BR112019027491A2 - proteína de fusão multiepítopo, método de produção de uma proteína, uso de uma proteína, método para detectar o antígeno e kit - Google Patents
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Abstract
A invenção refere-se a uma proteína de fusão multiepítopo, bem como o uso da mesma como calibrador e/ou controle de um imunoensaio de diagnóstico in vitro para a detecção do antígeno core do HCV. A proteína de fusão multiepítopo compreende de dois a seis peptídeos lineares que não se sobrepõem presentes na sequência de aminoácidos da proteína core do vírus da hepatite C (HCV), em que cada um dos referidos peptídeos é separado dos outros referidos peptídeos por um espaçador que consiste em uma sequência de aminoácidos não-HCV e compreende uma sequência de aminoácidos chaperona. Não estão presentes mais sequências de aminoácidos específicas do HCV no referido polipeptídeo. Um aspecto adicional refere-se a um kit de reagentes para a detecção do antígeno core do HCV compreendendo a referida proteína de fusão multiepítopo como calibrador ou controle, ou como ambos.
Description
[001] Os materiais de controle e calibradores confiáveis são partes essenciais nos ensaios sorológicos para o diagnóstico in vitro, principalmente na área das doenças infecciosas. Para apoiar o diagnóstico de infecções virais, os testes com ácido nucleico e a detecção de antígenos virais pertencem aos métodos bem conhecidos no estado da técnica. A hepatite C é uma infecção viral disseminada em todo o mundo, causada pelo vírus da hepatite C (HCV), um RNA vírus que afeta o fígado e tende a se tornar crônico.
O HCV é transmitido por contato sangue-sangue (por exemplo, pelo uso de drogas injetáveis, transfusão de sangue, transmissão de mãe para filho durante a gravidez/nascimento). Além do teste de RNA, a detecção sorológica de antígenos estruturais do HCV, tal como o antígeno core, são métodos comuns para uma detecção na fase precoce de uma infecção por hepatite C.
[002] Existem diversos kits comerciais para detectar o antígeno core do HCV disponíveis no mercado, como o Abbott Architect HCV Ag, Ortho HCV Core Ag EIA, Fujirebio Lumipulse II HCV core test, Murex HCV Ag/Ab Combination e Bio-Rad Monolisa HCV Ag-Ab HCV Ultra. Cada um desses ensaios precisa de material de calibração para gerar um valor de corte confiável para a diferenciação de amostras negativas e positivas. Para ensaios quantitativos, o material de calibração também pode ser usado para ajustar a leitura do sistema de teste, a fim de mostrar e provar uma correlação entre a medida do instrumento do analito que está sendo testado e a concentração real do analito. Além disso, também é necessária a verificação da calibração ou do material de controle (qualidade). Para ensaios quantitativos, o material de controle tem uma concentração conhecida do analito e é testado da mesma maneira que as amostras dos pacientes. A medição dos controles garante que o sistema de teste esteja medindo com precisão as amostras em todas as faixas de medição reportáveis. Para os ensaios qualitativos, a mera presença do analito na medição dos controles assegura que o sistema de teste está funcionando corretamente e, por esse motivo, pode ser contado para produzir resultados de qualidade.
[003] Para os ensaios diagnósticos in vitro do core do HCV, tanto os soros nativos a partir de pacientes infectados quanto o antígeno core do HCV produzido de maneira recombinante são usados como material de calibração, e muitas vezes também como material de controle. Tendo em vista o tratamento terapêutico eficaz das infecções por HCV, a disponibilidade de soros positivos para pacientes com HCV se torna cada vez mais desafiadora.
Por isso, uma opção é produzir o antígeno core recombinante do HCV e depois misturar soros nativos ou matrizes artificiais e sistemas tampão com o material recombinante. Entretanto, isso deve ser cuidadosamente avaliado para que a recuperação em tais matrizes produzidas artificialmente seja mais próxima a da recuperação no soro nativo e que a matriz artificial em si não cause quaisquer interferências.
[004] Pouco é conhecido sobre a estabilidade do antígeno core do HCV no soro ou plasma humano. Tanaka et al. (Hepatol Res 2003, 26 (4):261-267) descrevem que o antígeno core do HCV é bastante estável contra o estresse térmico quando incubado a 25ºC por 7 dias. Após esse procedimento de estresse, um ensaio ELISA ainda é capaz de detectar o antígeno core do HCV. Entretanto, descobrimos que a reatividade de soros humanos positivos para o antígeno core, bem como a reatividade de amostras enriquecidas com o antígeno recombinante de HCV diminui consideravelmente quando armazenados em temperatura ambiente por vários dias.
[005] Um objeto da invenção é fornecer o material com maior estabilidade em longo prazo e maior vida útil para a calibração e controles de imunoensaios para HCV que ultrapassem as limitações observadas.
[006] A invenção refere-se a uma proteína de fusão multiepítopo, bem como o uso da mesma como calibrador e/ou controle de um imunoensaio de diagnóstico in vitro para a detecção do antígeno core do HCV. A proteína de fusão multiepítopo compreende de dois a seis peptídeos lineares que não se sobrepõem presentes na sequência de aminoácidos da proteína core do vírus da hepatite C (HCV), em que cada um dos referidos peptídeos diferentes está presente 1-5 vezes na referida proteína de fusão multiepítopo, e cada um dos referidos peptídeos diferentes é separado dos outros peptídeos por um espaçador que consiste em uma sequência de aminoácidos não-HCV compreendendo uma sequência de aminoácidos chaperona. Não estão presentes mais sequências de aminoácidos específicas do HCV no referido polipeptídeo.
[007] Em um exemplo de realização, cada um dos referidos peptídeos lineares tem um comprimento de 5 a 50 aminoácidos e em outro exemplo de realização três peptídeos lineares diferentes estão presentes na proteína de fusão multiepítopo. Outro aspecto refere-se a um kit de reagentes para detectar o antígeno core do HCV compreendendo um antígeno de fusão multiepítopo compreendendo a referida proteína de fusão multiepítopo como calibrador ou controle, ou como ambos.
[008] SEQ ID NO: 1, HCV core, genótipo 1a (isolado 1) de acordo com a UniProt Nº P26664,
[009] 191 aminoácidos
[010] SEQ ID NO: 2, envelope E1 do HCV, genótipo 1a (isolado 1) de acordo com a UniProt Nº P26664,
[011] 192 aminoácidos
[012] SEQ ID NO: 3, envelope E2 do HCV, genótipo 1a (isolado 1) de acordo com a UniProt Nº P26664,
[013] 363 aminoácidos
[014] SEQ ID NO: 4, calibrador com epítopos HCVcore-3 (HCVcore- 3Epi-EcS-FP), 432 amino ácidos;
[015] Três epítopos do core do HCV diferentes separados por dois polipeptídeos espaçadores SlyD de E. coli. As partes sublinhadas são três peptídeos core do HCV diferentes.
[016] SEQ ID NO: 5, calibrador com epítopos HCVcore-3 (HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY (Z, extralongo, C/A)), 473 aminoácidos; três epítopos core do HCV diferentes separados por dois polipeptídeos espaçadores SlyD de E. coli. As partes sublinhadas são três peptídeos core do HCV diferentes.
[017] SEQ ID NO: 6, calibrador com epítopos HCVcore-3 (HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4), 513 aminoácidos; três epítopos core do HCV diferentes separados por dois polipeptídeos espaçadores SlyD de E. coli. As partes sublinhadas representam três peptídeos core do HCV diferentes. O epítopo C-terminal está presente por quatro vezes, enquanto os outros dois epítopos estão presentes como epítopos únicos.
