊的位置和大小。泡型疾病通常在肝脏中开始，但可以扩散到身体的其它部分，例如肺或脑。当肝脏受影响时，人可能患腹痛以及体重减轻并发黄。肺部疾病可能导致胸痛、气短和咳嗽。在不进行治疗的情况下，棘球绦虫感染可能是致命的。
由于患者可能一段时间无症状，并且随着疾病进展提供有效的治疗会变得越来越困难，所以用于人蠕虫感染的早期血清诊断的可靠工具是被高度追求的。
感染棘球绦虫的患者显示各种免疫反应(Gottstein,B.,Mesarina,B.,Tanner,I.,Ammann,R.W.,Wilson,j.F.,Eckert,J.Lanier,A.(1991):Specific Cellular andHumoral Immune Responses in Patients with Different Long-Term Courses ofAlveolar Echinococcosis(Infection with Echinococcus multilocularis).Am.J.TropMed.Hy.45,734-742)。
因此，基于天然抗原(其可从全蠕虫或体外培养物中提取)的常规免疫测定可以用于免疫印迹以检测针对寄生虫的宿主抗体(Ayadi,A.,Dutoit,B.,Sendid,B.,and Camus,D(1995):Specific Diagnostic Antigens of Echinococcus granulosus detected byWestern Blot.Parasite 2,119-123)。这样的测定可商购获得，例如获自EUROIMMUN,Lübeck(抗-细粒棘球绦虫蛋白质印迹)。
这些天然抗原在可用性方面受到限制，遭受批次间变化并且缺乏期望的诊断可靠性程度。进一步的缺点包括这样的事实：它们往往是交叉反应性的，即被来自感染有两个或更多个蠕虫物种的患者的血清识别。
除了检测棘球绦虫以外，寄生虫学家还对区分细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫感兴趣。尽管这两种寄生虫的幼虫主要在肝脏中发现，但它们在整个宿主体内的分布在发育晚期不同，对治疗感染的患者具有显著影响。例如，细粒棘球绦虫最常发现在肺中，而多房棘球绦虫可进入宿主的肺和大脑二者。
因此，本发明涉及的问题是提供用于或帮助检测棘球绦虫感染的测定，所述测定相较于现有技术测定在其多个缺点中的一个或多个方面得到改善。
本发明涉及的另一问题是提供用于检测棘球绦虫的测定，其相较于现有技术测定，关于多房棘球绦虫和细粒棘球绦虫感染的检测在特异性和/或灵敏度方面具有较高程度的可靠性。
本发明涉及的另一问题是提供相较于现有技术测定关于多房棘球绦虫与细粒棘球绦虫感染之间的区别具有较高程度的可靠性的测定。
发明描述
本发明涉及的问题通过所附独立和从属权利要求的主题来解决。
在第一方面，本发明涉及的问题通过一种诊断上有用的载体来解决，所述载体包含用于特异性捕获来自受试者的样品中的针对来自多房棘球绦虫的p21的抗体的工具。
在第一方面的优选实施方案中，所述载体还包含用于特异性捕获针对一种或多种多肽的抗体的工具，所述一种或多种多肽选自包含来自多房棘球绦虫的p7、p16/18和p25/26，优选其全部的组。
在第一方面的另一优选实施方案中，用于特异性捕获针对来自包含来自多房棘球绦虫的p21、p7、p16/18和p25/26的组的多肽的抗体的工具是来自包含来自多房棘球绦虫的p21、p7、p16/18和p25/26的组的各多肽或其变体，优选为天然形式的多肽。
在第一方面的另一优选实施方案中，用于特异性捕获针对来自包含来自多房棘球绦虫的p21、p7、p16/18和p25/26的组的多肽的抗体的工具以来自棘球绦虫(优选多房棘球绦虫，更优选根据分子量分离的)的多肽提取物的形式提供，并且其中所述多肽提取物包含来自多房棘球绦虫的p16/18和p21，其被充分分离以允许区分针对p16/18的抗体和针对p21的另一抗体。具体地，载体上的p16/18和p21之间的距离使得与它们相关的条带不重叠至这样的程度，所述程度使得指示抗体与p16/18的结合的信号不能与指示抗体与p21结合的信号区分开。换句话说，载体可用于检测样品中是否存在针对p16/18的抗体、针对p21的抗体或针对p16/18和p21两者的抗体。
在任一方面的另一优选实施方案中，载体还包含用于特异性捕获针对选自包含来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b、来自多房棘球绦虫的Em18和Em95、优选其全部的组的一种或多种多肽的抗体的工具。
在第一方面的另一优选实施方案中，用于特异性捕获针对选自包含来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b、来自多房棘球绦虫的Em18和Em95的组的一种或多种多肽的抗体的工具是来自包含来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b、来自多房棘球绦虫的Em18和Em95的组的各多肽或其变体，优选以一种或多种重组和/或纯化的多肽的形式提供。
