CN1877330A - 丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒及其研制方法，本发明通过分析丙型肝炎病毒不同亚型的核心抗原序列，克隆表达HCV高度保守的特征性核心抗原基因，获得高效分泌的抗HCV核心抗原的细胞株，纯化出包含HCV核心四个aa表位的高比活单克隆抗体：使用其中的Cab1、Cab2作为包被抗体，Cab3、Cab4作为酶标抗体，用双抗体夹心技术制备HCV－cAg ELISA诊断试剂盒。本发明大大缩短HCV病毒检测的“窗口期”，使其从现有ELISA抗体检测方法的70天缩短到14天，为HCV感染的早期诊断提供了更为先进的技术支持。同时其灵敏度和特异性较现有产品有明显提高。
Description
技术领域
本发明涉及病毒抗原检测试剂盒及其制备方法，具体涉及丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)酶联免疫诊断试剂盒及该试剂盒的制备方法。
背景技术
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起，主要经输血传播的非甲非乙型肝炎，据统计全世界约有1.7亿HCV的感染者，我国的丙肝病毒感染者已达到4000万。目前还没有确实有效的临床治疗方法，针对HCV的疫苗也尚未面世，这种状况已引起我国政府有关部门的高度重视，特别是在血液制品生产领域，国家已颁布相关法规对其质量进行严格把关。但由于现行HCV Ab-ELISA法检测HCV感染“窗口期”过长的原因，我们仍未能有效地阻止HCV的传播。
目前用于临床诊断HCV感染的方法主要有两类：PCR法检测HCVRNA和免疫学检测HCV抗体法。
1.PCR(聚合酶链式反应)检测法：直接用来检测HCV的核酸物质，HCV RNA阳性说明病毒的存在。它能在HCV感染早期体内病毒含量很少的时候就能检出病毒，因此，它是诊断HCV感染的一种直接检测实验，也是目前最灵敏的检测方法，它更适合于丙型肝炎的早期诊断。但由于PCR非常敏感，实验过程中的污染问题非常容易导致出现假阳性结果。因此，前段时期PCR诊断试剂的生产、临床检测工作较为混乱，卫生部曾经暂停PCR的临床检测工作，最近卫生部虽然已经同意重新开始进行该类项目的临床检测，但其距临床的大规模应用尚存在很大的距离。
2.免疫学检测HCV抗体法：人体在感染HCV后能够产生特异性的HCV抗体，因此，用免疫学方法测定HCV抗体是一种快速简便的检测手段。现阶段国内对于HCV病毒检测绝大部分采用HCV Ab-ELISA检测诊断试剂，该类诊断试剂在对HCV进行检测时，检测灵敏度和特异性较低，检测“窗口期”长达50～70天，不利于HCV的及早发现和及时治疗，同时使血液制品使用者面临着较高的HCV病毒潜在感染风险。
美国ORTHO公司于2000年推出了HCV Ag-ELISA诊断试剂盒，该产品具有很高的灵敏度和特异性，检测效果稳定，“窗口期”为14天，各类指标明显优于目前被广泛使用的HCV Ab-ELISA检测方法。由于技术保密等原因，ORTHO公司尚未在中国进行新产品申报注册，也未在中国申报发明专利，同时由于价格过高导致该产品未能在中国得以推广和普及。不同HCV检测方法性能比较见表1
表1现有丙型肝炎病毒诊断方法性能比较
| 技术指标 | PCR方法 | 免疫学抗体检测方法 | ORTHO公司产品 |
| 窗口期 | 11天 | 70天 | 14天 |
| 灵敏度 | 高 | 较高 | 1pg |
| 特异性 | 较低 | 高 | 高 |
发明内容
本发明的目的在于针对现有丙型肝炎抗体诊断试剂检测“窗口期”过长的不足，避免现有检测方法的局限性，提供一种丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒。
该试剂盒包括：
96人份抗HCV-cAg单克隆抗体包被板1块，酶结合物1瓶，阳性参考血清1瓶，阴性参考血清1瓶，样品稀释液1瓶，浓缩洗涕液1瓶，显色液A1瓶，显色液B1瓶，终止液1瓶，说明书1份及不干胶纸片2张。
上述试剂盒采用双抗体夹心ELISA法(图1)，包被物为抗HCV-cAg单克隆抗体CAb1、CAb2，两种单抗包被浓度均为10ug/ml，每孔加样200μl，包被缓冲液为0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液，指示抗体为过氧化物酶(HRP)标记的抗HCV-cAg单克隆抗体CAb3、CAb4，显色体系为3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMB)体系。
本发明的另一目的是提供上述试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)HCV-core重组抗原的制备：选择HCV核心抗原1～160位氨基酸序列进行重组克隆表达。