[018] Considera-se que os antígenos recombinantes que correspondem ao antígeno de ocorrência natural mimetizem efetivamente o analito natural. As sequências parciais de antígenos de HCV foram amplamente descritas na técnica anterior. O documento WO2016/172121 descreve polipeptídeos de antígeno core do vírus da hepatite C que compreendem sequências parciais do antígeno core de comprimento total. Os antígenos divulgados podem ser usados como imunógenos para a produção de anticorpos camelídeos e para o subsequente rastreamento. Esta publicação é omissa em relação aos problemas de estabilidade, e também não revela informações sobre o uso de um antígeno core como calibrador ou controle. Entretanto, observou-se que, independentemente da matriz utilizada (soro, plasma ou matrizes artificiais como, por exemplo, tampões aquosos) um antígeno core da hepatite C com um tamanho próximo do antígeno core nativo inteiro perde a sua reatividade em cada uma dessas matrizes em considerável extensão dentro de alguns dias. A razão desta instabilidade não é conhecida, mas pode ser devida à degradação proteolítica ou química ou ao mascaramento do antígeno por outras substâncias contidas na referida matriz.
Além disso, o estresse mecânico e térmico também pode influenciar a estabilidade do antígeno core do HCV.
[019] Surpreendentemente, quando apenas seções curtas do antígeno core foram usadas como antígeno de fusão multiepítopo em um imunoensaio de diagnóstico in vitro e aplicadas em vez de um antígeno core quase completo (168 aminoácidos), a recuperação do sinal resultante foi muito alta em um teste de estresse por calor a 35ºC por 14 dias. Embora o sinal da proteína de fusão multiepítopo recombinante diminuiu em menos de 10%, o antígeno core inteiro mostrou uma perda contínua de sinal em cerca de dois terços do sinal original.
[020] Portanto, a invenção diz respeito a uma proteína de fusão multiepítopo compreendendo de dois a seis peptídeos lineares que não se sobrepõem presentes na sequência de aminoácidos da proteína core do vírus da hepatite C (HCV), em que cada um dos referidos peptídeos diferentes está presente 1-5 vezes na referida proteína de fusão multiepítopo, e cada um dos referidos peptídeos diferentes é separado dos outros peptídeos por um espaçador que consiste em uma sequência de aminoácidos não HCV compreendendo uma sequência de aminoácidos chaperona e em que nenhuma sequência de aminoácidos HCV-específica adicional está presente no referido polipeptídeo.
[021] O termo “proteína de fusão multiepítopo” é sinônimo de “antígeno de fusão multiepítopo”. Uma proteína de fusão multiepítopo compreende mais de um epítopo que é um sítio de ligação que é especificamente reconhecido e ligado por anticorpos, tais como anticorpos aplicados como reagentes em um imunoensaio para a detecção dos referidos epítopos.
[022] A proteína de fusão multiepítopo de acordo com a presente invenção contém epítopos apenas da proteína core do HCV. Isto significa que os dois a seis peptídeos lineares não sobrepostos diferentes representam epítopos distintos da proteína core, mas não de uma mistura de, por exemplo, peptídeos do core e envelope. Os antígenos de fusão multiepítopos de hepatite C descritos no estado da técnica, tal como no pedido de patente internacional WO97/44469 ou por Chien et al. (J Clin Microbiol 1999, 37 (5): 1393-1397), nos quais várias proteínas ou epítopos virais de várias proteínas virais fazem parte de uma proteína de fusão multiepítopo, tal como core, env, NS3 e NS4 de de HCV, não são abrangidos pela presente invenção. Em contraste com a técnica anterior, a proteína de fusão multiepítopo da presente invenção contêm epítopos presentes no antígeno core HCV de ocorrência natural. A sequência de aminoácidos de uma proteína core do HCV representativa (genótipo 1a, isolado 1) é mostrada na SEQ ID NO: 1. As SEQ ID NOs: 2 e 3 mostram as sequências de aminoácidos do envelope 1 (E1) e envelope 2 (E2), respectivamente.
[023] A proteína de fusão multiepítopo compreende dois a seis peptídeos lineares diferentes que não se sobrepõem, em um exemplo de realização de três peptídeos lineares diferentes, presentes na sequência de aminoácidos da proteína core do vírus da hepatite C (HCV), tal como descrito acima. Os peptídeos lineares são aminoácidos ligados através de uma ligação peptídica em sequência direta, um após o outro, onde os aminoácidos individuais são adjacentes e covalentemente ligados entre si. A proteína de fusão multiepítopo é uma cadeia contínua, ininterrupta e contígua de aminoácidos covalentemente ligados.
[024] O termo “sem sobreposição” ou “que não se sobrepõem” significa que as regiões de aminoácidos selecionadas são epítopos separados que não possuem sequências de aminoácidos sobrepostas em comum no antígeno core natural. Para ilustrar isso, quando o epítopo core das posições de aminoácidos 60-75 é selecionado como epítopo, um epítopo adicionalmente selecionado pode começar na posição 76 ou terminar na posição 59. Uma combinação de epítopos nas posições 60-75, 97-117 e 152 -171 é um exemplo que atende ao requisito de não sobreposição.
[025] Um epítopo dentro desta proteína de fusão multiepítopo geralmente compreende pelo menos 5 aminoácidos em uma cadeia polipeptídica contígua, em um exemplo de realização, entre 5 a 50 aminoácidos, em um exemplo de realização de 5 a 31 aminoácidos, em um exemplo de realização de 5 a 25 aminoácidos, em um exemplo de realização de 7 a 21 aminoácidos, e em um exemplo de realização de 15 a 21 aminoácidos.
[026] O termo peptídeo e polipeptídeo são entendidos como sinônimos no presente relatório descritivo, e referem-se a moléculas de até 50 aminoácidos. O termo proteína refere-se aos polipeptídeos com mais de 50 aminoácidos. Um antígeno pode ser um polipeptídeo ou uma proteína. O termo antígeno refere-se ao fato de que os anticorpos podem se ligar especificamente a ele. Um antígeno compreende pelo menos um epítopo (sítio de ligação para anticorpos), mas geralmente possui mais de um epítopo.
[027] Normalmente, os peptídeos contidos na proteína de fusão multiepítopo são selecionados de tal maneira que as sequências lineares de peptídeo correspondam aos epítopos reconhecidos pelos anticorpos que são aplicados como reagentes específicos em um imunoensaio que detecta uma proteína estrutural do HCV, em um exemplo de realização, o antígeno core do HCV. Os peptídeos individuais mimetizam certos epítopos do analito nativo. É importante que a proteína de fusão multiepítopo artificialmente composta reaja de uma forma muito semelhante com os especificadores do ensaio, ou seja, os agentes de ligação analito-específicos, como é o caso com a proteína core em amostras naturais. Caso contrário, um ensaio de diagnóstico in vitro não pode ser adequadamente calibrado. Em um exemplo de realização, três peptídeos lineares não sobrepostos diferentes fazem parte da proteína de fusão multiepítopo. Em outro exemplo de realização, os referidos três peptídeos lineares diferentes compreendem uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácidos 55 a 80 da SEQ ID NO: 1, posições de aminoácidos 90 a 120 da SEQ ID NO: 1 e posições de aminoácidos 145 a 175 da SEQ ID NO: 1. Em um exemplo de realização adicional, os referidos três peptídeos lineares diferentes consistem nas posições de aminoácidos 60 a 75 da SEQ ID NO: 1, nas posições de aminoácidos 97 a 117 da SEQ ID NO: 1 e nas posições de aminoácidos 152 a 171 da SEQ ID NO: 1. Em outro exemplo de realização adicional, os referidos três peptídeos lineares diferentes consistem nas posições de aminoácidos 60 a 75 da SEQ ID NO: 1, nas posições de aminoácidos 97 a 117 da SEQ ID NO: 1 e nas posições de aminoácidos 111 a 171 da SEQ ID NO: 1.
[028] Também estão incluídas variantes da SEQ ID NO: 1, como os antígenos core de diferentes genótipos de HCV. Essas variantes podem ser facilmente criadas por um técnico hábil no assunto por substituições conservadoras ou homólogas das sequências de aminoácidos divulgadas (como, por exemplo, substituições de uma cisteína por alanina ou serina). O termo “variantes”, no presente contexto, também se refere a um polipeptídeo substancialmente semelhante ao referido polipeptídeo. De modo específico, uma forma variante pode ser uma isoforma que exibe trocas, deleções ou inserções de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos da isoforma proteica mais prevalente. Em um exemplo de realização, uma proteína substancialmente semelhante possui uma identidade de sequência de aminoácidos com a isoforma mais prevalente da proteína de pelo menos 90%, em outro exemplo de realização, de pelo menos 95%. Uma variante da SEQ ID NO: 1 é, por exemplo, a sequência principal de aminoácidos dos genótipos 1 a 7 de HCV. Os genótipos de HCV, sua prevalência e distribuição global foram bem descritos no estado da técnica e estão resumidos, por exemplo, em Messina et al., Hepatology 2015 61 (1), p. 77-87.