在第二方面，本发明涉及的问题通过包含根据本发明的诊断上有用的载体的试剂盒来解决，所述试剂盒优选还包含用于检测任何捕获的抗体的工具。
在第三方面，本发明涉及的问题通过包括以下步骤的方法来解决：在来自受试者的样品中检测针对来自多房棘球绦虫的p21的抗体。
在第三方面的优选实施方案中，所述方法还包括检测针对选自包含p7、p16/18和p25/26，优选其全部，更优选p7和p16/18，更优选p7的组的一种或多种多肽的抗体。
在第三方面的另一优选实施方案中，所述方法还包括检测针对选自包含来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b、来自多房棘球绦虫的Em18和Em95、优选其全部的组的一种或多种多肽的抗体的步骤。
在第三方面的另一优选实施方案中，同时检测针对来自所述组的多于一种多肽的抗体。
在第三方面的另一优选实施方案中，在空间上分开的结合反应中或在一锅反应中，优选在一锅反应中检测针对来自所述组的多于一种多肽的抗体。
在第三方面的另一优选实施方案中，其中针对p21的抗体可以与结合p16/18的抗体区分开。
在第四方面，本发明涉及的问题通过来自棘球绦虫优选多房棘球绦虫的p21或其变体用于增加诊断可靠性，优选用于增加检测棘球绦虫感染的测定的灵敏度，优选用于区分多房棘球绦虫感染与细粒棘球绦虫感染的用途来解决。
在第五方面，本发明涉及的问题通过来自多房棘球绦虫的分子量为21kDa的多肽或其变体或针对所述多肽的抗体来解决，所述多肽可以通过使用凝胶电泳根据分子量分离来自多房棘球绦虫的提取物来获得。
本发明基于本发明人的令人惊讶的发现：存在一种新的棘球绦虫多肽(在整个本申请被称为“p21”)，当将其并入用于检测棘球绦虫感染的测定中时，可提高整体的测定灵敏度。
本发明聚焦于用于诊断棘球绦虫感染的测定，其涉及在来自怀疑患有棘球绦虫感染的受试者的样品中检测针对来自多房棘球绦虫的多肽p21的抗体。p21是在还原条件下通过SDS PAGE并与在相同条件下电泳的标准分子量标记蛋白的电泳行为进行比较而判断的表观分子量约为21kDa的多肽。p21多肽条带电泳在现有技术中描述的p16/p18和p25/26多肽的条带之间。针对p21和优选地针对来自包含来自多房棘球绦虫的p7、p16/18和p25/26、来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b、和来自多房棘球绦虫的Em18和Em95的一种或多种多肽的抗体可以证实患者患有棘球绦虫感染的假设和提供诊断相关信息。优选地，诊断上有用的载体包括来自多房棘球绦虫的p16/18和p21或其变体，其被充分分离以允许区分针对p16/18的抗体和针对p21的另一抗体。更优选地，它可以另外包括(以增加的优先级的顺序)p7；来自多房棘球绦虫的p7和Em18；来自多房棘球绦虫的p7、Em18和Em95；或来自多房棘球绦虫的p7、Em18和Em95，以及来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b或其变体。优选地，来自包含p7、p16/18和p21的组的任何多肽是天然多肽，而来自包含来自多房棘球绦虫的Em18和Em95以及来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b的组的任何多肽是重组的。这样的载体可被用于以较高的灵敏度来检测棘球绦虫感染。
天然蛋白可通过制备来自多房棘球绦虫的多肽提取物来获得，优选按照Spiliotis,M.,Tappe,D.,Sesterhenn,L.,and Brehm,K.(2004)Long-termin in vitrocultivation of Echinococcus multilocularis metacestodes under axenicconditions,Parasitol.Res.92(5),430-432的方案进行。在整个纯化过程中，可以使用与p21反应的来自感染患者的样品作为抗体来源，通过免疫印迹来检测p21。优选地，p21相对于其针对天然组织中的其它多肽的比例是富集的，例如通过根据大小分离多肽提取物、收集级分并制备包含超过其它级分体积的含有p21的级分的体积的混合物来富集。优选地，根据本发明使用的p21是从组织纯化的非重组p21。
包含p21的蛋白质条带可在电泳完成后从凝胶中切出，并使用标准蛋白质纯化技术洗脱蛋白质。它可以通过亲和层析，使用与p21反应的来自感染患者的样品以获得作为亲和配体的针对p21的抗体，从以类似分子量电泳的任何多肽中分离。本领域技术人员熟悉这样的方法。