(2)用基因重组表达的HCV-cAg免疫BALB/C小鼠，制备抗HCV-cAg单克隆抗体。抗体包含了针对HCV核心抗原四个氨基酸表位的单克隆抗体，分别为：CAb1(20～35aa)，CAb2(35～50aa)，CAb3(100～115aa)，CAb4(115～130aa)。
(3)包被抗HCV-cAg单克隆抗体CAb1、CAb2成为包被反应板。
(4)将辣根过氧化物酶(HRP)与CAb3、CAb4单抗偶联制备酶标抗体。
(5)样品稀释液、浓缩洗涕液、显色液及终止液的配制。
(6)阳性对照和阴性对照的制备。
(7)分装试剂盒的各种成分，按试剂盒需要量分装在小瓶中。
(8)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密度。
(9)组装成为成品。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
1.本发明通过从基因库中调出HCV全序列基因，对不同亚型HCV核心抗原的序列进行分析，同时使用Macvector程序对丙型肝炎核心抗原1～160氨基酸序列的抗原性、亲水性和抗原表位进行分析。选择序列保守、抗原性强的4个主要的抗原表位，分别位于20～35、35～50和100～115、115～130位氨基酸残基。利用这些抗原表位制备单克隆抗体构建丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒，经检测该试剂盒能很好地识别丙型肝炎病毒核心抗原，具有较高特异性和较低假阴性率及假阳性率，预示着有良好的应用前景。
2.本发明基于酶联免疫吸附的基本原理，采用包被抗HCV核心抗原的单克隆抗体的方法，能直接检测到血制品中HCV核心抗原，其应用可以大大缩短HCV病毒检测的“窗口期”，使其从第三代ELISA抗体检测方法的70天缩短到14天，对于加强输血及血液制品使用的安全性具有重要意义，同时为HCV感染的早期临床诊断提供了更为先进的技术支持，增加了丙肝预防和治疗的主动性。
3.本发明所采用的标酶方法可以大大提高抗原检测灵敏度。常规标酶方法是过碘酸钠法和戊二醛法，这两种方法产生的酶结合物中，酶分子与待测抗原结合部位之间距离很近，如过碘酸钠法中两者距离接近于1个碳原子，由此制成的酶结合物只有一个表面可与底物接触。而本发明所采用的标酶方法可以使HRP与抗原结合部位的间距增加到约25个碳原子的距离，酶结合物与待测抗原分子反应并加入底物后，HRP酶分子可全部浸在底物中(酶与抗体间可同时通过10个以上的底物分子)，由此提高了酶表面底物的浓度，抗原检测灵敏度相应得到较大提高，可检测到0.1ml血清中lpg量的丙型肝炎病毒抗原。
附图说明
图1：HCV-cAg ELISA双抗体夹心检测原理图。图中：1为ELISA微孔板，2为抗HCV核心抗体，3为HCV核心抗原，4为抗HCV核心第二抗体，5为HRP辣根过氧化物酶，6为底物显色反应。
图2：HCV核心抗原的抗原性、亲水性和抗原表位的分析图。图中(1)为抗原性分析图；(2)为抗原亲水性分析图；(3)为抗原表位分析图。
图3：重组HCV核心抗原的克隆表达图。
具体实施方式
1.HCV-core重组抗原的制备
1.1重组抗原克隆表达：从基因库中调出HCV全序列基因，对不同亚型HCV核心抗原的序列进行分析：
同时使用Macvector程序对丙型肝炎核心抗原1～160氨基酸序列的抗原性、亲水性和抗原表位进行分析(图2)。其中有4个序列保守、抗原性强的抗原表位，分别位于20～35、35～50和100～115、115～130位氨基酸残基。选择2～160位氨基酸序列插入表达载体pBVIL1进行重组克隆表达(图3)。
1.2重组HCV-cAg的纯化和活性鉴定：将工程菌中提取的重组HCV-C抗原经S-Sepharose柱阶段梯度洗脱，收集0.15M NaCl洗脱峰，再经Sephadex G50柱脱盐，收集第一个洗脱峰。用SDS-PAGE方法鉴定抗原纯度，蛋白质上样量为10μg的条件下仅存一条带，扫描纯度≥95％。用已纯化HCV-c抗原对室内质控血清进行ELISA试验以测定活性。纯化后的抗原于-20℃低温保存。
2.抗HCV-cAg单克隆抗体的制备
2.1制备腹水：取HCV-cAg免疫的Balb/c小鼠，无菌取出已免疫的Balb/c小鼠脾脏，分离脾细胞，将脾细胞与骨髓瘤细胞按9∶1的比例混合，PEG促融合，于HAT培养液(20％胎牛血清/DMEM 1×HAT)上融合成杂交瘤细胞。制备成杂交瘤细胞，接种杂交瘤细胞，制备腹水。
2.2.抗体纯化：单克隆腹水先经辛酸-硫酸铵法粗纯化，再上SephadexG-50凝胶柱作进一步纯化，PEG2000浓缩，测280nm时OD值计算纯化抗体的浓度，用SDS-PAGE方法鉴定纯度，冻干，-20℃保存备用。
3.抗HCV-cAg单克隆抗体包被板的制备
