CN102043048A - Hcv抗原检测板及用该板检测hcv抗原的方法 - Google Patents
Hcv抗原检测板及用该板检测hcv抗原的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102043048A CN102043048A CN2010102954482A CN201010295448A CN102043048A CN 102043048 A CN102043048 A CN 102043048A CN 2010102954482 A CN2010102954482 A CN 2010102954482A CN 201010295448 A CN201010295448 A CN 201010295448A CN 102043048 A CN102043048 A CN 102043048A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hcv
- antigen
- hole
- detection
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种HCV抗原检测板及用该板检测HCV抗原的方法，将纯化的抗HCV多克隆抗体按常规稀释至5-50μg/ml，按50-200μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4℃过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按100-300μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，2-8℃过夜，洗板，晾干，2-8℃保存，得HCV抗原检测板；再用该HCV抗原检测板，并以长臂生物素标记的单(多)克隆HCV-IgG，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，或者用辣根过氧化物酶标记的单(多)克隆HCV-IgG作为放大系统，检测丙型肝炎病毒抗原。可减少检测步骤，缩短检测时间，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高检测灵敏度，是一种特异性高、灵敏度高，操作简便、快捷的丙型肝炎病毒抗原检测方法，为HCV感染的早期诊断、大规模快速筛查、定量检测等提供一条可靠的技术路径。
Description
技术领域
本发明涉及一种病毒抗原的检测方法，尤其是丙型肝炎病毒HCV抗原的检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
目前，丙型肝炎的检测方法主要有三类：
第一类是丙型肝炎抗体检测：其缺点是感染丙型肝炎病毒HCV后，有2～26周的潜伏期，一般到抗HCV抗体出现(转阳)有一个较长的窗口期，平均为70d，有的患者窗口期可延长至6-9个月或更长，约1-3％的患者抗HCV可持续阴性，在丙氨酸氨基转移酶升高后，抗HCV抗体才上升。由于窗口期的存在，对潜伏期和隐形感染者容易造成漏检，机体感染HCV后，在抗HCV抗体出现之前约2周左右，血循环中即可出现病毒颗粒，此时丙型肝炎病毒HCV的RNA经PCR方法检测可为阳性，血液具有感染性，而用抗体检测方法根本无法测出。另外该方法无法区分携带感染是急性期还是慢性期，或是既往感染痊愈后HCV抗体在体内的长期存在。此外，少数因免疫缺陷或免疫系统发育未成熟患者的HCV抗体检测表现为阴性，导致丙型肝炎病毒HCV感染者的漏检；由于厂家之间使用HCV基因重组抗原质量及各抗原片段包被比例的不同，各厂家试剂间的灵敏度和特异性存在着一定差异，从而导致抗HCV抗体检测结果不一致，易产生假阳性或漏检等情况。
第二类是丙型肝炎病毒HCV核酸检测：感染丙型肝炎病毒HCV后1-2周，血清中即可检测到HCV-RNA。因此，HCV核酸检测(HCV RT-PCR检测)可用于丙型肝炎的早期诊断，并且通过对病毒拷贝数的定量检测可对其临床疗效进行监测。HCV-RNA的存在是病毒复制的直接标志，提示血液中有HCV存在，可以缩短感染后血清阳转前的检测窗口期，以实现HCV感染的早期诊断，是诊断丙型肝炎病毒HCV的金标准。但是HCV-RNA在达到峰值或重新出现前数天或数周内偶尔也可能检测不到。在向慢性转化的大多数感染者中，HCV-RNA含量逐渐降低，最后趋于稳定，晚期肝病患者的HCV-RNA水平很低，甚至无法测出。HCV-RNA易被血细胞中的RNA酶降解，因此如果被检标本保存不当(例如反复冻融)将影响检测结果；HCV-RNA还受进食的影响，因食物中的某些成分易与血中脂质及脂蛋白结合，从而降低检出率。因此在一定程度上影响了核酸扩增检测方法的进一步完善。因为PCR法检测HCV-RNA影响因素较多，在样本收集、储存和检测方面都有严格的要求，并且PCR的检测操作过程复杂、费时，需要经过认证的PCR实验室和用特殊的检测仪器才能完成，且试剂盒价格昂贵，因此在一些基层实验室难以推广应用，在大量筛查献血者血液质量方面受到相当的局限。
第三类是丙型肝炎抗原检测：丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最为保守的部分编码而来，在HCV-RNA出现后的1～2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与HCV-RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。血清中HCV抗原的检测有利于HCV感染患者的早期发现，特别是某些免疫功能紊乱、免疫功能低下的患者和某些不产生抗体的携带者。有研究表明，HCV抗原检测与抗HCV抗体检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染者的献血的风险。与RT-PCR方法相比具有操作简便、时间短、对环境要求低的特点，在临床上可用于早期急性丙型肝炎诊断、抗HCV阳性感染者的病毒血症分析以及HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析。
