BR102020000922A2 - Detecção sorológica de anticorpos de plasmodium - Google Patents
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Abstract
detecção sorológica de anticorpos de plasmodium. a presente invenção refere-se a um polipeptídeo compreendendo dois ou mais, de preferência todos, do grupo compreendendo p19 de p. falciparum ou uma variante do mesmo, p19 de p. vivax ou uma variante do mesmo, p19 de p. ovale ou uma variante do mesmo, p19 de p. malariae ou uma variante do mesmo e p19 de p. knowlesi ou uma variante do mesmo, um veículo diagnosticamente útil compreendendo tal polipeptídeo, um método compreendendo a etapa de detecção em um líquido de dois ou mais anticorpos, de preferência todos, do grupo compreendendo um anticorpo para p19 de p. falciparum, um anticorpo para p19 de p. vivax, um anticorpo para p19 de p. ovale, um anticorpo para p19 de p. malariae e um anticorpo para p19 de p. knowlesi, um kit compreendendo o polipeptídeo e um uso do polipeptídeo para a fabricação de um dispositivo analítico ou para a fabricação de uma composição, kit ou reagente para detectar uma infecção por malária.
Description
[001] A presente invenção refere-se a um polipeptídeo compreendendo dois ou mais, de preferência todos do grupo compreendendo p19 de P. falciparum ou uma variante do mesmo, p19 de P. vivax ou uma variante do mesmo, p19 de P. ovale ou uma variante do mesmo, p19 de P. malariae ou uma variante do mesmo e p19 de P. knowlesi ou uma variante do mesmo, um veículo diagnosticamente útil compreendendo esse polipeptídeo, um método compreendendo a etapa de detecção em um líquido de dois ou mais anticorpos, de preferência todos do grupo compreendendo um anticorpo para p19 de P. falciparum, um anticorpo para p19 de P. vivax, um anticorpo para p19 de P. ovale, um anticorpo para p19 de P. malariae e um anticorpo para p19 de P. knowlesi, um kit compreendendo o polipeptídeo e um uso do polipeptídeo para a fabricação de um dispositivo analítico ou para a fabricação de uma composição, kit ou reagente para detectar uma infecção por malária.
[002] A malária é uma doença transmitida por mosquitos causada por um parasita. Quatro espécies de parasitas da malária podem infectar seres humanos em condições naturais: Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale e P. malariae. As duas primeiras espécies causam mais infecções no mundo. P. falciparum é o agente de malária grave e potencialmente fatal, causando uma estimativa de 700.000 a 2,7 milhões de mortes anualmente. P. vivax e P. ovale têm parasitas em estágio hepático dormentes, referidos como hipnozoítos, que podem reativar e causar malária vários meses ou anos após-a picada do mosquito infectante. P. malariae produz infecções duradouras e, se não tratada, pode persistir de forma assintomática no hospedeiro humano por anos, até uma vida inteira.
[003] Mais recentemente, P. knowlesi, cujos hospedeiros naturais incluem macacos comedores de caranguejo (Macaca fascicularis) e macacos da cauda do porco, demonstrou infectar seres humanos e pode ser responsável por um número significativo de infecções humanas na Malásia
[004] Nos seres humanos, os parasitas crescem e se multiplicam primeiro nas células do fígado e em seguida nos glóbulos vermelhos do sangue. No sangue, sucessivas ninhadas de parasitas crescem dentro dos glóbulos vermelhos e os destroem, liberando parasitas filhas que continuam o ciclo infectando as células.
[005] A malária deve ser reconhecida prontamente para tratar o paciente a tempo e impedir outra disseminação de infecções na comunidade. A malária deve ser considerada uma emergência médica potencial e deve ser tratada adequadamente. Embora a malária não complicada seja bastante tratável e os sintomas não sejam incapacitantes, a malária grave ocorre quando as infecções por P. falciparum são complicadas por graves falhas de órgãos ou anormalidades no sangue ou no metabolismo do paciente.
[006] Geralmente a malária é transmitida pela picada de um mosquito Anopheles infectado, porém os casos de malária transmitida por transfusão (TTM) foram registrados. O TTM pode ser adquirido através de componentes sanguíneos, tal como concentrados de glóbulos vermelhos, plaquetas, leucócitos, plasma e glóbulos vermelhos congelados. TTM é raro em países em que a malária não é endêmica. No entanto, esta doença tem um impacto nos recursos dos bancos de sangue porque, nos últimos anos, mais e mais doadores em potencial vêm de áreas endêmicas da malária, como turistas, imigrantes ou trabalhadores. Além disso, o sangue doado pode ser importado de países onde a malária é endêmica. Além disso, a doença está atualmente ressurgindo em muitas áreas onde havia sido erradicada no passado e, consequentemente, o número de indivíduos provenientes de áreas de malária aumentou. Também deve-se ter em mente que a mudança climática alterou recentemente a distribuição de mosquitos e provavelmente permitirá que a malária se espalhe para novos países.
[007] Em muitos países, a doação de sangue total é adiada por vários anos em doadores em potencial que viveram os primeiros 5 anos de sua vida em áreas endêmicas da malária e por vários meses em doadores em potencial que retornam de uma área endêmica e naqueles que foram infectados anteriormente.
[008] Este período pode, no entanto, ser reduzido se um teste genômico imunológico ou molecular for negativo antes de uma doação de sangue, aumentando o grupo de doadores de sangue. Portanto, há uma demanda significativa por imunoensaios diagnosticamente úteis.
[009] Um grande obstáculo para o estabelecimento de imunoensaios confiáveis tem sido a falta de antígenos solúveis. Mesmo os fragmentos proteoliticamente obtidos da proteína de superfície dos merozoítos (MSP) são proteínas grandes e extremamente difíceis de obter em grandes quantidades de atividade biológica suficiente usando métodos recombinantes, como seria necessário para estabelecer um ensaio de rotina.
[0010] O estado da técnica descreve uma série de imunoensaios para detectar uma infecção por malária em amostras de sangue. Meyerhof, A. S. e outros (2010) Clin. e Vacc. Immunol., Página 1631- 1638, e WO2009/111599 descrevem ELISA, IFA e imunoensaio com base em contas para a detecção de anticorpos para as regiões carboxiterminais de 19 kDa das proteínas de superfície do merozoíto 1 (MSP-1) de P. falciparum, P. vivax , P. ovale e P. malariae. Usando um ensaio com base em contas revestidas com todos os quatro antígenos, os autores relataram uma sensibilidade de detecção de IgG de 100%. No entanto, o ensaio parece ter especificidade limitada, uma vez que amostras de doadores de sangue saudáveis produziram resultados positivos. p33 é descrito, porém não como um antígeno para um ensaio diagnóstico.
[0011] Os ensaios adequados foram descritos no estado da técnica e já produzem confiabilidades de diagnóstico razoavelmente boas. No entanto, devido ao grande número de doadores de sangue e amostras a serem testados e à considerável escassez de sangue doado, qualquer outra otimização para 100% de sensibilidade e especificidade deve ser considerada uma contribuição valiosa para a técnica
[0012] WO2011/06237 descreve uma vacina para proteger contra a malária compreendendo uma região p19 de P. falciparum MSP-1 em combinação com segmentos selecionados de p33, que têm propriedades imunogênicas em uma vacina. O documento não descreve que essa mistura pode ser aplicada a um imunoensaio diagnóstico, muito menos uma especificidade aumentada no sentido de que resultados falso negativos podem ser evitados.
[0013] Lucchi e outros (2008) descreve diferentes respostas de anticorpos ao complexo de proteína-I de superfície do merozoíto em pacientes com malária cerebral na Índia. Pacientes que sofrem de malária cerebral estão em coma e, portanto, dificilmente doam sangue. Além disso, não há indicação para p33, muito menos que ele possa ser usado para aumentar a sensibilidade de um teste com base em p19 (Lucchi e outros (2008) Respostas de anticorpos ao complexo de proteína I da superfície de merozoíto em pacientes com malária cerebral na India, Malaria Journal, 7: 121).