使用包被抗体(CAb1、CAb2)以最佳包被抗体浓度(CAb1 10ug/ml，CAb210ug/ml)，用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液稀释，每孔加200μl于酶联板孔内，置4℃12小时。弃去包被液，用洗涤液充分洗涤各孔，每次300μl/孔，随之拍干。加入封闭液(BSA2g，1％硫柳汞6ml，加0.01M PBS至1000ml)220μl/孔，4℃封闭4小时，随后弃去封闭液拍干，室温干燥24小时。干燥后的酶联板，迅速真空封口包装。将封装好的板存于2-8℃。
4.酶标抗体的制备
取5mg HRP溶于1.0ml NaHCO3溶液，充分溶解HRP。加入适量0.06M NaIO4室温避光搅拌30分钟。移入透析袋，用0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液透析过夜。取纯化酶标单抗5mg，用0.01M NaHCO3溶液充分溶解后与酶液混合，装入透析袋，用0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液4℃避光透析20小时，中间换液3次。取透析后结合液加入0.4％NaBH40.2ml，搅拌30分钟后，4℃放置4小时。将酶结合物装入透析袋，用PH7.2，0.01M PBS透析48小时。Sephadex G-200凝胶过滤：将透析液上Sephadex G-200层析柱，用PH7.2，0.01M PBS洗脱，收集第一个的洗脱峰，再用PEG2000浓缩，-20℃保存备用。抗人IgG酶标记物采用方阵滴定，以间接ELISA法测定效价。
5.样品稀释液、洗涕液、终止液的配制
1)样品稀释液：
山羊血清 100ml
1％硫柳汞 20ml
0.1M铁氰化钾 10ml
吐温-20 0.5ml
10mg/ml庆大霉素 10ml
0.01M PBS(PH7.4)至1000ml，过滤除菌，4℃保存
2)洗涤液(20倍浓缩)
NaH2PO42H2O 2.96g
Na2HPO412H2O 29g
NaCl 234g
吐温-20 20ml
双蒸H2O至1000ml，过滤除菌，4℃保存
3)中止液
浓H2SO4 112ml
双蒸H2O至1000ml，过滤除菌，4℃保存
6.阳性对照和阴性对照的制备
1)阳性对照的制备：从HCV感染者静脉采血后分离血清，经抗HCV-EIA抗体检测阴性；单项转氨酶高(大于40)，经HCV-RNA PCR法测定亦为阳性；经ortho抗原检测试剂(EIA)对比检测均为阳性，抗HIV、HBsAg均为阴性血清样品，HCV-C抗原检测为阳性.。
2)阴性对照的制备：选用正常献血员血清，经抗HCV-EIA检测为阴性、抗HIV、HbsAg及Tp亦为阴性正常人血清10份，其中包括较高本底的样品，加入0.02％的硫柳汞，除菌过滤后分装，-20℃保存。
7.显色液的配制
1)显色液A
醋酸钠 27.2g
柠檬酸 3.2g
30％H2O2 0.6ml
双蒸H2O至1000ml
2)显色剂B
TMB 0.4g
EDTA-Na2 0.4g
柠檬酸 1.9g
甘油 100ml
双蒸H2O至1000ml
8.试剂盒检测操作程序
1)取出试剂，15-30℃放置30分钟，每孔加100μl样品稀释液，然后再加入100μl待测样品，留空白孔，阴、阳性对照孔，其中空白孔加入200μl样品稀释液，阴、阳性对照孔直接加入200μl阴、阳对照血清，混匀后37℃水浴振荡90分钟。
2)用1∶20稀释后的洗涤液洗板4次，最后一次拍干。
3)每孔加100μl酶结合物，37℃水浴30分钟，剩余酶结合物4℃保存。
4)洗板同2)。
5)先加入显色剂A液50μl，再加入显色剂B液50μl，37℃水浴避光显色15-20分钟。
6)每孔加50μl终止液。终止后10分钟用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD450nm)。
7)根据判定标准进行判定。
判定标准为：临界值(cut off值)＝阴性对照平均OD值+0.05＝0.118。阴性对照OD值≤0.06时按0.06计算；阴性对照OD值＞0.06时则按实际OD值计算。凡待检标本OD值大于临界值即判为阳性。待检标本OD值小于临界值即判为阴性。
9.试剂盒的准确性，特异性，敏感性和精密性检测.
1)准确性：用内控阳性样品检测三批试剂无1例假阴性，在10pg的OD450nm均大于临界值0.118(表2)。
表2阳性内质控血清试验(450nm OD值)
| 批号 | P1 | P2 | P3 | P4 | P5 |
| 030606030608030610 | 2.5802.6272.573 | 0.5600.5700.575 | 1.4191.4511.454 | 0.3280.3370.333 | 0.2390.2350.233 |
2)特异性：用内控阴性样品检测三批试剂无1例假阳性，在10pg的OD450nm均小于临界值0.118(表3)。
表3阴性内质控血清试验(450nm OD值)
| 批号 | N1 | N2 | N3 | N4 | N5 |