可替代地，包含来自棘球绦虫优选多房棘球绦虫的多肽(其具有相对于未加工的多肽提取物的富集比例的如通过标准分子量标记物判断的具有一定范围的分子量的多肽(p21在其中))的一块电泳凝胶可从通过使来自棘球绦虫优选多房棘球绦虫的多肽提取物经历制备凝胶电泳获得的电泳凝胶中切出。优选地，在凝胶上的分子量范围包括1至200kDa，更优选5至100kDa，更优选6至50kDa和更优选7至30kDa的多肽，其中最优选地，在所述分子量范围之外的天然棘球绦虫优选多房棘球绦虫多肽以比直接从所述生物体获得的多肽提取物中的比例更低的比例存在。在所述分子量范围之外的多肽可任选地不存在，例如作为切掉包含所寻求的分子量范围的凝胶片并丢弃凝胶的剩余部分的结果。其它选项可用于产生与未加工的多肽提取物相比富含在所述分子量范围内的那些多肽的棘球绦虫优选多房棘球绦虫多肽级分，例如使用尺寸排阻色谱法。
有利的是，根据分子量的任何分离足以允许区分p21和具有相似分子量的任何其它多肽，例如p18和p25/p26。本领域技术人员熟悉合适的技术，例如使用凝胶的凝胶电泳，其中聚丙烯酰胺浓度被定制为特异性用于有效分离具有一定分子量(例如21kDa)的多肽。对于本发明的任何方面，p21的量需要足以用于可与任何背景信号区分的检测，例如用于使用第二标记抗体的检测，其中所述标记优选具有酶活性或是化学发光的、荧光的或放射性的。
具有所述分子量范围的多房棘球绦虫多肽(任选与所述电泳凝胶片缔合的)可例如通过电印迹转移至诊断上有用的优选固相载体，所述载体任选地为测试条优选线印迹的形状。固相载体可以另外包括来自多房棘球绦虫的一种或多种重组和/或纯化的诊断有关的多肽。在优选的实施方案中，如本文所用的术语“纯化的”多肽是指多肽构成所存在的所有多肽的至少50、60、70、80、90、95或99％，如通过SDS PAGE随后考马斯染色和目视检查所判断的。
本发明涉及诊断上有用的载体，其优选为固相载体，用于使特异性捕获抗体的工具(所述工具与所述载体缔合)与来自受试者，优选人受试者的体液样品接触。在优选的实施方案中，固相载体是诊断装置，更优选选自包含一种或多种珠子、测试条、微量滴定板、印迹、玻璃表面、生物芯片和膜的组，更优选选自包含印迹、测试条和膜的组。在最优选的实施方案中，诊断上有用的载体是线印迹(Raoult,D.,and Dasch,G.A.(1989),The line blot:an immunoassay for monoclonal and other antibodies.Its application to theserotyping of gram-negative bacteria.J.Immunol.Methods,125(1-2),57-65；WO2013041540)。在优选的实施方案中，本文所用的术语“线印迹”是指已用一种或多种用于捕获抗体的工具(优选各自为多肽)包被的测试条，更优选是基于膜的。如果使用两种或更多种工具，则它们优选在载体上(优选沿测试条形式的载体形状的纵轴)是在空间上分开的。优选地，带的宽度为测试条的宽度的至少30％，更优选地40％，50％，60％，70％或80％。测试条可以包含一个或多个对照带，用于确认其适当的条件下，特别是在存在人血清、抗体缀合物或两者的情况下，已与样品接触足够长的时间。许多诊断方案包括线印迹是可商购获得的，例如获自EUROIMMUN AG,Lübeck,Germany。
必要的是，用于实施本发明的样品包含抗体，也称为免疫球蛋白。通常，样品是包含受试者的抗体的代表性集合的体液。样品可以选自包含全血、血清、脑脊液和唾液的组，并且优选是血清或血浆，更优选血清。优选地，抗体是人抗体。
必要的是，诊断上有用的载体包含用于特异性捕获针对来自棘球绦虫优选多房棘球绦虫的诊断相关的一种或多种抗原性多肽的抗体的工具。根据本发明的诊断上有用的载体用作一种或多种这些工具的支架，所述工具是特异性捕获目标抗体的分子。本领域技术人员知道多种制备和鉴定具有所需结合性质的分子或定制现有分子的方法。这些分子包括但不限于多肽、适体、小分子及其衍生物，并且优选是抗原性多肽。所述载体适于执行诊断方法。
诊断相关的抗原性多肽的第一组包括：除p21以外，包含来自多房棘球绦虫的p7、p16/18和p25/26的组的多肽。这些是已知的抗原性多肽，优选是非重组的，其根据它们的分子量命名(Aslan,M.,Yüksel,P,Polat,E.,Cakan,H.,Ergin,S.,
Figure BDA0001132732450000081
Y.A.,Zengin,K.,Arikan,S.,Saribas,A.,Mamal Torum,M.,Kocazeybek,B.(2011)The diagnostic valueof Western blot method in patients with cystic echinococcosis,New.Microbiol.23,173-177)。