[0014] Portanto, o problema subjacente à presente invenção é fornecer um imunoensaio para a detecção de anticorpos para proteínas de Plasmodium que produzam resultados mais confiáveis do que o estado dos ensaios da técnica, particularmente em termos de especificidade, sensibilidade e confiabilidade geral do diagnóstico. É desejável que tal imunoensaio possa ser realizado de maneira de alto rendimento para o propósito de confirmar que o sangue doado não está infectado. O formato do ensaio deve ser baseado em proteínas solúveis obtidas usando métodos recombinantes para uso e padronização de alto rendimento. Deve ser possível identificar doadores saudáveis e diagnosticar TTM em pacientes que receberam uma transfusão de sangue, bem como rastrear sangue fracionado doado.
[0015] O problema subjacente à presente invenção é resolvido pelo objetivo das reivindicações independentes e dependentes.
[0016] Em um primeiro aspecto, o problema subjacente à presente invenção é resolvido por um polipeptídeo compreendendo dois ou mais, preferencialmente todos do grupo compreendendo p19 de P. falciparum ou uma variante do mesmo, p19 de P. vivax ou uma variante do mesmo, p19 de P. ovale ou uma variante do mesmo, p19 de P. malariae ou uma variante do mesmo e p19 de P. knowlesi ou uma variante do mesmo.
[0017] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo compreende quatro ou cinco do grupo compreendendo p19 de P. falciparum ou uma variante do mesmo, p19 de P. vivax ou uma variante do mesmo, p19 de P. ovale ou uma variante do mesmo, p19 de P. malariae ou uma variante do mesmo e p19 de P. knowlesi ou uma variante do mesmo
[0018] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo também compreende uma p33 de uma cepa de Plasmodium.
[0019] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo é imobilizado, de preferência em um veículo diagnosticamente útil.
[0020] Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo é purificado.
[0021] Em um segundo aspecto, o problema é resolvido por um veículo diagnosticamente útil que compreende, preferencialmente revestido com o polipeptídeo, preferencialmente imobilizado diretamente no veículo, em que o veículo é preferencialmente selecionado a partir do grupo compreendendo uma lâmina de vidro, preferencialmente para microscopia, um biochip, uma placa de microtitulação, um dispositivo de fluxo lateral, uma tira de teste, uma membrana, de preferência uma mancha de linha, uma coluna de cromatografia e uma conta, de preferência uma conta magnética ou fluorescente.
[0022] Em um terceiro aspecto, o problema é resolvido por um método que compreende a etapa de detecção em um líquido de dois ou mais anticorpos, de preferência todos do grupo compreendendo
um anticorpo para p19 de P. falciparum,
um anticorpo para p19 de P. vivax,
um anticorpo para p19 de P. ovale,
um anticorpo para p19 de P. malariae e
um anticorpo para p19 de P. knowlesi,
compreendendo a etapa contatando o líquido com o polipeptídeo ou veículo.
um anticorpo para p19 de P. falciparum,
um anticorpo para p19 de P. vivax,
um anticorpo para p19 de P. ovale,
um anticorpo para p19 de P. malariae e
um anticorpo para p19 de P. knowlesi,
compreendendo a etapa contatando o líquido com o polipeptídeo ou veículo.
[0023] Em uma modalidade preferida, além disso, um anticorpo para um polipeptídeo p33 de uma cepa de Plasmodium é detectada.
[0024] Em uma modalidade preferida, o anticorpo é detectado usando um método selecionado a partir do grupo compreendendo técnicas de imunodifusão, técnicas imunoeletroforéticas, imunoensaios de dispersão de luz, técnicas de aglutinação, imunoensaios rotulados tais como aqueles do grupo compreendendo imunoensaio radiorrotulado, imunoensaios enzimáticos, mais preferencialmente ELISA, imunoensaios de quimioluminescência, preferencialmente imunoensaios por eletroquimiluminescência e imunofluorescência, preferencialmente imunofluorescência indireta.
[0025] Em um quarto aspecto, o problema é resolvido por um método compreendendo a etapa revestindo um veículo analiticamente ou diagnosticamente útil com o polipeptídeo, em que, de preferência, o veículo é selecionado a partir do grupo compreendo uma lâmina de vidro, de preferência para microscopia, um biochip, uma placa de microtitulação, um dispositivo de fluxo lateral, uma tira de teste, uma membrana, de preferência uma mancha de linha, uma coluna de cromatografia e uma conta, de preferência uma conta magnética ou fluorescente.
[0026] Em um quinto aspecto, o problema é resolvido pelo uso do polipeptídeo ou veículo diagnosticamente útil para identificar sangue de um doador de sangue não infectado.
[0027] Em uma modalidade preferida, um ou mais anticorpos são detectados em uma fração processada de sangue, preferencialmente de um doador de sangue.
[0028] Em um sexto aspecto, o problema é resolvido por um kit compreendendo o polipeptídeo ou veículo, compreendendo ainda um ou mais reagentes do grupo compreendendo um ou mais do que um calibrador, um tampão de lavagem e um meio para detectar um anticorpo, preferencialmente um anticorpo secundário rotulado.
[0029] Em um sétimo aspecto, o problema é resolvido pelo uso do polipeptídeo para a fabricação de um dispositivo analítico ou para a fabricação de uma composição, kit ou reagente para detectar uma infecção por Plasmodium.
[0030] Em um oitavo aspecto, o problema é resolvido por um método para determinar a capacidade, preferencialmente a capacidade de um veículo de acordo com a reivindicação 6, para ligar dois ou mais anticorpos às proteínas Plasmodium p19, compreendendo a etapa de contatar o veículo diagnosticamente útil com uma ou mais soluções compreendendo concentrações conhecidas dos dois ou mais anticorpos.
[0031] A presente invenção é baseada na surpreendente constatação dos inventores de que o uso de um polipeptídeo de fusão compreendendo dois ou mais polipeptídeos de Plasmodium p19 aumenta a confiabilidade do diagnóstico, particularmente a sensibilidade de um imunoensaio para a detecção de Plasmodium. Em particular, o sinal de detecção é surpreendentemente aprimorado e mais fácil de distinguir do antecedente. Sem significado a ser vinculado, teoriza-se que a proximidade espacial dos antígenos tem o efeito de que vários anticorpos para uma variedade de epítopos estejam ligados um ao outro e que isso leva a uma maior densidade de anticorpos que, juntos, são mais fáceis de distinguir de quaisquer anticorpos de ligação não específica ou de qualquer sinal anterior.
[0032] A presente invenção refere-se à detecção de um anticorpo para polipeptídeos de Plasmodium p19 com base em um polipeptídeo compreendendo dois ou mais deles. Em uma modalidade preferida, o termo "Plasmodium p19", como aqui utilizado, é um polipeptídeo compreendendo um elemento de sequência compreendendo a sequência SEQ ID NO1, em que a, b, c e d são cada qual pelo menos 1 e a é mais preferencialmente 2 a 10, mais preferencialmente 5, e b é mais preferencialmente 2 a 10, mais preferencialmente 5 a 6, e c é mais preferencialmente 5 a 15, mais preferencialmente 9 a 13, e d é preferencialmente, ou uma variante. De preferência, o referido polipeptídeo compreende um fragmento do polipeptídeo tipo silvestre do qual o p19 é naturalmente clivado ou uma variante do referido fragmento, em que o fragmento tem um comprimento não superior a 500, preferencialmente 400, 300, 250, 200, 150, 100 ou 90 aminoácidos. Por exemplo, se o Plasmodium p19 é de P. falciparum, o fragmento é do MSP-1 de P. falciparum.
[0033] Em uma modalidade mais preferida, o Plasmodium p19 é selecionado a partir do grupo compreendendo p19 de P. falciparum (SEQ ID NO2) e uma variante do mesmo, P. vivax (SEQ ID NO3) e uma variante do mesmo, P. ovale (SEQ ID NO4) e uma variante do mesmo, P. malariae (SEQ ID NO5) e uma variante do mesmo e P. knowlesi (SEQ ID NO6) e uma variante do mesmo. Em uma modalidade mais preferida, um dos pelo menos dois, quatro ou cinco polipeptídeos Plasmodium p19 é de P. falciparum. Em outra modalidade mais preferida, um dos pelo menos dois ou quatro ou cinco polipeptídeos do Plasmodium p19 é de P. vivax. Em outra modalidade mais preferida, um dos pelo menos dois, quatro ou cinco polipeptídeos do Plasmodium p19 é de P. ovale. Em outra modalidade mais preferida, um dos pelo menos dois ou quatro ou cinco polipeptídeos do Plasmodium p19 é de P. malariae. Em outra modalidade mais preferida, um dos pelo menos dois ou quatro ou cinco polipeptídeos do Plasmodium p19 é de P. knowlesi.