[029] Além dos dois a seis peptídeos lineares não sobrepostos diferentes, não estão presentes outras sequências de aminoácidos HCV- específicas na referida proteína de fusão multiepítopo. Os termos “não estão presentes outras sequências de aminoácidos HCV-específicas” e “sequências de aminoácidos não-HCV” significa que outros trechos de aminoácidos podem ser parte da proteína de fusão multiepítopo. Entretanto, se sequências de aminoácidos específicas não-HCV estão presentes, um anticorpo criado contra qualquer uma destas sequências não-HCV específicas não se ligaria a um antígeno estrutural do HCV, tal como ao antígeno core, com alta afinidade. A afinidade desse anticorpo para um antígeno estrutural do HCV seria menor que 103 L/mol. Apenas os dois a seis peptídeos diferentes são capazes de reagir imunologicamente com anticorpos em uma amostra de paciente ou com os anticorpos que são usados como reagentes de imunoensaio específico para detectar uma proteína estrutural do HCV. Normalmente, um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína estrutural do HCV em um imunoensaio tem uma afinidade para referida proteína de pelo menos 10 7 L/mol, em um exemplo de realização, de pelo menos 109 L/mol.
[030] Em um exemplo de realização, os dois a seis peptídeos lineares são selecionados de tal maneira que as sequências escolhidas não se sobrepõem.
[031] Ainda em outro exemplo de realização, a invenção refere-
se a uma proteína de fusão multiepítopo possuindo a fórmula: X - espaçador - Y - espaçador - Z, em que X, Y e Z designam diferentes sequências de aminoácidos lineares não sobrepostas presentes na proteína core do HCV; em que espaçador designa uma sequência de aminoácidos não-HCV e compreende uma sequência de aminoácidos chaperona. Em um exemplo de realização, cada um de X, Y e Z está presente de uma a cinco vezes. Em outro exemplo de realização, Z está presente de uma a cinco vezes. Todas as explicações e definições fornecidas acima se aplicam também a este exemplo de realização. Em um exemplo de realização, X compreende uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácidos de 55 a 80 da SEQ ID NO: 1, Y compreende uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácidos de 90 a 120 da SEQ ID NO: 1, e Z compreende uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácido de 145 a 175 da SEQ ID NO: 1. Em um exemplo de realização, X consiste nas posições de aminoácidos de 60 a 75 da SEQ ID NO: 1, Y consiste nas posições de aminoácidos de 97 a 117 da SEQ ID NO: 1, e Z consiste nas posições de aminoácidos de 152 a 171 da SEQ ID NO: 1, em um exemplo de realização, Z consiste nas posições de aminoácidos de 111 a 171 da SEQ ID NO: 1.
[032] Os dois a seis peptídeos lineares não sobrepostos diferentes são separados por um espaçador que consiste em uma sequência de aminoácidos que não está presente na poliproteína da hepatite C, e em particular, não está presente em nenhum antígeno estrutural core ou env do HCV. Qualquer polipeptídeo não-HCV com um comprimento de pelo menos 25 aminoácidos não-HCV, em um exemplo de realização, pelo menos 100, em um exemplo de realização pelo menos 150, em um exemplo de realização pelo menos 200, em um exemplo de realização de 25 a 200 aminoácidos não-HCV pode servir como espaçador. Em um exemplo de realização, o espaçador compreende uma sequência de aminoácidos de uma chaperona ou outra proteína que não reage de forma cruzada de ponto de vista imunológico com os anticorpos que supostamente se ligam aos peptídeos HCV-específicos. Em um exemplo de realização, a referida chaperona é selecionada a partir do grupo que consiste em SlyD, SlpA, FkpA e Skp.
[033] Cada um dos peptídeos diferentes pode estar presente de uma a cinco vezes na proteína de fusão multiepítopo. Isso significa que existem repetições idênticas de um epítopo individual. Esses epítopos repetitivos não precisam ser separados por uma sequência de aminoácidos chaperona, mas podem ser separados por um espaçador que contém sequências não chaperonas, tal como peptídeos curtos não-HCV. Como exemplo, um espaçador compreendendo 2 a 15 aminoácidos, como resíduos de glicina repetidos, pode separar os epítopos core do HCV idênticos. Outro exemplo de um espaçador que separa os epítopos idênticos é a sequência de aminoácidos GGGSGGG.
[034] Em outro aspecto, a proteína de fusão multiepítopo pode ser flanqueada por mais aminoácidos não-HCV que podem, por exemplo, estar presentes devido a procedimentos de clonagem ou podem ser necessários para fins de purificação. Esses aminoácidos adicionais podem ser conectados ao N-terminal ou C-terminal, ou nas duas extremidades.
[035] Em outro exemplo de realização, a proteína de fusão multiepítopo consiste na SEQ ID NO: 4. Em outro exemplo de realização, ela consiste na SEQ ID NO: 5 ou 6.
[036] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método de produção de uma proteína de fusão multiepítopo solúvel, conforme descrito nas seções acima, compreendendo as etapas de; a) cultivar células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA recombinante que codifica uma proteína de fusão multiepítopo como detalhado acima operacionalmente ligada, b) expressão do referido polipeptídeo e c) purificação do referido polipeptídeo. A tecnologia de DNA recombinante é conhecida por um especialista na técnica e foi extensivamente descrita no estado da técnica, por exemplo, por Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual). Outro aspecto da invenção é um vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA recombinante operacionalmente ligada de acordo com a presente invenção, ou seja, uma molécula de DNA recombinante que codifica uma proteína de fusão multiepítopo compreendendo de dois a seis peptídeos lineares diferentes presentes na sequência de aminoácidos de uma proteína estrutural do vírus da hepatite C (HCV), em que cada um dos referidos peptídeos é separado dos outros referidos peptídeos por um espaçador que consiste em uma sequência de aminoácidos que não é de HCV, e em que nenhuma sequência de aminoácidos HCV-específica adicional está presente no referido polipeptídeo.
[037] Um aspecto adicional é um método para a produção de uma proteína de fusão multiepítopo solúvel, estável e imunorreativa compreendendo dois a seis peptídeos lineares não sobrepostos diferentes do antígeno core do HCV. Este método compreende as etapas de: a) cultivo de células hospedeiras transformadas com o vetor de expressão descrito acima contendo um gene que codifica a referida proteína de fusão multiepítopo; b) expressão do gene que codifica a referida proteína de fusão multiepítopo; c) purificação da referida proteína de fusão multiepítopo.
[038] Em outro exemplo de realização a invenção diz respeito ao uso de uma proteína de fusão multiepítopo compreendendo sequências de aminoácido de uma proteína core HCV conforme divulgado no presente relatório descritivo como material calibrador e/ou material de controle de um ensaio de diagnóstico in vitro de para a detecção do antígeno core do HCV.
[039] A calibração de um instrumento de diagnóstico in vitro (IVD) executando um imunoensaio para detectar o antígeno HCV funciona da seguinte maneira: Um procedimento de calibração de um instrumento IVD para um ensaio específico geralmente é feito de acordo com o manual do operador apropriado para obter instruções específicas do analisador. Em geral, cada pacote de reagentes é calibrado usando o material calibrador fornecido. Como um exemplo: Para o antígeno core HCV, diferentes anticorpos específicos para o core são usados em um formato marcado e/ou em um formato que permite que os anticorpos sejam ligados em uma fase sólida. O material calibrador, em um exemplo de realização de uma proteína de fusão multiepítopo como a descrita na presente invenção, é incubado com os anticorpos específicos para o core e processado da mesma maneira que uma amostra. Após a detecção de um sinal, este resultado é comparado com os valores predefinidos e a faixa de medição apropriada é definida. Dependendo das instruções do fabricante, a calibração é repetida em intervalos predefinidos ou conforme necessário, por exemplo, se os resultados do controle de qualidade estiverem fora dos limites especificados.
