CN117890589A - 一种多表位HCV core抗体组合及检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种丙型肝炎病毒检测试剂盒。本发明提供丙型肝炎病毒检测试剂盒，其包括检测丙型肝炎病毒核心抗原的第一抗体、第二抗体、第三抗体和第四抗体。本发明的试剂盒灵敏度高，稳定性好，操作简单，可用于早期急性丙型肝炎的快速检测。

Description

一种多表位HCV core抗体组合及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒检测领域。具体而言，涉及一种多表位HCV core抗体组合及检测试剂盒。
背景技术
根据WHO统计，全世界多达1.7亿人被丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染，即肝脏的一种病毒性感染。75％-85％的感染者会发展成慢性感染，这些病例中大约20％会发展慢性丙型肝炎的并发症，包括肝硬化或肝癌。当前推荐HCV感染的治疗是干扰素和利巴韦林药物的结合，但是，该治疗并不是所有情况下都是有效的，并且在丙型肝炎相关的末期肝病中指示肝移植。因此，及早检出HCV对于HCV感染者来说非常重要。
HCV是一种小包膜RNA病毒，属黄病毒科，基因组含一条约9.6kb长的单股、正链RNA分子。病毒有一脂质包膜，结合着宿主来源的脂质或免疫球蛋白。包膜内部是密度较高的核心颗粒，由核心蛋白(core)和病毒核酸相结合构成。HCV基因组只有一个开放阅读框，位于基因组中央，编码一条约3000个aa的病毒前体多肽；后经宿主细胞信号肽酶和病毒自身蛋白酶的剪切形成至少10个结构和功能蛋白。其中蛋白core/E1，E1/E2，E2/p7 和p7/NS2的位点由宿主细胞信号肽酶剪切并形成病毒的结构蛋白和p7蛋白。NS2-3蛋白酶剪切NS2/NS3位点，其余下游蛋白的加工有NS3-4A丝氨酸蛋白酶完成，释放出成熟的NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白。
HCV感染的实验室诊断是丙型肝炎诊断的重要依据，主要包括特异性抗体(HCV抗体)的检查、HCV基因和HCV核心抗原的检测以及肝细胞损害的检查。HCV抗体阳性是HCV感染的间接证据，而病毒基因和抗原检测阳性是病毒存在的直接证据；肝细胞损害的检查往往以肝脏酶学检查，特别是丙氨酸氨基转移酶(ALT)来反映。其中，用PCR技术检测HCV基因，虽然能在感染后2-3天即可检测到阳性结果，实现早期病原学诊断，且特异性强，可以判断传播途径，但对设备和人员操作要求高，极易出现污染及操作误差，因此在基层医疗机构普及存在困难。HCV抗体检测是当前主流的血清学检测方法。1989年，Kuo等建立了抗-C-100放射免疫试验方法 (RIA)，随后Ortho公司又研制成功酶联免疫试验方法(ELISA)检测抗-C-100。这两种方法均用重组酵母表达的病毒抗原(C-100-3，为NS4编码的蛋白，含363个氨基酸)，经纯化后包被微量塑料板孔，然后加被检血清，该病毒抗原即与被检血清中抗-C-100结合，最后加同位素或酶标记的鼠抗人lgG单克隆抗体，加底物显色判断结果。第二代酶联免疫试验法 (ELISA)检测抗HCV采用HCV Core区编码蛋白C-22-3和非结构区NS3 编码蛋白C-33-3和C-100-3包被载体。虽然抗HCV抗体检测方法不断迭代，极大的提高检出率，但由于抗体检测存在窗口期，因此，检测HCV抗原才能更早的检测出病毒感染。
采用双抗体夹心法检测HCV抗原可以有效提高检出窗口期，并且可用于免疫功能障碍人群HCV感染的辅助诊断，鉴别HCV既往感染与现症感染，丙肝治疗的辅助监测等方面，其中，核心抗原(core)富含精氨酸、赖氨酸、脯氨酸，亲水性强，抗原性强，特异性高，亲和力强，是HCV诊断的重点区段。HCV核心抗原测定是近年来国际上出现的一种新的测定方法，国外的研资料表明它与HCV RNA检测存在着很好的相关性，可用于 HCV早期诊断。但是，由于血清中的游离core水平较低，因此需要一种高灵敏的多表位抗体组合，来满足更高的活性检测要求。
发明内容