[0034] Opcionalmente, tal Plasmodium p19 pode ser fundido com uma sequência de Plasmodium p33 no terminal C, que pode ser fundida com o Plasmodium p19, mais preferencialmente com seu terminal N, opcionalmente diretamente, ou pode no polipeptídeo de fusão de acordo com a presente invenção ser usado como um ligante entre os dois ou mais polipeptídeos de Plasmodium p19. Em uma modalidade preferida, esta sequência do Plasmodium p33 no terminal C é uma sequência que compreende pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 15 ou 17 aminoácidos do terminal C de um Plasmodium p33, mais preferencialmente compreendendo o motivo de consenso SXLL (SEQ ID NO14) ou uma variante do mesmo. O polipeptídeo p33 do terminal C pode ser da mesma cepa de Plasmodium que o p19 que é fundido, preferencialmente fundido diretamente. Pode ser selecionado a partir do grupo compreendendo a SEQ ID NO20 (P. vivax), SEQ ID NO22 (P. falciparum), SEQ ID NO24 (P. ovale), SEQ ID NO26 (P. malariae) e SEQ ID NO28 (P. knowlesi) e uma variante do mesmo. Em uma modalidade preferida, um Plasmodium p19 fundido a uma sequência de Plasmodium p33 de terminal C faz parte do polipeptídeo e é selecionada do grupo compreendendo a SEQ ID NO21 (P. vivax), SEQ ID NO23 (P. falciparum), SEQ ID NO25 (P. ovale), SEQ ID NO27 (P. malariae) e SEQ ID NO29 (P. knowlesi) e uma variante do mesmo.
[0035] Em uma modalidade preferida, os termos que implicam que dois polipeptídeos do Plasmodium p19 e/ou polipeptídeos adicionais são compreendidos por um polipeptídeo ou fundidos significam que estão covalentemente ligados em uma molécula compreendendo estes polipeptídeos. Embora este possa ser um polipeptídeo de fusão direta no sentido de que a totalidade dos polipeptídeos fundidos ou o polipeptídeo compreendendo esses polipeptídeos é expressa com base em um ácido nucleico sob o controle de um promotor, cujo ácido nucleico codifica a totalidade do polipeptídeo, uma ligação póstranslacional entre polipeptídeos expressos separadamente por ligação química ou reticulação química é outra opção. A pessoa versada na técnica está familiarizada com várias reações químicas e reagentes, como tal como reticuladores, por exemplo, ésteres à base de NHS, carbodiimidas, maleimidas, haloacetilas, estão comercialmente disponíveis e são descritas no estado da técnica, por exemplo, em US6184344 ou US7597882
[0036] O polipeptídeo de acordo com a presente invenção é uma fusão compreendendo dois, três, quatro ou cinco polipeptídeos de Plasmodium p19, por exemplo, o p19 de P. vivax e o p19 de P. falciparum; o p19 de P. vivax e o p19 de P. falciparum e o p19 de P. falciparum e o p19 de P. ovale. Além disso, pode compreender um ou mais polipeptídeos do Plasmodium p33. Os dois polipeptídeos de p19, opcionalmente polipeptídeos de p19 e/ou p33 adicionais podem ser fundidos diretamente um ao outro ou podem ser fundidos por meio de ligantes que são preferencialmente sequências de polipeptídeos compreendendo um Plasmodium ou não-Plasmodium ou uma sequência artificial. Esta sequência é preferencialmente escolhida de modo que seja razoavelmente resistente à clivagem por clivagem proteolítica em uma célula de expressão. Adicionalmente, a sequência não deve comprometer a solubilidade de todo o polipeptídeo e não deve limitar o acesso de anticorpos em um ambiente aquoso do polipeptídeo a epítopos nos polipeptídeos p19 e/ou p33.
[0037] Em uma modalidade preferida, o termo “Plasmodium p33”, como aqui utilizado, é um polipeptídeo compreendendo um elemento de sequência compreendendo a sequência (SEQ ID NO7), em que a e b são cada qual pelo menos 1 e a é mais preferencialmente 15 a 60, mais preferencialmente 21, 23, 29, 35 ou 45, e b é mais preferencialmente 10 a 30, mais preferencialmente 16, 22 ou 23, ou uma variante. De preferência, o referido polipeptídeo compreende um fragmento do polipeptídeo tipo silvestre do qual o p19 é naturalmente clivado ou uma variante do referido fragmento, em que o fragmento tem um comprimento não superior a 800, preferencialmente 700, 600, 500, 450, 400, 350 ou 320 aminoácidos. Por exemplo, se o Plasmodium p33 for de P. falciparum, o fragmento será de MSP-1 de P. falciparum.
[0038] Em uma modalidade preferida, o Plasmodium p33 é selecionado a partir de ou compreende todos do grupo compreendendo p33 de P. falciparum (SEQ ID NO8) e uma variante do mesmo, P. vivax (SEQ ID NO9) e uma variante do mesmo, P. ovale (SEQ ID NO10) e uma variante do mesmo, P. malariae (SEQ ID NO11) e uma variante do mesmo e P. knowlesi (SEQ ID NO12) e uma variante do mesmo. Em uma modalidade mais preferida, o Plasmodium p33 é de P. vivax. Em uma modalidade mais preferida, o Plasmodium p33 é de P. falciparum. Em uma modalidade mais preferida, o Plasmodium p33 é de P. ovale. Em uma modalidade mais preferida, o Plasmodium p33 é de P. malariae. Em uma modalidade mais preferida, o Plasmodium p33 é de P. knowlesi.
[0039] As sequências de consenso citadas permitem que o especialista na técnica use qualquer proteína p19 ou p33 de outras cepas de Plasmodium ou partes delas, tal como o terminal C da p33, que possa ser detectado no futuro, ou de organismos similares, que causam malária ou uma doença similar ou necessita ser detectada para garantir a qualidade do sangue doado por outro motivo.
[0040] A proteína da superfície do merozoíto (MSP-1) é um grande complexo multiproteico exposto na superfície dos merozoítos. Durante a esquizogonia tardia, MSP-1 é proteoliticamente processado de seu precursor de 190 kDa em quatro principais produtos de clivagem: p83, p30, p38 e p42. Durante a invasão de eritrócitos, p42 é também clivado em p33 e p19, o que é essencial para a invasão. O MSP-1 proteoliticamente processado parece existir em associação com os produtos processados de MSP-6 e MSP-7.
[0041] De acordo com a presente invenção, um veículo diagnosticamente útil é fornecido, que compreende o polipeptídeo de acordo com a presente invenção. O referido polipeptídeo, juntamente com o veículo insolúvel ao qual está ligado, pode ser separado de uma mistura de reação, em que é contatado com um líquido, de maneira direta, por exemplo por filtração, centrifugação ou decantação. O referido polipeptídeo pode ser imobilizado de maneira reversível ou irreversível. Por exemplo, a imobilização é reversível se o polipeptídeo interage com o veículo por meio de interações iônicas que podem ser mascaradas pela adição de uma alta concentração de sal ou se o polipeptídeo estiver ligado por meio de uma ligação covalente clivável. Por outro lado, a imobilização é irreversível se o polipeptídeo for amarrado ao veículo através de uma ligação covalente que não pode ser clivada em solução aquosa. O polipeptídeo pode ser indiretamente imobilizado, por exemplo, imobilizando-se um anticorpo ou outra entidade com afinidade com o polipeptídeo, seguido pela adição do polipeptídeo e formação de um complexo polipeptídeo-anticorpo. O anticorpo capturado pode ser detectado usando um anticorpo secundário rotulado ou um meio rotulado para capturar especificamente o anticorpo a ser detectado.
