ES2714513T3 - Ensayo novedoso para el diagnóstico de infecciones helmínticas - Google Patents

Abstract

Un transportador útil para el diagnóstico que comprende un medio para capturar específicamente un anticuerpo contra p21 procedente de Echinococcus multilocularis en una muestra de un sujeto, en la que el transportador comprende adicionalmente (a) medios para capturar específicamente anticuerpos contra uno o más polipéptidos de p7 y p16/18 procedentes de Echinococcus multilocularis, y (b) medios para capturar específicamente anticuerpos contra uno o más polipéptidos de AgB8/1a definido en la SEQ ID NO:1, AgB8/1 b definido en la SEQ ID NO:2, AgB8/2 definido en la SEQ ID NO:3, AgB8/3 definido en la SEQ ID NO:4, AgB8/4a definido en la SEQ ID NO:5 y AgB8/4b definido en la SEQ ID NO:6 procedentes de Echinococcus granulosus, y Em18 definido en la SEQ ID NO:7 y Em95 definido en la SEQ ID NO:8 procedentes de Echinococcus multilocularis, en el que p21 es un peso molecular que tiene un peso molecular aparente de 21 kDa según se analiza mediante SDS PAGE en condiciones reductoras.

Description

DESCRIPCION

Ensayo novedoso para el diagnostico de infecciones helmmticas

La presente invencion se refiere a un transportador util en diagnostico para capturar espedficamente un anticuerpo contra p21 procedente de Echinococcus multilocularis en una muestra del sujeto; un kit que comprende el transportador util en diagnostico, que preferentemente comprende ademas un medio para detectar cualquier anticuerpo capturado; un procedimiento para comprender la etapa de detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo contra p21 procedente de Echinococcus multilocularis en una muestra de un sujeto; un uso de p21 procedente de Echinococcus multilocularis o una variante del mismo para aumentar la fiabilidad del diagnostico, preferentemente, la sensibilidad de un ensayo para la deteccion de una infeccion por Echinococcus, preferentemente para distinguir una infeccion por Echinococcus multilocularis de una infeccion por Echinococcus granulosus; un polipeptido que resulta con un peso molecular de 21 kDa procedente de Echinococcus multilocularis, que se puede obtener mediante la separacion por pesos moleculares de un extracto procedente de Echinococcus multilocularis usando electroforesis en gel, o una variante del mismo, o un anticuerpo contra dicho polipeptido.

La infeccion por helmintos o la infeccion por gusanos, tambien conocida como helmintiasis, es una enfermedad macroparasttica que se puede transmitir a mairnferos tales como seres humanos, perros, zorros y lobos, caracterizada por la infeccion del cuerpo por helmintos tales como tenias del tipo Echinococcus. E. granulosus y E. multilocularis y dos de los principales parasitos del planeta. Mas de un millon de personas se han infectado con uno de ellos en un momento dado.

Existen dos tipos principales de infecciones por Echinococcus, equinococcosis dstica y equinococcosis alveolar. Las infecciones en seres humanos se producen tras la ingestion de huevos. Las larvas se liberan en el intestino del hospedador, penetran en las vellosidades intestinales y migran a varios organos.

La enfermedad frecuentemente se inicia sin smtomas y estos pueden tardar un ano. Los smtomas y signos que se producen posteriormente dependen de la situacion y el tamano del quiste. La enfermedad alveolar se inicia habitualmente en el hngado, pero despues se disemina a otras partes del organismo tales como los pulmones o el cerebro. Cuando el tngado esta afectado, la persona puede tener dolor abdominal, asf como perdida de peso, y presentar ictericia. La enfermedad pulmonar puede producir dolor toracico, dificultades respiratorias y tos. Sin tratamiento, las infecciones por Echinococcus pueden ser letales.

Como el paciente puede estar asintomatico durante algun tiempo y resulta cada vez mas diffcil proporcionar un tratamiento eficaz a medida que la enfermedad progresa, son muy deseables herramientas fiables para el serodianostico temprano de las infecciones helmmticas en seres humanos.

Los pacientes infectados con Echinococcus presentan una variedad de respuestas inmunitarias (Gottstein, B., Mesarina, B., Tanner, I., Ammann, R. W., Wilson, j. F., Eckert, J. Lanier, A. (1991): Specific Cellular and Humoral Immune Responses in Patients with Different Long-Term Courses of Alveolar Echinococcosis (Infection with Echinococcus multilocularis). Am. J. Trop Med. Hy. 45, 734-742.

Por lo tanto, los inmunoensayos convencionales basados en antfgenos naturales, que se pueden extraer de gusanos completos o de cultivos in vitro, se pueden usar en inmunotransferencias para detectar anticuerpos del hospedador contra el parasito (Ayadi, a., Dutoit, B., Sendid, B., y Camus, D (1995): Specific Diagnostic Antigens of Echinococcus granulosus detected by Western Blot. Parasite 2, 119-123). Dichos dispositivos estan comercialmente disponibles, por ejemplo, de EUROIMMUN, Lubeck (Anti-Echinococcus-granulosus We STERNBLOT).

Estos antfgenos naturales tienen disponibilidad limitada, tienen variaciones de un lote a otro y carecen del grado de fiabilidad diagnostica que sena deseable. Otros inconvenientes incluyen el hecho de que frecuentemente presentan reactividad cruzada, es decir, se reconocen por el suero de pacientes infectados con dos o mas especies de helmintos.

Ademas de detectar Echinococcus, los parasitologos tienen interes en distinguir material procedente de E. granulosus y E. multilocularis. Aunque las larvas de ambos parasitos se encuentran predominantemente en el hngado, sus distribuciones por el organismo del hospedador difieren en estadios del desarrollo posteriores, con implicaciones significativas para el tratamiento de los pacientes infectados. Por ejemplo, E. granulosus se encuentra con mas frecuencia en el pulmon, mientras que E. multilocularis puede entrar tanto en el pulmon como en el cerebro del hospedador.

Por lo tanto, un problema subyacente en la presente invencion es proporcionar un ensayo para detectar o ayudar en la deteccion de infecciones por Echinococcus que suponga una mejora comparado con los ensayos del estado de la tecnica relativos a uno o mas de sus diversos inconvenientes.

Otro problema subyacente en la presente invencion es proporcionar un ensayo para la deteccion de Echinococcus que tenga mayor grado de fiabilidad, en terminos de especificidad y sensibilidad, con respecto a la deteccion de infecciones por Echinococcus multilocularis y Echinococcus granulosus en comparacion con los ensayos de la tecnica.