诊断相关的抗原性多肽的第二组包括来自包含来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b、来自多房棘球绦虫的Em18和Em95的组的那些多肽，其中术语来自细粒棘球绦虫的“AgB8/1a”、“AgB8/1b”、“AgB8/2”、“AgB8/3”、“AgB8/4a”和“AgB8/4b”、来自多房棘球绦虫的“Em18”和“Em95”是指分别由数据库代码SEQ ID NO1(Eg AgB8/1a)、SEQ ID NO 2(Eg AgB8/1b)、SEQ ID NO 3(Eg AgB8/2)、SEQ ID NO 4(Eg AgB8/3)、SEQ ID NO 5(Eg AgB8/4a)、SEQ ID NO 6(Eg_AgB8/4b),SEQ IDNO 7(多房棘球绦虫Em18)和SEQ ID No 8(多房棘球绦虫Em95)代表的序列。任选地一种或多种这些多肽或其变体(例如来自包含来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b的组的那些)可以融合以产生诸如SEQ ID NO 9的融合蛋白。在本申请全文中提及的任何数据库代码是指在本申请的优先权日时可通过NCBI数据库在线获得的代表性多肽序列。
根据本发明，载体包括用于特异性捕获抗体的一种或多种工具，优选一种或多种，更优选两种或更多种，更优选三种或更多种，更优选四种或更多种这样的工具，它们中的每一种能够特异性捕获不同的抗体。所述工具优选固定在所述载体上。在优选的实施方案中，用于特异性捕获目标抗体的工具是包含与所述抗体结合的抗原性多肽(优选来自包含来自多房棘球绦虫的p21、p7、p16/18和p25/26、来自细粒棘球绦虫的AgB8/1a、AgB8/1b、AgB8/2、AgB8/3、AgB8/4a和AgB8/4b、来自多房棘球绦虫的Em18和Em95)的或由其组成的抗原性多肽。所述抗原性多肽含有一个或多个包含至少7个、优选10个、更优选15个氨基酸的特征性表位，其赋予与来自感染患者的样品中的抗体特异性结合的能力。所述抗原性多肽与其附着至的不溶性载体一起可以以直接方式例如通过过滤、离心或倾析从包含待分析样品的反应混合物中分离。一种或多种这些抗原性多肽(例如来自多房棘球绦虫的p21)可用于制造用于治疗疾病的药物或用于制造用于诊断疾病的药剂，所述疾病是棘球绦虫感染。
所述抗原性多肽可以以可逆或不可逆的方式固定。例如，如果分子经由可以通过加入高浓度的盐掩蔽的离子相互作用与载体相互作用，或者如果分子通过可切割的共价键结合，则固定是可逆的。相比之下，如果分子通过不能在水溶液中裂解的共价键连接到载体上，则固定是不可逆的。所述多肽可以是间接固定的，例如通过固定对多肽具有亲和力的抗体或其它实体，然后加入多肽并形成多肽-抗体复合物。
然而，本发明的教导不仅可以使用具有本申请中明确或隐含提及(例如通过功能、名称、序列或登录号)的精确序列的多肽来执行，还可以使用这样的多肽的变体来执行。
在优选的实施方案中，如本文所用的术语“变体”可以指所提及的全长序列的至少一个片段，更具体地，相对于全长序列而言在一个或两个末端上截短一个或多个氨基酸的一个或多个氨基酸或核酸序列。这样的片段包含或编码具有原始序列的至少10、15、25、50、75、100、150或200个连续氨基酸的肽或其变体。变体的总长度可以是25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨基酸。在天然蛋白质的情况下，这样的片段可以通过有限的蛋白水解来制备。在重组蛋白的情况下，另一种可能性是表达截短的多肽。
在另一个优选的实施方案中，术语“变体”不仅涉及至少一个片段，而且还涉及包含氨基酸序列的多肽或其片段，优选包含至少25个，更优选50个，更优选200个连续氨基酸的片段，所述氨基酸序列可以与所提及的参考氨基酸序列或其片段具有至少40、50、60、70、75、80、85、90、92、94、95、96、97、98或99％的同一性，其中除了对多肽的生物活性(例如特异性结合目标抗体的能力)或折叠和结构必需的那些氨基酸之外的氨基酸被缺失或取代和/或一个或多个这样的必需氨基酸以保守方式被替换和/或氨基酸被添加或缺失以使得多肽的生物活性至少被部分保留。现有技术包括可用于比对两个给定的核酸或氨基酸序列和计算同一性程度的各种方法，参见例如Arthur Lesk(2008),Introduction tobioinformatics,Oxford University Press,2008，第三版。在优选的实施方案中，使用ClustalW软件(Larkin,M.A.,Blackshields,G.,Brown,N.P.,Chenna,R.,McGettigan,P.A.,McWilliam,H.,Valentin,F.,Wallace,I.M.,Wilm,A.,Lopez,R.,Thompson,J.D.,Gibson,T.J.,Higgins,D.G.(2007):Clustal W and Clustal X version2.0.Bioinformatics,23,2947-2948)，应用默认设置。
在优选的实施方案中，变体可以另外包含化学修饰，例如同位素标记或共价修饰，例如糖基化，磷酸化，乙酰化，脱羧基化，瓜氨酸化，羟基化等。这可以包括与天然、重组或化学合成的蛋白质一起的天然或重组蛋白质或化学的、非重组的连接。本领域技术人员熟悉用于修饰多肽的方法。此外，还可以通过与其它已知多肽或其变体融合来产生变体。