[040] Em um exemplo de realização, a proteína de fusão multiepítopo definida na presente invenção é usada como material para controle de qualidade. Isto significa que a proteína de fusão multiepítopo é utilizada em uma concentração pré-definida, em vez de ser utilizada como uma amostra, a fim de verificar se o sistema IVD está funcionando corretamente e - em particular para ensaios quantitativos - se está fazendo medições com precisão.
[041] Outro aspecto da invenção é um método para detectar o antígeno core do HCV. O referido método aplica uma proteína de fusão multiepítopo, conforme descrito em detalhes acima, como material calibrador ou material de controle ou ambos. Em um exemplo de realização, o referido método compreende as etapas de a) formar uma mistura de imunorreação, misturando uma amostra de fluido corporal com pelo menos um agente de ligação específico para o antígeno core do HCV; b) manter a referida mistura de imunorreação por um período de tempo suficiente para permitir que o antígeno core do HCV presente na amostra de fluido corporal reaja com o referido pelo menos um agente de ligação específico para o antígeno core do HCV para formar um produto da imunorreação; e c) detectar a presença e/ou a concentração de qualquer um dos referidos produtos da imunorreação, em que uma proteína de fusão multiepítopo como divulgada no presente relatório descritivo é usada como um material calibrador e/ou de controle.
[042] Os imunoensaios para detecção de proteínas são bem conhecidos no estado da técnica, assim como os métodos para realizar esses ensaios e aplicações e procedimentos práticos. Em um exemplo de realização, a proteína de fusão multiepítopo é usada no formato sanduíche, em que a referida proteína de fusão multiepítopo é ligada por pelo menos dois anticorpos, um anticorpo marcado e um anticorpo que permite a ligação a uma fase sólida.
Entretanto, como a proteína de fusão multiepítopo serve como material calibrador e/ou de controle, ela imita o analito para que qualquer princípio de detecção (por exemplo, imunoensaio enzimático, ensaio eletroquimioluminescente, ensaio radioisótopo etc.) ou o formato do ensaio (por exemplo, ensaio tipo tira de teste, ensaio sanduíche, conceito de teste indireto ou ensaio homogêneo etc.) possa ser escolhido.
[043] Em um exemplo de realização da invenção, o imunoensaio é um imunoensaio baseado em partículas que aplica micropartículas como fase sólida. Uma “partícula”, tal como utilizado na presente invenção, significa um objeto pequeno e localizado ao qual pode ser atribuída uma propriedade física, como volume, massa ou tamanho médio. As micropartículas podem, portanto,
ter uma forma simétrica, globular, essencialmente globular ou esférica, ou podem ter uma forma irregular ou assimétrica. O tamanho de uma partícula prevista pela presente invenção pode variar. Em um exemplo de realização, as micropartículas usadas são de forma globular, por exemplo, micropartículas com um diâmetro na faixa de nanômetros e micrômetros. Em um exemplo de realização, as micropartículas usadas em um método de acordo com a presente divulgação têm um diâmetro de 50 nanômetros a 20 micrômetros. Em outro exemplo de realização, as micropartículas têm um diâmetro entre 100 nm e 10 µm. Num exemplo de realização, as micropartículas usadas em um método de acordo com a presente divulgação têm um diâmetro de 200 nm a 5 µm ou de 750 nm a 5 µm.
[044] As micropartículas, conforme definidas acima, podem compreender ou consistir em qualquer material adequado conhecido pelo técnico hábil no assunto, por exemplo, elas podem compreender, consistir ou consistir essencialmente de material inorgânico ou orgânico. Tipicamente, elas podem compreender, consistir ou consistir essencialmente em metal ou uma liga de metais, ou um material orgânico, ou compreender, consistir ou consistir essencialmente em elementos de carboidratos. Exemplos de material previsto para micropartículas incluem agarose, poliestireno, látex, álcool polivinílico, sílica e metais ferromagnéticos, ligas ou materiais de composição. Em um exemplo de realização, as micropartículas são metais, ligas ou composições magnéticas ou ferromagnéticas. Em outros exemplos de realização, o material pode ter propriedades específicas e, por exemplo, ser hidrofóbico ou hidrofílico.
Tais micropartículas são tipicamente dispersas em soluções aquosas e retêm uma pequena carga superficial negativa, mantendo as micropartículas separadas e evitando agrupamentos não específicos.
[045] Em um exemplo de realização da presente invenção, as micropartículas são micropartículas paramagnéticas e a separação dessas partículas no método de medição de acordo com a presente divulgação é facilitada por forças magnéticas. São aplicadas forças magnéticas para puxar as partículas paramagnéticas ou magnéticas para fora da solução/suspensão e para retê-las conforme desejado, enquanto o líquido da solução/suspensão pode ser removido e as partículas podem, por exemplo, ser lavadas e ressuspensas.
[046] Todos os líquidos biológicos conhecidos pelo técnicos hábeis no assunto podem ser usados como amostras isoladas. As amostras normalmente utilizadas são líquidos corporais como sangue total, soro, plasma sanguíneo, líquido cefalorraquidiano (líquor) ou saliva, em um exemplo de realização, soro ou plasma sanguíneo.
[047] Outra parte da invenção diz respeito um kit de reagentes para a detecção do antígeno core do HCV, compreendendo em recipientes separados ou em compartimentos separados de um único recipiente, pelo menos, um agente de ligação específico para o antígeno core do HCV e pelo menos uma proteína de fusão multiepítopo conforme definida no presente relatório descritivo como material calibrador.
[048] O termo unidade contentora única refere-se ao fato de que, para muitos analisadores automáticos, tal como o analisador Elecsys® da Roche Diagnostics, os reagentes necessários para mensurar determinado analito são fornecidos na forma de um “pacote de reagente”, ou seja, como uma unidade contentora que se encaixa no analisador e contém em diferentes compartimentos todos os principais reagentes necessários para a medição do analito de interesse.
[049] Em um exemplo de realização, o kit compreende pelo menos dois agentes de ligação específicos para o antígeno core do HCV, em que um dos referidos pelo menos dois agentes de ligação específicos para o antígeno core do HCV é marcado de forma detectável. Além disso, as micropartículas, conforme definidas acima, podem fazer parte do kit de reagentes. Em um exemplo de realização, o kit de reagentes contém micropartículas que são revestidas com um primeiro parceiro de um par de ligação e o segundo dos referidos pelo menos dois agentes de ligação específicos para o antígeno core do HCV é ligado a um segundo parceiro do referido par de ligação.
[050] Em outro aspecto, o kit compreende um recipiente separado adicional compreendendo uma proteína de fusão multiepítopo conforme descrito na presente invenção como material de controle.
[051] Além disso, os kits de reagentes definidos acima contêm controles e soluções padrão, bem como reagentes em uma ou mais soluções com os aditivos, tampões, sais, detergentes e similares comuns usados pelo especialista na técnica, juntamente com as instruções de uso.
[052] Os seguintes exemplos de realização também fazem parte da invenção:
[053] 1. Uma proteína de fusão multiepítopo compreendendo de dois a seis peptídeos lineares que não se sobrepõem presentes na sequência de aminoácidos da proteína core do vírus da hepatite C (HCV), em que cada um dos referidos peptídeos diferentes está presente de uma a cinco vezes, e cada um dos referidos peptídeos diferentes é separado dos outros peptídeos referidos por um espaçador que consiste em uma sequência de aminoácidos não-HCV compreendendo uma sequência de aminoácidos chaperona, e em que nenhuma sequência de aminoácidos HCV-específica adicional está presente no referido polipeptídeo.
[054] 2. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com o exemplo de realização 1, caracterizada pela referida proteína core do HCV corresponder a uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1.