| 030606030608030610 | 0.0650.0350.042 | 0.0620.0640.067 | 0.0670.0720.065 | 0.0570.0330.047 | 0.0580.0670.073 |
| 批号 | N6 | N7 | N8 | N9 | N10 |
| 030606030608030610 | 0.0620.0590.085 | 0.0560.0690.065 | 0.0660.0810.071 | 0.0660.0690.068 | 0.0650.0820.073 |
3)敏感性：三批试剂用灵敏度标准品测定在10pg的OD450nm大于临界值(表4)。
表4灵敏性试验
| 批号 | 100ng | 10ng | 1ng | 100pg | 10pg |
| 030606030608030610 | 2.5552.5502.549 | 1.6631.6781.756 | 1.3871.4761.463 | 0.9140.9100.911 | 0.4790.4870.489 |
4)精密性
(1)板间精密性(CV％)测定：随机抽取8块抗体包被板，各取1条板条，组成1块整板。取1份阳性内质控血清及1份阴性内质控血清，用样品稀释液10倍稀释后各加42孔，按正常程序检测，测定各孔OD值，分别计算阴、阳性组的变异系数(CV％)，要求CV％≤15％。检测结果见(表5)。
表5：板间精密性(CV％)测定结果
| 阴性血清CV％ | 阳性血清CV％ | |
| 包被抗体板 | X＝0.046 SD＝0.003CV＝6.5％ | X＝0.467 SD＝0.014CV＝3％ |
(2)板内精密性(CV％)测定：随机抽取1块抗体包被板，取1份阳性内质控血清及1份阴性内质控血清，用样品稀释液10倍稀释后各加42孔，按正常程序检测，测定各孔OD值，分别计算阴、阳性组的变异系数(CV％)，要求CV％≤15％。检测结果见表6。
表6：板内精密性(CV％)测定结果
| 阴性血清CV％ | 阳性血清CV％ | |
| 包被抗体板 | X＝0.048，SD＝0.004CV＝8.3％ | X＝0.465，SD＝0.013CV＝2.8％ |
3)用1份弱阳性血清进行三批精密性实验(表7)
表7三批精密性实验
| 批号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | CV％ |
| 030606030608030610 | 0.4830.5120.495 | 0.4650.4640.466 | 0.4700.4610.464 | 0.4540.4570.453 | 0.4650.4570.464 | 0.4520.4590.456 | 0.4540.4650.462 | 0.4570.4570.456 | 0.4550.4520.455 | 0.4490.4530.455 | 2.2％3.8％2.7％ |
试验结果表明，本试剂盒灵敏度为10pg；在所设定cut off临界值下，标本阳性符合率为100％，阴性符合率为100％，精密性(CV％)，符合质控标准。
对五种氨基酸序列的四个抗原表位的补充说明：
对五种不同亚型HCV核心抗原(HCV 1、HCV 1b、HCV 2a、HCV 2b、HCV 3)的1～160氨基酸序列进行分析，选择序列保守、抗原性强的4个主要的抗原表位，分别为20～35aa，35～50aa，100～115aa，115～130aa。
针对HCV核心抗原四个氨基酸表位的单克隆抗体，分别为：CAb1，CAb2，CAb3，CAb4。使用其中的CAb1、Cab2作为检测板包被抗体，使用Cab3、CAb4作为酶标第二抗体。
SEQUENCE LISTING
<110>湖南景达基因有限公司
<120>丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒及其制备方法
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<140>2005100316838
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<400>1
Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly
20 25 30
Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
35 40 45
Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro
50 55 60
Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Thr Trp Ala Gln Pro Gly
65 70 75 80
Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp
85 90 95
Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro
100 105 110
Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys
115 120 125
Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp
145 150 155 160
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Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly
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Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
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Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
35 40 45
Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro
50 55 60
Ile Pro Lys Asp Arg Gln Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly
65 70 75 80
Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp
85 90 95
Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro
100 105 110
Arg Arg Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys
115 120 125
Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Val Val Met Ala Pro Leu
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp
145 150 155 160
<210>5
<211>160
<212>PRT
<213>Hepatitis C virus
<220>
<221>DOMAIN
<222>(20)..(35)
<220>
<221>DOMAIN
<222>(35)..(50)
<220>
<221>DOMAIN
<222>(100)..(115)
<220>
<221>DOMAIN
<222>(115)..(130)
<400>5
Met Ser Thr Leu Pro Lys Pro G1n Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Thr
1 5 10 15
Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly
20 25 30
Gly Val Tyr Val Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala
35 40 45
Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro
50 55 60
Ile Pro Lys Ala Arg Gln Ser Glu Gly Arg Ser Trp Ala Gln Pro Gly
65 70 75 80
Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Cys Gly Trp Ala Gly Trp
85 90 95
Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro
100 105 110
Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys
115 120 125
Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Met Ala Pro Val
130 135 140
Gly Gly Ala Arg Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Ala Leu Glu Asp
145 150 155 160
Claims (7)