发明人经过大量研究和探索，对各种结合HCV抗原片段的抗体进行分析，通过实验筛选和验证，获得能够用于HCV核心抗原(core)检测的抗体组合，并且组合中的抗体识别不同的HCV core片段，能够充分互补，实现HCV core抗原的高灵敏、高活性检测，降低漏检风险和缩短窗口期。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种检测丙型肝炎病毒核心抗原的抗体组合，具备改善的灵敏度、检出率和检测活性，可用于制备检测丙型肝炎试剂盒，缩短了检测窗口期。在一些实施方案中，一种检测丙型肝炎病毒核心抗原的抗体组合包括第一抗体、第二抗体、第三抗体和第四抗体，所述第一抗体特异性结合丙型肝炎病毒核心抗原第28-35位氨基酸序列，所述第二抗体特异性结合丙型肝炎病毒核心抗原第100-120位氨基酸序列，所述第三抗体特异性结合丙型肝炎病毒核心抗原第35-53位氨基酸序列，所述第四抗体特异性结合丙型肝炎病毒核心抗原第60-72位氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一抗体、第二抗体、第三抗体或第四抗体可以是单克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体或者抗体的抗原结合片段，只要他们展示所需的生物学活性，如特异性结合HCV抗原的氨基酸片段。在一些实施方案中，第一抗体、第二抗体、第三抗体或第四抗体可以是抗体片段，即可以是全长抗体的部分，优选地包括其抗原结合区、可变区或CDR。例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fd、Fv、dAb、scFv、双价抗体或结构域抗体。在一些实施方案中，当用于本文中时，"特异性结合"可以指抗体选择性地或优先地结合所述氨基酸序列，或者所述氨基酸序列上的主要表位。
在一些实施方案中，可以使用任何适当的体外测定、基于细胞的测定、体内测定、动物模型等检测本发明抗体的效果如结合能力、活性、特异性、或灵敏度等。在一些实施方案中，所述测定可以包括例如ELISA，FACS结合测定，Biacore，竞争性结合测定等。在一些实施方案中，例如在ELISA或FACS 中本发明的抗体(或其抗原结合片段)与抗原结合的EC50值。在一些实施方案中，可以使用标准测定法如表面等离子共振技术(例如)确定结合亲和力。在一些实施方案中，也可以使用酶联免疫吸附法检测抗体结合所述氨基酸序列的能力。例如在一些实施方案中，采用HRP标记羊抗鼠 IgG，所述氨基酸序列包被酶标反应板，测定样品(如血清)中抗体的反应值，来表示结合能力。例如在一些实施方案中，以反应值与对照值(阴性) 比值≥2.0为阳性，阳性表示特异性结合。
在一些实施方案中，第一抗体、第二抗体、第三抗体、第四抗体之间表位互补，获得改善的检出率。在一些实施方案中，对第一抗体、第二抗体、第三抗体、第四抗体进行包被或者标记。在一些实施方案中，将上述四种抗体分为捕获抗体和标记抗体。例如捕获抗体选自所述第一抗体至第四抗体中的任意一种、任意两种或任意三种，标记抗体选自所述第一抗体至第四抗体中的除捕获抗体的其他所有抗体。在一些实施方案中，第一抗体为捕获抗体，第二抗体、第三抗体、第四抗体为标记抗体。又或者，在一些实施方案中，第二抗体为捕获抗体，第一抗体、第三抗体、第四抗体为标记抗体；以此类推。在一些实施方案中，所述捕获抗体为第一抗体和第二抗体；所述标记抗体为第三抗体和第四抗体。又或者，在一些实施方案中，所述捕获抗体为第一抗体和第三抗体；所述标记抗体为第二抗体和第四抗体；以此类推。在一些实施方案中，第一抗体、第二抗体、第三抗体为捕获抗体，第四抗体为标记抗体。又或者，在一些实施方案中，第一抗体、第二抗体、第四抗体为捕获抗体，第三抗体为标记抗体；以此类推。在一些实施方案中，捕获抗体又称为包被抗体。
在一些实施方案中，捕获抗体结合至固相，在一些实施方案中，所述捕获抗体可以用于包被固相；在一些实施方案中，固相没有特别限制，其可以是例如是膜载体、微粒或微孔板；例如是磁微粒，乳胶、微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、尼龙膜或微流控芯片。
在一些实施方案中，所述标记抗体用可检测标记物标记，在一些实施方案中，可检测标记物例如金属粒子、荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，放射性标记，或酶标记，例如胶体金，胶体银，胶体硒，胶体碳，胶体碲、荧光团，罗丹明，荧光素酶，荧光素，吖啶酯，放射性同位素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，三联钌、鲁米诺类、Eu螯合物，自旋标记，噬菌体标记。
在一些实施方案中，所述捕获抗体或所述标记抗体可以独立地连接至结合配偶体之一；通过结合配偶体在测定反应中连接至固相或者可检测标记物；又或者通过结合配偶体以间接方式连接至固相或者可检测标记物。在一些实施方案中，结合配偶体选自生物素/抗生物素蛋白、生物素或其衍生物/亲和素或其衍生物(如链霉亲和素)、受体/配体，地高辛/地高辛配基，碳水化合物/凝集素。在一些实施方案中，例如抗体连接至生物素，例如抗体连接至链霉亲和素。