多肽的变体具有生物活性。在优选的实施方案中，这样的生物活性是从获自感染棘球绦虫的受试者的样品(其包含这样的抗体)而非获自健康受试者的样品捕获针对各多肽的抗体的能力。
用于进行本发明的教导的任何多肽(包括任何变体)被设计来使得其是抗原性的，即包含由来自患有棘球绦虫感染更优选患有细粒棘球绦虫或多房棘球绦虫感染的患者的抗体(而非来自健康受试者的抗体)特异性识别的表位。在一个实施方案中，这样的多肽包含6、7、8、9、10、11、12、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个(优选至少9个但不超过16个)来自各天然棘球绦虫多肽的连续氨基酸的区段。本领域技术人员熟悉用于设计具有足够免疫原性的肽的指南，例如在Jackson,D.C.,Fitzmaurice,C.J.,Brown,L.E.,Zeng,W.(1999),Preparation and properties of totally synthetic immunogenes,VaccineVolume 18,Issues 3–4,September 1999,Pages355–361；and Black,M.,Trent,A.,Tirrell,M.and Olive,C.(2010),Advances in the design and delivery of peptidesubunit vaccines with a focus on Toll-like receptor agonists,Expert RevVaccines,2010February；9(2):157–173中描述的那些。简言之，期望肽满足尽可能多的以下要求：(a)它具有高的亲水性程度，(b)它包含一个或多个选自包含天冬氨酸、脯氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的组的残基，(c)为了更高的特异性，它与其它已知的肽或多肽没有或几乎没有同源性，(d)它需要是充分可溶的，和(e)除非因特定原因需要，否则它不包含糖基化或磷酸化位点。或者，可以遵循生物信息学方法，例如由Moreau,V.,Fleury,C.,Piquer,D.,Nguyen,C.,Novali,N.,Villard,S.,Laune,D.,Granier,C.and Molina,F.(2008),PEPOP:Computational design of immunogenic peptides,BMC Bioinformatics 2008,9:71描述的那些。
如果使用抗原性多肽作为用于特异性捕获抗体(例如针对p21的抗体)的工具，当用于实施本发明的教导时，所述多肽可以任何形式和以任何纯化程度从包含内源形式的所述多肽的组织或细胞、更优选过表达该多肽的细胞、这样的细胞的粗制或富集的裂解物提供为纯化和/或分离的基本上纯的多肽。在优选的实施方案中，多肽是天然多肽，其中本文所用的术语“天然多肽”是指折叠的多肽，更优选从组织或细胞、更优选从哺乳动物细胞或组织、任选地从非重组组织或细胞纯化的折叠多肽。如果使用天然多肽，与其天然状态相比，其优选是富集的。根据本发明捕获或检测的抗体优选是IgG类抗体。
根据本发明，多肽可以是重组蛋白，其中本文使用的术语“重组”是指在生产过程的任何阶段使用遗传工程方法产生的多肽，例如通过将编码多肽的核酸融合至用于在细胞或组织中过表达的强启动子，或通过改造多肽本身的序列。本领域技术人员熟悉用于工程化核酸和所编码的多肽的方法(例如，在Sambrook,J.，Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989)，Molecular Cloning，CSH中或在Brown T.A.(1986)，Gene Cloning-anintroduction，Chapman&Hall中所描述的)以及用于产生和纯化天然或重组多肽的方法(例如由GE Healthcare Life Sciences出版的手册“Strategies for ProteinPurification”，“Antibody Purification”，以及在Burgess,R.R.，Deutscher,M.P.(2009)：Guide to Protein Purification中描述的)。在另一个优选的实施方案中，多肽是分离的多肽，其中术语“分离的”是指与使用生物技术或合成方法生产时的状态相比多肽已被富集并且优选是纯的，即如通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳接着考马斯蓝染色和目视检查所判断的，各自样品中至少60、70、80、90、95或99％的多肽由所述多肽组成。