Otro problema subyacente en la presente invencion es proporcionar un ensayo que tenga mayor grado de fiabilidad con respecto a la distincion entre infecciones por Echinococcus multilocularis y Echinococcus granulosus en comparacion con los ensayos del estado de la tecnica.

El problema subyacente en la presente invencion se resuelve mediante la materia sujeto de las reivindicaciones independientes y dependientes adjuntas.

En un primer aspecto, el problema subyacente en la presente invencion se resuelve mediante un transportador util en diagnostico que comprende un medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra p21 procedente de Echinococcus multilocularis en una muestra de un sujeto.

El transportador comprende ademas un medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra uno o mas polipeptidos seleccionados entre el grupo que comprende p7 y p16/18 y opcionalmente p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis, preferentemente todos ellos.

En otra realizacion preferida del primer aspecto, el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra un polipeptido del grupo que comprende p21, p7, p16/18 y p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis es el respectivo polipeptido del grupo que comprende p21, p7, p16/18 y p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis o una variante del mismo, preferentemente en una forma natural del polipeptido.

En otra realizacion preferida del primer aspecto, el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra un polipeptido del grupo que comprende p21, p7, p16/18 y p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis se proporciona en forma de un extracto polipeptfdico procedente de Echinococcus, preferentemente Echinococcus multilocularis, mas preferentemente separado por pesos moleculares,

y, y en el que el extracto polipeptfdico comprende p16/18 y p21 procedente de Echinococcus multilocularis que se han separado lo suficiente para permitir la distincion entre un anticuerpo contra p16/18 de otro anticuerpo contra p21. En particular, la distancia entre p16/18 y p21 sobre el transportador es tal que las bandas asociadas con el mismo no se solapan de forma que una senal que indique la union e un anticuerpo contra p16/18 no se pueda distinguir de una senal que indique la union de un anticuerpo contra p21. En otras palabras, el transportador se puede usar para detectar si los anticuerpos contra p16/18, contra p21, o los anticuerpos contra ambos p16/18 y p21 estan presentes en la muestra.

El transportador comprende ademas un medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra uno o mas polipeptidos seleccionados entre el grupo que comprende AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus, Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis, preferentemente todos ellos.

En otra realizacion preferida del primer aspecto, el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra uno o mas polipeptidos seleccionados entre el grupo que comprende AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus, Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis es el respectivo polipeptido del grupo que comprende AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus, Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis o una variante de los mismos, proporcionados preferentemente en la forma de uno o mas polipeptidos recombinantes y/o purificados.

En un segundo aspecto, el problema subyacente en la presente invencion se resuelve mediante un kit que comprende el transportador util en diagnostico de acuerdo con la presente invencion, que preferentemente comprende ademas un medio para detectar cualquier anticuerpo capturado.

En un tercer aspecto, el problema subyacente en la presente invencion se resuelve mediante un procedimiento que comprende la etapa de detectar un anticuerpo contra p21 procedente de Echinococcus multilocularis en una muestra de un sujeto.

El procedimiento tambien comprende detectar un anticuerpo contra uno o mas polipeptidos seleccionados entre el grupo que comprende p7 y pl6/18 y opcionalmente p25/26, preferentemente todos ellos, mas preferentemente p7 y p16/pl8, lo mas preferible p7.

El procedimiento tambien comprende la etapa de detectar un anticuerpo contra uno o mas polipeptidos seleccionados entre el grupo que comprende AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus, Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis, preferentemente todos ellos.

En otra realizacion preferida del tercer aspecto, los anticuerpos contra mas de uno de los polipeptidos de dicho grupo se detectan simultaneamente.

En otra realizacion preferida del tercer aspecto, los anticuerpos contra mas de uno de los polipeptidos de dicho grupo se detectan en reacciones de union espacialmente separadas, o en una reaccion en un unico recipiente, preferentemente en una reaccion en un unico recipiente.

En otra realizacion preferida del tercer aspecto, en la que un anticuerpo contra p21 detectado se puede distinguir de un anticuerpo que se une a p16/18.

Tambien se desvela el uso de p21 procedente de Echinococcus, preferentemente Echinococcus multilocularis o una variante del mismo para aumentar la fiabilidad del diagnostico, preferentemente, la sensibilidad de un ensayo para la deteccion de una infeccion por Echinococcus, mas preferentemente para distinguir una infeccion por Echinococcus multilocularis de una infeccion por Echinococcus granulosus.

Se desvela en el presente documento un polipeptido que tiene un peso molecular de 21 kDa procedente de Echinococcus multilocularis o una variante del mismo, que se puede obtener mediante la separacion por pesos moleculares de un extracto procedente de Echinococcus multilocularis usando electroforesis en gel, o un anticuerpo contra dicho polipeptido.

La presente invencion se basa en el sorprendente hallazgo de los inventores de que un novedoso polipeptido de Echinococcus, denominado en toda esta solicitud como "p21", existe y que, cuando se incorpora a los ensayos para detectar una infeccion por Echinococcus, puede potenciar la sensibilidad global del ensayo.

La presente invencion se centra alrededor de un ensayo para diagnosticar una infeccion por Echinococcus que implica detectar, en una muestra de un sujeto con sospecha de tener una infeccion por Echinococcus, anticuerpos contra el polipeptido p21 procedente de Echinococcus multilocularis. p21 es un polipeptido que tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 21 kDa segun se analiza mediante SDS PAGE en condiciones reductoras, y su comparacion con el comportamiento de analisis de las protemas marcadoras de peso molecular patron analizadas en las mismas condiciones. Las bandas del polipeptido p21 transcurre entre las bandas de los polipeptidos p16/p18 y p25/26 descritos en el estado de la tecnica. La deteccion de los anticuerpos contra p21, y preferentemente contra uno o mas polipeptidos del grupo que comprende p7, p16/18 y p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis, AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus y Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis puede corroborar la suposicion de que el paciente padece una infeccion por Echinococcus y proporcionar informacion relevante para el diagnostico. Preferentemente, el transportador util en diagnostico comprende p16/18 y p21 procedentes de Echinococcus multilocularis o una variante de los mismos, que se han separado lo suficiente para permitir la distincion entre un anticuerpo contra p16/18 de otro anticuerpo contra p21. Mas preferentemente, puede comprender la adicion, en orden de preferencia creciente, p7; p7 y Em18 procedentes de Echinococcus multilocularis; p7, Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis; o p7, Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis y AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus o variantes de los mismos. Preferentemente, cualquier polipeptido derivado del grupo que comprende p7, p16/18 y p21 es un polipeptido natural, mientras que cualquier polipeptido derivado del grupo que comprende Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis y AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus es recombinante. Dicho transportador se puede usar para detectar una infeccion por Echinococcus con mayor sensibilidad.

