ES2946937T3 - Detección serológica de anticuerpos contra el Plasmodium - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un polipéptido que comprende dos o más, preferiblemente todos del grupo que comprende p19 de P.falciparum o una variante de la misma, p19 de P.vivax o una variante de la misma, p19 de P.ovale o una variante de la misma, p19 de P.malariae o una variante de la misma y p19 de P.knowlesio una variante del mismo, un vehículo útil para el diagnóstico que comprende dicho polipéptido, un método que comprende el paso de detectar en un líquido dos o más anticuerpos, preferiblemente todos del grupo que comprende un anticuerpo contra p19 de P. falciparum, un anticuerpo contra p19 de P. .vivax, un anticuerpo contra p19 de P.ovale, un anticuerpo contra p19 de P.malariae y un anticuerpo contra p19 de P.knowlesi, un kit que comprende el polipéptido y un uso del polipéptido para la fabricación de un dispositivo analítico, o para la fabricación de una composición , kit o reactivo para detectar una infección por paludismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Detección serológica de anticuerpos contra el Plasmodium
La presente invención se refiere a un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, un portador útil para el diagnóstico que comprende dicho polipéptido, un procedimiento in vitro de acuerdo con la reivindicación 5, un kit que comprende el polipéptido y un uso del polipéptido para la fabricación de un dispositivo analítico, o para la fabricación de una composición, kit o reactivo para detectar una infección por Malaria.
La malaria es una enfermedad transmitida por mosquitos y causada por un parásito. Cuatro especies de parásitos del paludismo pueden infectar al ser humano en condiciones naturales: Plasmodium falciparum, P vivax, P. ovale y P. malariae. Las dos primeras especies causan la mayoría de las infecciones en todo el mundo. El P falciparum es el agente causante del paludismo grave y potencialmente mortal, y se calcula que causa entre 700.000 y 2,7 millones de muertes al año. P vivax y P. ovale tienen parásitos en fase hepática latentes, denominados hipnozαtos, que se pueden reactivar y causar paludismo varios meses o años después de la picadura del mosquito infectante. El P malariae produce infecciones de larga duración y, si no se trata, puede persistir de forma asintomática en el huésped humano durante años, incluso toda la vida.
Más recientemente, se ha demostrado que P knowlesi, cuyos huéspedes naturales incluyen macacos cangrejeros (Macaca fascicularis) y macacos de cola de cerdo, infecta a seres humanos y puede ser responsable de un número significativo de infecciones humanas en Malasia.
En los seres humanos, los parásitos crecen y se multiplican primero en las células del hígado y después en los glóbulos rojos de la sangre. En la sangre, sucesivas nidadas de parásitos crecen en el interior de los glóbulos rojos y los destruyen, lo cual libera parásitos hijos que continúan el ciclo infectando células.
La malaria se debe reconocer con prontitud para tratar al paciente a tiempo y evitar una mayor propagación de la infección en la comunidad. El paludismo se debe considerar una emergencia médica potencial y se debe tratar en consecuencia.
Aunque la malaria no complicada es bastante tratable y los síntomas no son incapacitantes, la malaria grave se produce cuando las infecciones por P. falciparum se complican con fallos orgánicos graves o anomalías en la sangre o el metabolismo del paciente.
Normalmente, la malaria se transmite por la picadura de un mosquito Anopheles infectado, pero se han registrado casos de malaria transmitida por transfusión (MTT). La TTM se puede adquirir a través de componentes sanguíneos tales como concentrados de hematíes, plaquetas, leucocitos, plasma y hematíes congelados. La TTM es poco frecuente en los países en los que la malaria no es endémica. No obstante, esta enfermedad repercute en los recursos de los bancos de sangre, dado que en los últimos años cada vez son más los posibles donantes procedentes de áreas endémicas de paludismo, ya sea como turistas, inmigrantes o trabajadores. Además, la sangre donada se puede importar de países en los que la malaria es endémica. Además, la enfermedad está reapareciendo actualmente en numerosas áreas en los que había sido erradicada en el pasado y, en consecuencia, ha aumentado el número de sujetos procedentes de áreas palúdicas. También hay que tener en cuenta que el cambio climático ha alterado recientemente la distribución de los mosquitos y es probable que permita que la malaria se extienda a nuevos países.
En numerosos países, la donación de sangre total se aplaza durante varios años en donantes potenciales que vivieron los primeros 5 años de su vida en áreas endémicas de malaria, y durante varios meses en donantes potenciales que regresan de una área endémica y en aquellos que han estado infectados previamente.
Sin embargo, este período se puede reducir si una prueba inmunológica o genómica molecular es negativa antes de una donación de sangre, para de ese modo aumentar el grupo de donantes de sangre. Por lo tanto, existe una importante demanda de inmunoensayos útiles para el diagnóstico.
Un obstáculo importante para el establecimiento de inmunoensayos fiables ha sido la falta de antígenos solubles. Incluso los fragmentos obtenidos proteolíticamente de la proteína de superficie del merozoito (MSP) son proteínas de gran tamaño y extremadamente difíciles de obtener en grandes cantidades con suficiente actividad biológica por medio de procedimientos recombinantes, como sería necesario para establecer un ensayo de rutina.
El estado de la técnica describe una serie de inmunoensayos para detectar una infección por malaria en muestras de sangre. Meyerhof, A. S. et al., (2010) Clin. and Vacc. Immunol., página 1631 a 1638 y el documento WO2009/111599 desvelan ELISA, IFA e inmunoensayo basado en microesferas para la detección de anticuerpos contra regiones carboxiterminales de 19 kDa de las proteínas de superficie del merozoito 1 (MSP-1) de P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae. Mediante el uso de un ensayo basado en perlas revestidas con los cuatro antígenos, los autores informaron de una sensibilidad de detección de IgG del 100%. Sin embargo, el ensayo parece tener una especificidad limitada, dado que las muestras de donantes de sangre sanos dieron resultados positivos. Se desvela p33, pero no como antígeno para un ensayo de diagnóstico.
Se han descrito ensayos adecuados en el estado de la técnica que ya arrojan fiabilidades de diagnóstico razonablemente buenas. Sin embargo, debido al gran número de donantes de sangre y muestras que hay que analizar y a la considerable escasez de sangre donada, cualquier optimización adicional hacia el 100% de sensibilidad y especificidad se debe considerar una valiosa contribución a la técnica.
El documento WO2011/06237 desvela una vacuna para proteger contra la malaria que comprende una región p19 de MSP-1 de P falciparum en combinación con segmentos seleccionados de p33, que tienen propiedades inmunogénicas en una vacuna. El documento no desvela que dicha mezcla se pueda aplicar a un inmunoensayo de diagnóstico, y mucho menos una mayor especificidad en el sentido de que se puedan evitar los resultados falsos negativos.
Lucchi et al (2008) desvelan diferentes respuestas de anticuerpos al complejo de proteína-I de superficie del merozoito en pacientes con malaria cerebral en la India. Sin embargo, los pacientes con paludismo cerebral están en coma, por lo que es poco probable que donen sangre. Además, no hay ningún indicador de p33, y mucho menos de que se pueda usar para aumentar la sensibilidad de una prueba basada en p19 (Lucchi et al. (2008) Antibody responses to the merozoite surface protein-I complex in cerebral malaria patients in India, Malaria Journal, 7:121). Qian et al. (2012) desvela agregados y conjugados de p42, que incluyen necesariamente un fragmento de p19 unido covalentemente al fragmento de p33 correspondiente. Los fragmentos p19 y p33 (que forman el fragmento p42) en los agregados y conjugados proceden de la misma cepa (Plasmodium falciparum) (Qian et al. (2012) Immunogenicity of Self-Associated Aggregates and Chemically Cross-Linked Conjugates of the 42 kDa Plasmodium falciparum Merozoite Surface Protein-1. PLOS ONE 7(6): e36996. doi:l0.1371/journal.pone.0036996) .
Muerhoff et al. (2010) desvela ensayos ELISA y EIA mediante el uso de MSP-1-ig de P. falciparum, P vivax, P ovale y P. malariae inmovilizados en perlas de poliestireno como antígenos de captura. El ensayo se usa para analizar la sangre de posibles donantes. Menciona explícitamente la posibilidad de combinar antígenos de diferentes cepas en un único inmunoensayo (por medio de la inmovilización de una mezcla de antígenos en la misma microesfera) para mejorar la eficacia del lest, sin embargo, no dice nada sobre p33 (Muerhoff et al. (2010) Detection of Plasmodium falciparum, P vivax, P ovale, and P malariae Merozoite Surface Protein 1-p19 Antibodies in Human Malaria Patients and Experimentally Infected Non-human Primates. CLINICAL AND VACCINE IMMUNOLOGY, oct. 2010, p. 1631 a 1638).
Priest et al. (2018) desvela un inmunoensayo serológico multiplexado para detectar anticuerpos contra la malaria mediante el uso de MSP-1-ig de P falciparum, P vivax, P ovale y P malariae covalentemente inmovilizados en perlas magnéticas como antígenos de captura. También desvela un procedimiento para determinar la capacidad del portador para unir el anticuerpo correspondiente por medio de la monitorización de la unión del anticuerpo a diferentes diluciones y el uso de estas perlas para purificar anticuerpos. Sin embargo, esta divulgación tampoco se refiere a la p33. Además, el antígeno de diferentes cepas se inmoviliza en diferentes microesferas (Priest et al. (2018) Specificity of the IgG antibody response to Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, and Plasmodium ovale MSP1 19 subunit proteins in multiplexed serologic assays. Malar J 17:417).