根据本发明的受试者是产生抗体、优选感染相关抗体、更优选来自哺乳动物、最优选来自人的抗体的生物体。优选地，根据本发明的方法没有在人或动物体上实施，而是在体外条件下实施。
在本发明范围内的是包含用于特异性捕获针对抗原性多肽(例如p21)的抗体的工具的诊断上有用的载体。在优选的实施方案中，本文所用的术语“特异性捕获抗原”是指特异性结合目标抗体的能力，使其结合并从样品中除去，而不是结合任何抗体或来自样品中存在的某个抗体类别的任何抗体。
根据本发明，提供了用于特异性检测捕获的抗体的工具，任选地作为试剂盒的一部分。在优选的实施方案中，如本文所用的术语“特异性检测捕获的抗体”是指由于工具特异性结合抗体的可变区的能力(所述抗体的可变区而不是其恒定区决定抗体的结合特异性)，特异性结合用于特异性捕获抗体的所述工具(优选p21)的抗体在捕获后被检测到，而不是样品中存在的全部抗体被检测到，。在优选的实施方案中，如本文所用的术语“特异性结合”是指比以1×10-5M，更优选1×10-7M，更优选1×10-8M，更优选1×10-9M，更优选1×10- 10M，更优选1×10-11M，更优选1×10-12M的解离常数为特征的结合反应更强的结合，如使用Biacore设备通过表面等离子体共振在25℃下在pH7的PBS缓冲液中所测定的。
在优选的实施方案中，根据本发明的用于特异性捕获针对第一抗原性多肽的抗体的工具和根据本发明的用于特异性捕获针对第二抗原性多肽的抗体的工具在分开的载体上。这意味着该工具不附接到单个载体，而是附接到分开的和/或可分开的一个或多个载体而不损坏它们。例如，用于特异性捕获抗体p21的工具可以附接到第一测试条，并且检测针对p16的抗体附接到与第一测试条分开的另一测试条。
在另一个优选的实施方案中，根据本发明的用于特异性捕获针对第一抗原性多肽的抗体的工具和根据本发明的用于特异性捕获针对第二抗原性多肽的抗体的工具在一个载体上，优选共价连接至一个载体。这意味着该工具附接到一个不能被拆开的载体上而不损坏该载体，以使得该工具在分开的载体上。例如，所述工具可以全部涂布在一个测试条上，特别是以线印迹的形式。
根据本发明的教导提供了一种试剂盒，其优选用于诊断棘球绦虫感染，更优选用于区分细粒棘球绦虫与多房棘球绦虫感染。这样的试剂盒是包含以下内容的容器：实施本发明方法所需的特定试剂，任选地除了实施根据本发明的方法所需的一种或多种溶液之外，特别是根据本发明的诊断上有用的载体，优选选自或全部选自包含样品稀释缓冲液、洗涤缓冲液和包含用于检测任何特定捕获抗体的工具的缓冲液的组，所述捕获抗体为例如二抗和任选用于检测二抗的工具。此外，它可以包括详述如何使用根据本发明的试剂盒和用于使根据本发明的多肽与来自受试者、优选人受试者的体液样品接触的诊断上有用的载体的说明书，所述载体为例如线印迹，其中将根据本发明的用于特异性捕获p21、优选包含p21或其变体的多肽的工具固定在线印迹上。此外，试剂盒可以包含阳性对照(例如已知结合p21的抗体)和阴性对照(例如对p21没有可检测的亲和力的蛋白质，例如牛血清白蛋白)。最后，这样的试剂盒可以包含用于制备校准曲线的包含p21结合抗体的标准溶液。在优选的实施方案中，试剂盒包括装置，优选基于印迹的装置，例如用用于特异性捕获根据本发明的抗原性多肽的工具涂布的线印迹。
根据本发明，可以提供用于检测一种或多种捕获抗体的工具。本领域技术人员知道可以使用的许多方法。在优选的实施方案中，使用结合一种或多种捕获抗体(其是相应的一抗)的恒定区的二抗，所述二抗可以与直接检测的标记相关联，例如荧光、放射性或酶活性标记，后者可以催化化学发光反应或使用比色法或光谱法或另一种分析方法可检测的分子的产生。
在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“诊断”是指旨在获得在评估患者是否或有可能或比平均值或比较受试者(后者优选地具有相似的症状)更可能在过去、在诊断时或在将来的时候患有某种疾病或病症的有用信息以找出疾病如何进展或在未来有可能进展或评估患者针对某种治疗(例如施用合适的药物)的反应性的任何种类的操作。换句话说，术语“诊断”不仅包括帮助诊断，而且包括预后和/或监测疾病或病症进程的努力。
因此，术语“诊断”优选地不暗示根据本发明的诊断方法或试剂将是确定性的并且足以基于单个测试(更不用说参数)来完成诊断。相比之下，必须强调的是，必须收集过多的进一步的信息，特别是通过成像技术(超声扫描和计算机断层扫描)，并且必须由医生仔细考量以获得一致的图片，其允许所述医生提供最终的诊断。
术语“诊断”可以指对所谓的“鉴别诊断”的贡献，即，考虑基于一系列诊断参数的一系列可能条件的可能性的系统诊断操作。术语“诊断”还可以指用于为患者选择最有希望的治疗方案的方法或药剂。换句话说，所述方法或药剂可涉及选择受试者的治疗方案。