La protema natural se puede obtener preparando un extracto polipeptfdico procedente de Echinococcus multilocularis preferentemente segun el protocolo de Spiliotis, M., Tappe, D., Sesterhenn, L., y Brehm, K. (2004) Long-termin in vitro cultivation of Echinococcus multilocularis metacestodes under axenic conditionsParasitol. Res.

92 (5), 430-432. p21 se puede detectar, en la totalidad del procedimiento de purificacion, mediante inmunotransferencia, usando una muestra de un paciente infectado que reacciona con p21 como fuente de anticuerpos. Preferentemente, p21 se enriquece con respecto a su proporcion en otros polipeptidos del tejido natural, por ejemplo, separando el extracto polipeptfdico por tamanos, recogiendo las fracciones, y preparando una mezcla que comprende un volumen de las fracciones que contienen p21 que supere el volumen de otras fracciones. Preferentemente, el p21 usado de acuerdo con la invencion es un p21 no recombinante purificado a partir de un tejido.

La banda de la protema que comprende p21 se puede recortar del gel tras finalizar la electroforesis, y eluirse la protema usando tecnicas convencionales para purificacion de protemas. Se puede separar de cualquier polipeptido que se analice con un peso molecular similar mediante cromatograffa de afinidad, usando una muestra de un paciente infectado reactivo con p21 para obtener el anticuerpo contra p21 como ligando de afinidad. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con dichos procedimientos.

Como alternativa, un trozo del gel de electroforesis que comprende los polipeptidos procedentes de Echinococcus, preferentemente Echinococcus multilocularis que tienen una proporcion enriquecida de polipeptidos, entre ellos de p21, que tienen determinado intervalo de pesos moleculares, segun se considera mediante marcadores de peso molecular patron, en comparacion con un extracto polipeptfdico no procesado, se puede recortar de un gel de electroforesis obtenido sometiendo un extracto polipeptidico procedente de Echinococcus, preferentemente Echinococcus multilocularis, a electroforesis en gel preparativa. Preferentemente, el intervalo de pesos moleculares del gel incluye polipeptidos de 1 a 200 kDa, mas preferentemente de 5 a 100 kDa, mas preferentemente de 6 a 50 kDa y mas preferentemente de 7 a 30 kDa, en el que, lo mas preferible, los polipeptidos naturales procedentes de Echinococcus, preferentemente de Echinococcus multilocularis, no comprendidos en dicho intervalo de pesos moleculares esta presentes en menor proporcion en que el extracto polipeptfdico obtenido directamente del organismo. Los polipeptidos no comprendidos en dicho intervalo de pesos moleculares pueden estar opcionalmente ausentes, por ejemplo, como resultado de recortar el trozo de gel que comprende el intervalo de pesos moleculares deseados, y de descartar el resto del gel. Estan disponibles otras opciones para producir una fraccion de polipeptidos procedentes de Echinococcus, preferentemente de Echinococcus multilocularis, enriquecida en dichos polipeptidos, en comparacion con un extracto polipeptfdico no procesado, comprendido en dicho intervalo de pesos moleculares, por ejemplo, el uso de la cromatograffa de exclusion molecular.

Es ventajoso que cualquier separacion por pesos moleculares sea suficiente para permitir la distincion entre p21 y cualquier otro polipeptido que tenga un peso molecular similar, por ejemplo p18 y p25/p26. La persona experta en la tecnica esta familiarizada con las tecnicas adecuadas, por ejemplo, electroforesis en gel usando geles con una concentracion de poliacrilamida espedficamente adaptada para la separacion eficaz de polipeptidos que tienen un determinado peso molecular, por ejemplo 21 kDa. La cantidad de p21, para cualquier aspecto de la presente invencion, debe ser suficiente para que la deteccion se pueda separar de cualquier senal del fondo, por ejemplo, para su deteccion usando un anticuerpo secundario marcado, en el que, preferentemente, la marca tiene actividad enzimatica o es quimioluminiscente, fluorescente o radiactiva.

Los polipeptidos de Echinococcus multilocularis que tienen dicho intervalo de pesos moleculares, opcionalmente, asociados con dicho trozo de gel de electroforesis, se pueden transferir, por ejemplo, mediante electrotransferencia, a un transportador util para el diagnostico, preferentemente un transportador solido, opcionalmente en forma de una tira reactiva, preferentemente una lmea de transferencia. El transportador solido puede comprender uno o mas polipeptidos recombinantes y/o purificados relevantes para el diagnostico procedentes de Echinococcus multilocularis ademas. En una realizacion preferida, la expresion polipeptido "purificado", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido que constituye al menos un 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % de todos los polipeptidos presentes, segun se considera mediante SDS PAGE seguido de tincion de Coomassie y exploracion visual.

La invencion se refiere a un transportador util para el diagnostico, que es preferentemente un transportador solido para poner en contacto un medio para capturar espedficamente un anticuerpo, lo que significa que esta asociado con dicho transportador, con una muestra de fluido corporal procedente de un sujeto, preferentemente un sujeto humano. En una realizacion preferida, el transportador solido es un dispositivo diagnostico, mas preferentemente seleccionado del grupo que comprende una o mas perlas, una tira reactiva, una placa de microtitulacion, una transferencia, una superficie de vidrio, un biochip y una membrana, mas preferentemente del grupo que comprende una transferencia, una tira reactiva y una membrana. En una realizacion mas preferida, el transportador util para el diagnostico es una lmea de transferencia (Raoult, D., y Dasch, G. a. (1989), The line blot: an immunoassay for monoclonal and other antibodies. Its application to the serotyping of gram-negative bacteria. J. Immunol. Methods, 125 (1-2), 57-65; WO2013041540). En una realizacion preferida, la expresion "lmea de transferencia", como se usa en el presente documento, se refiere a una tira reactiva, mas preferentemente de tipo membrana, que se ha revestido con uno o mas medios para capturar un anticuerpo, preferentemente un polipeptido cada uno. Si se utilizan dos o mas medios, estan preferentemente separados entre sf en el transportador, preferentemente a lo largo del eje longitudinal de un transportador en forma de una tira reactiva. Preferentemente, la anchura de la banda es al menos un 30, mas preferentemente un 40, 50, 60, 70 u 80 % de la anchura de la tira reactiva. La tira reactiva puede comprender una o mas bandas de control para confirmar que se ha puesto en contacto el tiempo suficiente con la muestra y en condiciones adecuadas, en particular en presencia de un suero humano, conjugado de anticuerpos, o ambos. Estan comercialmente disponibles muchas soluciones para diagnostico que incluyen transferencias en lmea, por ejemplo, de EUROIMMUN, Lubeck, Alemania.