[0042] Em todo este pedido, o termo "para especificamente capturar", da mesma forma em variações tais como "especificamente capturar" ou similar, quando aqui utilizado, significa que a reação de ligação entre os meios e o anticorpo é mais forte do que uma reação de ligação caracterizada por uma dissociação constante de 1 x 10-5 M, mais preferencialmente 1 x 10-7 M, mais preferencialmente 1 x 10-8 M, mais preferencialmente 1 x 10-9 M, mais preferencialmente 1 x 10-10 M, mais preferencialmente 1 x 10-11 M, mais preferencialmente 1 x 10-12 M, como determinado por ressonância plasmônica de superfície usando equipamento Biacore a 25°C em tampão de PBS em pH 7.
[0043] Em outra modalidade preferida, o veículo é uma placa de microtitulação compreendendo pelo menos 8 cavidades que podem ser utilizadas para ELISA. Pelo menos uma das cavidades é revestida direta ou indiretamente, por exemplo, usando um anticorpo de revestimento acoplado à placa que se liga ao polipeptídeo. Pelo menos 3, preferencialmente 4, mais preferencialmente 5 calibradores são fornecidos que compreendem um anticorpo ao polipeptídeo em concentrações definidas e podem ser usados para configurar uma curva de calibração para análise semiquantitativa. Um anticorpo secundário compreendendo um rotulador enzimaticamente ativo pode ser fornecido.
[0044] Em outra modalidade preferida, o veículo diagnosticamente útil compreende um polipeptídeo para especificamente capturar qualquer anticorpo da classe de anticorpo a ser detectado, preferencialmente um meio para especificamente capturar toda a classe, preferencialmente IgG, IgA ou IgM, preferencialmente anticorpos da classe IgM no líquido, em que o veículo diagnosticamente útil pode ser fornecido em combinação com o polipeptídeo.
[0045] Se for esse o caso, o ensaio é realizado de modo que o líquido seja contatado com o veículo sob condições que permitam a ligação ao veículo de todos os anticorpos no líquido da classe de anticorpos que compreendem o anticorpo a ser detectado, mais especificamente classe IgG, preferencialmente anticorpo IgG, seguido de lavagem, seguido de detecção específica do anticorpo a ser detectado. Para este propósito, o veículo pode ser contatado com um polipeptídeo rotulado de acordo com a presente invenção.
[0046] O polipeptídeo ou anticorpo secundário ou qualquer outro meio para detectar um complexo compreendendo o polipeptídeo e um anticorpo de uma amostra pode compreender um rótulo detectável, de preferência do grupo compreendendo um rótulo enzimaticamente ativo, fluorescente, radioativo ou luminescente, preferencialmente quimioluminescente ou rótulo rotativo. Alternativamente, o polipeptídeo pode ser dissociado do anticorpo após-ligação e lavagem específicas para detectar sua presença ou ausência.
[0047] Alternativamente, um anticorpo purificado e rotulado pode ser usado para detectar um antígeno não rotulado ligado pelo anticorpo a ser detectado, que por sua vez foi capturado pelos meios para especificamente capturar todos os anticorpos da classe Ig do anticorpo a ser detectado, preferencialmente Classe IgG, um método geralmente referido como teste de ponte e descrito em vários formatos no estado da técnica, por exemplo, US2018209973 ou US5296347.
[0048] Um formato de ensaio competitivo pode ser usado, em que o polipeptídeo forma um complexo com um anticorpo que se liga a ele, após-o deslocamento do polipeptídeo ou do anticorpo do complexo, como pode ser detectado usando um rótulo que é anexo ao deslocado ou deslocando o polipeptídeo ou anticorpo.
[0049] De acordo com a presente invenção, um veículo diagnosticamente útil, preferencialmente uma conta, compreendendo o polipeptídeo é fornecido
[0050] Várias contas para inúmeras aplicações estão comercialmente disponíveis, principalmente à base de carboidratos, por exemplo, sefarose ou agarose ou plástico. Eles contêm grupos químicos ativos ou ativáveis, como o grupo carboxila, que podem ser utilizados para a imobilização de reagentes, tal como o polipeptídeo. De preferência, as contas são contas com um diâmetro médio de 0,2 µm a 5 mm, de 0,5 µm a 1 mm, de 0,75 µm a 100 µm ou de 1 µm a 10 µm. As contas podem ser revestidas com o polipeptídeo diretamente ou através de ligantes de afinidade, por exemplo biotina ou glutationa. De preferência, a conta é fornecida na forma de uma suspensão aquosa com um conteúdo de conta de 10 a 90%, preferencialmente de 20 a 80%, preferencialmente de 30 a 70%, mais preferencialmente de 40 a 60% (p/p).
[0051] Em uma modalidade particularmente preferida, as contas são contas paramagnéticas, que podem ser facilmente concentradas em uma superfície com a ajuda de um ímã. Para este propósito, as contas paramagnéticas comerciais geralmente contêm um mineral paramagnético, por exemplo, óxido de ferro. Uma multiplicidade de contas paramagnéticas adequadas está comercialmente disponível.
[0052] O líquido utilizado é qualquer líquido aquoso que pode compreender anticorpos a serem detectados, de preferência derivados do sangue. O líquido pode preferencialmente ser uma amostra compreendendo anticorpos de um indivíduo. Em uma modalidade preferida, a amostra é selecionada a partir do grupo compreendendo sangue total, soro, plasma, saliva, sangue doado processado, preferencialmente sangue doado fracionado, mais preferencialmente frações enriquecidas em plaquetas ou plasma ou eritrócitos. O sangue doado processado pode compreender produtos químicos que o estabilizam, por exemplo, impedindo o entupimento, preferencialmente do grupo compreendendo citrato, fosfato e dextrose.
[0053] No entanto, os ensinamentos da presente invenção podem não apenas ser realizados usando polipeptídeos com as sequências exatas mencionadas neste pedido explicitamente, por exemplo, por função, nome, sequência ou número de acesso ou implicitamente, porém da mesma forma usando variantes de tais polipeptídeos.
[0054] Em uma modalidade preferida, o termo "variante", quando aqui utilizado, pode se referir a pelo menos um fragmento da sequência completa referida, mais especificamente a uma ou mais sequências de aminoácidos ou ácidos nucleicos que são, relativas à sequência de tamanho natural, truncadas em um ou ambos os terminais por um ou mais aminoácidos. Um tal fragmento compreende ou codifica para um peptídeo possuindo pelo menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200 ou 250 sucessivos aminoácidos da sequência original ou uma variante do mesmo. O comprimento total da variante pode estar em 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 ou 250 ou mais aminoácidos.
[0055] Em outra modalidade preferida, o termo "variante" refere-se não apenas a pelo menos um fragmento, porém da mesma forma a um polipeptídeo ou um fragmento do mesmo compreendendo sequências de aminoácidos, preferencialmente um fragmento compreendendo pelo menos 25, mais preferencialmente 50, mais preferencialmente 200 aminoácidos sucessivos, que são pelo menos 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 ou 99% idênticos à sequência de aminoácidos de referência referida ou ao seu fragmento, em que aminoácidos que não sejam essenciais para a atividade biológica, por exemplo, a capacidade de se ligar especificamente a um anticorpo de interesse ou à dobra ou estrutura do polipeptídeo são excluídos ou substituídos e/ou um ou mais desses aminoácidos essenciais são substituídos de uma maneira conservadora e/ou aminoácidos são adicionados ou excluídos de modo que a atividade biológica do polipeptídeo seja pelo menos parcialmente preservada. O estado da técnica compreende vários métodos que podem ser usados para alinhar duas sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos e calcular o grau de identidade, veja, por exemplo, Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, Oxford University Press, 2008, 3º edição. Em uma modalidade preferida, o software ClustalW (Larkin, MA, Blackshields, G., Brown, NP, Chenna, R., McGettigan, PA, McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, IM, Wilm, A., Lopez, R., Thompson, JD, Gibson, TJ, Higgins, DG (2007): Clustal W e Clustal X versão 2.0. Bioinformatics, 23, 2947-2948) é usado aplicando configurações padrão.