根据文献检索，目前报道的丙型肝炎病毒HCV抗原检测法主要是使用单克隆抗体的双抗体夹心法，主要检测HCV核心抗原。该方法是以抗HCV核心抗原单克隆抗体作为固相包被物，用与固相包被物有不同抗原决定簇的抗HCV核心抗原单克隆抗体作为辣根过氧化物酶标记物这一系统。但由于HCV核心抗原是HCV结构区抗原的一部分，而血清中可存在游离的保守性相对较高非结构蛋白NS3，这可能是造成目前HCV抗原检出率低的原因之一。有文献报道，现有的HCV核心抗原检测试剂盒由于检出率较低尚不适合作临床丙型肝炎的筛选，但可作为HCV抗体检测的进一步验证，可部分替代HCV-RNA检测。
针对目前丙型肝炎病毒核心抗原检出率较低的现状，如果能对非结构区抗原进行联合检测，就有可能提高HCV抗原的检出率。
发明内容
为解决现有丙型肝炎病毒核心抗原检出率较低的问题，本发明提供一种灵敏度高，特异性好的HCV抗原检测板。
本发明的另一个目的是提供一种灵敏度高，特异性好，操作简便、快捷的用HCV抗原检测板检测丙型肝炎病毒抗原的方法，以应用于丙型肝炎病毒的科研、临床检验及对众多献血者的筛查。
本发明的第一个目的通过下列技术方案完成：一种HCV抗原检测板，其特征在于：将纯化的抗HCV多克隆抗体按常规稀释至5-40μl/ml，按100μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，2-8℃过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按150μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，4℃过夜，洗板，晾干，2-8℃保存，即得HCV抗原检测板。
所述纯化的抗HCV多克隆抗体经过下列方法制得：
A、抗HCV血清的制备
A1、取浓度为512-1024Eu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、C的等量混合液1-2ml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；
A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检测，效价未达1∶4000时，须进行加强免疫注射；
A3、当抗HCV血清效价大于1∶8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到抗HCV血清，-60℃以下保存待用；
B、抗HCV抗体的纯化
B1、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡液进行平衡；
B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至B1的蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体。
本发明所述HCV抗原检测板具体经过下列方法制得：
A、抗HCV血清的制备
A1、取浓度为512-1024Eu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、C的等量混合液1-2ml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；
A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检测，效价未达1∶4000时，须进行加强免疫注射；
A3、当抗HCV血清效价大于1∶8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到抗HCV血清，-60℃以下保存待用；
B、抗HCV抗体的纯化
B1、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡液进行平衡；
B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至B1的蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体；
C、HCV抗原检测板包被
C1、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用常规碳酸盐缓冲液稀释至5-50μg/ml，按50-300μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，2-8℃过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3-8次；
C2、在C1的聚苯乙烯板的孔中，按50-300μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白，以对检测板进行封闭，4℃过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3-8次，晾干，2-8℃保存备用，即得HCV抗原检测板。
本发明的第二个目的通过下列技术方案完成：用HCV抗原检测板检测丙型肝炎病毒抗原的方法，其特征在于经过下列步骤：
A、在所述的HCV抗原检测板的孔中，先加入样品缓冲液50-200μl/孔，再加入待检样品50-200μl/孔，同时加入抗原阳性、阴性对照各2-3孔，设空白调零孔1孔，之后放入湿盒中，37℃保温0.5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3-8次；
B、在A的检测板的孔中先加入生物素标记的HCV抗体使用液100-300μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3～8次；再在检测板的孔中加入常规辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液100-300μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3～8次；
或者
B1、在A的检测板的孔中加入辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液100-300μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3～8次；