Es fundamental que la muestra utilizada para llevar a la practica en la presente invencion comprenda anticuerpos, tambien denominados como inmunoglobulinas. Tfpicamente, la muestra es un fluido corporal que comprende un conjunto representativo de los anticuerpos del sujeto. La muestra se puede seleccionar del grupo que consiste sangre completa, suero, lfquido cefalorraqrndeo y saliva, y es preferentemente suero o plasma, mas preferentemente suero. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos humanos.

Es fundamental que el transportador util para el diagnostico comprenda un medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra uno o mas polipeptidos antigenicos de relevancia diagnostica procedentes de Echinococcus, preferentemente Echinococcus multilocularis. El transportador util para el diagnostico de acuerdo con la invencion sirve como estructura base para el uno o mas de estos medios, que son moleculas que capturan espedficamente el anticuerpo de interes. El experto en la tecnica es conocedor de la minada de procedimientos para fabricar e identificar moleculas con las propiedades de union deseadas o para adaptar una molecula existente. Estas moleculas incluyen, aunque no de forma limitativa, butorfanol, aptameros, moleculas pequenas, y derivados de los mismos, y son preferentemente polipeptidos antigenicos. Dicho transportador es adecuado para transportar un procedimiento de diagnostico.

Un primer grupo de polipeptidos antigenicos de relevancia diagnostica incluye, ademas de p21, los polipeptidos del grupo que comprende p7, p16/18 y p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis. Estos son polipeptidos antigenicos conocidos, preferentemente no recombinantes, denominados segun su peso molecular (Asian, M., Yuksel, P, Polat, E., Cakan, H., Ergin, S., oner, Y. a., Zengin, K., Arikan, S., Saribas, a., Mamal Torum, M., Kocazeybek, B. (2011) The diagnostic value of Western blot method in patients with cystic echinococcosis, New.

Microbiol. 23, 173-177). Un segundo grupo de polipeptidos antigenicos de relevancia diagnostica incluye los del grupo que comprende AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus, Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis, en el que los terminos "AgB8/1a", "AgB8/1b", "AgB8/2", "AgB8/3", "AgB8/4a" y "AgB8/4b" procedentes de Echinococcus granulosus, "Em18" y "Em95" procedentes de Echinococcus multilocularis, se refieren a las secuencias presentadas por los codigos de bases de datos SEQ ID NO1 (Eg AgB8/1a), SEQ ID NO 2 (EG AgB8/1b), SEQ ID NO 3 (Eg AgB8/2), SEQ ID NO 4 (Eg AgB8/3), SEQ ID NO 5 (Eg AgB8/4a), SEQ ID NO 6 (Eg_AgB8/4b), SEQ ID NO 7 (Echinococcus multilocularis Em18) y SEQ ID No 8 (Echinococcus multilocularis Em95), respectivamente. Opcionalmente, uno o mas de estos polipeptidos o variante de los mismos, por ejemplo, los del grupo que comprende AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus, se pueden fusionar para generar una protema de fusion tal como la SEQ ID NO 9. Cualesquiera codigos de bases de datos a los que se haga referencia a lo largo de la presente solicitud se refieren a la correspondiente secuencia polipeptfdica disponible mediante las bases de datos del NCBI publicadas en lmea en la fecha de prioridad de la presente solicitud.

De acuerdo con la presente invencion, el transportador comprende uno o mas medios para capturar espedficamente un anticuerpo, preferentemente uno o mas, mas preferentemente dos o mas, mas preferentemente tres o mas, mas preferentemente cuatro o mas de dichos medios, capaz cada uno de ellos para capturar espedficamente un anticuerpo diferente, como se define en las presentes reivindicaciones. Dicho medio esta preferentemente inmovilizado sobre dicho transportador. En una realizacion preferida, el medio para capturar espedficamente un anticuerpo de interes es un polipeptido antigenico que comprende o consiste del polipeptido antigenico al que se une el anticuerpo, preferentemente del grupo que comprende p21, p7, p16/18 y p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis, AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus y Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis. Dicho polipeptido antigenico contiene uno o mas epttopos caractensticos que comprenden al menos 7, preferentemente l0, mas preferentemente 15 aminoacidos, que transmiten la capacidad de unirse espedficamente al anticuerpo en una muestra procedente de un paciente infectado. Dicho polipeptido antigenico, junto con el transportador insoluble al que esta unido, se puede separar de una mezcla de reaccion que comprende una muestra a analizar de una forma directa, por ejemplo, mediante filtracion, centrifugacion o decantacion. Uno o mas de estos polipeptidos antigenicos, por ejemplo p21 procedente de Echinococcus multilocularis, se puede usar en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad, o usarse en la fabricacion de un agente para diagnosticar una enfermedad, dicha enfermedad es una infeccion por Echinococcus.

Dicho polipeptido antigenico se puede inmovilizar de una forma reversible o irreversible. Por ejemplo, la inmovilizacion es reversible si la molecula interactua con el transportador mediante interacciones ionicas que se pueden enmascarar mediante la adicion de una elevada concentracion de sal o si la molecula esta unida mediante un enlace covalente escindible. Por el contrario, la inmovilizacion es irreversible si la molecula esta unida al transportador mediante un enlace covalente que no se puede escindir en solucion acuosa. El polipeptido se puede inmovilizar indirectamente, por ejemplo, inmovilizando un anticuerpo u otra entidad que tenga afinidad por el polipeptido, seguido por la adicion del polipeptido y la formacion de un complejo polipeptidos-anticuerpo.

Sin embargo, las ensenanzas de la presente invencion pueden no solo llevarse a cabo usando polipeptidos que tengan las secuencias exactas a las que se hace referencia explfcitamente en la presente solicitud, por ejemplo, por la funcion, nombre, secuencia o numero de referencia, o implfcitamente, pero tambien usando variantes de dichos polipeptidos.