在一些实施方案中，本发明提供一种检测丙型肝炎试剂盒，包括所述检测丙型肝炎病毒核心抗原的抗体组合，实现丙型肝炎病毒核心的灵敏检测。在一些实施方案中，试剂盒还包括检测丙型肝炎病毒抗体的试剂。在一实施方案中，所述丙型肝炎病毒抗体为core抗体，E1抗体、E2抗体、 NS2抗体、NS3抗体、NS4抗体或NS5抗体中的至少一种。在一些实施方案中，检测丙型肝炎病毒抗体可以采用双抗原夹心法或间接法。在一些实施方案中，双抗原夹心法检测丙型肝炎病毒抗体，采用至少两个抗原，包括第一抗原和第二抗原，对待检测抗体进行夹心，其中第一抗原和第二抗原可以选自HCV核心抗原第1位至56位氨基酸中的片段，NS3第1201位至1490位氨基酸中的片段，NS4的1883位至1925位氨基酸中的片段；或者选自以上片段的组合或嵌合的序列；例如第一抗原和第二抗原可以是HCV 核心抗原第1位至35位氨基酸，NS3第1223位至1426位氨基酸，NS4的 1890位至1923位氨基酸。例如第一抗原和第二抗原来自同一丙型肝炎病毒抗原的不同位置，例如来自丙型肝炎病毒核心抗原第7-48位氨基酸序列，例如来自丙型肝炎病毒核心抗原第7-21位氨基酸序列，和/或第29-48位氨基酸序列。在一些实施方案中，第一抗原和第二抗原可以用作捕获抗原和标记抗原，例如第一抗原为捕获抗原，第二抗原为标记抗原，或者第一抗原为标记抗原，第二抗原为捕获抗原。在一些实施方案中，所述捕获抗原结合至固相。在一些实施方案中，所述捕获抗原可以用于包被固相；在一些实施方案中，固相没有特别限制，其可以是例如是膜载体、微粒或微孔板；例如是磁微粒，乳胶、微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、尼龙膜或微流控芯片。在一些实施方案中，所述标记抗原用可检测标记物标记，在一些实施方案中，可检测标记物例如金属粒子、荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，放射性标记，或酶标记，例如胶体金，胶体银，胶体硒，胶体碳，胶体碲、荧光团，罗丹明，荧光素酶，荧光素，吖啶酯，放射性同位素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β- 半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，三联钌、鲁米诺类、Eu螯合物，自旋标记，噬菌体标记。在一些实施方案中，所述捕获抗原或所述标记抗原可以独立地连接至结合配偶体之一；通过结合配偶体在测定反应中连接至固相或者可检测标记物；又或者通过结合配偶体以间接方式连接至固相或者可检测标记物。在一些实施方案中，结合配偶体选自生物素/抗生物素蛋白、生物素或其衍生物/亲和素或其衍生物(如链霉亲和素)、受体/配体，地高辛/ 地高辛配基，碳水化合物/凝集素。在一些实施方案中，例如抗原连接至生物素，例如抗原连接至链霉亲和素。
在一些实施方案中，试剂盒还包括适合进行免疫测定的试剂。在一些实施方案中，本发明的试剂盒可以用于进行免疫测定，例如ELISA，化学发光、免疫层析、间接免疫荧光测定IFA，放射免疫测定RIA以及其它非酶联抗体结合试验或方法。
在一些实施方案中，例如在ELISA实验方案中，可以将捕获抗体包被固相如磁珠或者微孔板，捕获样品中的HCV核心抗原，然后用标记抗体与结合在磁珠或者板上的抗原再次结合，经显色后读取结果。在一些实施方案中，捕获抗体固定到固相表面，例如塑料、膜如硝酸纤维素膜、玻璃、磁珠或金属支持物等等。在一些实施方案中，来自受试者的样品与所述固相中的捕获抗体接触，然后接触带有可检测标记的标记抗体，通过可检测标记显色或发出可识别信号。在一些实施方案中，可以采用封闭剂如牛血清白蛋白、奶粉溶液、明胶、PVP、Superblock封闭非特异性位点，減少非特异性结合造成的背景。在一些实施方案中，可以采用稀释剂，如应用BSA 和磷酸缓冲盐液(PBS)/吐温稀释待测样品，有助于减少非特异性背景。
在一些实施方案中，试剂盒还可以包括病毒裂解液。在一些实施方案中，病毒裂解液可以包含例如变性剂，表面活性剂，保护蛋白，硫酸铵和无水乙醇。在一些实施方案中，所述病毒裂解液可以是缓冲液，例如磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，所述裂解液不需要进行抗原抗体的解离，通过调整温和的裂解液，能够把病毒中的核心抗原释放出来，从而实现抗原抗体高效的反应，提高病毒检出率。