El documento EP 2393824 desvela secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos codificadas por las mismas, derivadas del gen de la Proteína de Superficie del Merozoito (MSPI) de las especies de Plasmodium P. malariae y P ovale. Dichos genes y proteínas tienen numerosos usos beneficiosos tanto diagnósticos como terapéuticos.
El documento US 2009/0226445 A1 desvela una metodología para determinar la presencia de anticuerpos contra MSP-119 de P. falciparum, P. vivax, P. ovale y P. malariae en una muestra mediante el uso de una mezcla de microesferas revestidas con antígenos de una sola especie, o microesferas revestidas con antígenos de las cuatro especies. No se pronuncia sobre la p33.
El documento US 2009/226445 desvela un procedimiento que consiste en poner en contacto la muestra con una mezcla de antígenos p19, p33 y p42 de diferentes cepas. Los polipéptidos “fusionados” (p42) comprenden fragmentos p19 y p33 de la misma cepa.
Pusic et al. (2011) desvela ensayos ELISA para detectar anticuerpos contra la malaria mediante el uso de MSP-1 42 de P falciparum unido covalentemente a puntos cuánticos revestidos de polímero como antígeno de captura (véase las págs. 8898 a 8900). Por analogía con 01, los polipéptidos “fusionados” (p42) comprenden fragmentos p19 y p33 de la misma cepa (Pusic et al. (2011) Blood stage merozoite surface protein conjugated to nanoparticles induce potent parasite inhibitory antibodies. Vaccine 29 (2011) 8898 a 8908).
Fonseca et al. (2016) desvela un polipéptido que comprende el p19 de P vivax elongado con un fragmento del p33 de P. vivax y fusionado en tándem con varios epítopos promiscuos de células T Esta quimera modular se usa como vacuna contra la malaria. El polipéptido quimera “fusionado” comprende fragmentos de p19 y p33 de la misma cepa (Fonseca et al. (2016) A chimeric protein-based malaria vaccine candidate induces robust T cell responses against Plasmodium vivax MSP119. SCIENTIFIC REPORTS (2016) 6:34527).
Kaira et al. (2016) desvela una quimera polipeptídica fusionada que comprende tres regiones antigénicas de P
falciparum y guarda silencio sobre p33 (Kaira et al. (2016) Antigenicity of a Bacterially Expressed Triple Chimeric Antigen of Plasmodium falciparum AAr P, MSP-311 and MSP-1 19 : PfAMSP-Fu35. PLOS ONE 31 de octubre de 2016 DOI:10.1371/journal.pone.0165720).
Por lo tanto, el problema subyacente a la presente invención es proporcionar un inmunoensayo para detectar anticuerpos contra proteínas de Plasmodium que produzca resultados más fiables que los ensayos del estado de la técnica, particularmente en términos de especificidad, sensibilidad y fiabilidad general del diagnóstico. Es deseable que un inmunoensayo de este tipo se pueda llevar a cabo de una manera de alto rendimiento con el fin de confirmar que la sangre donada no está infectada. El formato del ensayo se debe basar en proteínas solubles obtenibles por medio de procedimientos recombinantes para un uso de alto rendimiento y estandarización. Debería ser posible identificar a los donantes sanos y diagnosticar el TTM en pacientes que han recibido una transfusión de sangre, así como cribar la sangre fraccionada donada.
Los problemas se resuelven con el objeto de las reivindicaciones independientes y dependientes.
En un 1er aspecto, el problema subyacente a la presente invención se resuelve por medio de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
En una realización preferente, el polipéptido se inmoviliza, preferentemente en un portador útil para el diagnóstico. En una realización preferente, el polipéptido se purifica.
En un 2do aspecto, el problema se resuelve por medio de un portador útil para el diagnóstico revestido con el polipéptido, preferentemente inmovilizado directamente sobre el portador, en el que el portador se selecciona preferentemente del grupo que comprende un portaobjetos de vidrio, preferentemente para microscopía, un biochip, una placa de microtitulación, un dispositivo de flujo lateral, una tira reactiva, una membrana, preferentemente una transferencia en línea, una columna de cromatografía y una perla, preferentemente una perla magnética o fluorescente.
En un 3er aspecto, el problema se resuelve por medio de un procedimiento que comprende la etapa de detectar en un líquido cuatro o cinco anticuerpos, preferentemente todos del grupo que comprende
un anticuerpo contra p19 de P. falciparum,
un anticuerpo contra p19 de P. vivax,
un anticuerpo contra p19 de P. ovale,
un anticuerpo contra p19 de P. malariae y
un anticuerpo contra p19 de P. knowlesi,
que comprende la etapa de contacto del líquido con el polipéptido o portador de acuerdo con la presente invención, en la que además se detecta un anticuerpo contra un polipéptido p33 de una cepa de Plasmodium. En una realización preferente, el anticuerpo se detecta mediante el uso de un procedimiento seleccionado del grupo que comprende técnicas de inmunodifusión, técnicas inmunoelectroforéticas, inmunoensayos de dispersión de luz, técnicas de aglutinación, inmunoensayos marcados tales como los del grupo que comprende inmunoensayos radiomarcados, inmunoensayos enzimáticos, más preferentemente ELISA, inmunoensayos de quimioluminiscencia, preferentemente inmunoensayos de electroquimioluminiscencia, e inmunofluorescencia, preferentemente inmunofluorescencia indirecta.
En un 4to aspecto, el problema se resuelve por medio de un procedimiento que comprende la etapa de revestimiento de un portador útil para el análisis o el diagnóstico con el polipéptido, en el que preferentemente el portador se selecciona preferentemente del grupo que comprende un portaobjetos de vidrio, preferentemente para microscopía, un biochip, una placa de microtitulación, un dispositivo de flujo lateral, una tira reactiva, una membrana, preferentemente una transferencia en línea, una columna de cromatografía y una perla, preferentemente una perla magnética o fluorescente.
En un 5to aspecto, el problema se resuelve por medio de un uso in vitro del polipéptido o portador útil para el diagnóstico para identificar sangre de un donante de sangre no infectado.
En una realización preferente, uno o más anticuerpos se detectan en una fracción procesada de sangre, preferentemente de un donante de sangre.
En un 6to aspecto, el problema se resuelve por medio de un kit que comprende el polipéptido o portador, que además comprende uno o más reactivos del grupo que comprende uno o más de un calibrador, un tampón de lavado y un medio para detectar un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo secundario marcado.
En un 7mo aspecto, el problema se resuelve por medio de un uso del polipéptido para la fabricación de un dispositivo analítico, o para la fabricación de una composición, kit o reactivo para detectar una infección por Plasmodium.
En un 8vo aspecto, el problema se resuelve por medio de un procedimiento para determinar la capacidad, preferentemente la capacidad de un portador de acuerdo con la reivindicación 4 para unir dos o más anticuerpos a
proteínas p19 de Plasmodium, que comprende la etapa que pone en contacto el portador útil para el diagnóstico con una o más soluciones que comprenden concentraciones conocidas de los dos o más anticuerpos.
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento de los inventores de que el uso de un polipéptido de fusión que comprende cuatro o cinco polipéptidos p19 de Plasmodium mejora la fiabilidad diagnóstica, en particular la sensibilidad de un inmunoensayo para la detección de Plasmodium. En particular, la señal de detección es sorprendentemente mejor y más fácil de distinguir del fondo. Sin ánimo de ser vinculante, se teoriza que la proximidad espacial de los antígenos tiene el efecto de que varios anticuerpos a una gama de epítopos se unen cerca unos de otros y que esto conduce a una mayor densidad de anticuerpos que juntos son más fáciles de distinguir de cualquier anticuerpo de unión no específica o de cualquier señal de fondo.
La presente invención se refiere a la detección de un anticuerpo contra los polipéptidos p19 de Plasmodium basado en un polipéptido que comprende cuatro o más de ellos. En una realización preferente, el término “Plasmodium p19”, como se usa en la presente memoria, es un polipéptido que comprende un elemento de secuencia que comprende la secuencia SEC. ID Núm. 1, en la que a, b, c y d son cada uno al menos 1 y a es más preferentemente de 2 a 10, más preferentemente 5, y b es más preferentemente de 2 a 10, más preferentemente de 5 a 6, y c es más preferentemente de 5 a 15, más preferentemente de 9 a 13, y d es preferentemente, o una variante de la misma. Preferentemente, dicho polipéptido comprende un fragmento del polipéptido de tipo salvaje del que se escinde naturalmente el p19 o una variante de dicho fragmento, en el que el fragmento tiene una longitud no superior a 500, preferentemente 400, 300, 250, 200, 150, 100 o 90 aminoácidos. Por ejemplo, si el Plasmodium p19 es de P. falciparum, el fragmento es del MSP-1 de P falciparum.