C、在B或B1的检测板的孔中加入TMB显色液A、B液各50-200μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温5-30分钟，之后加入终止液，50-200μl/孔；
D、用波长为450nm的酶标仪对空白孔调零后，测吸光度(A)值；
E、结果判定：
阳性对照平均A值-阴性对照平均A值≥0.4时，表明检测成立，反之重试；Cutoff值＝阴性对照的平均A值×2.1，其中，阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值算；阴性对照的平均A值小于0.05按0.05算；样品A值≥Cutoff值，该样品判定为HCV抗原阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为HCV抗原阴性样品。
所述生物素标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：将常规长臂生物素用注射用水按常规溶解后，与常规HCV单克隆抗体按1∶10克分子比的比例混合；室温下放置30分钟，或2-8℃冰箱放置2小时后，用磷酸盐缓冲液PBS按常规透析过夜，加等量甘油，-20℃以下保存备用，得生物素标记的HCV抗体；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释生物素标记的HCV抗体至1∶500～1∶5000的体积浓度，得生物素标记的HCV抗体使用液。
所述辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：按照常规方法将常规多克隆HCV抗体与常规辣根过氧化物酶标记结合成辣根过氧化物酶标记的HCV抗体原液；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释辣根过氧化物酶标记的HCV抗体原液至1∶1000～1∶20000的体积浓度，得辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：采用上述方案，即用重组HCV抗原免疫动物后获得的纯化的抗HCV多克隆抗体包被聚苯乙烯微孔板，获得HCV抗原检测板，再用长臂生物素标记的单(多)克隆HCV-IgG，辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，或者用辣根过氧化物酶标记的单(多)克隆HCV-IgG作为放大系统，建立的丙型肝炎病毒抗原检测方法，可减少免疫检测中的步骤，缩短检测时间，并可通过降低交叉反应而降低背景，提高检测灵敏度，是一种特异性高、灵敏度高，操作简便、快捷的丙型肝炎病毒抗原检测方法，为HCV感染的早期诊断、大规模快速筛查、定量检测等提供一条可靠的技术路径。
表1给出了不同丙型肝炎检测方法的比较结果。
表1
从上表中可以看出，抗HCV抗体的检测由于窗口期较长，易造成对窗口期献血员的漏检；HCV核酸检测虽可反映病毒在体内的复制状况，且窗口期较短，仅有7-14天，但检测成本较高，操作繁琐，在技术和设备上要求较高，难以在常规工作或基层实验室推广，限制了普遍应用；HCV抗原检测窗口期比抗HCV抗体窗口期平均缩短49天，但现有技术中的常规HCV抗原检测，由于只使用HCV核心抗原单克隆抗体作为固相包被物，只能与核心抗原结合，血清中游离的核心抗原非常微量，且核心抗原被包膜蛋白包裹，影响抗原的检测，以上是造成现有技术中的HCV抗原检测法检出率很低的因素。HCV抗原包括多种蛋白(核心蛋白C、膜蛋白、非结构蛋白NS2、NS3、NS4及NS5)，核心蛋白及NS3在肝细胞胞浆中表达，可游离存在于血清中，其保守性相对较高，已广泛用于血清学诊断。另外，有些血清中可能含有一种或多种不同的抗原，有的抗原也因含量太低而不易测出，故阳性率较低。所以，多种抗原联合检测，可大大提高阳性检出率，这对减少输血后肝炎的发生有一定的价值。本发明采用多个高度保守区基因表达的重组抗原免疫家兔，获得了特异性的多克隆抗体，经PrintA/G亲和层析纯化后，其效价没有明显改变，其与HCAg的结合位点多。实验证明，使用抗多表位抗原的抗体作为固相包被物，不仅能与核心抗原结合，还可以识别HCV-C抗原、HCV-NS3抗原及HCV-NS5抗原表位，通过与生物素-亲和素酶(或辣根过氧化物酶)放大系统的有机结合，大大提高了检测的灵敏度和检出率。由于丙型肝炎病毒抗原检测法操作简便，并且可缩短血清学转换前的窗口期，对于提高窗口期感染者的检出率、提高输血和血制品的安全性都具有重要意义。
丙型肝炎是严重危害人类健康的传染病之一，其中有20％-30％的病人会发展为肝硬化，有将近一半的人会变为慢性肝炎，导致肝癌的比例远远超过其它型肝炎。目前全世界HCV感染者超过1亿人，其中我国占4000万，并且呈逐年升高之势。另外丙型肝炎病毒(HCV)感染人体后，至今还没有有效的疫苗问世，也没有特效的药物治疗，因此早期诊断仍是防止HCV传播的有效手段。本发明提供的丙型肝炎病毒抗原检测法与目前商售的“丙型肝炎病毒核心抗原检测法”相比，检测灵敏度明显提高，可提高窗口期的检出率。目前，市场上没有除HCV核心抗原检测试剂盒外的其他HCV抗原检测试剂盒(多表检测)。本发明在临床上有很好的应用前景，可利用此方法开发出1-2种多用途诊断试剂产品。
具体实施方式
实施例1
HCV抗原检测板的获得：
A、抗HCV血清的制备
A1、取浓度为512Eu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、C的等量混合液2ml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；
A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检测，效价未达1∶4000时，须进行加强免疫注射；
A3、当抗HCV血清效价大于1∶8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到抗HCV血清，-60℃以下保存待用；
B、抗HCV抗体的纯化
B1、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡液进行平衡；