[055] 3. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 2, caracterizada por cada um dos referidos dois a seis peptídeos lineares ter um comprimento de 5 a 50 aminoácidos, em um exemplo de realização de 5 a 31 aminoácidos, em um exemplo de realização de 5 a 25 aminoácidos, em um exemplo de realização de 7 a 21 aminoácidos, e em um exemplo de realização de 15 a 21 aminoácidos.
[056] 4. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 3, caracterizada por três peptídeos lineares diferentes presentes na sequência de aminoácidos de uma proteína estrutural do vírus da hepatite C (HCV) fazerem parte da referida proteína de fusão multiepítopo.
[057] 5. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 4, caracterizada pelos referidos três peptídeos lineares diferentes compreenderem uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácidos 55 a 80 da SEQ ID NO: 1, posições de aminoácidos 90 a 120 da SEQ ID NO: 1, e posições de aminoácidos 145 a 175 da SEQ ID NO: 1.
[058] 6. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 5, caracterizada pelos referidos três peptídeos lineares diferentes consistirem nas posições de aminoácidos 60 a 75 da SEQ ID NO: 1, nas posições de aminoácidos 97 a 117 da SEQ ID NO: 1 e nas posições de aminoácidos 152 a 171 da SEQ ID NO: 1.
[059] 7. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 6, caracterizada por possuir a fórmula: X - espaçador - Y - espaçador - Z em que; X, Y e Z designam sequências de aminoácidos lineares que não se sobrepõem diferentes na proteína core do HCV; em que espaçador designa uma sequência de aminoácidos não-HCV compreendendo uma sequência de aminoácidos chaperona.
[060] 8. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo o exemplo de realização 7, caracterizada por X compreender uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácidos de 55 a 80 da SEQ ID NO: 1; Y compreender uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácidos de 90 a 120 da SEQ ID NO: 1; e Z compreender uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácido de 145 a 175 da SEQ ID NO: 1.
[061] 9. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 7 a 8, caracterizada por X consistir nas posições de aminoácidos 60 a 75 da SEQ ID NO: 1; Y consistir nas posições de aminoácidos 97 a 117 da SEQ ID NO: 1; e Z consistir nas posições de aminoácidos 152 a 171 da SEQ ID NO: 1.
[062] 10. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 9, caracterizada pelo referido espaçador compreender uma sequência de pelo menos 25 aminoácidos não- HCV, em um exemplo de realização, pelo menos 100, em um exemplo de realização, pelo menos 150, em um exemplo de realização, pelo menos 200, e em um exemplo de realização, de 25 a 200 aminoácidos não-HCV.
[063] 11. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 10, caracterizada pela referida chaperona ser selecionada a partir do grupo que consiste em SlyD, SlpA, FkpA e Skp.
[064] 12. Uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 11, caracterizada por consistir de uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 4, 5 e 6.
[065] 13. Um método de produção de uma proteína de fusão multiepítopo solúvel, caracterizado pelo referido método compreender as etapas de; a) cultivo de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA recombinante operacionalmente ligada que codifica uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, b) expressão do referido polipeptídeo; e c) purificação do referido polipeptídeo.
[066] 14. Uso de uma proteína de fusão multiepítopo compreendendo a sequências de aminoácidos de uma proteína core do HCV de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 até 12 como um calibrador e/ou o material de controle de um teste de diagnóstico in vitro para a detecção de um antígeno do HCV, em um exemplo de realização do antígeno core do HCV.
[067] 15. Um método para detectar o antígeno core do HCV em um imunoensaio, caracterizado por uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12 ser usada como material calibrador e/ou material de controle.
[068] 16. Um método para detectar o antígeno core do HCV em uma amostra isolada, caracterizado pelo referido método compreender; a) a formação de uma mistura de imunorreação pela mistura de uma amostra de fluido corporal com pelo menos um agente de ligação específico para o antígeno core do HCV b) manter a referida mistura de imunorreação por um período de tempo suficiente para permitir que o antígeno core do HCV presente na amostra de fluido corporal reaja com o referido pelo menos um agente de ligação específico para o antígeno core do HCV para formar um produto da imunorreação; e c) detecção da presença e/ou a concentração de qualquer um dos referidos produtos da imunorreação, em que uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12 é utilizada como material calibrador e/ou material de controle.
[069] 17. Um kit de reagentes para a detecção do antígeno core do HCV, caracterizado por compreender em recipientes separados ou em compartimentos separados de um único recipiente pelo menos um agente de ligação específico para o antígeno core do HCV e pelo menos uma proteína de fusão multiepítopo conforme definida em qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12, como material calibrador.
[070] 18. Um kit de reagentes, de acordo com o exemplo de realização 17, caracterizado por compreender pelo menos dois agentes de ligação específicos para o antígeno core do HCV, em que um dos referidos pelo menos dois agentes de ligação específicos para o antígeno core do HCV está marcado de forma detectável.
[071] 19. Um kit de reagentes, de acordo com qualquer um dos exemplos de realização 17 e 18, caracterizado por compreender adicionalmente micropartículas.
[072] 20. Um kit de reagentes, de acordo com o exemplo de realização 19, caracterizado pelas micropartículas estarem revestidas com um primeiro parceiro de um par de ligação e o segundo dos referidos pelo menos dois agentes de ligação específicos para o antígeno core do HCV estão ligado a um segundo parceiro do referido par de ligação.
[073] 21. Um kit de reagentes para a detecção do antígeno core do HCV, de acordo com o exemplo de realização 17, caracterizado por compreender um recipiente separado adicional compreendendo uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer um dos exemplos de realização de 1 a 12 como material de controle.
[074] A invenção é adicionalmente ilustrada pelos Exemplos.
EXEMPLOS EXEMPLO 1
[075] O antígeno core do HCV recombinante necessário para a imunização de animais apropriados foi obtido utilizando técnicas padrão conhecidas no estado da técnica, inserindo um fragmento de DNA que codifica a sequência de aminoácidos do antígeno desejada em um plasmídeo de expressão de E. coli seguido pela superexpressão e purificação da proteína.
Estes métodos biológicos moleculares padrão estão descritos, por exemplo, em Sambrook, J. et al, “Molecular cloning: A laboratory manual”; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989.
[076] Anticorpos monoclonais de murino ou coelho contra o core do HCV foram preparados pela tecnologia padrão de hibridoma ou por técnicas de ácido nucleico recombinante conhecidas pelos peritos na técnica e de maneira análoga à descrita, por exemplo, no documento WO2016/091755, respectivamente.
[077] Os anticorpos monoclonais contra a proteína core do HCV usados como compostos de captura nos exemplos abaixo se ligam aos epítopos formados pelos aa 157-169 e aa 65-71 da proteína core do HCV (SEQ ID NO: 1). Epítopos muito semelhantes e a determinação dos mesmos já foram divulgados no documento EP1308507. Como composto de detecção, foi escolhido um anticorpo monoclonal capaz de se ligar ao epítopo core aa 102- 112, um epítopo relacionado aos epítopos também está descrito nos documentos EP0967484 e EP1308507. Para a imunização de camundongos e coelhos foram utilizadas as sequências antigênicas do core do HCV de genótipo 1a de acordo com nº de acesso Genbank: P26664.3 GI: 130455 (SEQ ID NO: 1), que descreve a poliproteína completa codificada pelo genótipo 1 do HCV.
[078] Em particular, os peptídeos dos aminoácidos 110-171 como proteína de fusão recombinante com SlyD de Escherichia coli, seguindo os procedimentos divulgados nos documentos WO 03/000878 A2, US 2009/0291892 A1, WO 2013/107633 A1 ou os peptídeos dos aminoácidos 2- 169 como proteína recombinante seguindo os procedimentos descritos por Boulant, S. et al., 2005, J. Virol. 79: 11353-11365 foram utilizados para imunização. E uma abordagem adicional, os peptídeos dos aminoácidos 82- 117 acoplados a KLH (hemocianina do molusco lapa (keyhole limpet hemocyanin)) foram utilizados para imunização de acordo com métodos conhecidos.
[079] O antígeno core do HCV recombinante dos aa 2-169 (core do HCV (2-169)) foi preparado seguindo o procedimento descrito por Boulant, S. et al., 2005, J. Virol. 79: 11353-11365.