En una realización más preferente, el Plasmodium p19 se selecciona del grupo que comprende p19 de P. falciparum (SEC. ID Núm. 2) y una variante del mismo, P vivax (SEC. ID Núm. 3) y una variante del mismo, P ovale (SEC. ID Núm. 4) y una variante del mismo, P malariae (SEC. ID Núm. 5) y una variante del mismo y P knowlesi (SEC. ID Núm. 6) y una variante del mismo. En una realización más preferente, uno de los al menos cuatro o cinco polipéptidos p19 de Plasmodium es de P falciparum. En otra realización más preferente, uno de los al menos cuatro o cinco polipéptidos p19 de Plasmodium es de P. vivax. En otra realización más preferente, uno de los al menos cuatro o cinco polipéptidos p19 de Plasmodium es de P. ovale. En otra realización más preferente, uno de los al menos cuatro o cinco polipéptidos p19 de Plasmodium es de P malariae. En otra realización más preferente, uno de los al menos cuatro o cinco polipéptidos p19 de Plasmodium es de P. knowlesi.
Un Plasmodium p19 se fusiona con una secuencia C-terminal de Plasmodium p33, que se fusiona con el Plasmodium p19, más preferentemente con su N-terminal, opcionalmente de forma directa, o se puede usar en el polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención como enlazador entre los dos o más polipéptidos de Plasmodium p19. En una realización preferente, esta secuencia C-terminal de Plasmodium p33 es una secuencia que comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o 15 o 17 aminoácidos del C-terminal de un Plasmodium p33, más preferentemente que comprende el motivo de consenso SXLL (SEC. ID Núm. 14), o una variante del mismo. El polipéptido p33 C-terminal puede proceder de la misma cepa de Plasmodium que el p19 al que está fusionado, preferentemente fusionado directamente. Se puede seleccionar del grupo que comprende la s Ec . ID Núm. 20 (P. vivax), la SEC. ID Núm. 22 (P. falciparum), la SEC. ID Núm. 24 (P. ovale), la SEC. ID Núm. 26 (P. malariae) y la SEC. ID Núm. 28 (P. knowlesi) y una variante de las mismas. En una realización preferente, un Plasmodium p19 fusionado a una secuencia C-terminal de Plasmodium p33 forma parte del polipéptido y se selecciona del grupo que comprende la SEC. ID Núm. 21 (P. vivax), la SEC. ID Núm. 23 (P. falciparum), la s Ec . ID Núm. 25 (P. ovale), la SEC. ID Núm. 27 (P. malariae) y la SEC. ID Núm. 29 (P. knowlesi) y una variante de las mismas.
Los términos que implican que dos polipéptidos p19 de Plasmodium y/o polipéptidos adicionales están comprendidos en un polipéptido o están fusionados significan que están unidos covalentemente en una molécula que comprende estos polipéptidos. Si bien se puede tratar de un polipéptido de fusión directa, en el sentido de que la totalidad de los polipéptidos fusionados o el polipéptido que comprende estos polipéptidos se expresa a partir de un ácido nucleico bajo el control de un promotor, cuyo ácido nucleico codifica la totalidad del polipéptido, otra opción es un enlace postraduccional entre polipéptidos expresados por separado por medio de ligadura química o entrecruzamiento químico. Los expertos en la materia están familiarizados con diversas reacciones químicas y reactivos tales como reticulantes, por ejemplo, ésteres basados en NHS, carbodiimidas, maleimidas, haloacetilos están disponibles comercialmente, y se desvelan en el estado de la técnica, por ejemplo en el documento US6184344o US7597882.
El polipéptido de acuerdo con la presente invención es una fusión que comprende cuatro o cinco polipéptidos p19 de Plasmodium, por ejemplo el p19 de P vivax y el p19 de P falciparum; el p19 de P vivax y el p19 de P falciparum y el p19 de P falciparum y el p19 de P ovale. Además, comprende uno o más polipéptidos p33 de Plasmodium. Los cuatro o cinco polipéptidos p19 y el polipéptido p33, opcionalmente polipéptidos p19 y/o p33 adicionales, se pueden fusionar directamente entre sí o se pueden fusionar por medio de enlazadores que son preferentemente secuencias polipeptídicas que comprenden una secuencia de Plasmodium o no Plasmodium o una secuencia artificial. Esta secuencia se elige preferentemente de forma que sea razonablemente resistente a la escisión por escisión proteolítica en una célula de expresión. Además, la secuencia no debe comprometer la solubilidad de todo el polipéptido y no debe limitar el acceso de anticuerpos en un entorno acuoso del polipéptido a epítopos en los polipéptidos p19 y/o p33.
El término “Plasmodium p33”, como se usa en la presente memoria, es un polipéptido que comprende un elemento de secuencia que comprende la secuencia (SEC. ID Núm. 7), en la que a y b son cada uno al menos 1, y a es más preferentemente de 15 a 60, más preferentemente 21, 23, 29, 35 o 45, y b es más preferentemente de 10 a 30, más preferentemente 16, 22 o 23, o una variante de la misma. Preferentemente, dicho polipéptido comprende un fragmento del polipéptido de tipo salvaje del que se escinde naturalmente el p19 o una variante de dicho fragmento, en el que el fragmento tiene una longitud no superior a 800, preferentemente 700, 600, 500, 450, 400, 350 o 320 aminoácidos. Por ejemplo, si el Plasmodium p33 es de P falciparum, el fragmento es del MSP-1 de P. falciparum. En una realización preferente, el Plasmodium p33 se selecciona o comprende todos del grupo que comprende p33 de P falciparum (SEC. ID Núm. 8) y una variante del mismo, P. vivax (SEC. ID Núm. 9) y una variante del mismo, P. ovale (SEC. ID Núm. 10) y una variante del mismo, P malariae (SEC. ID Núm. 11) y una variante del mismo y P. knowlesi (SEC. ID Núm. 12) y una variante del mismo. En una realización más preferente, el Plasmodium p33 es de P. vivax. En una realización más preferente, el Plasmodium p33 es de P. falciparum. En una realización más preferente, el Plasmodium p33 es de P. ovale. En una realización más preferente, el Plasmodium p33 es de P. malariae. En una realización más preferente, el Plasmodium p33 es de P knowlesi.
Las secuencias consenso citadas permiten a los expertos en la técnica usar cualquier proteína p19 o p33 de otras cepas de Plasmodium o partes de las mismas, tales como el extremo C-terminal de p33, que se puedan descubrir en el futuro, o de organismos similares, que causen malaria o una enfermedad similar o que se deban detectar para garantizar la calidad de la sangre donada por otro motivo.
La proteína de superficie del merozoito (MSP-1) es un gran complejo multiproteico expuesto en la superficie de los merozoitos. Durante la esquizogonia tardía, MSP-1 se procesa proteolíticamente a partir de su precursor de 190 kDa en cuatro productos de escisión principales: p83, p30, p38 y p42. Durante la invasión eritrocitaria, la p42 se escinde en p33 y p19, lo que es esencial para la invasión. El m SP-1 procesado proteolíticamente parece existir en asociación con los productos procesados de MSP-6 y MSP-7.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un portador útil para el diagnóstico que comprende el polipéptido de acuerdo con la presente invención. Dicho polipéptido, junto con el portador insoluble al que está unido, se puede separar de una mezcla de reacción, en la que se pone en contacto con un líquido, de manera sencilla, por ejemplo por filtración, centrifugación o decantación. Dicho polipéptido se puede inmovilizar de forma reversible o irreversible. Por ejemplo, la inmovilización es reversible si el polipéptido interactúa con el portador por medio de interacciones iónicas que se pueden enmascarar por medio de la adición de una concentración elevada de sal o si el polipéptido se une por medio de un enlace covalente escindible. Por el contrario, la inmovilización es irreversible si el polipéptido está unido al portador por medio de un enlace covalente que no se puede romper en solución acuosa. El polipéptido se puede inmovilizar indirectamente, por ejemplo por medio de la inmovilización de un anticuerpo u otra entidad que tenga afinidad por el polipéptido, seguido por la adición del polipéptido y la formación de un complejo polipéptido-anticuerpo. El anticuerpo capturado se puede detectar mediante el uso de un anticuerpo secundario marcado o un medio marcado para capturar específicamente el anticuerpo que se debe detectar.
A lo largo de esta solicitud, el término “capturar específicamente”, también en variaciones tales como “captura específica” o similares, como se usa en la presente memoria, significa que la reacción de unión entre el medio y el anticuerpo es más fuerte que una reacción de unión caracterizada por una constante de disociación de 1 * 10'5 M, más preferentemente 1 * 10'7 M, más preferentemente 1 * 10'8 M, más preferentemente 1 * 10'9 M, más preferentemente 1 * 10'1° M, más preferentemente 1 * 10'11 M, más preferentemente 1 * 10'12 M, determinada por resonancia de plasmón de superficie mediante el uso de un equipo Biacore a 25 °C en tampón PBS a pH 7.
En otra realización preferente, el portador es una placa de microtitulación que comprende al menos 8 pocillos que se pueden usar para ELISA. Al menos uno de los pocillos se reviste directa o indirectamente, por ejemplo mediante el uso de un anticuerpo de revestimiento acoplado a la placa que se une al polipéptido. Se proporcionan al menos 3, preferentemente 4, más preferentemente 5 calibradores que comprenden un anticuerpo contra el polipéptido a concentraciones definidas y se pueden usar para establecer una curva de calibración para el análisis semicuantitativo. Se puede proporcionar un anticuerpo secundario que comprenda una etiqueta enzimáticamente activa.