[0056] Em uma modalidade preferida, as variantes podem, além disso, compreender modificações químicas, por exemplo, rótulos como rótulos isotópicos ou rótulos detectáveis ou modificações covalentes, como glicosilação, fosforilação, acetilação, descarboxilação, citrulinação, hidroxilação e similares. A pessoa versada na técnica está familiarizada com métodos para a modificação de polipeptídeos. Além disso, variantes podem da mesma forma ser geradas por meio de fusão com outros polipeptídeos conhecidos ou variantes dos mesmos, por exemplo, ligantes artificiais, preferencialmente não derivados de um polipeptídeo de Plasmodium, rótulos de afinidade, outros antígenos e similares.
[0057] A variante do polipeptídeo tem atividade biológica. Em uma modalidade preferida, tal atividade biológica é a capacidade de se ligar ao anticorpo respectivo. Em uma modalidade preferida, compreende um epítopo com a capacidade de se ligar ao anticorpo respectivo, preferencialmente a partir de uma amostra de um paciente que sofre de malária, em que mais preferencialmente o epítopo compreende uma sequência compreendendo pelo menos 5, 6, 7 ou 8 resíduos de aminoácidos. Mais especificamente, uma variante de SEQ X tem a capacidade de se ligar especificamente ou capturar especificamente um anticorpo que se liga a SEQ X a partir de uma amostra de um paciente infectado com Plasmodium, em que X é preferencialmente selecionado a partir do grupo compreendendo SEQ ID NO1, SEQ ID NO2 , SEQ ID NO3, SEQ ID NO4, SEQ ID NO5, SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9, SEQ ID NO10, SEQ ID NO11, SEQ ID NO12, SEQ ID NO13, SEQ ID NO14, SEQ ID NO15, SEQ ID NO16, SEQ ID NO17, SEQ ID NO18, SEQ ID NO19, SEQ ID NO20, SEQ ID NO21, SEQ ID NO22, SEQ ID NO23, SEQ ID NO24, SEQ ID NO25, SEQ ID NO26, SEQ ID NO27 , SEQ ID NO28 e SEQ ID NO29.
[0058] A pessoa versada na técnica é capaz de projetar variantes tendo atividade biológica iniciando com a respectiva sequência X, se uma variante de X é requerida, introduz modificações tais como mutações pontuais, truncamentos e similares e subsequentemente confirma que a variante ainda tem atividade biológica testando se a referida variante se liga a um anticorpo de tal amostra. Em uma modalidade preferida, um ensaio ELISA com base no polipeptídeo variante revestido em uma microplaca, de preferência como descrito nos exemplos, é utilizado para testar se a variante tem tal atividade.
[0059] O polipeptídeo pode ser fornecido em qualquer forma e em qualquer grau de purificação, a partir de tecidos, frutas ou células compreendendo o referido polipeptídeo em uma forma endógena, mais preferencialmente células que superexpressam o polipeptídeo, lisados brutos ou enriquecidos de tais células, para polipeptídeo purificado e/ou isolado que pode ser essencialmente puro. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo é um polipeptídeo nativo, em que o termo "polipeptídeo nativo", quando aqui utilizado, refere-se a um polipeptídeo dobrado, mais preferencialmente a um polipeptídeo dobrado purificado a partir de células, mais preferencialmente a partir de células de mamíferos. Se um polipeptídeo nativo for utilizado, é preferencialmente enriquecido em comparação com o seu estado natural.
[0060] De acordo com a presente invenção, o polipeptídeo pode ser uma proteína recombinante, em que o termo "recombinante", quando aqui utilizado, refere-se a um polipeptídeo produzido utilizando abordagens de engenharia genética em qualquer estágio do processo de produção, por exemplo, fundindo um ácido nucleico que codifica o polipeptídeo para um forte promotor para superexpressão em células ou tecidos ou por engenharia da sequência do próprio polipeptídeo. A pessoa versada na técnica está familiarizada com os métodos de engenharia de ácidos nucleicos e polipeptídeos codificados (por exemplo, descritos em Sambrook, J., Fritsch, EF e Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, CSH ou Brown TA (1986), Gene Cloning - an introduction, Chapman & Hall) e para a produção e purificação de polipeptídeos nativos ou recombinantes (por exemplo, Handbooks “Strategies for Protein Purification”, “Antibody Purification”, published by GE Healthcare Life Sciences, and in Burgess, R. R., Deutscher, M. P. (2009): Guide to Protein Purification). Em outra modalidade preferida, o polipeptídeo é um polipeptídeo isolado, em que o termo "isolado" significa que o polipeptídeo foi enriquecido em comparação com seu estado após-a produção usando uma abordagem biotecnológica ou sintética e é preferencialmente puro, ou seja, pelo menos 60, 70, 80 90, 95 ou 99 por cento do polipeptídeo no respectivo líquido consiste no referido polipeptídeo, a julgar pela eletroforese em gel de poliacrilamida SDS, seguido por coloração com azul de Coomassie e inspeção visual. Preferencialmente, qualquer polipeptídeo em um veículo usado como um meio para capturar um anticorpo é puro.
[0061] Qualquer anticorpo pode ser detectado em um líquido, de preferência uma amostra de um indivíduo. É um organismo que produz anticorpos, preferencialmente anticorpos da classe IgM, IgA ou IgG, mais preferencialmente anticorpos da classe IgG, mais preferencialmente um mamífero, mais preferencialmente um humano.
[0062] Os ensinamentos da invenção fornecem um kit, preferencialmente para detectar infecção por Plasmodium ou diagnosticar Malária, mais preferencialmente para diagnosticar TTM. Esse kit é um recipiente que compreende reagentes específicos necessários para a prática do método inventivo, em particular o veículo diagnosticamente útil de acordo com a presente invenção, opcionalmente além de uma ou mais soluções ou reagentes necessários para a prática do método inventivo, de preferência selecionado a partir de ou todos do grupo compreendendo tampão de diluição da amostra, tampão de lavagem e tampão compreendendo um meios para detectar qualquer anticorpo especificamente capturado, tal como um anticorpo secundário e opcionalmente um meio para detectar o último. Além disso, pode compreender instruções detalhando como usar o kit. Pode compreender o veículo diagnosticamente útil para o contato do polipeptídeo inventivo com uma amostra de fluido corporal de um indivíduo, preferencialmente um indivíduo humano, por exemplo, uma linha de transferência. Além disso, o kit pode compreender um controle positivo, por exemplo, um anticorpo recombinante conhecido por se ligar a um ou mais do grupo compreendendo SEQ ID NO1, SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, SEQ ID NO4, SEQ ID NO5, SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 e SEQ ID NO10 e um controle negativo, por exemplo, uma proteína que não possui afinidade detectável com um Plasmodium p19 ou p33, como albumina de soro bovino. Finalmente, esse kit pode compreender uma ou mais soluções padrões compreendendo um anticorpo que se liga a um ou mais de SEQ ID NO1, SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, SEQ ID NO4, SEQ ID NO5, SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, SEQ ID NO8, SEQ ID NO9 e SEQ ID NO10 para preparar uma curva de calibração, em que a concentração absoluta ou relativa do anticorpo em cada solução padrão é preferencialmente conhecida. O kit pode compreender um meio ou reagente para detectar um anticorpo capturado. O kit pode compreender o polipeptídeo de acordo com a presente invenção ou um polipeptídeo purificado compreendendo uma sequência do grupo compreendendo SEQ ID NO1, SEQ ID NO2, SEQ ID NO3, SEQ ID NO4, SEQ ID NO5, SEQ ID NO6, SEQ ID NO7, ID SEQ NO8, SEQ ID NO9 e SEQ ID NO10, cujo polipeptídeo pode opcionalmente ser rotulado. O kit pode da mesma forma compreender uma solução de lavagem. O kit pode compreender um recipiente à prova d’água adequado para entrar em contato com o veículo diagnosticamente útil com a amostra na presença de outros líquidos, como um tampão de reação. Por exemplo, uma mancha de linha em ou em combinação com uma bandeja de incubação ou uma placa de microtitulação pode ser fornecida. Recipientes adequados são descritos no estado da técnica, por exemplo EP3025780 ou EP3025779).