En una realizacion preferida, el termino "variante", como se usa en el presente documento, se puede referir a al menos un fragmento de la secuencia de longitud completa que se cita, mas espedficamente, uno o mas secuencias de aminoacidos o de acido nucleico que, con respecto a la secuencia de longitud completa, esta truncada en uno o ambos extremos mediante uno o mas aminoacidos. Dicho fragmento comprende o codifica un peptido que tiene al menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150 o 200 aminoacidos sucesivos de la secuencia original, o una variante de la misma. La longitud total de la variante puede ser de 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mas aminoacidos. En el caso de una protema natural, dichos fragmentos se pueden preparar mediante proteolisis limitada. En el caso de una protema recombinante, una posibilidad adicional es expresar polipeptidos truncados.

En otra realizacion preferida, el termino "variante" se refiere no solamente a al menos un fragmento, sino tambien a un polipeptido o un fragmento del mismo que comprende secuencias de aminoacidos, preferentemente un fragmento que comprende al menos 25, mas preferentemente 50, mas preferentemente 200 aminoacidos sucesivos, que son al menos 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % identicos a la secuencia de aminoacidos de referencia que se cita o a un fragmento de la misma, en la que aminoacidos diferentes a los esenciales para la actividad biologica, por ejemplo, la capacidad para unirse a un anticuerpo de interes, o el pliegue o estructura del polipeptido se eliminan o sustituyen y/o uno o mas de dichos aminoacidos esenciales se sustituyen de una forma conservativa y/o los aminoacidos se anaden o se eliminan de forma que la actividad biologica del polipeptido de conserva al menos en parte. El estado de la tecnica comprende varios procedimientos que se pueden usar para alinear dos secuencias de acidos nucleicos o de aminoacidos dadas y calcular el grado de identidad, veanse por ejemplo, Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3a edicion. En una realizacion preferida, el programa informatico ClustalW (Larkin, M. a., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. a., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, a., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948) se utiliza aplicando la configuracion por defecto.

En una realizacion preferida, las variantes pueden comprender, ademas, modificaciones químicas, por ejemplo marcas isotopicas o modificaciones covalentes tales como glicosilacion, fosforilacion, acetilacion, descarboxilacion, citrulinacion, hidroxilacion y similares. Esto puede incluir la ligadura química no recombinante de una protema natural o recombinante con una protema natural, recombinante o químicamente sintetizada. El experto en la tecnica esta familiarizado con los procedimientos para la modificacion de polipeptidos. Ademas, se pueden generar tambien variantes mediante fusion con otros polipeptidos conocidos o las variantes de los mismos.

La variante del polipeptido tiene actividad biologica. En una realizacion preferida, dicha actividad biologica es la capacidad de capturar un anticuerpo con el polipeptido respectivo a partir de una muestra obtenida de un sujeto infectado por Echinococcus que comprende dicho anticuerpo, pero no de una muestra obtenida de un sujeto sano.

Cualquier polipeptido utilizado para llevar a cabo las ensenanzas inventivas, incluyendo cualquier variante, se disena de forma que sea antigenico, es decir, comprende epftopos reconocidos espedficamente por anticuerpos de pacientes que padecen una infeccion por Echinococcus (pero no anticuerpos de sujetos sanos), mas preferentemente de una infeccion por E. granulosus o E. multilocularis. En una realizacion, dicho polipeptido comprende un tramo de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o mas, preferentemente al menos 9, pero no mas de 16, aminoacidos consecutivos del respectivo polipeptido de Echinococcus natural. El experto en la tecnica esta familiarizado con las directrices usadas para disenar peptidos que tienen inmunogenicidad suficiente, por ejemplo, las descritas en Jackson, D. C., Fitzmaurice, C. j., Brown, L. E., Zeng, W. (1999), Preparation and properties of totally synthetic immunogenes, Vaccine Volumen 18, Fasdculos 3-4, septiembre de 1999, paginas 355-361; y Black, M., Trent, a., Tirrell, M. y Olive, C. (2010), Advances in the design and delivery of peptide subunit vaccines with a focus on Toll-like receptor agonists, Expert Rev Vaccines, febrero de 2010; 9(2): 157-173. En resumen, es deseable que el peptido cumpla tanto como sea posible los siguientes requerimientos: (a) tenga un alto grado de hidrofilicidad, (b) comprenda uno o mas restos seleccionado entre el grupo que comprende aspartato, prolina, tirosina y fenilalanina, (c) tenga, para una mayor especificidad, ninguna o poca homologfa con otros peptidos o polipeptidos conocidos, (d) necesita ser suficientemente soluble y (e) no comprenda sitios de glicosilacion o fosforilacion salvo que se requiera por motivos espedficos. Como alternativa, se pueden seguir estrategias bioinformaticas, por ejemplo, las descritas por Moreau, V., Fleury, C., Piquer, D., Nguyen, C., Novali, N., Villard, S., Laune, D., Granier, C. y Molina, F. (2008), PEPOP: Computational design of immunogenic peptides, BMC Bioinformatics 2008, 9:71.

Si se usa un polipeptido antigenico como el medio para capturar espedficamente un anticuerpo, por ejemplo, p21, dicho polipeptido, cuando se usa para llevar a cabo las ensenanzas de la presente invencion, puede proporcionarse en cualquier forma y en cualquier grado de purificacion, a partir de tejidos o celulas que comprenden dicho polipeptido en una forma endogena, mas preferentemente celulas que expresan en exceso el polipeptido, los lisados en bruto o enriquecidos de dichas celulas, a un polipeptido purificado y/o aislado que es esencialmente puro. En una realizacion preferida, el polipeptido es un polipeptido natural, en el que el termino "polipeptido natural", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido plegado, mas preferentemente a un polipeptido plegado purificado a partir de tejidos o celulas, mas preferentemente de celulas o tejido de mairnferos, opcionalmente de tejidos o celulas no recombinantes. Si se usa un polipeptido natural, esta preferentemente enriquecido en comparacion con su estado natural. El anticuerpo capturado o detectado de acuerdo con la presente invencion es preferentemente un anticuerpo de clase IgG.