En otra realización preferente, el portador útil para el diagnóstico comprende un polipéptido para capturar específicamente cualquier anticuerpo de la clase de anticuerpos a detectar, preferentemente un medio para capturar específicamente todos los anticuerpos de clase, preferentemente IgG, IgA o IgM, preferentemente de clase IgM en el líquido, en el que el portador útil para el diagnóstico se puede proporcionar en combinación con el polipéptido.
En ese caso, el ensayo se lleva a cabo de forma que el líquido se pone en contacto con el portador en condiciones que permiten la unión al portador de todos los anticuerpos presentes en el líquido de la clase de anticuerpos que comprende el anticuerpo que se debe detectar, más específicamente de la clase IgG, preferentemente anticuerpo IgG, seguido por un lavado, seguido por la detección específica del anticuerpo que se debe detectar. Para ello, el portador se puede poner en contacto con un polipéptido marcado de acuerdo con la presente invención.
El polipéptido o anticuerpo secundario o cualquier otro medio para detectar un complejo que comprenda el polipéptido y un anticuerpo de una muestra puede comprender una etiqueta detectable, preferentemente del grupo que comprende una etiqueta enzimáticamente activa, fluorescente, radiactiva o luminiscente, preferentemente quimioluminiscente o de espín. Alternativamente, el polipéptido se puede disociar del anticuerpo tras la unión específica y el lavado para detectar su presencia o ausencia.
Alternativamente, se puede usar un anticuerpo purificado y marcado para detectar un antígeno no marcado unido por el anticuerpo a detectar que, a su vez, había sido capturado por los medios para capturar específicamente todos los anticuerpos de la clase Ig del anticuerpo a detectar, preferentemente de la clase IgG, procedimiento a menudo denominado ensayo puente y descrito en diversos formatos en el estado de la técnica, por ejemplo el documento US2018209973o US5296347.
Se puede usar un formato de ensayo competitivo, en el que el polipéptido forma un complejo con un anticuerpo que se une a él, tras el desplazamiento del polipéptido o del anticuerpo del complejo, como se puede detectar mediante el uso de una etiqueta que se une al polipéptido o anticuerpo desplazado o desplazante.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un portador útil para el diagnóstico, preferentemente una perla, que comprende el polipéptido.
Existen en el mercado diversas perlas para numerosas aplicaciones, principalmente a base de carbohidratos, por ejemplo, sefarosa o agarosa, o de plástico. Contienen grupos químicos activos o activables, tales como el grupo carboxilo, que se pueden usar para la inmovilización de reactivos tales como el polipéptido. Preferentemente, las perlas tienen un diámetro medio de 0,2 μm a 5 mm, de 0,5 μm a 1 mm, de 0,75 μm a 100 μm o de 1 μm a 10 μm. Las perlas se pueden revestir con el polipéptido directamente o por medio de ligandos de afinidad, por ejemplo, biotina o glutatión. Preferentemente, la perla se proporciona en forma de suspensión acuosa con un contenido de perlas del 10 al 90%, preferentemente del 20 al 80%, preferentemente del 30 al 70%, más preferentemente del 40 al 60% (p/p).
En una realización particularmente preferente, las perlas son perlas paramagnéticas, que se pueden concentrar fácilmente en una superficie con la ayuda de un imán. Para ello, las perlas paramagnéticas comerciales suelen contener un mineral paramagnético, por ejemplo, óxido de hierro. Existe en el mercado una gran variedad de perlas paramagnéticas adecuadas.
El líquido usado es cualquier líquido acuoso que pueda contener anticuerpos a detectar, preferentemente derivados de la sangre. El líquido puede ser preferentemente una muestra que contenga anticuerpos de un sujeto. En una realización preferente, la muestra se selecciona del grupo que comprende sangre total, suero, plasma, saliva, sangre donada procesada, preferentemente sangre donada fraccionada, más preferentemente fracciones enriquecidas en plaquetas o plasma o eritrocitos. La sangre donada procesada puede contener sustancias químicas que la estabilicen, por ejemplo impidiendo su obstrucción, preferentemente del grupo que comprende el citrato, el fosfato y la dextrosa.
Las enseñanzas de la presente invención no sólo se pueden llevar a cabo mediante el uso de polipéptidos que tengan las secuencias exactas a las que se hace referencia en esta solicitud de forma explícita, por ejemplo por función, nombre, secuencia o número de acceso, o de forma implícita, sino también mediante el uso de variantes de dichos polipéptidos.
El término “variante”, como se usa en la presente memoria, se puede referir a al menos un fragmento de la secuencia de longitud completa a la que se hace referencia o a un polipéptido que comprende dicho fragmento, más específicamente a una o más secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos que están, en relación con la secuencia de longitud completa, truncadas en uno o ambos terminales por uno o más aminoácidos. Dicho fragmento comprende o codifica para un péptido que tiene al menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200 o 250aminoácidos sucesivos de la secuencia original o para una variante de la misma. La longitud total de la variante puede ser de 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o 250 aminoácidos o más.
El término “variante” se refiere no sólo a al menos un fragmento, sino también a un polipéptido o a un fragmento del mismo que comprende secuencias de aminoácidos, preferentemente un fragmento que comprende al menos 25, más preferentemente 50, más preferentemente 200 aminoácidos sucesivos, que son al menos 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% idénticos a la secuencia de aminoácidos de referencia a la que se hace referencia o al fragmento de la misma, en los que se suprimen o sustituyen aminoácidos diferentes de los esenciales para la actividad biológica, por ejemplo la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo de interés, o el pliegue o la estructura del polipéptido, y/o se sustituyen uno o más de dichos aminoácidos esenciales de forma conservadora y/o se añaden o suprimen aminoácidos de forma que se preserve, al menos parcialmente, la actividad biológica del polipéptido. El estado de la técnica comprende varios procedimientos que se pueden usar para alinear dos secuencias dadas de ácidos nucleicos o aminoácidos y calcular el grado de identidad, véase, por ejemplo Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3ra edición. En una realización preferente, el software ClustalW (Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T J., Higgins, D. G. (2007): Clustal W y
Clustal X versión 2.0. Bioinformática, 23, 2947 a 2948) se usa por medio de la aplicación de la configuración por defecto.
Las variantes pueden, además, comprender modificaciones químicas, por ejemplo, marcadores tales como marcadores isotópico o marcadores detectables o modificaciones covalentes tales como glicosilación, fosforilación, acetilación, descarboxilación, citrulinación, hidroxilación y similares. Los expertos en la técnica están familiarizados con los procedimientos de modificación de polipéptidos. Además, las variantes también se pueden generar por medio de la fusión con otros polipéptidos conocidos o variantes de los mismos, por ejemplo, enlazadores artificiales, preferentemente no derivado de un polipéptido de Plasmodium, etiquetas de afinidad, otros antígenos y similares. La variante del polipéptido tiene actividad biológica. Dicha actividad biológica es la capacidad de unirse al anticuerpo correspondiente. En una realización preferente comprende un epítopo que tiene la capacidad de unirse a un anticuerpo respectivo, preferentemente de una muestra de un paciente que sufre de Malaria, en la que más preferentemente el epítopo comprende una secuencia que comprende al menos 5, 6, 7 u 8 residuos de aminoácidos. Más específicamente, una variante de SEQ X tiene la capacidad de unirse específicamente o capturar específicamente un anticuerpo que se une a SEQ X a partir de una muestra de un paciente infectado con Plasmodium, en la que X se selecciona preferentemente del grupo que comprende la SEC. ID Núm. 1, la SEC. ID Núm. 2, la SEC. ID Núm. 3, la SEC. ID Núm. 4, la SEC. ID Núm. 5, la SEC. ID Núm. 6, la SEC. ID Núm. 7, la SEC. ID Núm. 8, la SEC. ID Núm. 9, la SEC. ID Núm. 10, la SEC. ID Núm. 11, la SEC. ID Núm. 12, la SEC. ID Núm.13, la SEC. ID Núm. 14, la SEC. ID Núm. 15, la SEC. ID Núm. 16, la SEC. ID Núm. 17, la SEC. ID Núm. 18, la SEC. ID Núm. 19, la SEC. ID Núm. 20, la SEC. ID Núm. 21, la SEC. ID Núm. 22, la SEC. ID Núm. 23, la SEC. ID Núm.24, la SEC. ID Núm. 25, la SEC. ID Núm. 26, la SEC. ID Núm. 27, la SEC. ID Núm. 28 y la SEC. ID Núm. 29.
Los expertos en la materia serán capaces de diseñar variantes que tengan actividad biológica partiendo de la secuencia X respectiva, si se requiere una variante de X, introducir modificaciones tales como mutaciones puntuales, truncamientos y similares y posteriormente confirmar que la variante sigue teniendo actividad biológica probando si dicha variante se une a un anticuerpo de dicha muestra. En una realización preferente, se usa un ensayo ELISA basado en el polipéptido variante revestido en una microplaca, preferentemente como se describe en los ejemplos, para comprobar si la variante tiene dicha actividad.