在一些实施方案中，本发明提供检测丙型肝炎病毒核心抗原的抗体组合在制备检测丙型肝炎试剂盒中的用途。在一些实施方案中，本发明还提供一种检测丙型肝炎的方法，包括用检测丙型肝炎病毒核心抗原的抗体组合接触受试者的样品，检测抗原抗体免疫反应信号。
在一些实施方案中，来自受试者的样品可以包括健康或病理状态的生物组织、细胞或体液，例如血液样品，例如血浆、血清、血制品，例如精液或阴道分泌物。
在一些实施方案中，采用本领域已知的方法制备本发明的抗体，例如第一抗体、第二抗体、第三抗体或第四抗体。在一些实施方案中，可以利用丙型肝炎病毒核心抗原第28-35位氨基酸序列作为免疫原中的抗原性部分，利用免疫原免疫动物，获得第一抗体；在一些实施方案中，可以利用丙型肝炎病毒核心抗原第100-120位氨基酸序列作为免疫原中的抗原性部分，利用免疫原免疫动物，获得第二抗体；在一些实施方案中，可以利用丙型肝炎病毒核心抗原第35-53位氨基酸序列作为免疫原中的抗原性部分，利用免疫原免疫动物，获得第三抗体；在一些实施方案中，可以利用丙型肝炎病毒核心抗原第60-72位氨基酸序列作为免疫原中的抗原性部分，利用免疫原免疫动物，获得第四抗体。在一些实施方案中，可以利用丙型肝炎病毒核心抗原全长作为免疫原中的抗原性部分，利用免疫原免疫动物，再用丙型肝炎病毒核心抗原第28-35位氨基酸序列筛选第一抗体；用丙型肝炎病毒核心抗原第100-120位氨基酸序列筛选第二抗体；用丙型肝炎病毒核心抗原第35-53位氨基酸序列筛选第三抗体；用丙型肝炎病毒核心抗原第 60-72位氨基酸序列筛选第四抗体。在一些实施方案中，免疫原中除了抗原性部分，还可以包含适当的载体蛋白。在一些实施方案中，适当的载体蛋白是本领域技术人员已知的，其可以是例如KLH和BSA等。在一些实施方案中，本发明提供制备检测丙型肝炎病毒核心抗原的抗体组合的方法，包括：选自下述片段1-片段4作为免疫原中的抗原性部分，利用免疫原免疫动物，获得分别特异性结合片段1-片段4的抗体：片段1：丙型肝炎病毒核心抗原第28-35位氨基酸序列；片段2：丙型肝炎病毒核心抗原第100-120 位氨基酸序列；片段3：丙型肝炎病毒核心抗原第35-53位氨基酸序列；和片段4：丙型肝炎病毒核心抗原第60-72位氨基酸序列。
本发明有利地具有以下一种或多种优点：
本发明提供的4个针对不同表位的抗体组合提高了样本整体检出率，并且还不提高假阳性，特别适合临床检测应用。
具体实施方式
下面主要结合具体实施例对多表位HCV core抗体组合及HCV core抗原检测试剂盒及其制备作进一步详细的说明。以下实施例仅仅是例证，本发明并不局限于这些实施例。
试剂与方法
实施例1HCV core抗体制备
1.1免疫小鼠
取1m HCV core抗原(菲鹏生物股份有限公司提供)与等量与弗氏完全佐剂混合，采用皮下、腹腔多点注射BALB/c小鼠，第一次免疫14天后腹腔增强免疫，增强免疫到四针后，采尾血进行效价检测，效价达到融合要求。小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏供融合用。
1.2杂交瘤细胞系的制备
(1)饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天，BALB/c鼠拉颈处死，75％酒精全身浸泡，超净台内，无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，回收冲洗液，1000rpm，离心5分钟，留沉淀，用RPMI1640筛选培养液(含 HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬，调整细胞浓度1×105个/mL，加入 96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。
(2)免疫脾细胞的制备
小鼠末次免疫后三天，在无菌条件下取出脾脏，置于平皿中，RPMI 1640 基础培养液冲洗一次，放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，弃上清，RPMI 1640基础培养液重悬，如此重复三次，计数。
(3)骨髓瘤细胞的制备
小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(菲鹏生物股份有限公司保存)经8-氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用 RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，计数。
(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤
将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640基础培养液洗1次，1200rpm，离心8分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL 50％的PEG1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。1000rpm，离心5分钟。弃上清，用50mL 的RPMI 1640筛选培养液轻轻混悬，平分于10块铺有饲养细胞的96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2培养。培养至第六天，换HT培养液(含HT的RPMI 1640完全培养液)两次。
1.3抗体的筛选
以HCV core抗原包被酶标反应板，4℃包被过夜后，用含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.02M pH7.2 PBS，0.15ml/孔，37℃封闭2小时，加入细胞培养上清37℃、30分钟后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(菲鹏生物股份有限公司生产，货号BA-PAB-MU0001)，37℃、30 分钟后，每孔加入100μl含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水， pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃、15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μl，测450nm吸光度。RPMI 1640完全培养液作为阴性对照，以测定值与对照值得比≧2.0为阳性细胞孔。融合三次共获得14株稳定分泌HCV core抗体的细胞株，其ELISA法测定的效价均在105～107之间。
实施例2HCV core抗体表位鉴定
用10种HCV短肽抗原A1～A10分别包被微孔，以PBS+20％NBS为稀释液，稀释实施例1所得14株单抗(作为一抗)浓度到1ug/ml，以羊抗鼠 IgG-HRP为二抗，依据各单抗对不同抗原的反应情况来确定单抗表位，结果如下表1所示。
表1
实施例3HCV core抗体表位配对
在ELISA平台测试不同抗体表位配对的检测效果，取实施例2所鉴定抗体分别作为HRP酶标抗体和包被抗体。
HRP酶标抗体制备工艺如下：
(1)将12mg抗体用20mM PH9.51 CB缓冲液透析，4℃透析约过夜个小时；换液
(2)取24mgHRP用配成10mg/ml的HRP溶液，
(3)向HRP溶液中加入5ml新配的10mg/ml的NaIO4溶液，4℃下避光搅拌40分钟；
(4)加入20ul乙二醇避光搅拌60分钟；
(5)将上述处理好的HRP溶液加入到抗体溶液中，用20mM PH9.51 的CB缓冲液透析，4℃透析约过夜；
(6)加入20ul的NaBH4终止反应；
(7)用G25脱盐柱进行纯化，收集主峰测浓度后加入甘油保存至-20 度备用。
ELISA测试方法如下：
(1)取包被抗体分别按照1ug/ml用量分别加入到pH 9.51，50mM CB 中混匀后，每孔100ul,包被到ELISA聚苯乙烯微孔板中，4℃包被18-22 小时；
取出包被板平衡置室温，用洗涤液洗板1次拍干后，每孔加220ul封闭液37℃封闭2小时；甩干置于湿度小于30％的干燥房或者是电子干燥箱中干燥24h后待用。
(2)将上述制得的HRP酶标抗体稀释为酶标抗体工作液，待用。
取100ul待测样品按照1:1稀释，在37度恒温箱反应90min，洗板5 次，每次浸泡1min；
拍干后加入200ulHRP酶标抗体工作液，37℃反应30min，洗板5次，每次浸泡1min；
加入TMB显色液，显色10min，
加入终止液50ul，用450nm～630nm双波长读值。
其中单抗5E-7、8F-16、13C-10、3F-21、6B-25分别作为包被抗体，而单抗10D-2、11C-13、5G-8、6D-33、12B-3分别作为HRP酶标抗体。结果如下表2所示，结合HCV core 28-35aa的抗体与结合HCV core 60-72aa抗体配对夹心能检测到低至2ng/ml的HCV core抗原，结合HCV core 35-53aa的抗体与结合HCV core 100-120aa抗体配对夹心能检测到低至4ng/ml的HCV core抗原。这两种抗体配对组合比其它配对组合的检测灵敏度更高。
表2.