1、一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于：试剂盒内装有96人份抗体检测板1块，酶结合物、阳性参考血清、阴性参考血清、样品稀释液、浓缩洗涕液、显色液A、显色液B、和终止液各1瓶。
2、根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于：其包被抗体及酶标第二抗体为抗丙型肝炎病毒核心基因区不同表位的单克隆抗体，单克隆抗体对应的核心区氨基酸序列为：
CAb1：包含HCV核心区氨基酸位置： 20-35aa
CAb2：包含HCV核心位区氨基酸置： 35-50aa
CAb3：包含HCV核心区氨基酸位置： 100-115aa
CAb4：包含HCV核心区氨基酸位置： 115-130aa
使用其中的CAb1、Cab2作为包被抗体，使用Cab3、CAb4作为酶标第二抗体。
3、根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于：抗体检测板的最佳制备条件为，使用包被单克隆抗体以最佳包被抗体浓度(CAb1：10ug/ml，CAb2：10ug/ml)，用0.05M，pH9.6碳酸盐缓冲液稀释，每孔加200μl于检测板孔内，置4℃，12小时。弃去包被液，用洗涤液充分洗涤各孔，每次300μl/孔，随之拍干。加入封闭液，220μl/孔，4℃封闭4小时，随后弃去封闭液拍干，室温干燥24小时。干燥后的酶联板，迅速真空封口包装，将封装好的板存于2-8℃。
4、根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于其酶结合物的制备方法为：取5mg HRP溶于1.0ml NaHCO3溶液，充分溶解HRP。加入适量0.06M NaIO4室温避光搅拌30分钟。移入透析袋，用0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液透析过夜。取纯化包被单抗(CAb1和CAb2)5mg，用0.01M的NaHCO3溶液充分溶解，与酶液混合，装入透析袋，用0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液4℃避光透析20小时，换液3次。取透析后结合液，加入0.4％NaBH4(按5mg HRP溶于0.2ml NaBH4溶液计)搅拌30分钟后，4℃放置4小时。将酶结合物装入透析袋，用PH7.2，0.01M的PBS透析48小时。Sephadex G-200凝胶过滤：将透析液上Sephadex G-200层析柱，用0.01M，PH7.2的PBS洗脱，收集第一个的洗脱峰，再用PEG2000浓缩，测量浓缩液体积后加等体积甘油，-20℃保存备用。
5、根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)酶联免疫诊断试剂盒，其特征在于：1)阳性对照的制备：从HCV感染者静脉采血后分离血清，经抗HCV-EIA抗体检测阴性；单项转氨酶高(大于40)，经HCV-RNA PCR法测定亦为阳性；经ortho抗原检测试剂(EIA)对比检测均为阳性，抗HIV、HBsAg均为阴性血清样品，HCV-C抗原检测为阳性。2)阴性对照的制备：选用正常献血员血清，经抗HCV-EIA检测为阴性、抗HIV、HbsAg及Tp亦为阴性正常人血清10份，其中包括较高本底的样品，加入0.02％的硫柳汞，除菌过滤后分装，-20℃保存。
6、根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)酶联免疫诊断试剂盒，其检测程序为：
1)取出试剂，15-30℃放置30分钟；每孔加100μl样品稀释液，然后再加入100μl待测样品；包被板均需留空白孔，阴、阳性对照孔。空白孔加入200μl样品稀释液，阴、阳性对照孔直接加入200μl阴、阳对照血清，混匀后37℃水浴振荡90分钟。
2)用1∶20稀释后的洗涤液洗板4次，最后一次拍干。
3)每孔加100μl酶结合物37℃水浴30分钟，剩余酶结合物4℃保存。
4)洗板同2)。
5)先加入显色剂A液50μl，再加入显色剂B液50μl，37℃水浴避光显色15-20分钟。
6)每孔加50μl终止液。终止后10分钟用酶标仪在450nm波长下读取每孔光吸收值(OD450nm)。
7)根据判定标准进行判定。
7、根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒核心抗原(HCV-core Ag)酶联免疫诊断试剂盒，其判定标准为：临界值(cut off值)＝阴性对照平均OD值+0.05＝0.118。阴性对照OD值≤0.06时按0.06计算；若＞0.06，则按实际OD值计算。凡待检标本OD值大于临界值即判为阳性。待检标本OD值小于临界值即判为阴性。
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