El polipéptido se puede proporcionar en cualquier forma y en cualquier grado de purificación, desde tejidos, frutos o células que comprenden dicho polipéptido en forma endógena, más preferentemente células que sobreexpresan el polipéptido, lisados crudos o enriquecidos de dichas células, hasta polipéptido purificado y/o aislado que puede ser esencialmente puro. En una realización preferente, el polipéptido es un polipéptido nativo, en el que el término “polipéptido nativo”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido plegado, más preferentemente a un polipéptido plegado purificado a partir de células, más preferentemente a partir de células de mamífero. Si se usa un polipéptido nativo, es preferente que esté enriquecido en comparación con su estado natural.
De acuerdo con la presente invención, el polipéptido puede ser una proteína recombinante, en la que el término “recombinante”, como se usa en la presente memoria, se refiere a un polipéptido producido mediante el uso de enfoques de ingeniería genética en cualquier etapa del proceso de producción, por ejemplo, por medio de la fusión de un ácido nucleico que codifica el polipéptido a un promotor fuerte para la sobreexpresión en células o tejidos o por medio de la ingeniería de la secuencia del propio polipéptido. Los expertos en la técnica están familiarizados con los procedimientos de ingeniería de ácidos nucleicos y polipéptidos codificados (por ejemplo, los descritos en Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T (1989), Molecular Cloning, CSH o en Brown T A. (1986), Gene Cloning -an introduction, Chapman & Hall) y para producir y purificar polipéptidos nativos o recombinantes (por ejemplo, Handbooks “Strategies for Protein Purification", “Antibody Purificaron", publicados por GE Healthcare Life Sciencesy en Burgess, R. R., Deutscher, M. P (2009): Guide to Protein Purification). En otra realización preferente, el polipéptido es un polipéptido aislado, en el que el término “aislado” significa que el polipéptido ha sido enriquecido en comparación con su estado de producción mediante el uso de un enfoque biotecnológico o sintético y es preferentemente puro, es decir, al menos el 60, 70, 80, 90, 95 o 99 por ciento del polipéptido en el líquido respectivo consiste en dicho polipéptido de acuerdo con lo juzgado por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS seguida por tinción con azul de Coomassie e inspección visual. Preferentemente, cualquier polipéptido en un portador usado como medio para capturar un anticuerpo es puro.
Cualquier anticuerpo se puede detectar en un líquido, preferentemente una muestra de un sujeto. Se trata de un organismo productor de anticuerpos, preferentemente anticuerpos de clase IgM, IgA o IgG, más preferentemente anticuerpos de clase IgG, más preferentemente un mamífero, más preferentemente un ser humano.
Las enseñanzas inventivas proporcionan un kit, preferentemente para detectar la infección por Plasmodium o diagnosticar la Malaria, más preferentemente para diagnosticar la Tt M. Un kit de este tipo es un recipiente que comprende reactivos específicos necesarios para practicar el procedimiento inventivo, en particular el portador útil para el diagnóstico de acuerdo con la presente invención, opcionalmente además de una o más soluciones o reactivos necesarios para practicar el procedimiento inventivo, preferentemente seleccionados de entre o todos del grupo que comprende el tampón de dilución de la muestra, el tampón de lavado y el tampón que comprende un medio para detectar cualquier anticuerpo capturado específicamente, tal como un anticuerpo secundario y opcionalmente un medio para detectar este último. Además, puede incluir instrucciones sobre cómo usar el kit.
Puede comprender el portador útil para el diagnóstico para poner en contacto el polipéptido inventivo con una muestra de fluido corporal de un sujeto, preferentemente un sujeto humano, por ejemplo un line blot. Además, el kit puede comprender un control positivo, por ejemplo un anticuerpo recombinante que se sabe que se une a uno o más del grupo que comprende la SEC. ID Núm. 1, la SEC. ID Núm. 2, la SEC. ID Núm. 3, la SEC. ID Núm. 4, la SEC. ID Núm. 5, la SEC. ID Núm. 6, la SEC. ID Núm. 7, la SEC. ID Núm. 8, la SEC. ID Núm. 9 y la SEC. ID Núm. 10, y un control negativo, por ejemplo una proteína que no tiene afinidad detectable con una p19 o p33 de Plasmodium, tal como la albúmina sérica bovina. Por último, dicho kit puede comprender una o más soluciones estándar que comprenden un anticuerpo que se une a uno o más de la SEC. ID Núm. 1, la SEC. ID Núm. 2, la SEC. ID Núm. 3, la SEC. ID Núm. 4, la SEC. ID Núm. 5, la SEC. ID Núm. 6, la SEC. ID Núm. 7, la SEC. ID Núm. 8, la SEC. ID Núm. 9 y la SEC. ID Núm. 10 para preparar una curva de calibración, en la que la concentración absoluta o relativa del anticuerpo en cada solución estándar es preferentemente conocida. El kit puede comprender un medio o reactivo para detectar un anticuerpo capturado. El kit puede comprender el polipéptido de acuerdo con la presente invención o un polipéptido purificado que comprenda una secuencia del grupo que comprende la SEC. ID Núm. 1, la SEC. ID Núm. 2, la SEC. ID Núm. 3, la SEC. ID Núm. 4, la SEC. ID Núm. 5, la SEC. ID Núm. 6, la SEC. ID Núm. 7, la SEC. ID Núm. 8, la SEC. ID Núm. 9 y la SEC. ID Núm. 10, cuyo polipéptido puede estar opcionalmente marcado. El kit también puede incluir una solución de lavado. El kit puede incluir un recipiente estanco adecuado para poner en contacto el portador útil para el diagnóstico con la muestra en presencia de otros líquidos, tales como un tampón de reacción. Por ejemplo, se puede proporcionar una línea de borrones en o en combinación con una bandeja de incubación, o se puede proporcionar una placa de microtitulación. En el estado de la técnica se describen recipientes adecuados, por ejemplo, el documento EP3025780 o EP3025779).
De acuerdo con la presente invención, se puede proporcionar o usar un medio o reactivo para detectar un anticuerpo capturado para un Plasmodium p19 y/o para detectar un anticuerpo para un Plasmodium p33. Este medio o reactivo puede ser un anticuerpo secundario que se une a la región constante de un anticuerpo de la clase de interés. Por ejemplo, si se desea detectar un anticuerpo de clase IgG humano capturado, se puede usar un anticuerpo que se una específicamente a la región constante de los anticuerpos de clase IgG humanos. Los medios o reactivos pueden estar marcados directa o indirectamente. Se une específicamente, lo cual significa preferentemente que la reacción de unión es más fuerte que una reacción de unión caracterizada por una constante de disociación de 1 * 10-5 M, más preferentemente 1 * 10-7 M, más preferentemente 1 * 10-8 M, más preferentemente 1 * 10-9 M, más preferentemente 1 * 10-10 M, más preferentemente 1 * 10-11 M, más preferentemente 1 * 10-12 M, determinada por resonancia de plasmón de superficie mediante el uso de un equipo Biacore a 25 °C en tampón PBS a pH 7.
Los productos y procedimientos de acuerdo con la presente invención se pueden usar para detectar una infección o contaminación por Plasmodium en un líquido tal como la sangre donada in vitro. La sangre donada procede preferentemente de un donante cuya identidad se desconoce. Es probable o más probable que la sangre esté contaminada con Plasmodium si se detecta un anticuerpo contra al menos un Plasmodium p19 o al menos un Plasmodium p33.
También se pueden usar para diagnosticar una enfermedad que sea una infección por Plasmodium, preferentemente Malaria, más preferentemente TTM en un sujeto. En una realización preferente, el término “diagnóstico”, como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier tipo de procedimiento destinado a obtener información instrumental en la evaluación de si un paciente sufre o es probable o más probable que la media o un sujeto comparativo, este último preferentemente con síntomas similares, de sufrir cierta enfermedad o trastorno en el pasado, en el momento del diagnóstico o en el futuro, para averiguar cómo está progresando la enfermedad o es probable que progrese en el futuro o para evaluar la capacidad de respuesta de un paciente con respecto a un tratamiento. En otras palabras, el término “diagnóstico” comprende no sólo el diagnóstico, sino también el pronóstico y/o el seguimiento del curso de una enfermedad o trastorno. Es probable o más probable que el sujeto padezca la enfermedad si se detecta en su líquido un anticuerpo contra al menos un Plasmodium p19 o contra al menos un Plasmodium p33, tal y como muestra la detección de un anticuerpo contra el polipéptido de acuerdo con la invención.
Por lo tanto, el término “diagnóstico” no implica preferentemente que los procedimientos o agentes de diagnóstico de acuerdo con la presente invención sean definitivos y suficientes para finalizar el diagnóstico sobre la base de una sola prueba, y mucho menos de un parámetro, sino que se puede referir a una contribución a lo que se denomina “diagnóstico diferencial”, es decir, un procedimiento de diagnóstico sistemático que considera la probabilidad de una serie de posibles afecciones sobre la base de una serie de parámetros de diagnóstico. En una realización preferente, el término “diagnóstico” significa que el procedimiento o el producto o el uso se pueden usar para ayudar en el diagnóstico de una enfermedad o para identificar a un sujeto con riesgo de padecer una enfermedad. El término “diagnóstico” también se puede referir a un procedimiento o agente usado para seleccionar el régimen de tratamiento más prometedor para un paciente. En otras palabras, el procedimiento o agente puede estar relacionado con la selección de un régimen de tratamiento para un sujeto.