[0063] De acordo com a presente invenção, um meio ou reagente para detectar um anticorpo capturado pode ser fornecido ou utilizado para detectar um anticorpo capturado em um Plasmodium p19 e/ou para detectar um anticorpo em um Plasmodium p33. Este meio ou reagente pode ser um anticorpo secundário que se liga à região constante de um anticorpo da classe de interesse. Por exemplo, se um anticorpo capturado da classe IgG humana for detectado, uma ligação de anticorpo especificamente à região constante dos anticorpos humanos da classe IgG pode ser usada. Os meios ou reagentes podem ser rotulados direta ou indiretamente. Liga-se especificamente, que preferencialmente significa que a reação de ligação entre os meios e o anticorpo capturado é mais forte do que uma reação de ligação caracterizada por uma constante de dissociação de 1 x 10-5 M, mais preferencialmente 1 x 10-7 M, mais preferencialmente 1 x 10-8 M, mais preferencialmente 1 x 10-9 M, mais preferencialmente 1 x 10-10 M, mais preferencialmente 1 x 10-11 M, mais preferencialmente 1 x 10-12 M, como determinado por ressonância plasmônica de superfície usando equipamento Biacore a 25°C em tampão de PBS em pH 7.
[0064] Os produtos e métodos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para detectar uma infecção ou contaminação por Plasmodium em um líquido como sangue doado in vitro. O sangue doado é preferencialmente de um doador cuja identidade é desconhecida. É provável ou mais provável que o sangue seja contaminado com Plasmodium se um anticorpo para pelo menos um Plasmodium p19 ou pelo menos um Plasmodium p33 for detectado.
[0065] Eles podem da mesma forma ser usados para diagnosticar uma doença que é uma infecção por Plasmodium, preferencialmente Malária, mais preferencialmente TTM em um indivíduo. Em uma modalidade preferida, o termo "diagnóstico", quando aqui utilizado, refere-se a qualquer tipo de procedimento que visa obter informações instrumentais na avaliação se um paciente sofre ou é provável ou mais provável que a média ou um indivíduo comparativo, este último preferencialmente tendo sintomas similares, sofrer de certa doença ou distúrbio no passado, no momento do diagnóstico ou no futuro, para descobrir como a doença está progredindo ou é provável que progrida no futuro ou para avaliar a capacidade de resposta de um paciente em relação a um tratamento. Em outras palavras, o termo "diagnóstico" compreende não apenas o diagnóstico, porém da mesma forma o prognóstico e/ou o monitoramento do curso de uma doença ou distúrbio. É provável ou mais provável que o indivíduo sofra da doença se um anticorpo para pelo menos um Plasmodium p19 ou pelo menos um Plasmodium p33, como mostrado pela detecção de um anticorpo para o polipeptídeo de acordo com a invenção, for detectado em seu líquido.
[0066] Portanto, o termo "diagnóstico" preferencialmente não implica que os métodos ou agentes diagnósticos de acordo com a presente invenção sejam definitivos e suficientes para finalizar o diagnóstico com base em um único teste, sem falar no parâmetro, porém pode se referir a uma contribuição para o que é referido como "diagnóstico diferencial", isto é, um procedimento diagnóstico sistemático, considerando a probabilidade de uma variedade de condições possíveis com base em uma variedade de parâmetros diagnósticos. Em uma modalidade preferida, o termo "diagnóstico" significa que o método, produto ou uso pode ser usado para auxiliar no diagnóstico de uma doença ou identificar um indivíduo em risco de sofrer de uma doença. O termo "diagnóstico" pode da mesma forma se referir a um método ou agente usado para escolher o regime de tratamento mais promissor para um paciente. Em outras palavras, o método ou agente pode estar relacionado à seleção de um regime de tratamento para um indivíduo.
[0067] A presente invenção refere-se a um método compreendendo a etapa de detecção em um líquido de um indivíduo da presença ou ausência de um anticorpo para um Plasmodium p19 e/ou um Plasmodium p33. Tal método pode compreender as etapas a) fornecer um líquido, preferencialmente uma amostra de sangue processado e/ou fracionado doado ou amostra de um indivíduo, b) contatar o líquido com o polipeptídeo de acordo com a presente invenção sob condições compatíveis com a formação de um complexo compreendendo o veículo útil para o diagnóstico e o anticorpo, mais especificamente o polipeptídeo e o anticorpo, c) isolar qualquer complexo referido, por exemplo, removendo o líquido, d) opcionalmente lavar o referido complexo e e) detectar o referido complexo, opcionalmente apóscontato com um Plasmodium p19 e/ou Plasmodium p33, que pode ser rotulado no caso de um formato de ensaio competitivo. O método é preferencialmente um método in vitro.
[0068] A detecção do anticorpo ou complexo para prognóstico, diagnóstico, métodos ou kit de acordo com a presente invenção compreende a utilização de um método selecionado a partir do grupo compreendendo técnicas de imunodifusão, técnicas imunoeletroforéticas, imunoensaios de dispersão de luz, técnicas de aglutinação, imunoensaios rotulados tais como aqueles do grupo compreendendo imunoensaios radiorotulados, imunoensaios enzimáticos, tais como ensaios colorimétricos, imunoensaios de quimioluminescência e técnicas de imunofluorescência. Em uma modalidade preferida, o complexo é detectado usando um método selecionado a partir do grupo compreendendo técnicas de imunodifusão, técnicas imunoeletroforéticas, imunoensaios de dispersão de luz, técnicas de aglutinação, imunoensaios rotulados do grupo compreendendo imunoensaios radiorotulados, imunoensaios de quimioluminescência e técnicas de imunofluorescência. A pessoa versada na técnica está familiarizada com esses métodos, que são da mesma forma descritos no estado da técnica, por exemplo, em Zane, HD (2001): Immunology – Theoretical & Practical Concepts in Laboratory Medicine, W. B. Saunders Company, em particular, no capítulo 14.
[0069] Em outra modalidade preferida, o prognóstico, diagnóstico, métodos ou kit de acordo com os ensinamentos da invenção contemplam o uso de imunofluorescência indireta. A pessoa versada na técnica está familiarizada com essas técnicas, descritas no estado da técnica (US4647543; Voigt, J., Krause, C., Rohwäder, E, Saschenbrecker, S., Hahn, M., Danckwardt, M., Feirer, C., Ens, K, Fechner, K, Barth, E, Martinetz, T., e Stöcker, W. (2012), Automated Indirect Immunofluorescence Evaluation of Antinuclear Autoantibodies on HEp-2 Cells,” Clinical and Developmental Immunology, vol. 2012, doi:10.1155/2012/65105; Bonilla, E., Francis, L., Allam, F., e outros, Immuno-fluorescence microscopy is superior to fluorescent beads for detection of antinuclear antibody reactivity in systemic lupus erythematosus patients, Clinical Immunology, vol. 124, no. 1, pp. 18–21, 2007). Reagentes, dispositivos e pacotes de software adequados estão comercialmente disponíveis, por exemplo, em EUROIMMUN, Lübeck, Alemanha.
[0070] Em muitos casos, detectar, preferencialmente significando detectar a ausência ou presença de um anticorpo, opcionalmente significando determinar se a concentração do anticorpo está além de um certo limiar, de preferência como definido por medição usando ELISA, no líquido, é suficiente para o diagnóstico. Se o anticorpo puder ser detectado, isso será uma informação instrumental para o diagnóstico clínico e indica uma probabilidade aumentada de que o paciente sofra de uma doença. Em uma modalidade preferida, a concentração relativa do anticorpo no soro, em comparação com o nível que pode ser encontrado no indivíduo saudável médio, pode ser determinada. Em uma modalidade preferida, o termo "detectando a presença", quando aqui utilizado, significa que é suficiente verificar se um sinal suficientemente além de qualquer nível antecedente pode ser detectado usando um método de detecção complexo adequado que indica que o anticorpo de interesse está presente ou mais anticorpos de interesse estão presentes do que em um indivíduo saudável.
[0071] Em uma modalidade preferida, a ausência ou presença de dois ou mais anticorpos em um Plasmodium p19 e opcionalmente um ou mais anticorpos para um Plasmodium p33 é preferencialmente detectada simultaneamente, isto é, ao mesmo tempo.
[0072] Em uma modalidade preferida, a ausência ou presença de dois ou mais anticorpos em um Plasmodium p19 e opcionalmente um ou mais anticorpos para um Plasmodium p33 é detectada em reações espacialmente separadas, mais preferencialmente em diferentes misturas de reação em vasos separados.