本发明涉及一种方法，其包括在来自受试者的样品中检测针对抗原性多肽(例如p21)的抗体的步骤。这样的方法可以包括步骤a)提供来自受试者的样品，b)在与包含诊断上有用的载体和抗体的复合物的形成相容的条件下，使样品与根据本发明的诊断上有用的载体，更具体地用于特异性捕获与抗原结合的抗体的工具接触c)分离任何所述复合物，例如通过除去样品，d)任选地洗涤所述复合物，和e)检测所述复合物。该方法优选是体外方法。根据本发明的抗体，更具体地所述复合物的检测包括使用选自包含以下的组的方法：免疫扩散技术，免疫电泳技术，光散射免疫测定，凝集技术，标记的免疫测定例如放射性标记的免疫测定、酶免疫测定例如比色测定、化学发光免疫测定和免疫荧光技术。本领域技术人员熟悉这些方法，其也在现有技术中描述，例如在Zane,H.D.(2001):Immunology–Theoretical&Practical Concepts in Laboratory Medicine,W.B.Saunders Company中，特别是第14章中。
在许多情况下，检测抗体(任选地意指确定样品中抗体的浓度是否超过某一阈值)足以用于诊断。如果可以检测到抗体，则该结果将有助于临床医生的诊断，并且表明患者患有疾病的可能性增加。在优选的实施方案中，可以测定血清中抗体相对于可能在平均健康受试者中发现的水平的相对浓度。在优选的实施方案中，如本文所使用的术语“检测”是指足以确认是否可以使用合适的复合物检测方法检测足够超过任何背景水平的信号，所述检测方法指示目标抗体存在或者比健康受试者存在更多的目标抗体。在更优选的实施方案中，这可以包括确定浓度是否为至少0.1，优选0.2、0.5、1、2、5、10、20、25、50、100、200、500、1000、10000或100000倍高于在平均健康受试者中发现的目标抗体的浓度。
在优选的实施方案中，同时(即在相同的时间)检测至少两种抗体，每种针对根据本发明的不同抗原性多肽。这在有效诊断操作方面是方便的，因为在给定时间段内获得最大的诊断信息。当然前提条件是有足够的容量可用于运行所有反应。
在优选的实施方案中，在空间上分开的反应中检测至少两种抗体，每种抗体针对根据本发明的抗原性多肽。这意味着这些反应在分开的容器中在不同的反应混合物中运行。
如果要检测多于一种抗体，则该方法可以在一锅反应中进行。优选地，本文使用的术语“一锅反应”是指为了检测抗体的存在或不存在而进行的两个或更多个、优选所有反应在一个反应容器中在相同的反应混合物中进行，而在反应之间没有物理屏障，这与考虑在分开的溶液和反应容器中进行至少两个反应的实验设置相反。一锅模式是有利的，因为仅需要设置一个反应，因此节省时间和资源。可以减少所需的样品的最小体积。
通过以下附图和非限制性实施例进一步说明本发明，从中可以获得本发明的其它特征、实施方案、方面和优点。
图1显示了根据本发明的诊断上有用的载体。它是线印迹，其包含用分子量范围为7至160kDa的多房棘球绦虫提取物多肽(其根据分子量、然后通过电泳、随后通过电印迹转移到线印迹上分离)包被的部分。
此外，它包含来自细粒棘球绦虫的重组融合蛋白AgB8/1a,AgB8/1b,AgB8/2,AgB8/3,AgB8/4a和AgB8/4b和来自多房棘球绦虫的重组Em18和Em95。
图2显示了以与前述相同的方式产生的一系列线印迹。每个都已经与不同的患者样品接触。各种显影印迹的比较显示p21是与先前使用的抗原性多肽(例如p18)不同的抗原性多肽。
图3显示了包含根据分子量分离的天然棘球绦虫蛋白的部分线印迹。
在本申请全文中提及许多多肽序列。它们包括：
Figure BDA0001132732450000171
实施例1：诊断上有用的载体的制备
图1中描述的线印迹用于本文所述的实验程序。其从多房棘球绦虫多肽提取物通过电泳根据分子量分离多肽进行制备，所述提取物包含分子量范围为7至160kDa的蛋白质p7，p16/18，p21和p25/26，如Spiliotis,M.,Tappe,D.,Sesterhenn,L.,和Brehm,K.(2004)Long-termin in vitro cultivation of Echinococcus multilocularis metacestodesunder axenic conditions Parasitol.Res.92(5),430-432所述并进行少量修改进行制备，并将得到的分离的多肽转移到膜上，其中分离的多肽的模式保持完整。此外，使用包含AgB8/1a，AgB8/1b，AgB8/2，AgB8/3，AgB8/4a和AgB8/4b的重组融合蛋白(SEQ ID NO 9)和重组多肽Em18(SEQ ID NO 16)和Em95(SEQ ID NO17)包被膜。使用用于分离GST和/或His标记蛋白的标准方案纯化所有重组蛋白。
实施例2：诊断可靠性的评估