实施例4不同表位的抗体配对检测比较
依据实施例3所述的ELISA测试方法，用不同的抗体与针对表位 60-72aa的标记抗体配对，进行测试，结果如表3所示。
表3.
实施例5用四种HCV core抗体进行表位配对
依据实施例3所述的ELISA测试方法，用4种抗体配对夹心组合对临床样本进行测试，配对模式如表4所示。
表4.
测试结果如下表5所示，三种组合测试临床阴性样本的本底值差不多。而采用本发明抗体组合，检测阳性样本的信号值总体会相对最高，对照组合2稍微低于本发明抗体组合，对照组合1明显低于本发明抗体组合。
表5.
实施例6临床样本测试
在ELISA平台分别用本发明抗体组合和对照组合测试35份临床阳性样本(RNA测试阳性)和400份临床阴性样本(RNA测试阴性)。结果如下表6所示，本发明抗体组合实现了0漏检，并且还具有相当高的特异性，证明本发明抗体组合具有显著的技术进步。
表6

Claims (10)

1.一种检测丙型肝炎病毒核心抗原的抗体组合，包括第一抗体、第二抗体、第三抗体和第四抗体，所述第一抗体特异性结合丙型肝炎病毒核心抗原第28-35位氨基酸序列，所述第二抗体特异性结合丙型肝炎病毒核心抗原第100-120位氨基酸序列，所述第三抗体特异性结合丙型肝炎病毒核心抗原第35-53位氨基酸序列，所述第四抗体特异性结合丙型肝炎病毒核心抗原第60-72位氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体组合，包括捕获抗体和标记抗体；例如捕获抗体选自所述第一抗体至第四抗体中的任意一种、任意两种或任意三种，标记抗体选自所述第一抗体至第四抗体中的除捕获抗体的其他所有抗体；例如所述捕获抗体为第一抗体和第二抗体；所述标记抗体为第三抗体和第四抗体。
3.根据权利要求2所述的抗体组合，其中捕获抗体结合至固相，可选地，固相例如是膜载体、微粒或微孔板；例如是磁微粒，乳胶、微球、微量滴定板、硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、尼龙膜或微流控芯片。
4.根据权利要求2所述的抗体组合，其中所述标记抗体用可检测标记物标记，可选地，可检测标记物例如金属粒子、荧光标记，发色团标记，电子致密标记，化学发光标记，放射性标记，或酶标记，例如胶体金，胶体银，胶体硒，胶体碳，胶体碲、荧光团，罗丹明，荧光素酶，荧光素，吖啶酯，放射性同位素，辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶，葡萄糖氧化酶，半乳糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，三联钌、鲁米诺类、Eu螯合物，自旋标记，噬菌体标记。
5.根据权利要求2所述的抗体组合，其中所述捕获抗体或所述标记抗体独立地连接至结合配偶体之一；结合配偶体选自生物素/抗生物素蛋白、生物素/亲和素、受体/配体，地高辛/地高辛配基，碳水化合物/凝集素。
6.一种检测丙型肝炎试剂盒，包括权利要求1-5任一项所述的检测丙型肝炎病毒核心抗原的抗体组合。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，还包括检测丙型肝炎病毒抗体的试剂。
8.根据权利要求7所述的抗试剂盒，所述丙型肝炎病毒抗体为core抗体、E1抗体、E2抗体、NS2抗体、NS3抗体、NS4抗体或NS5抗体中的至少一种。
9.如权利要求1-5任一项所述的抗体组合在制备检测丙型肝炎试剂盒中的用途。
10.制备权利要求1所述的检测丙型肝炎病毒核心抗原的抗体组合的方法，包括：选自下述片段1-片段4作为免疫原中的抗原性部分，利用免疫原免疫动物，获得分别特异性结合片段1-片段4的抗体：
片段1：丙型肝炎病毒核心抗原第28-35位氨基酸序列；
片段2：丙型肝炎病毒核心抗原第100-120位氨基酸序列；
片段3：丙型肝炎病毒核心抗原第35-53位氨基酸序列；和
片段4：丙型肝炎病毒核心抗原第60-72位氨基酸序列。
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