La presente invención se refiere a un procedimiento que comprende la etapa de detectar en un líquido de un sujeto la presencia o ausencia de un anticuerpo contra un Plasmodium p19 y/o un Plasmodium p33. Dicho procedimiento puede comprender las etapas a) proporcionar un líquido, preferentemente una muestra de sangre donada procesada y/o fraccionada o una muestra de un sujeto, b) poner en contacto el líquido con el polipéptido de acuerdo con la presente invención en condiciones compatibles con la formación de un complejo que comprenda el portador útil para
el diagnóstico y el anticuerpo, más específicamente el polipéptido y el anticuerpo, c) aislar dicho complejo, por ejemplo eliminando el líquido, d) opcionalmente lavar dicho complejo, y e) detectar dicho complejo, opcionalmente tras el contacto con un Plasmodium p19 y/o Plasmodium p33, que puede estar marcado en el caso de un formato de ensayo competitivo. El procedimiento es preferentemente un procedimiento in vitro.
La detección del anticuerpo o el complejo para el pronóstico, diagnóstico, procedimientos o kit de acuerdo con la presente invención comprende el uso de un procedimiento seleccionado del grupo que comprende las técnicas de inmunodifusión, las técnicas inmunoelectroforéticas, los inmunoensayos de dispersión de la luz, las técnicas de aglutinación, los inmunoensayos marcados tales como los del grupo que comprende los inmunoensayos radiomarcados, los inmunoensayos enzimáticos tales como los ensayos colorimétricos, los inmunoensayos de quimioluminiscencia y las técnicas de inmunofluorescencia. En una realización preferente, el complejo se detecta mediante el uso de un procedimiento seleccionado del grupo que comprende técnicas de inmunodifusión, técnicas inmunoelectroforéticas, inmunoensayos de dispersión de luz, técnicas de aglutinación, inmunoensayos marcados del grupo que comprende inmunoensayos radiomarcados, inmunoensayos de quimioluminiscencia y técnicas de inmunofluorescencia. Los expertos en la técnica están familiarizados con estos procedimientos, que también se describen en el estado de la técnica, por ejemplo en Zane, H. D. (2001): Immunology - Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, en particular en el Capítulo 14.
En otra realización preferente, el pronóstico, diagnóstico, procedimientos o kit en línea con las enseñanzas inventivas contemplan el uso de inmunofluorescencia indirecta. Los expertos en la materia están familiarizados con dichas técnicas, que se describen en el estado de la técnica (US4647543; Voigt, J., Krause, C., Rohwader, E, Saschenbrecker, S., Hahn, M., Danckwardt, M., Feirer, C., Ens, K, Fechner, K, Barth, E, Martinetz, T, y Stocker, W. (2012), Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of Antinuclear Autoantibodies on HEp-2 Cells," Clinical and Developmental Immunology, vol. 2012, doi:10.1155/2012/65105; Bonilla, E., Francis, L., Allam, F., et al., Immuno-fluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection of antinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients, Clinical Immunology, vol. 124, no. 1, págs. 18 a 21, 2007). Los reactivos, dispositivos y paquetes de software adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo en EUROIMMUN, Lübeck, Alemania.
En numerosos casos, la detección, que preferentemente significa detectar la ausencia o presencia de un anticuerpo, que opcionalmente significa determinar si la concentración del anticuerpo está por encima de un cierto umbral, preferentemente establecido por medición por medio de ELISA, en el líquido, es suficiente para el diagnóstico. Si se puede detectar el anticuerpo, será una información decisiva para el diagnóstico del clínico e indica una mayor probabilidad de que el paciente padezca una enfermedad. En una realización preferente, se puede determinar la concentración relativa del anticuerpo en el suero, en comparación con el nivel que se puede encontrar en un sujeto sano medio. En una realización preferente, el término “detectar la presencia", como se usa en la presente memoria, significa que basta con comprobar si se puede detectar una señal suficientemente por encima de cualquier nivel de fondo mediante el uso de un procedimiento de detección complejo adecuado que indique que el anticuerpo de interés está presente o que hay más anticuerpo de interés presente del que habría en un sujeto sano.
En una realización preferente, la ausencia o presencia de dos o más anticuerpos contra un Plasmodium p19 y opcionalmente uno o más anticuerpos contra un Plasmodium p33 se detecta preferentemente de forma simultánea, es decir, al mismo tiempo.
En una realización preferente, la ausencia o presencia de dos o más anticuerpos contra un Plasmodium p19 y opcionalmente uno o más anticuerpos contra un Plasmodium p33 se detecta en reacciones espacialmente separadas, más preferentemente en diferentes mezclas de reacción en recipientes separados.
De acuerdo con la presente invención, se detectan cuatro o cinco anticuerpos contra un Plasmodium p19 y un anticuerpo contra un Plasmodium p33 y opcionalmente anticuerpos adicionales. En una realización preferente, esto significa que se detecta si al menos cuatro o cinco de estos anticuerpos están presentes, sin distinguir a cuál de los antígenos se unen los anticuerpos o si sólo cinco o más de cinco anticuerpos están presentes. En cualquier caso, es importante asegurarse de que los anticuerpos que se unen a un antígeno diferente de Plasmodium p19 y Plasmodium p33 no se toman erróneamente como anticuerpos que se unen a Plasmodium p19 y Plasmodium p33 para evitar resultados falsos positivos.
En una realización preferente, la infección se detecta en una etapa temprana. En una realización preferente, el término “dispositivo analítico" se refiere a un dispositivo fabricado con fines no diagnósticos, en particular para detectar al menos un anticuerpo contra un Plasmodium p19 y al menos un anticuerpo contra un Plasmodium p33 para el cribado de sangre donada. En otras palabras, la información recopilada se usa para comprobar la calidad de la sangre donada, desconociendo la identidad del donante, en lugar de para diagnosticar el estado de un paciente conocido, asignando un resultado de diagnóstico a una persona concreta.
La invención proporciona un uso del polipéptido de acuerdo con la presente invención para la fabricación de un kit, reactivo o composición para el diagnóstico de una enfermedad o para el cribado de sangre donada para la infección o contaminación con Plasmodium, en el que preferentemente se proporciona un ensayo diagnóstico o analítico con una sensibilidad aumentada. Dicha fabricación se puede referir a un procedimiento que comprende la etapa de
inmovilización del polipéptido de acuerdo con la presente invención en un portador o dispositivo analítico útil para el diagnóstico.
Secuencias:
Se hace referencia a una gama de polipéptidos novedosos, más específicamente
SEC. ID Núm. 1 (motivo de consenso de Plasmodium p19)
en el que cada uno de a, b, c y d es al menos 1.