[0073] De acordo com a presente invenção, um anticorpo para um Plasmodium p19 e opcionalmente um anticorpo para um Plasmodium p33 e opcionalmente anticorpos adicionais são detectados. Em uma modalidade preferida, isso significa que é detectado se pelo menos um desses anticorpos está presente, sem distinguir a qual dos antígenos o anticorpo se liga ou se apenas um ou mais do que um anticorpo está presente. De qualquer forma, é importante garantir que os anticorpos que se liguem a um antígeno que não seja um Plasmodium p19 e Plasmodium p33 não sejam erroneamente tomados como ligação de anticorpos a um Plasmodium p19 e Plasmodium p33 para evitar resultados falsos positivos.
[0074] Em uma modalidade preferida, a invenção é usada para verificar um dispositivo analítico. Em uma modalidade preferida, o termo "dispositivo analítico" refere-se a um dispositivo feito para fins não diagnósticos, em particular para detectar pelo menos um anticorpo contra um Plasmodium p19 e pelo menos um anticorpo para um Plasmodium p33 para rastrear sangue doado. Em outras palavras, as informações coletadas são usadas para verificar a qualidade do sangue doado, com a identidade do doador desconhecida, em vez de diagnosticar a condição de um paciente conhecido, com a atribuição de um resultado diagnóstico a uma pessoa específica.
[0075] A invenção fornece um uso do polipeptídeo de acordo com a presente invenção para a fabricação de um kit, reagente ou composição para o diagnóstico de uma doença ou para avaliar sangue doado para infecção ou contaminação com Plasmodium, em que preferencialmente, um ensaio diagnóstico ou analítico com uma sensibilidade aumentada é fornecido. Tal fabricação pode se referir a um método compreendendo a etapa de imobilização em um veículo diagnosticamente útil ou dispositivo analítico do polipeptídeo de acordo com a presente invenção.
[0076] A presente invenção é também ilustrada pelas figuras a seguir e exemplos não limitantes dos quais outras características, modalidades, aspectos e vantagens da presente invenção podem ser tomadas.
[0077] Fig. 1 mostra um alinhamento de polipeptídeos p19 de P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi.
[0078] Fig. 2 mostra um alinhamento dos polipeptídeos p33 de P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi.
[0079] Fig. 3 mostra um marcador de peso molecular (PM, esquerdo) e um polipeptídeo de fusão purificado de acordo com a presente invenção (SEQ ID NO30).
[0080] As seguintes experiências foram realizadas para avaliar o desempenho de diferentes combinações de antígenos do Plasmodium para a detecção de anticorpos IgG anti-Plasmodium específicos no soro ou plasma humano.
[0081] O painel de sensibilidade continha 50 amostras clínicas de pacientes com infecção por Plasmodium comprovada. Os quatro causadores de Plasmodium spp. (P. falciparum n = 26, P. vivax n = 6, P. ovale n = 12 e P. malariae n = 6) foram determinados por microscopia e PCR. Além disso, as amostras clínicas foram analisadas quanto a anticorpos anti-Plasmodium usando a imunofluorescência (IFT) e ELISA.
[0082] O painel de especificidade contém 37 amostras originárias de indivíduos saudáveis (gestantes, crianças e doadores de sangue da Alemanha). A exposição anterior ao Plasmodium é altamente improvável devido à origem das amostras.
[0083] Os seguintes antígenos da Proteína de Superfície de Merozoíto 1 (MSP-1) foram utilizados na forma de construções marcadas com His clonadas no vetor pET24d (Novagen) e purificadas por cromatografia de afinidade por níquel usando metodologia padrão:
- • polipeptídeo p19 de MSP-1 P. falciparum (SEQ ID NO13)
- • polipeptídeo p19 de MSP-1 P. vivax (SEQ ID NO15)
- • polipeptídeo p33 de MSP-1 P. vivax (SEQ ID NO16)
- • polipeptídeo p19 de MSP-1 P. ovale (SEQ ID NO17)
- • polipeptídeo p19 de MSP-1 P. malariae (SEQ ID NO18)
- • polipeptídeo p19 de MSP-1 P. knowlesi (SEQ ID NO19)
- • Polipeptídeo de fusão, de acordo com a presenteinvenção, N-terminalmente rotulado com His, compreendendo nessa ordem: p33 de P. vivax - p19 de P. vivax - sequência de terminal C de P. falciparum p33 - p19 de P. falciparum - sequência de terminal C de P. ovale p33 - p19 de P. ovale - sequência de terminal C de P. malariae p33 - p19 de P. malariae - sequência de terminal C de P. knowlesi - p19 de P. knowlesi (SEQ ID NO30).
[0084] Para utilização em microtitulação ELISA, esses antígenos foram diluídos em PBS em concentrações finais de aproximadamente 2,0 µg/ml e usados para revestir placas de microtitulação ELISA (Nunc, Roskilde, Dinamarca).
[0085] As amostras foram diluídas 1:101 em tampão de amostra de IgG, aplicadas a placas de microtitulação e incubadas como descrito para os kits de teste comerciais EUROIMMUN ELISA (por exemplo, EI 2260-9601 G). Em resumo: 60 min a 37 °C; 3 etapas de lavagem usando tampão de lavagem EUROIMMUN; adição de 100 µl de conjugado de IgG anti-humano rotulado com peroxidase (cabra) por cavidade; incubação por 30 min a 37°C; 3 etapas de lavagem usando tampão de lavagem EUROIMMUN; adição de 100 µl de solução de cromogênio/substrato (TMB/H2O2) por cavidade; incubação por 30 min em temperatura ambiente; adição de 100 µl de solução de parada (ácido sulfúrico 0,5 M); medição da densidade óptica a 450 nm.
[0086] O painel 1 foi utilizado para avaliação da sensibilidade dos respectivos antígenos para detecção de anticorpos IgG antiPlasmodium específicos. O painel 2 foi incubado para determinar a especificidade do sistema de teste.
[0087] A comparação dos polipeptídeos p19 de MSP-1 P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi, bem como os polipeptídeos p33 de MSP-1 de P. falciparum e P. vivax mostraram sensibilidades e especificidades gerais de:
[0088] Os dados primários são mostrados na Tabela 1, um resumo dos resultados na Tabela 2.
Tabela 1: Dados primários. As colunas mostram as leituras de ELISA obtidas quando a mesma amostra foi contatada em vasos separados com antígenos individuais expressos separadamente ou o polipeptídeo de fusão compreendendo todos eles.
Tabela 1: Dados primários. As colunas mostram as leituras de ELISA obtidas quando a mesma amostra foi contatada em vasos separados com antígenos individuais expressos separadamente ou o polipeptídeo de fusão compreendendo todos eles.
[0089] O conjunto de amostras utilizado para avaliação da sensibilidade deste teste são amostras originárias de pacientes com infecções agudas. Se essas amostras fossem coletadas em momentos precoces da infecção, haveria a possibilidade de que eles não apresentassem IgG anti-Plasmodium, porque a soroconversão ainda não ocorreu (quatro amostras positivas para PCR e microscopia, porém a sorologia é negativa).
[0090] Em primeiro lugar, a intensidade do sinal é consideravelmente aumentada se o polipeptídeo de fusão for usado em vez de antígenos expressos separadamente, mesmo se um anticorpo para um antígeno estiver presente apenas, por exemplo, nas amostras 9 a 11, em que os anticorpos para polipeptídeo P. falciparum p19 estão presentes apenas.
[0091] Em segundo lugar, é claro que o sinal está acima do ponto de corte em um número maior de amostras de pacientes que sofrem de Malária, mostrando a sensibilidade aumenta do teste. A especificidade é apenas um pouco melhor.
[0092] Polipeptídeos de fusão adicionais compreendendo polipeptídeos p19 e p33 de MSP-1 de Plasmodium spp. foram utilizados para a detecção de anticorpos em amostras de sangue humano. As experiências foram essencialmente realizadas como descrito no Exemplo 1, porém utilizando polipeptídeos adicionais de acordo com a presente invenção.