[080] Os genes sintéticos que codificam a proteína de fusão do antígeno core do HCV recombinante contendo os epítopos de três anticorpos anti-core HCV monoclonais descritos acima e duas unidades SlyD de E. coli (rec. HCVcore-3Epi-ECS-FP, SEQ ID NO 4) foram adquiridos da Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemanha). Com base no plasmídeo de expressão pET24a da Novagen (Madison, WI, EUA), foram realizadas as seguintes etapas de clonagem. O vetor foi digerido com NdeI e XhoI e um cassete compreendendo a proteína de fusão descrita foi inserido. A inserção do plasmídeo resultante foi sequenciada e descobriu-se que codificava a proteína de fusão desejada. As sequências de aminoácidos da proteína resultante (SEQ ID NO. 4) são mostradas no protocolo de sequência da presente invenção. Ela continha um marcador tag hexa-histidina C-terminal para facilitar a purificação assistida por Ni-NTA. O rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP foi purificado de acordo com o seguinte protocolo. As células de E. coli BL21 (DE3) que continham o plasmídeo de expressão foram cultivadas em meio LB mais canamicina (30 µg/mL) em uma OD600 de 1, e a superexpressão citosólica foi induzida pela adição de isopropil-ß-D-tiogalactosídeo (IPTG) a uma concentração final de 1 mM e uma temperatura de crescimento de 37ºC. Quatro horas após a indução, as células foram coletadas por centrifugação (20 min a 5000 g), congeladas e armazenadas a -20ºC. Para a lise celular, o sedimento congelado foi resuspenso em 20 mM de tampão Tris pH 8,0, 10 mM de MgCl 2, 10 U/ml de Benzonase®, um comprimido de Complete® e sem EDTA por 50 mL de tampão (coquetel inibidor de protease) e a suspensão resultante foi lisada por homogeneização a alta pressão. O lisado bruto foi suplementado com imidazol a 20 mM. Após a centrifugação, o sobrenadante foi aplicado em uma coluna de Ni-NTA (níquel-nitrilotriacetato) pré-equilibrada no tampão A (fosfato de sódio a 100 mM, pH 8,0, cloreto de sódio a 300 mM, cloreto de sódio a 300 mM, imidazol a 20 mM, 1 comprimido Complete® sem EDTA por 50 mL de tampão).
Antes da eluição, a concentração de imidazol foi aumentada para 40 mM, a fim de remover proteínas contaminantes. As proteínas foram então eluídas aplicando uma concentração de imidazol de 250 mM. Após diálise, a proteína foi adicionalmente purificada por cromatografia de troca iônica (Q-Sepharose). Finalmente, a proteína foi submetida a cromatografia de exclusão por tamanho e as frações contendo a proteína foram agrupadas (em pools).
[081] A concentração de proteína de polipeptídeos purificados foi determinada por meio da medição da densidade óptica (OD) a 280 nm, utilizando o coeficiente de extinção molar calculado com base na sequência de aminoácidos do polipeptídeo ou usando o método colorimétrico BCA.
EXEMPLO 2
[082] Os reagentes de biotinilação biotina-PEGn-NHS (CAS-No.
365441-71-0; n = número de unidades de óxido de etileno) foram obtidos da IRIS Biotech GmbH ou sintetizados internamente.
[083] Na síntese de novo, o controle do número discreto de unidades de óxido de etileno foi assegurado pelo alongamento gradual de PEGs mais curtos, como o tetraetileno glicol, seguindo o método descrito por Chen e Baker, J. Org. Chem. 1999, 64, 6840-6873.
[084] Em uma primeira etapa, foi obtido o bis-tritil-PEGn 1 (como óbvio, n representa o número de unidades de etileno glicol).
[085] A desproteção de 1 foi realizada agitando HCl 1M em dioxano durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a evaporação, o resíduo foi submetido ao refluxo em metanol até se obter uma solução límpida e o balão foi mantido a 4ºC durante a noite. Após filtração a solução foi extraída com hexano, a camada metanólica foi evaporada e seca para formar o correspondente PEGn-diol 2 como um óleo ou cera (consistência, dependendo da duração/número de unidades (n) de PEG).
[086] Em seguida, a introdução da função ácida foi realizada pela adição catalisada por sódio de PEGn-di-iol em acrilato de terc-butila, de acordo com Seitz e Kunz, J. Org. Chem. 1997, 62, 813-826. Desta forma, o composto 3 é obtido.
[087] Em uma solução de HO-PEGn-COOtBu 3 (1 equivalente) e trietilamina (2,5 equivalentes) em cloreto de metileno, o cloreto de metilsulfonila (2 equivalentes) foi adicionado gota a gota a 0ºC. Após agitação durante 1 hora, foi realizado o tratamento aquoso e a evaporação.
[088] O mesilato 4 (1 equivalente) foi feito reagir diretamente com NaN3 (2 equivalentes) sob agitação em dimetilformamida à temperatura ambiente durante dois dias. Após a remoção dos sólidos e dimetilformamida, foi realizado o tratamento aquoso com éter dietílico e, em seguida, Na 2CO3.
[089] O produto bruto 5 foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel em acetato de etila/metanol 15/1. A redução da azida 5 (1 equivalente) foi realizada agitando por 24 horas com trifenilfosfina (1,1 equivalentes) em tetra-hidrofurano/água 4/1 em temperatura ambiente. Após a evaporação, o resíduo foi suspenso em água e lavado com acetato de etila por várias vezes. A camada aquosa foi evaporada e seca para formar a amina 6 como um óleo incolor.
[090] A clivagem do éster terc-butílico foi realizada com ácido trifluoroacético a 5% em água. O Amino-PEGn-ácido 7 foi obtido por evaporação com água por várias vezes.
[091] A biotina foi introduzida por acoplamento com o éster N- hidroxissuccinimida 8 correspondente (1,05 equivalentes) com trietilamina (4 equivalentes) em dimetilformamida à temperatura ambiente durante a noite.
Após a evaporação, o produto bruto 9 foi purificado por RP-HPLC em acetonitrila/água.
[092] Finalmente, o éster N-hidroxissuccinimida 10 foi formado pela reação com N-hidroxissuccinimida (1,1 equivalentes) e dimetilaminopropil carbodi-imida de etila (1,1 equivalentes) em cloreto de metileno. Após a conclusão da reação, a mistura de reação foi diluída com cloreto de metileno e lavada com água. A evaporação e a secagem levaram a Biotina-PEGn-NHS 10 pura como óleo, cera ou sólido, respectivamente, dependendo do número de unidades de óxido de etileno.
ESQUEMA 1 SÍNTESE DE BIOTINA-PEG(N)-NHS EXEMPLO 3
[093] Acoplamento de porções de biotina e rutênio, respectivamente, aos anticorpos:
[094] Os anticorpos foram obtidos e purificados de acordo com os procedimentos do estado da técnica que são completamente familiares para um perito no assunto.
[095] Antes da marcação, o anticorpo de detecção foi clivado por pepsina para obter um fragmento F(ab')2 e eliminar o fragmento Fc propenso a interferências (o método é descrito por A. Johnstone e R. Thorpe em Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific 1987). O fragmento F(ab')2 purificado foi adicionalmente polimerizado com o reticulador suberato de dissuccinimidila (DSS) homobifuncional e aplicado a uma cromatografia de filtração em gel S400 para reunir a faixa de tamanho ideal do polímero F(ab') 2 (o princípio é descrito na publicação DE3640412).
[096] Para a ligação do respectivo marcador, em geral os grupos ε-amino-lisina dos anticorpos foram alvo de compostos ativados por N-hidroxi- succinimida. Em uma concentração de proteína de 10 mg/mL, os anticorpos foram reagidos com reagentes de biotinilação ativados por N-hidroxi- succinimida (Biotina-PEG24-NHS) e reagentes de marcação com rutênio ativados por N-hidroxi-succinimida, respectivamente. A relação marcador/proteína do reagente de biotinilação ou de marcação com rutênio foi de 5-6:1 ou 15:1, respectivamente. O tampão de reação foi 50 mM de fosfato de potássio (pH 8,5), 150 mM de KCl. A reação foi realizada em temperatura ambiente durante 15 minutos e interrompida pela adição de L-lisina a uma concentração final de 10 mM. Para evitar a inativação hidrolítica dos marcadores, as respectivas soluções de estoque foram preparadas em DMSO seco (Sigma-Aldrich, Alemanha). Após a reação de acoplamento, o marcador de biotina ou rutênio livre que não reagiu foi removido passando o conjugado de anticorpo bruto através de uma coluna de filtração em gel (Superdex 200 HI Load) ou por diálise.