SEC. ID Núm. 2 (P falciparum p19)
SEC. ID Núm. 3 (P vivax p19)
SEC. ID Núm. 4 (P ovale p19)
SEC. ID Núm. 5 (R malariae p19)
SEC. ID Núm. 6 (R knowlesi p19)
SEC. ID Núm. 7 (motivo de consenso de P. p33)
en el que a y b son al menos 1
SEC. ID Núm. 8 (R falciparum p33)
SEC. ID Núm. 9 (P. vivax p33)
SEC. ID Núm. 10 (P. ovale p33)
SEC. ID Núm. 11 (P malariae p33)
SEC. ID Núm. 12 (P. knowlesi p33)
SEC. ID Núm. 13 (marcado con His p19 de P. falciparum)
P6527_His-MSP-1-p19_P.falciparum_B140110RD
SEC. ID Núm. 14 (motivo de consenso p33 C-terminal)
>MSP motivo de consenso p33 C-terminal
SEC. ID Núm. 15 (marcado con His p19 de P. vivax)
>P6526_His-MSP-1-p19_P.vivax_B140110RE
SEC. ID Núm. 16 (marcado con His p33 de P. vivax)
>P16463_His-MSP-1 -p33_P.vivax_B180806RA
SEC. ID Núm. 17 (marcado con His p19 de P. ovale)
>P6528_His-MSP-1-p19_P.ovale_B140110RC
SEC. ID Núm. 18 (marcado con His p19 de P. malariae)
>P6529_His-MSP-1-p19_P.malariae_B140110RB
SEC. ID Núm. 19 (marcado con His p19 de P. knowlesi)
>P6530_His-MSP-1-p19_P.knowlesi_B140110RA
SEC. ID Núm. 20 (delta-p33 de P vivax)
> MSP1[delta-p33]_P. vivax
SEC. ID Núm. 21 (delta-p33-p19 de P. vivax)
> MSP1[delta-p33-p19]_P. vivax
SEC. ID Núm. 22 (delta-p33 de P. falciparum)
> MSP1[delta-p33]_P. falciparum
SEC. ID Núm. 23 (delta-p33-p19 de P. falciparum)
> MSP1[delta-p33-p19]_P. falciparum
SEC. ID Núm. 24 (delta-p33 de P. ovale) > MSP1[delta-p33]_P. falciparum
SEC. ID Núm. 25 (delta-p33-p19 de P. ovale)
> MSP1[delta-p33-p19]_P. ovale
SEC. ID Núm. 26 (delta-p33 de P. malariae
> MSP1[delta-p33]_P. malariae
SEC. ID Núm. 27 (delta-p33-p19 de P. malariae)
> MSP1[delta-p33-p19]_P. malariae
SEC. ID Núm. 28 (delta-p33 de P. knowlesi
> MSP1[delta-p33]_P. knowlesi
SEC. ID Núm. 29 (delta-p33-p19 de P. knowlesi)
> MSP1[delta-p33-p19]_P. knowlesi
SEC. ID Núm. 30 (“His-MSP-multi-p19” - Polipéptido de fusión purificado de acuerdo con la presente invención, marcado N-terminalmente con His, p33 de P. vivax - p19 de P. vivax - secuencia C-terminal de P. falciparum p33 - p19 de P. falciparum - C-terminal P. ovale secuencia p33 - p19 de P. ovale - C-terminal P. malariae secuencia p33 - p19 de P. malariae- C-terminal P knowlesi secuencia p33 - p19 de P. knowlesi)
SEC. ID Núm. 31 (“His-MSP-multi-His_a” - Polipéptido de fusión purificado de acuerdo con la presente invención, marcado N-terminalmente con His p33 de P. vivax - secuencia p33 C-terminal de P. knowlesi -p19 de P. knowlesi - p19 de P. vivax - C-terminal P. falciparum secuencia p33 - p19 de P falciparum - C-terminal P. ovale secuencia p33 - p19 de P ovale - C-terminal P. malariae secuencia p33 - p19 de P. malariae)
SEC. ID Núm. 32 (“His-MSP-multi-His_b” - Polipéptido de fusión purificado de acuerdo con la presente invención, marcado N-terminalmente con His p33 de P. vivax -secuencia C-terminal P. malariae p33 - p19
de P. malariae - C-terminal P. knowlesi secuencia p33 - p19 de P. knowlesi - p19 de P. vivax - C-terminal P falciparum secuencia p33 - p19 de P. falciparum - C-terminal P ovale secuencia p33 - p19 de P ovale)
SEC. ID Núm. 33 (“His-MSP-multi-His_c” - Polipéptido de fusión purificado de acuerdo con la presente invención, marcado N-terminalmente con His p33 de P. vivax- C-terminal P. ovale secuencia p33 - p19 de P. ovale - C-terminal P. malariae secuencia p33 - p19 de P. malariae - C-terminal secuencia p33 de P knowlesi - p19 de P knowlesi - p19 de P vivax - C-terminal secuencia p33 de P. falciparum - p19 de P. falciparum)
SEC. ID Núm. 34 (“His-MSP-multi-His_d” - Polipéptido de fusión purificado de acuerdo con la presente invención, marcado N-terminalmente con His p33 de P vivax -secuencia C-terminal p33 de P. falciparum -p19 de P falciparum - C-terminal P. ovale secuencia p33 - p19 de P. ovale - C-terminal P malariae secuencia p33 - p19 de P. malariae - C-terminal P. knowlesi secuencia p33 - p19 de P. knowlesi - p19 de P vivax)
La presente invención se ilustra además por medio de las siguientes figuras y ejemplos no limitantes de los que se pueden extraer otras características, realizaciones, aspectos y ventajas de la presente invención.
La Fig. 1 muestra una alineación de los polipéptidos p19 de P falciparum, P vivax, P ovale, P malariae y P. knowlesi.
La Fig. 2 muestra una alineación de los polipéptidos p33 de P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae y P. knowlesi.
La Fig. 3 muestra un marcador de peso molecular (MW, izquierda) y un polipéptido de fusión purificado de acuerdo con la presente invención (s Ec . ID Núm. 30).
Ejemplo 1:
Se llevaron a cabo los siguientes experimentos para evaluar el rendimiento de diferentes combinaciones de antígenos de Plasmodium para la detección de anticuerpos IgG específicos anti-Plasmodium en suero o plasma humano.
1. Muestras
Panel 1 (panel de sensibilidad):
El panel de sensibilidad contenía 50 muestras clínicas de pacientes con infección por Plasmodium demostrada. Los cuatro Plasmodium spp. Causantes (P. falciparum n=26, P. vivax n=6, P. ovale n=12 y P. malariae n=6) se determinaron por medio de microscopía y PCR. Además, se analizaron las muestras clínicas en busca de anticuerpos anti-Plasmodium por medio de inmunofluorescencia (IFT) y ELISA.
Panel 2 (panel de especificidad):
El panel de especificidad contiene 37 muestras procedentes de individuos sanos (mujeres embarazadas, niños y donantes de sangre de Alemania). La exposición previa a Plasmodium es muy improbable debido al origen de las muestras.
2. Experimentos:
2.1. Preparación de placas de microtitulación revestidas
Se usaron los siguientes antígenos de la Proteína de Superficie del Merozoito 1 (MSP-1) en forma de construcciones marcadas con His clonadas en el vector pET24d (Novagen) y purificadas por cromatografía de afinidad de níquel mediante el uso de la metodología estándar:
• polipéptido p19 de MSP-1 P falciparum (SEC. ID Núm. 13)
• polipéptido p19 de MSP-1 P vivax (SEC. ID Núm. 15)
• polipéptido p33 de MSP-1 P vivax (SEC. ID Núm. 16)
• polipéptido p19 de MSP-1 P ovale (SEC. ID Núm. 17)
• polipéptido p19 de MSP-1 P malariae (SEC. ID Núm. 18
• polipéptido p19 de MSP-1 P knowlesi (SEC. ID Núm. 19)
• Polipéptido de fusión de acuerdo con la presente invención, marcado N-terminalmente con His, que comprende en este orden: secuencia p33 de P vivax - secuencia p19 de P vivax - secuencia C-terminal p33 de P falciparum - secuencia p19 de P. falciparum - C-terminal P. ovale secuencia p33 - p19 de P. ovale - C-terminal P. malariae secuencia p33 - p19 de P malariae - C-terminal P. knowlesi secuencia p33 - p19 de P. knowlesi (SEC. ID Núm. 30).
Para su uso en ELISA de microtitulación, la proteína purificada se diluyó en PBS hasta concentraciones finales de aproximadamente 2,0 μg/ml y se usó para revestir placas de microtitulación ELISA (Nunc, Roskilde, Dinamarca) durante la noche.
2.2. Procedimiento experimental
Las muestras se diluyeron 1:101 en tampón de muestra de IgG, se aplicaron a placas de microtitulación y se incubaron como se describe para los kits de prueba EUROIMMUN ELISA comerciales, mediante el uso de reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, El 2260-9601 G/A). En resumen: 60 min a 37 °C; 3 etapas de lavado mediante el uso de tampón de lavado EUROIMMUN; adición de 100 μl de conjugado anti-IgG humana (cabra) por pocillo; incubación durante 30 min a 37 °C; 3 etapas de lavado mediante el uso de tampón de lavado EUROIMMUN; adición de 100 μl de solución de cromógeno/sustrato (TMB/H2O2) por pocillo; incubación durante 30 min a temperatura ambiente; adición de 100 μl de solución de parada (ácido sulfúrico 0,5 M); medición de la densidad óptica a 450 nm.
El panel 1 se usó para evaluar la sensibilidad de los antígenos respectivos para la detección de anticuerpos IgG específicos anti-Plasmodium. El Panel 2 se incubó para determinar la especificidad del sistema de prueba.
3. Resultados: Sensibilidad y especificidad de los polipéptidos p19 y p33 de MSP-1 de Plasmodium spp. expresados por separado y de un polipéptido de fusión que los comprende.
La comparación de polipéptidos p19 de MSP-1 de P falciparum, P. vivax, P ovale, P malariae y P knowlesi así como de polipéptidos p33 de MSP-1 de P. falciparum y P. vivax mostró sensibilidades y especificidades globales de:
Los datos primarios figuran en la Tabla 1, y un sumario de los resultados, en la Tabla 2.
Tabla 1: Datos primarios. Las columnas muestran las lecturas ELISA obtenidas cuando la misma muestra se puso en contacto en recipientes separados con antígenos individuales expresados por separado o con el polipéptido de fusión que los contiene a todos.
Tabla 2: Sumario de los resultados
El conjunto de muestras usado para la evaluación de la sensibilidad de esta prueba son muestras procedentes de pacientes con infecciones agudas. Si estas muestras se extrajeron en momentos tempranos de la infección, existiría la posibilidad de que carecieran de IgG anti-Plasmodium porque aún no se ha producido la seroconversión (cuatro muestras positivas para PCR y microscopía, pero la serología es negativa.
Conclusión
En primer lugar, la intensidad de la señal aumenta considerablemente si se usa el polipéptido de fusión en lugar de antígenos expresados por separado, incluso si sólo está presente un anticuerpo contra un antígeno, por ejemplo en las muestras 9 a 11, en las que sólo están presentes anticuerpos contra el polipéptido p19 de P. falciparum.
En segundo lugar, es evidente que la señal está por encima del punto de corte en un mayor número de muestras de pacientes que padecen Malaria, lo que demuestra la mayor sensibilidad del ensayo. La especificidad es sólo ligeramente mejor.