[0093] O painel de sensibilidade contém 47 amostras clínicas de pacientes com infecção comprovada por Plasmodium. Os quatro causadores de Plasmodium spp. (P. falciparum n = 24, P. vivax n = 5, P. ovale n = 12 e P. malariae n = 6) foram determinados por microscopia e PCR. Além disso, as amostras clínicas foram analisadas quanto a anticorpos anti-Plasmodium por meio de IFT e ELISA.
[0094] O painel se sobrepôs ao Painel 1 usado na Experiência 1, com a exceção de que poucas amostras não puderam ser examinadas novamente porque as quantidades disponíveis eram insuficientes. Os números das amostras são idênticos nos painéis 1 e 2.
[0095] O painel de especificidade contém 16 amostras originárias de indivíduos saudáveis (gestantes, crianças e doadores de sangue da Alemanha). Pode ser assumido que os doadores não foram expostos ao Plasmodium.
[0096] Os seguintes antígenos da Proteína de Superfície de Merozoíto 1 (MSP-1) foram utilizados:
- • proteína de fusão de polipeptídeos p19 de MSP-1 P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae e P. knowlesi (MSP-1 multip19) (SEQ ID NO30)
- • His-MSP-1-multi_a (SEQ ID NO31)
- • His-MSP-1-multi_b (SEQ ID NO32)
- • His-MSP-1-multi_c (SEQ ID NO33)
- • His-MSP-1-multi_d (SEQ ID NO34)
[0097] Para uso em microtitulação ELISA, esses antígenos foram diluídos em PBS até concentrações finais de 5,0 µg/ml. As placas de microtitulação foram revestidas com 100 µL de diluição de antígeno por cavidade.
[0098] Todos os reagentes utilizados durante esta experiência estão incluídos em todos os kits de teste EUROIMMUN IgG ELISA para diagnóstico infeccioso. As amostras foram diluídas 1:101 em tampão de amostra de IgG, foram aplicadas em placas de microtitulação e incubadas como descrito para os kits de teste comerciais EUROIMMUN ELISA (por exemplo, EI 2260-9601 G). Em resumo: 60 min a 37 °C; 3 etapas de lavagem usando tampão de lavagem EUROIMMUN; adição de 100 µl de conjugado de IgG anti-humano rotulado com peroxidase (cabra) por cavidade; incubação por 30 min a 37 °C; 3 etapas de lavagem usando tampão de lavagem EUROIMMUN; adição de 100 µl de solução de cromogênio/substrato (TMB/H2O2) por cavidade; incubação por 30 min em temperatura ambiente; adição de 100 µl de solução de parada (ácido sulfúrico 0,5 M); medição da densidade óptica a 450 nm.
[0099] O painel 1 foi utilizado para avaliação da sensibilidade dos respectivos antígenos para detecção de anticorpos de IgG antiPlasmodium específicos. O painel 2 foi incubado para determinar a especificidade do sistema de teste.
[00100] Os dados primários são mostrados na Tabela 3. Cinco amostras que poderiam ser corretamente identificadas como positivas usando os polipeptídeos de acordo com a invenção, porém não os polipeptídeos expressos separadamente no Exemplo 1, estão em negrito. “no Mat”. Indica que as amostras foram examinadas apenas no Exemplo 1, porém não novamente no Exemplo 2, porque os volumes da amostra eram insuficientes. As amostras 1 a 6 são de pacientes expostos a P. vivax. As amostras 7 a 32 são de pacientes expostos a P. falciparum. As amostras 33 a 44 são de pacientes expostos a P. ovale. As amostras 45 a 50 são de pacientes expostos a P. malariae. As amostras 51 a 58 são controles positivos. As amostras restantes são de doadores de sangue saudáveis. 
[00101] Os resultados limítrofes não foram incluídos no cálculo da sensibilidade.
[00102] Curiosamente, as cinco amostras que mostraram ser positivas usando o polipeptídeo de acordo com a invenção pareciam ser positivas, independentemente da ordem dos componentes do antígeno, com exceção da amostra 41, que foi positiva apenas no caso de três das cinco construções. No entanto, os valores obtidos usando as outras duas construções foram limítrofes e bastante próximos do valor de corte.
[00103] Todos os polipeptídeos MSP-1 testados divulgam uma alta especificidade.
[00104] Os resultados mostram que a ordem dos fragmentos de p19 não tem impacto significativo na sensibilidade e especificidade do antígeno MSP-1 multi-p19. Independentemente da ordem, a sensibilidade é aumentada em um nível alto, enquanto a especificidade não é comprometida.
Claims (15)
- Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende dois ou mais, de preferência todos, do grupo compreendendo p19 de P. falciparum ou uma variante do mesmo, p19 de P. vivax ou uma variante do mesmo, p19 de P. ovale ou uma variante do mesmo, p19 de P. malariae ou uma variante do mesmo e p19 de P. knowlesi ou uma variante do mesmo.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende quatro ou cinco do grupo compreendendo p19 de P. falciparum ou uma variante do mesmo, p19 de P. vivax ou uma variante do mesmo, p19 de P. ovale ou uma variante do mesmo, p19 de P. malariae ou uma variante do mesmo e p19 de P. knowlesi ou uma variante do mesmo.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ainda um p33 de uma cepa de Plasmodium.
- Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é imobilizado, de preferência em um veículo diagnosticamente útil.
- Polipeptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é purificado.
- Veículo diagnosticamente útil, caracterizado pelo fato de que compreende, de preferência revestido com o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, de preferência imobilizado diretamente no veículo, em que o veículo é preferencialmente selecionado a partir do grupo compreendendo uma lâmina de vidro, preferencialmente para microscopia, um biochip, um placa de microtitulação, um dispositivo de fluxo lateral, uma tira de teste, uma membrana, de preferência uma mancha de linha, uma coluna de cromatografia e uma conta, de preferência uma conta magnética ou fluorescente.
- Método, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de detecção em um líquido de dois ou mais anticorpos, de preferência todos, do grupo compreendendo
um anticorpo para p19 de P. falciparum,
um anticorpo para p19 de P. vivax,
um anticorpo para p19 de P. ovale,
um anticorpo para p19 de P. malariae e
um anticorpo para p19 de P. knowlesi,
compreendendo a etapa de contato do líquido com o polipeptídeo ou veículo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6. - Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que, além disso, um anticorpo para um polipeptídeo p33 de uma cepa de Plasmodium é detectado.
- Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é detectado usando um método selecionado a partir do grupo compreendendo técnicas de imunodifusão, técnicas imunoeletroforéticas, imunoensaios de dispersão de luz, técnicas de aglutinação, imunoensaios rotulados, tais como os do grupo compreendendo imunoensaio radiorrotulado, imunoensaios enzimáticos, mais preferencialmente ELISA, imunoensaios quimioluminescentes, preferencialmente imunoensaios eletroquimioluminescentes e imunofluorescência, preferencialmente imunofluorescência indireta.
- Método, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de revestimento de um veículo analiticamente útil com o polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o veículo é preferencialmente selecionado a partir do grupo compreendendo uma lâmina de vidro, preferencialmente para microscopia, um biochip, uma placa de microtitulação, um dispositivo de fluxo lateral, uma tira de teste, uma membrana, de preferência uma mancha de linha, uma coluna de cromatografia e uma conta, preferencialmente uma conta magnética ou fluorescente.
- Uso do polipeptídeo ou veículo diagnosticamente útil, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende identificar sangue de um doador de sangue não infectado.
- Método ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 11, caracterizado pelo fato de que um ou mais anticorpos são detectados em uma fração processada de sangue, de preferência de um doador de sangue.
- Kit, caracterizado pelo fato de que compreende o polipeptídeo ou veículo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo ainda um ou mais reagentes do grupo compreendendo um ou mais de um calibrador, um tampão de lavagem e um meio para detectar um anticorpo, preferencialmente um anticorpo secundário rotulado.
- Uso do polipeptídeo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um dispositivo analítico ou para a fabricação de uma composição, kit ou reagente para detectar uma infecção por Plasmodium.
- Método para determinar a capacidade, preferencialmente a capacidade de um veículo, como definido na reivindicação 6, de ligar dois ou mais anticorpos às proteínas Plasmodium p19, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de contato com o veículo diagnosticamente útil como definido na reivindicação 6, com uma ou mais soluções compreendendo concentrações conhecidas de os dois ou mais anticorpos.
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