De acuerdo con la presente invencion, el polipeptido puede ser una protema recombinante, en el que el termino "recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipeptido producido utilizando estrategias de ingeniena genetica en cualquier etapa del procedimiento de produccion, por ejemplo, fusionando un acido nucleico que codifica el polipeptido a un promotor fuerte para la expresion en exceso en celulas o tejidos o disenando mediante ingeniena genetica la secuencia del propio polipeptido. El experto en la tecnica esta familiarizado con los procedimientos para disenar mediante ingeniena genetica los acidos nucleicos y los polipeptidos codificados (por ejemplo, descritos en Sambrook, j., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH o en Brown T. a. (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) y para producir y purificar polipeptidos nativos o recombinantes (por ejemplo Handbooks "Strategies for Protein Purification", "Antibody Purification", publicado por GE Healthcare Life Sciences, y en Burgess, R. R., Deutscher, M. P. (2009): Guide to Protein Purification). En otra realizacion preferida, el polipeptido es un polipeptido aislado, en el que el termino "aislado" significa que el polipeptido se ha enriquecido en comparacion con su estado tras la produccion utilizando una estrategia biotecnologica o sintetica y es preferentemente puro, es decir, al menos un 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento del polipeptido en la muestra respectiva consiste en dicho polipeptido segun la electroforesis en gel de SDS poliacrilamida seguida por la tincion con azul de Coomassie y exploracion visual.

El sujeto de acuerdo con la presente invencion es un organismo productor de anticuerpos, preferentemente, anticuerpos relacionados con una infeccion, mas preferentemente de un mai^ero, lo mas preferible un ser humano. Preferentemente, ninguno de los procedimientos de acuerdo con las presentes invenciones se practican en el cuerpo humano o animal, sino en condiciones in vitro.

Comprendido en el ambito de la presente invencion esta un transportador util para el diagnostico que comprende medios para capturar espedficamente un anticuerpo para un polipeptido antigenico tal como p21. En una realizacion preferida, la expresion "capturar espedficamente un antfgeno", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de unirse espedficamente al anticuerpo de interes con el fin de que se una y elimine de la muestra en lugar de unirse a cualquier anticuerpo o a algun anticuerpo de una determinada clase de anticuerpos presente en la muestra.

De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un medio para detectar espedficamente un anticuerpo capturado, opcionalmente como parte de un kit. En una realizacion preferida, la expresion "detectar espedficamente un anticuerpo capturado", como se usa en el presente documento, significa que el anticuerpo se une espedficamente al medio para capturar espedficamente el anticuerpo, preferentemente p21, tras la captura, se detecto mas bien que la totalidad de los anticuerpos presentes en la muestra debido a la capacidad del medio para unirse espedficamente a la region variable del anticuerpo que determina la especificidad de union del anticuerpo y no su region constante. En una realizacion preferida, la expresion "union de forma espedfica", como se usa en el presente documento, significa que la union es mas fuerte que una reaccion de union caracterizada por una constante de disociacion de 1 x 10-5 M, mas preferentemente 1 x 10-7 M, mas preferentemente 1 x 10-8 M, mas preferentemente 1 x 10-9 M, mas preferentemente 1 x 10-10 M, mas preferentemente 1 x 10-11 M, mas preferentemente 1 x 10-12 M, como se determina mediante resonancia de plasmon superficial utilizando un equipo Biacore a 25 °C en tampon PBS a pH 7.

En una realizacion preferida, el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra un primer polipeptido antigenico de acuerdo con la presente invencion y el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra un segundo polipeptido antigenico de acuerdo con la presente invencion esta en transportadores independientes. Esto significa que el medio no esta unido a un unico transportador, sino a uno o mas transportadores que estan separados y/o son separables sin danarlos. Por ejemplo, el medio para capturar espedficamente un anticuerpo p21 puede estar unido a una primera tira reactiva y el medio para detectar un anticuerpo contra p16 esta unido a otra tira reactiva que esta separada de la primera tira reactiva.

En otra realizacion preferida, el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra un primer polipeptido antigenico de acuerdo con la presente invencion y el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra un segundo polipeptido antigenico de acuerdo con la presente invencion esta en uno, preferentemente unidos covalentemente a un transportador. Esto significa que el medio esta unido a un transportador que no puede desmontarse, sin danar el transportador, de manera que los medios estan en transportadores separados. Por ejemplo, la tira reactiva puede estar revestida con todos los medios, particularmente en la forma de una transferencia en lmea.

Las ensenanzas de acuerdo con la presente invencion proporcionan un kit, preferentemente para el diagnostico de una infeccion por Echinococcus, mas preferentemente para distinguir entre una infeccion por E. granulosus de una infeccion por E. multilocularis. Dicho kit es un recipiente que comprende los reactivos espedficos requeridos para llevar a la practica el procedimiento de acuerdo con la presente invencion, en particular el transportador util para el diagnostico de acuerdo con la presente invencion, opcionalmente, ademas de una o mas soluciones requeridas para llevar a la practica el procedimiento de acuerdo con la presente invencion, seleccionadas preferentemente de o entre todo el grupo que comprende un tampon de dilucion de muestra, tampon de lavado y tampon que comprende un medio para detectar cualquier anticuerpo espedficamente capturado, tal como un anticuerpo secundario y opcionalmente un medio para detectar este ultimo. Ademas, puede comprender instrucciones que detallan como usar el kit y el transportador util para el diagnostico de acuerdo con la presente invencion para poner en contacto el polipeptido de acuerdo con la presente invencion con una muestra de fluido corporal procedente de un sujeto, preferentemente un sujeto humano, por ejemplo una transferencia en lmea, en el que el medio para capturar espedficamente p21 de acuerdo con la presente invencion, preferentemente un polipeptido que comprende p21 o una variante del mismo, se inmoviliza sobre la transferencia en lmea. Ademas, el kit puede comprender un control positivo, por ejemplo, un anticuerpo conocido por unirse a p21, y un control negativo, por ejemplo, una protema que no tiene afinidad detectable por p21 tal como albumina de suero bovino. Finalmente, dicho kit puede comprender una solucion patron que comprende un anticuerpo de union a p21 para preparar una curva de calibracion. En una realizacion preferida, el kit comprende un dispositivo, preferentemente un dispositivo basado en una transferencia tal como una transferencia en lmea revestida con un medio para capturar espedficamente un polipeptido antigenico de acuerdo con la presente invencion.

De acuerdo con la invencion, se puede proporcionar un medio para detectar el uno o mas anticuerpos capturados. El experto en la tecnica conoce muchos procedimientos que se pueden usar. En una realizacion preferida, se usa la union de un anticuerpo secundario a la region constante del uno o mas anticuerpos capturados, que es el correspondiente anticuerpo primario, cuyo anticuerpo secundario puede estar asociado con una marca que es facil de detectar, por ejemplo una marca fluorescente, radioactiva o enzimaticamente activa, la ultima de la cual puede catalizar una reaccion quimioluminiscente o la generacion de una molecula detectable usando colorimetna o espectroscopfa u otro procedimiento analttico.