Ejemplo 2:
Se usaron polipéptidos de fusión adicionales que comprendían los polipéptidos p19 y p33 de MSP-1 de Plasmodium spp. para la detección de anticuerpos en muestras de sangre humana. Los experimentos se llevaron a cabo esencialmente como se describe en el Ejemplo 1, pero mediante el uso de polipéptidos adicionales de acuerdo con la presente invención.
Panel 1 (panel de sensibilidad):
El panel de sensibilidad contiene 47 muestras clínicas de pacientes con infección por Plasmodium demostrada. Los cuatro Plasmodium spp. causantes (P falciparum n=24, P vivax n=5, P ovale n=12 y P malariae n=6) se determinaron por medio de microscopía y PCR. Además, se analizaron las muestras clínicas para detectar anticuerpos anti-Plasmodium por medio de IFT y ELISA.
El panel coincidía con el Panel 1 usado en el Experimento 1, con la salvedad de que algunas muestras no se pudieron examinar de nuevo porque las cantidades disponibles eran insuficientes. Los números de las muestras son idénticos en los paneles 1 y 2.
Panel 2 (panel de especificidad):
El panel de especificidad contiene 16 muestras procedentes de individuos sanos (mujeres embarazadas, niños y donantes de sangre de Alemania). Cabe suponer que los donantes no habían estado expuestos al Plasmodium.
1. Preparación de placas de microtitulación revestidas
Se usaron los siguientes antígenos de la Proteína de Superficie del Merozoito 1 (MSP-1):
• proteína de fusión de polipéptidos p19 de MSP-1 P falciparum, P vivax, P ovale, P malariae y P knowlesi (MSP-1 multi-p19) (SEC. ID Núm. 30)
• His-MSP-1-multi_a (SEC. ID Núm. 31)
• His-MSP-1-multi_b (SEC. ID Núm. 32)
• His-MSP-1-multi_c (SEC. ID Núm. 33)
• His-MSP-1-multi_d (SEC. ID Núm. 34)
Para su uso en ELISA de microtitulación, estos antígenos se diluyeron en PBS hasta concentraciones finales de 5,0 |jg/ml. Las placas de microtitulación se revistieron con 100 j l de dilución de antígeno por pocillo.
2. Procedimiento experimental
Todos los reactivos usados durante este experimento se incluyen en cada kit de prueba EUROIMMUN IgG ELISA para diagnóstico infeccioso. Las muestras se diluyeron 1:101 en tampón de muestra de IgG, se aplicaron a placas de microtitulación y se incubaron como se describe para los kits de prueba EUROIMMUN ELISA comerciales, mediante el uso de reactivos disponibles en el mercado (por ejemplo, El 2260-9601 G/A). En resumen: 60 min a 37 °C; 3 etapas de lavado mediante el uso de tampón de lavado EUROIMMUN; adición de 100 j l de conjugado anti-IgG humana (cabra) por pocillo; incubación durante 30 min a 37 °C; 3 etapas de lavado mediante el uso de tampón de lavado EUROIMMUN; adición de 100 j l de solución de cromógeno/sustrato (TMB/H2O2) por pocillo; incubación durante 30 min a temperatura ambiente; adición de 100 j l de solución de parada (ácido sulfúrico 0,5 M); medición de la densidad óptica a 450 nm.
El panel 1 se usó para evaluar la sensibilidad de los antígenos respectivos para la detección de anticuerpos IgG específicos anti-Plasmodium. El Panel 2 se incubó para determinar la especificidad del sistema de prueba.
3. Resultados
Los datos primarios se muestran en la Tabla 3.
Las cinco muestras que se pudieron identificar correctamente como positivas mediante el uso de los polipéptidos de acuerdo con la invención, pero no los polipéptidos expresados por separado en el Ejemplo 1, están en negrita. “no Mat.” Indica que las muestras se examinaron sólo en el Ejemplo 1, pero no de nuevo en el Ejemplo 2, porque los
volúmenes de la muestra eran insuficientes. Las muestras 1 a 6 proceden de pacientes expuestos a P vivax. Las muestras 7 a 32 proceden de pacientes expuestos a P falciparum. Las muestras 33 a 44 proceden de pacientes expuestos a P ovale. Las muestras 45 a 50 proceden de pacientes expuestos a P malariae. Las muestras 51 a 58 son controles positivos. Las muestras restantes proceden de donantes de sangre sanos.
Los datos primarios se muestran en la Tabla 4:
Los resultados limítrofes no se incluyeron en el cálculo de la sensibilidad.
Curiosamente, las cinco muestras que resultaron positivas mediante el uso del polipéptido de acuerdo con la invención parecían ser positivas independientemente del orden de los componentes del antígeno, con la excepción de la muestra 41 que fue positiva sólo en el caso de tres de las cinco construcciones. Sin embargo, los valores obtenidos mediante el uso de los otros dos constructos estaban en el límite y bastante cerca del valor de corte. Todos los polipéptidos MSP-1 probados revelan una alta especificidad.
3.1. Conclusión
Nuestros resultados muestran que el orden de los fragmentos p19 no tiene un impacto significativo en la sensibilidad y especificidad del antígeno MSP-1 multi-p19. Independientemente del orden, la sensibilidad aumenta a un alto nivel, mientras que la especificidad no se ve comprometida.
Claims (12)
1. Un polipéptido que comprenda cuatro o cinco polipéptidos p19, preferentemente todos, del grupo que comprende p19 de P falciparum de acuerdo con SEC. ID Núm. 2,
p19 de P. vivax de acuerdo con SEC. ID Núm. 3,
p19 de P. ovale de acuerdo con SEC. ID Núm. 4,
p19 de P malariae de acuerdo con SEC. ID Núm. 5 y
p19 de P. knowlesi de acuerdo con SEC. ID Núm. 6 y
además comprende un polipéptido p33 de una cepa de Plasmodium de acuerdo con la SEC. ID Núm. 7, en el que todos los polipéptidos comprendidos están unidos covalentemente en dicho polipéptido que comprende la totalidad de los polipéptidos.
2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido está inmovilizado, preferentemente en un portador útil para el diagnóstico.
3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que el polipéptido está purificado.
4. Un portador útil para el diagnóstico revestido con el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, preferentemente inmovilizado directamente sobre el portador, en el que el portador se selecciona preferentemente del grupo que comprende un portaobjetos de vidrio, preferentemente para microscopía, un biochip, una placa de microtitulación, un dispositivo de flujo lateral, una tira reactiva, una membrana, preferentemente una transferencia en línea, una columna de cromatografía y una perla, preferentemente una perla magnética o fluorescente.
5. Un procedimiento in vitro que comprende la etapa de detectar en un líquido cuatro o cinco anticuerpos, preferentemente todos, del grupo que comprende
un anticuerpo contra p19 de P. falciparum,
un anticuerpo contra p19 de P. vivax,
un anticuerpo contra p19 de P. ovale,
un anticuerpo contra p19 de P. malariae y
un anticuerpo contra p19 de P. knowlesi,
que comprende la etapa de contacto del líquido con el polipéptido o portador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4,
en el que además se detecta un anticuerpo contra un polipéptido p33 de una cepa de Plasmodium.
6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5, en el que el anticuerpo se detecta mediante el uso de un procedimiento seleccionado del grupo que comprende técnicas de inmunodifusión, técnicas inmunoelectroforéticas, inmunoensayos de dispersión de luz, técnicas de aglutinación, inmunoensayos marcados, tales como los del grupo que comprende inmunoensayos radiomarcados, inmunoensayos enzimáticos, más preferentemente ELISA, inmunoensayos de quimioluminiscencia, preferentemente inmunoensayos de electroquimioluminiscencia, e inmunofluorescencia, preferentemente inmunofluorescencia indirecta.
7. Un procedimiento que comprende la etapa de revestir un portador analíticamente útil con el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que preferentemente el portador se selecciona del grupo que comprende un portaobjetos de vidrio, preferentemente para microscopía, un biochip, una placa de microtitulación, un dispositivo de flujo lateral, una tira reactiva, una membrana, preferentemente una transferencia en línea, una columna de cromatografía y una perla, preferentemente una perla magnética o fluorescente.
8. Un uso in vitro del polipéptido o portador útil para el diagnóstico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para identificar sangre de un donante de sangre no infectado.
9. El procedimiento o uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 u 8, en el que uno o más anticuerpos se detectan en una fracción procesada de sangre, preferentemente de un donante de sangre.
10. Un kit que comprende el polipéptido o portador de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que además comprende uno o más reactivos del grupo que comprende uno o más de un calibrador, un tampón de lavado y un medio para detectar un anticuerpo, preferentemente un anticuerpo secundario marcado.
11. Un uso del polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 a 3 para la fabricación de un dispositivo analítico, o para la fabricación de una composición, kit o reactivo para detectar una infección por Plasmodium.
12. Un procedimiento para determinar la capacidad, preferentemente la capacidad de un portador de acuerdo con la reivindicación 4 para unir dos o más anticuerpos a las proteínas p19 de Plasmodium, que comprende la etapa de contacto del portador útil para el diagnóstico de acuerdo con la reivindicación 4 con una o más soluciones que comprenden concentraciones conocidas de los dos o más anticuerpos.
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