为了测定灵敏度、特异性、物种分化率和与其它寄生虫感染的交叉反应性，使用从健康血液供体获得的50个血清、从肿瘤患者获得的50个血清、从感染多房棘球绦虫的患者获得的52个血清、从感染细粒棘球绦虫的患者获得的55个血清、从感染其它寄生虫的患者获得的122个血清(n＝5个丝虫属(Filaria)，n＝10个弓蛔虫属(Toxocara)，n＝16个异尖线虫属(Anisakis)，n＝10个类圆线虫属(Strongyloides)，n＝9个血吸虫属(Schistosoma)，n＝2个多蠕虫(Multi-Helminth)，n＝7个疟原虫属(Plasmodium)，n＝10个蛔虫属(Ascaris)，n＝7个绦虫属(Taenia)，n＝13个毛线虫属(Trichinella)，n＝17个片形属(Fasciola)，n＝11个内阿米巴属(Entamoeba)，n＝5个利什曼原虫属(Leishmania)。患者由临床医生专家全面检查以建立各自的诊断。这包括基于血清学、超声波检查和计算机断层扫描的诊断检查。
如实施例1中所述产生的印迹随后与患者血清接触并使用随商购的抗细粒棘球绦虫蛋白质印迹(DY2320-G,EUROIMMUN,Lübeck)提供的试剂和说明书进行显色。
如果可以检测到针对来自包含Em18、Em95、AgB融合蛋白、p7、p16/18和p21的组中的至少一种抗原的抗体，则得出各患者患有棘球绦虫感染的结论。
针对Em18和/或Em95的抗体被认为指示多房棘球绦虫感染，而在不存在针对Em18和/或Em95的抗体的情况下针对AgB融合蛋白的抗体被认为指示细粒棘球绦虫感染。
结果：
研究显示灵敏度为93％，特异性为100％，物种分化率为81％，且交叉反应性为6％。
在通过在图3所示的底部通道中分析的样品所例示的几个病例中，可以基于针对p21的抗体检测棘球绦虫感染，而不能检测到针对p7或p16/18的抗体。
Figure IDA0001132732510000011
Figure IDA0001132732510000021
Figure IDA0001132732510000031
Figure IDA0001132732510000041
Figure IDA0001132732510000051
Figure IDA0001132732510000061
Figure IDA0001132732510000071
Figure IDA0001132732510000081
Figure IDA0001132732510000091
Figure IDA0001132732510000101
Figure IDA0001132732510000111
Figure IDA0001132732510000121
Figure IDA0001132732510000131
Figure IDA0001132732510000141

Claims (8)

1.一种诊断上有用的载体，其中包含：
(a)来自多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的p7多肽；
(b)来自多房棘球绦虫的p16/18多肽；
(c)来自多房棘球绦虫的p21多肽；
(d)来自多房棘球绦虫的p25/26多肽；
(e)包含SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的重组多肽；
(f)包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的重组多肽；和
(g)包含SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的重组多肽；并且
其中所述诊断上有用的载体是膜。
2.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的诊断上有用的载体。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其中还包含用于检测被捕获的抗体的工具。
4.用于在来自受试者的样品中检测针对来自多房棘球绦虫的p21多肽的抗体的工具在制备用于诊断棘球绦虫感染的制剂中的用途，其中所述制剂包含：
(a)来自多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)的p7多肽；
(b)来自多房棘球绦虫的p16/18多肽；
(c)来自多房棘球绦虫的p21多肽；
(d)来自多房棘球绦虫的p25/26多肽；
(e)包含SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的重组多肽；
(f)包含SEQ ID NO：16所示氨基酸序列的重组多肽；和
(g)包含SEQ ID NO：17所示氨基酸序列的重组多肽；并且
其中(a)-(g)中所述的多肽被包被在膜上。
5.根据权利要求4所述的用途，其中同时检测针对来自权利要求4中(a)-(g)中所述的多于一种多肽的抗体。
6.根据权利要求4或5所述的用途，其中在空间上分开的结合反应中或在一锅反应中检测针对多于一种所述多肽的抗体。
7.根据权利要求6所述的用途，其中在一锅反应中检测针对多于一种所述多肽的抗体。
8.根据权利要求4或5所述的用途，其中针对p21多肽的抗体被单独地检测，并且可以与结合p16/18多肽的抗体区分开。
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