En una realizacion preferida, el termino "diagnostico", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tipo de procedimiento destinado a obtener informacion instrumental para evaluar si un paciente padece o es probable o mas probable que un sujeto promedio o sujeto comparativo padezca (teniendo el ultimo preferentemente smtomas similares) una determinada enfermedad o trastorno en el pasado, en el momento del diagnostico o en el futuro, para descubrir como esta progresando la enfermedad o como progresara probablemente en el futuro o para evaluar la sensibilidad de un paciente con respecto a un determinado tratamiento, por ejemplo, la administracion de farmacos adecuados. En otras palabras, el termino "diagnostico" comprende no solo ayudar al diagnostico, sino tambien un pronostico y/o los esfuerzos por vigilar el curso de una enfermedad o trastorno.

Por lo tanto, el termino "diagnostico" no implica preferentemente que los procedimientos de diagnostico o los agentes de acuerdo con la presente invencion sean definitivos y suficientes para finalizar el diagnostico sobre la base de un unico ensayo, y mucho menos un unico parametro. Por el contrario, se debe enfatizar que se debe recopilar una gran cantidad de informacion adicional, en particular, mediante tecnicas de formacion de imagenes (barrido ultrasonico y tomograffa computarizada, y debe ponderarse cuidadosamente por un doctor en medicina para obtener para obtener una imagen coherente que permita a dicho doctor proporcionar un diagnostico final.

El termino "diagnostico" puede referirse a una contribucion a lo que se denomina "diagnostico diferencial", es decir, un procedimiento de diagnostico sistematico que considera la probabilidad de una gama de posibles dolencias sobre la base de una gama de parametros diagnosticos. El termino "diagnostico" puede referirse tambien a un procedimiento o agente utilizado para escoger el regimen de tratamiento mas prometedor para un paciente. En otras palabras, el procedimiento o agente puede referirse a la seleccion de un regimen de tratamiento para un sujeto.

La presente invencion se refiere a un procedimiento que comprende la etapa de detectar en una muestra procedente de un sujeto un anticuerpo contra un polipeptido antigenico tal como p21. Dicho procedimiento puede comprender las etapas de a) proporcionar una muestra procedente de un sujeto, b) poner en contacto la muestra con el transportador util para el diagnostico de acuerdo con la presente invencion en condiciones compatibles con la formacion de un complejo que comprende el transportador util para el diagnostico y el anticuerpo, mas espedficamente el medio para capturar espedficamente el anticuerpo unido al antfgeno, c) aislar cualquiera de dichos complejos, por ejemplo, retirando la muestra, d) lavar opcionalmente dicho complejo, y e) detectar dicho complejo. El procedimiento es preferentemente un procedimiento in vitro. La deteccion de un anticuerpo, mas espedficamente dicho complejo de acuerdo con la presente invencion comprende el uso de un procedimiento seleccionado entre el grupo que comprende tecnicas de inmunodifusion, tecnicas inmunoelectroforeticas, inmunoensayos mediante dispersion de luz, inmunoensayos mediante dispersion de luz, tecnicas de aglutinacion, inmunoensayos marcados tales como los del grupo que comprende un inmunoensayo radiomarcado, enzimoinmunoanalisis tales como analisis colorimetricos, inmunoensayos de quimioluminiscencia y tecnicas de inmunofluorescencia. El experto en la tecnica esta familiarizado con dichos procedimientos, que se describen tambien en el estado de la tecnica, por ejemplo en Zane, H. D. (2001): Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, en particular en el Capttulo 14.

En muchos casos, detectar un anticuerpo, significa opcionalmente determinar si la concentracion del anticuerpo en la muestra esta mas alla de un determinado umbral suficiente para el diagnostico. Si se puede detectar el anticuerpo, este resultado sera instrumental para el diagnostico del medico e indica una mayor probabilidad de que el paciente padezca la enfermedad. En una realizacion preferida, se puede determinar la concentracion relativa del anticuerpo en el suero, en comparacion con el nivel que se puede encontrar en el sujeto sano promedio. En una realizacion preferida, El termino "detectar", como se usa en el presente documento, significa que es suficiente comprobar si se puede detectar una suficientemente mas alla de cualquier nivel de fondo utilizando un procedimiento de deteccion del complejo adecuado que indica que el anticuerpo de interes esta presente o estan presentes mas anticuerpos de interes que lo que estanan en un sujeto sano. En una realizacion mas preferida, esto puede implicar determinar si la concentracion es al menos 0,1, preferentemente 0,2, 0,5, 1, 2, 5, l0, 20, 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 10000 o 100000 veces mayor que la concentracion del anticuerpo de interes que se encuentra en el sujeto sano promedio.

En una realizacion preferida, al menos dos anticuerpos, cada uno de ellos contra un polipeptido antigenico diferente de acuerdo con la presente invencion, se detectan simultaneamente, es decir a la vez. Esto es conveniente en terminos de procedimientos diagnosticos eficaces, ya que se obtiene una maxima informacion de diagnostico en un periodo de tiempo dado. Por supuesto, un requisito previo es que este disponible la capacidad suficiente para realizar todas las reacciones.

En una realizacion preferida, al menos dos anticuerpos, cada uno de ellos contra un polipeptido antigenico de acuerdo con la presente invencion, se detectan en reacciones espacialmente separadas. Esto significa que estas reacciones se realizan en diferentes mezclas de reaccion en recipientes separados.

Si se va a detectar mas de un anticuerpo, el procedimiento se puede llevar a cabo como reaccion en un unico recipiente. Preferentemente, la expresion "reaccion en un unico recipiente", como se usa en el presente documento, significa que dos o mas, preferentemente todas las reacciones realizadas con el fin de detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo se llevan a cabo en las misma mezcla de reaccion en un recipiente de reaccion, sin barreras ffsicas entre las reacciones, a diferencia de los escenarios experimentales, que contemplan que al menos dos reacciones se llevan a cabo en soluciones y recipientes de reaccion independientes. El modo de un unico recipiente es ventajoso, ya que solo se debe configurar una reaccion, ahorrando de esta forma tiempo y recursos. Se puede reducir el volumen mmimo de muestra necesario.

La presente invencion se ilustra adicionalmente por las siguientes figuras y ejemplos no limitativos de los que se pueden extraer caractensticas, realizaciones, aspectos y ventajas adicionales de la presente invencion.