EXEMPLO 4
[097] As medições de um ensaio Elecsys protótipo para antígeno core do HCV foram realizadas em um formato de ensaio tipo sanduíche em dispositivo analisador Cobas® E601 ou e801 automatizado (Roche Diagnostics GmbH). A detecção de sinal neste analisador é baseada em eletroquimiluminescência. Neste ensaio sanduíche, o um ou mais conjugados anticorpo-biotina de captura (isto é, agentes de ligação específicos para o analito) é/são imobilizados na superfície de uma esfera magnética revestida com estreptavidina. O anticorpo de detecção (outro agente de ligação específico do analito) possui um cátion de rutênio complexado como a porção de sinalização. Na presença de analito, o complexo de rutênio é ligado à fase sólida e emite luz a 620 nm após excitação no eletrodo de platina presente na célula de medição do analisador. A saída de sinal está em unidades de luz arbitrárias. As medições foram realizadas com amostras de soro e plasma humano positivas e negativas para antígeno core do HCV, adquiridas de várias fontes (Tabelas 1 e 2), bem como os antígenos core do HCV recombinantes (2- 169, correspondentes às posições de aminoácidos 2 a 169 da SEQ ID NO: 1) e HCVcore-3Epi-EcS-FP (SEQ ID NO: 4, Tabela 1 e Figura 1 e 2), HCVcore- 3Epi-EcS-FP, XY(Z, extralongo, C/A) (SEQ ID NO: 5, Tabela 2 e Figura 2) e HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4 (SEQ ID NO: 6, Tabela 2 e Figura 2).
[098] O ensaio experimental para o antígeno core do HCV foi conduzido da seguinte maneira. 50 µL de soro humano normal, amostra positiva para antígeno core do HCV ou antígenos core do HCV recombinantes (2-169) ou HCVcore-3Epi-EcS-FP ou HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z, extralongo, C/A) ou HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4 em um tampão HEPES a 36 mM contendo 5,4% de manitol e 5,9% de D (+)-sacarose, cloridrato de N- metilisotiazolona a 0,01%, oxipirion a 0,1% e albumina bovina a 0,4% e 25 μL de um detergente contendo reagente de pré-tratamento (PT: 0,25 M de KOH, 1,125 M de KCl, 1,5% de hexadeciltrimetilamônio (HTAC), 0,85% de octilglicosídeo) foram incubados em conjunto durante 9 minutos, para libertar o antígeno, seguida pela adição de 35 μL de uma mistura de dois conjugados anticorpo-biotina diferentes (1,5 µg/mL e 0,9 µg/mL) e 40 µL de conjugado de marcador rutênio do anticorpo de detecção de 1,2 µg/mL no mesmo tampão de ensaio R1 e R2 (200 mM de Tris, pH 7,0, 225 mM de KCl, taurodesoxicolato de sódio a 0,5%, zwittergent 3-14 a 0,3%, oxipirion a 0,1%, metilisotiazolinona a 0,01%, metilisotiazolinona a 0,01%, albumina sérica bovina a 0,2%, IgG bovina
0,2%, 50 µg/mL de MAK33-IgG1, 50 µg/mL de MAK33-F(ab')2-Poly, 50 µg/mL de MAK IgG2b/Fab2a-Poly). Após 9 minutos de incubação adicionais, foram adicionados 50 µL de micropartículas paramagnéticas revestidas com estreptavidina e incubadas por mais 9 minutos. Em seguida, o antígeno core do HCV foi detectado (através do sinal eletroquimioluminescente gerado nestes experimentos).
[099] A Figura 1 mostra a recuperação do sinal de ambos os antígenos core do HCV recombinante (core do HCV recombinante quase de comprimento total, core do HCV recombinante (2-169) e core do HCV recombinante 3Epi-EcS-FP) após estresse de 35ºC por 14 dias. No dia 0 (sem estresse por calor ainda), a fim de comparar os dois calibradores, os sinais de ambos os calibradores são definidos como 100%. Entretanto, durante o período de estresse térmico (incubação a 35ºC do calibrador), o calibrador compreendendo uma proteína de fusão multiepítopo é superior ao calibrador core (2-169): O sinal do rec. HCV-core3Epi-ECS-FP diminuiu menos do que 10% após 4 dias e manteve-se estável ao longo dos dias seguintes do estresse por calor. A perda contínua de sinal do HCV core (2-169) para cerca de dois terços do sinal original foi muito mais significativa durante o período de tempo observado. Essa situação reflete as condições realistas quando os kits de reagentes contendo calibradores e/ou controles quando armazenados em condições inadequadas, como durante o transporte em condições de clima quente. Além disso, a vida de prateleira do calibrador que pode ser parte de um kit é aumentada. Por razões de estabilidade, as proteínas de fusão multiepítopo como a rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP são muito mais adequadas como calibrador e/ou reagente de controle do que calibrador com core do HCV recombinante de comprimento total ou core do HCV próximo do comprimento total (2-169).
[100] A Tabela 1 mostra os resultados de um imunoensaio descrito no exemplo 4, em que uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com a invenção foi aplicada como “Cal2” (calibrador positivo contendo 350 pg/mL de rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP como analito análogo). “Cal1” é o calibrador negativo (amostras normais agrupadas) que não contém nenhum antígeno do HCV. O sinal fornecido com o calibrador Cal2 é cerca de 12 vezes maior que o sinal obtido para um conjunto de amostras normal (negativo), fornecendo uma excelente faixa de medição para que o ensaio seja capaz de discriminar entre resultados positivos e negativos. “COI” significa índice de corte e é uma razão obtida pela divisão do sinal medido pelo valor de corte pré- determinado. O valor de corte (Cut-Off) é o limiar para discriminar amostras negativas e positivas. Nesse caso, o corte é determinado pela multiplicação do valor médio do calibrador positivo Cal2 por 0,2 (consulte a tabela 1), resultando em 2041 contagens como valor de corte. As amostras com contagens abaixo desse número são classificadas como negativas e as amostras com mais de 2041 contagens são classificadas como amostras positivas (reativas ou infectadas).
[101] Voltando aos resultados da medição, o valor obtido para uma amostra normal (negativa) está muito próximo do calibrador negativo (Cal 1). O mesmo vale para amostras de doadores de sangue que são todos detectados como negativos. Por outro lado, também amostras positivas (infectadas pelo HCV) são corretamente detectadas como positivas. Em outras palavras, a proteína de fusão multiepítopo como descrita no presente relatório descritivo serve como um material de confiança para a calibração de imunoensaios para a detecção de antígenos estruturais do HCV, e em particular para a detecção de antígeno core do HCV.
[102] A Figura 2 representa os resultados de um experimento independente realizado como descrito para a Figura 1 expandido para as proteínas de fusão multiepítopo adicionais; rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z,extralongo, C/A) e rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4. Consistentemente,
por razões de estabilidade, as proteínas de fusão multiepítopo como a rec.
HCVcore-3Epi-EcS-FP, rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z,extralongo, C/A) e rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP,XY(Z)4 são muito mais adequadas como reagente calibrador e/ou de controle do que calibrador com core do HCV de comprimento total ou core do HCV recombinante próximo do comprimento total (2-169).
[103] A Tabela 2 apresenta os resultados de um experimento independente efetuado tal como descrito para a Tabela 1 e descrito no Exemplo 4 onde proteínas de fusão multiepítopo adicionais de acordo com a invenção foram aplicadas como “Cal2” (calibrador positivo contendo 400 pg/mL de rec. HCVcore- 3Epi-EcS-FP, XY (Z, extralongo, C/A) ou 520 pg/mL de rec.
HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4 como analito análogo). Além da rec. HCVcore- 3Epi-EcS-FP as proteínas de fusão multiepítopo rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY (Z, extralongo, C/A) e rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP, XY(Z)4 também serviram como material confiável para calibrar imunoensaios e detectar antígenos estruturais do HCV e, em particular, para detectar o antígeno core do HCV.
TABELA 1 DADOS PARA DOADORES DE SANGUE NORMAIS E AMOSTRAS HCV-POSITIVAS,
CALIBRAÇÃO COM PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO ID da amostra Contagens COI Amostras normais Cal1 agrupadas 836 0,41 854 0,42 Cal2 rec. HCVcore-3Epi-EcS-FP 10.248 5,02
10.160 4,98 Valor de corte (CutOff): 0,2 * méd.Cal2 2.041 Amostra normal #Dia62058 735 0,36 Amostras positivas para o #9224787 97.627 47,84 antígeno HCV #9233117 9.324 4,57 #217293 68.481 33,56 #9220121 359.798 176,30
ID da amostra Contagens COI #9220337 4.139 2,03 Doadores de sangue BRK_2401 808 0,40 BRK_2402 722 0,35 BRK_2403 781 0,38 BRK_2404 785 0,38 BRK_2405 798 0,39 BRK_2406 773 0,38 BRK_2407 825 0,40 BRK_2408 816 0,40 BRK_2409 755 0,37 BRK_2410 738 0,36 BRK_2413 796 0,39 BRK_2414 800 0,39 BRK_2415 800 0,39 BRK_2416 841 0,41 BRK_2418 799 0,39 BRK_2419 793 0,39 BRK_2420 707 0,35 BRK_2421 753 0,37 BRK_2422 789 0,39 BRK_2423 814 0,40 BRK_2424 786 0,39 TABELA 2 DADOS PARA DOADORES DE SANGUE NORMAIS E AMOSTRAS HCV-POSITIVAS,
CALIBRAÇÃO COM PROTEÍNAS DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO ADICIONAIS Contagens Contagens rec. HCVcore- rec. HCVcore- ID da amostra 3Epi-EcS-FP, COI 3Epi-EcS- COI XY(Z,extra- FP,XY(Z)4 longo, C/A) Amostras normais Cal1 926 0,45 0,44 agrupadas 923 0,44 0,44 Cal2 10323 4,96 10484 5,04 10389 4,99
Contagens Contagens rec.
HCVcore- rec.
HCVcore- ID da amostra 3Epi-EcS-FP, COI 3Epi-EcS- COI XY(Z,extra- FP,XY(Z)4 longo, C/A) 10440 5,01 Valor de corte (CutOff): 0,2 * méd.
Cal2 2081 2083 Amostra normal #59067614 882 0,42 0,42 #9224787 98.037 47,11 47,07 #9233117 7.782 3,74 3,74 Amostras positivas #217293 72.900 35,03 35,00 para antígeno HCV #9220121 319.605 153,58 153,43 #9220337 4.098 1,97 1,97 BRK_2401 868 0,42 0,42 BRK_2402 902 0,43 0,43 BRK_2403 895 0,43 0,43 BRK_2404 887 0,43 0,43 BRK_2405 915 0,44 0,44 BRK_2406 876 0,42 0,42 BRK_2407 873 0,42 0,42 BRK_2408 902 0,43 0,43 BRK_2409 888 0,43 0,43 BRK_2410 880 0,42 0,42 Doadores de sangue BRK_2413 852 0,41 0,41 BRK_2414 894 0,43 0,43 BRK_2415 909 0,44 0,44 BRK_2416 884 0,42 0,42 BRK_2418 901 0,43 0,43 BRK_2419 898 0,43 0,43 BRK_2420 903 0,43 0,43 BRK_2421 917 0,44 0,44 BRK_2422 893 0,43 0,43 BRK_2423 880 0,42 0,42 BRK_2424 890 0,43 0,43
Claims (15)
1. PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO, compreendendo de dois a seis peptídeos lineares que não se sobrepõem presentes na sequência de aminoácidos da proteína core do vírus da hepatite c (HCV), caracterizada por cada um dos referidos peptídeos diferentes estar presente de uma a cinco vezes na referida proteína de fusão multiepítopo, e cada um dos referidos peptídeos diferentes é separado dos outros peptídeos por um espaçador que consiste em uma sequência de aminoácidos não HCV compreendendo uma sequência de aminoácidos chaperona e em que nenhuma sequência de aminoácidos HCV-específica adicional está presente no referido polipeptídeo.
2. PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela referida proteína core do HCV corresponder a uma sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 1.
3. PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 2, caracterizada por cada um dos referidos dois a seis peptídeos lineares ter um comprimento de 5 a 50 aminoácidos, em um exemplo de realização de 5 a 31 aminoácidos, em um exemplo de realização de 5 a 25 aminoácidos, em um exemplo de realização de 7 a 21 aminoácidos, em um exemplo de realização de 15 a 21 aminoácidos, em um exemplo de realização de 15 a 30 aminoácidos e em um exemplo de realização de 15 a 65 aminoácidos.
4. PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada por três peptídeos lineares diferentes presentes na sequência de aminoácidos da referida proteína core do HCV fazerem parte da referida proteína de fusão multiepítopo.
5. PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelos referidos três peptídeos lineares diferentes compreenderem uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácidos 55 a 80 da SEQ ID NO: 1, posições de aminoácidos 90 a 120 da SEQ ID NO: 1, e posições de aminoácidos 145 a 175 da SEQ ID NO: 1.
6. PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada por possuir a fórmula: X - espaçador - Y - espaçador - Z em que; X, Y e Z designam sequências de aminoácidos lineares diferentes que não se sobrepõem presentes na proteína core do HCV; em que Z está presente de uma a cinco vezes, e o espaçador designa uma sequência de aminoácidos não-HCV compreendendo uma sequência de aminoácidos chaperona.
7. PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por X compreender uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácidos de 55 a 80 da SEQ ID NO: 1; Y compreender uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácidos de 90 a 120 da SEQ ID NO: 1; e Z compreender uma sequência linear de aminoácidos presente nas posições de aminoácido de 145 a 175 da SEQ ID NO: 1.
8. PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo referido espaçador compreender uma sequência de pelo menos 25 aminoácidos não- HCV, em um exemplo de realização, pelo menos 100, em um exemplo de realização, pelo menos 150, em um exemplo de realização, pelo menos 200, e em um exemplo de realização, de 25 a 200 aminoácidos não-HCV.
9. PROTEÍNA DE FUSÃO MULTIEPÍTOPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada por consistir em qualquer uma das SEQ ID NOs: 4 a 6.
10. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA de fusão multiepítopo solúvel, caracterizado por compreender as etapas de; a) cultivo de células hospedeiras transformadas com um vetor de expressão compreendendo uma molécula de DNA recombinante operacionalmente ligada que codifica uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, b) expressão do referido polipeptídeo; e c) purificação do referido polipeptídeo.
11. USO DE UMA PROTEÍNA de fusão multiepítopo caracterizado por compreender a sequências de aminoácidos de um antígeno core do HCV de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 até 9 como um material calibrador e/ou material de controle em um teste diagnóstico in vitro para a detecção de um antígeno core do HCV.
12. MÉTODO PARA DETECTAR O ANTÍGENO core do HCV em um imunoensaio, caracterizado por uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 ser usada como material calibrador e/ou material de controle.
13. KIT de reagentes para a detecção do antígeno core do HCV, caracterizado por compreender em recipientes separados ou em compartimentos separados de um recipiente único pelo menos um agente de ligação específico para o antígeno core do HCV e pelo menos uma proteína de fusão multiepítopo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9 como material calibrador.
14. KIT de reagentes, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender pelo menos dois agentes de ligação específicos para o antígeno core do HCV, em que um dos referidos pelo menos dois agentes de ligação específicos para o antígeno core do HCV está marcado de forma detectável.
15. KIT de reagentes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 e 14, caracterizado por compreender adicionalmente micropartículas.
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