La Fig. 1 muestra un transportador util para el diagnostico de acuerdo con la presente invencion. Se trata de una transferencia en lmea que comprende una seccion revestida con polipeptidos del extracto polipeptfdico de E. multilocularis en el intervalo de pesos moleculares de 7 a 160 kDa, separado por pesos moleculares anteriormente mediante electroforesis seguido de transferencia sobre la lmea de transferencia mediante electrotransferencia.

Ademas, comprende una protemas de fusion recombinante AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus y Em18 y Em95 recombinantes procedentes de Echinococcus multilocularis.

La Fig. 2 muestra un intervalo de transferencias en lmea producidas de la misma forma que se ha descrito anteriormente. Cada una se ha puesto en contacto con una muestra de un paciente diferente. La comparacion entre las diferentes transferencias reveladas muestra que p21 es un polipeptido antigenico diferente de los polipeptidos antigenicos anteriormente usados tales como pl8.

La Fig. 3 muestra la parte de las transferencias en lmea que comprenden las protemas de Echinococcus naturales separadas por pesos moleculares.

Numerosas secuencias polipeptfdicas se citan en toda esta solicitud. Estas incluyen:

Ejemplo 1: Produccion del transportador util para el diagnostico

La transferencia en lmea representado graficamente en la Fig. 1 se uso para el programa experimental descrito en el presente documento. Se preparo separando electroforeticamente por pesos moleculares polipeptidos procedentes de un extracto polipeptfdico de E. multilocularis que comprende las protemas p7, p16/18, p21 y p25/26 en el intervalo de pesos moleculares de 7 a 160 kDa, preparado como se ha descrito en Spiliotis, M., Tappe, D., Sesterhenn, L., y Brehm, K. (2004) Long-termin in vitro cultivation of Echinococcus multilocularis metacestodes under axenic conditions Parasitol. Res. 92 (5), 430-432., con modificaciones poco importantes, y transferir los polipeptidos separados resultantes sobre una membrana, en el que el patron de polipeptidos que se ha separado permanece intacto. Ademas, la membrana se reviso usando una protema de fusion recombinante que comprende AgB8/1a,

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un transportador util para el diagnostico que comprende un medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra p21 procedente de Echinococcus multilocularis en una muestra de un sujeto, en la que el transportador comprende adicionalmente

(a) medios para capturar espedficamente anticuerpos contra uno o mas polipeptidos de p7 y p16/18 procedentes de Echinococcus multilocularis, y

(b) medios para capturar espedficamente anticuerpos contra uno o mas polipeptidos de AgB8/1a definido en la SEQ ID NO:1, AgB8/1 b definido en la SEQ ID NO:2, AgB8/2 definido en la SEQ ID NO:3, AgB8/3 definido en la SEQ ID NO:4, AgB8/4a definido en la SEQ ID NO:5 y AgB8/4b definido en la SEQ ID NO:6 procedentes de Echinococcus granulosus, y Em18 definido en la SEQ ID NO:7 y Em95 definido en la SEQ ID NO:8 procedentes de Echinococcus multilocularis,

en el que p21 es un peso molecular que tiene un peso molecular aparente de 21 kDa segun se analiza mediante SDS PAGE en condiciones reductoras.

2. El transportador util para el diagnostico de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el transportador comprende un medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra uno o mas polipeptidos de p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis.

3. El transportador util para el diagnostico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra un polipeptido del grupo que comprende p21, p7, p16/18 y p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis es el respectivo polipeptido del grupo que comprende p21, p7, p16/18 y p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis o una variante del mismo, preferentemente en una forma natural del polipeptido, en el que una variante es un polipeptido que comprende secuencias de aminoacidos que son al menos un 90 % identicas a la secuencia de aminoacidos de referencia referenciada.

4. El transportador util para el diagnostico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra un polipeptido del grupo que comprende p21, p7, p16/18 y p25/26 procedentes de Echinococcus multilocularis se proporciona en forma de un extracto polipeptfdico procedente de Echinococcus, preferentemente Echinococcus multilocularis separado por pesos moleculares, en el que el extracto polipeptfdico comprende p16/18 y p21 que se han separado lo suficiente para permitir la distincion entre un anticuerpo contra p16/18 de otro anticuerpo contra p21.

5. El transportador util para el diagnostico de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el medio para capturar espedficamente un anticuerpo contra uno o mas polipeptidos seleccionados entre el grupo que comprende AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus, Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis es el respectivo polipeptido del grupo que comprende AgB8/1a, AgB8/1b, AgB8/2, AgB8/3, AgB8/4a y AgB8/4b procedentes de Echinococcus granulosus, Em18 y Em95 procedentes de Echinococcus multilocularis o una variante de los mismos, proporcionados preferentemente en la forma de uno o mas polipeptidos recombinantes y/o, en el que una variante es un polipeptido que comprende secuencias de aminoacidos que son al menos un 90 % identicas a la secuencia de aminoacidos de referencia referenciada.

6. Un kit que comprende el transportador util para el diagnostico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que preferentemente comprende ademas un medio para detectar cualquier anticuerpo capturado.

7. Un procedimiento para comprender la etapa de detectar un anticuerpo contra p21 procedente de Echinococcus multilocularis en una muestra de un sujeto y que comprende detectar ademas

(a) anticuerpos contra uno o mas polipeptidos de p7 y p16/18; y

(b) anticuerpos contra uno o mas polipeptidos de AgB8/1a definido en la SEQ ID NO:1, AgB8/1b definido en la SEQ ID NO:2, AgB8/2 definido en la SEQ ID NO:3, AgB8/3 definido en la SEQ ID NO:4, AgB8/4a definido en la SEQ ID NO:5 y AgB8/4b definido en la SEQ ID NO:6 procedentes de Echinococcus granulosus, y Em18 definido en la SEQ ID NO:7 y Em95 definido en la SEQ ID NO:8 procedentes de Echinococcus multilocularis, en el que p21 es un peso molecular que tiene un peso molecular aparente de 21 kDa segun se analiza mediante SDS PAGE en condiciones reductoras.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7, que comprende ademas detectar un anticuerpo contra uno o mas polipeptidos de p25/26.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, en el que los anticuerpos contra mas de uno de los polipeptidos de dicho grupo se detectan simultaneamente.

10. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que los anticuerpos contra mas de uno de los polipeptidos se detectan en reacciones de union espacialmente separadas o en una reaccion en un unico recipiente, preferentemente en una reaccion en un unico recipiente.

11. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en el que un anticuerpo contra p21 se detecta independientemente y se puede distinguir de un anticuerpo que se une a p16/18.