B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至B1的蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体；
B3、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检测，同时用HCV分片段抗体试剂盒进行特异性检测，结果表明该纯化的抗HCV多克隆抗体能与HCV-NS3、HCV-NS5及HCV-C抗原特异性结合；
B4、用lowrry法测定纯化的抗HCV多克隆抗体蛋白含量为6.15mg/ml，能够满足酶联免疫(ELISA)检测试剂盒包被及酶标记的需要，将纯化的抗HCV多克隆抗体于-20℃以下保存备用；
B5、经纯化的IgG，效价为1∶8 000-1∶16 000，与纯化前基本一致，表明所选择的纯化方法对抗体活性损伤较小；
B6、条件试验筛选使用浓度在5-50μg/ml间；
C、HCV抗原检测板包被
C1、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用常规碳酸盐缓冲液稀释至5μg/ml，按100μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，2-8℃过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
C2、在C1的聚苯乙烯板的孔中，按150μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白，以对检测板进行封闭，2-8℃过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次，晾干，2-8℃保存备用，即得HCV抗原检测板。
实施例2
HCV抗原检测板的获得：
A、抗HCV血清的制备
A1、取浓度为1024Eu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、C的等量混合液1ml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；
A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检测，效价未达1∶4000时，须进行加强免疫注射；
A3、当抗HCV血清效价大于1∶8000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到抗HCV血清，-60℃以下保存待用；
B、抗HCV抗体的纯化
B1、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡30分钟，用5个柱体积的常规平衡液进行平衡；
B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至B1的蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱上，用10个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用10个柱体积的磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体；
B3、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度检测，同时用HCV分片段抗体试剂盒进行特异性检测，结果表明该纯化的抗HCV多克隆抗体能与HCV-NS3、HCV-NS5及HCV-C抗原特异性结合；
B4、用lowrry法测定纯化的抗HCV多克隆抗体蛋白含量为6.15mg/ml，能够满足酶联免疫(ELISA)检测试剂盒包被及酶标记的需要，将纯化的抗HCV多克隆抗体于-20℃以下保存备用；
B5、经纯化的IgG，效价为1∶8 000-1∶16 000，与纯化前基本一致，表明所选择的纯化方法对抗体活性损伤较小；
B6、条件试验筛选使用浓度在5-50μg/ml间；
C、HCV抗原检测板包被
C1、将B2所得纯化的抗HCV多克隆抗体用常规碳酸盐缓冲液稀释至20μg/ml，按100μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，4℃过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
C2、在C1的聚苯乙烯板的孔中，按150μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白，以对检测板进行封闭，2-8℃过夜，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次，晾干，2-8℃保存备用，即得HCV抗原检测板。
本发明提供的HCV检测板能与大肠杆菌表达的HCV-NS3、HCV-NS5及哺乳类动物细胞表达的HCV-C抗原特异性结合，表明有较好的免疫原性(见表2)。
表2 HCV多表位抗体与HCV-NS3、HCV-NS5及HCV-C抗原的免疫反应性
注：大肠杆菌表达的GM-CSF作为NS3和NS5的阴性对照，地鼠肾细胞表达的HBsAg作为C抗原的阴性对照
用本发明提供的HCV抗原检测板能识别人血清中的丙型肝炎抗原，并且这种识别能被HCV抗体阳性血清预先中和所阻断(取50μl样品+50μl 1∶640的抗HCV血清，37℃中和1h后检测，另取50μl样品+50μl PBS作为对照)，中和前后A值下降在56.83％-86.90％(见表3、表4)。
表3 HCV多表位抗体与人血清中HCV抗原的反应性(BA-ELISA))
表4 HCV多表位抗体与人血清中HCV抗原的反应性(ELISA)
实施例3
生物素标记的HCV抗体使用液的的制备：将常规长臂生物素用注射用水按常规溶解后，与常规HCV单克隆抗体按1∶10克分子比的比例混合；室温下放置30分钟，或4℃冰箱放置2小时后，用磷酸盐缓冲液PBS按常规透析过夜，加等量甘油，-20℃以下保存备用，得生物素标记HCV抗体；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白所构成的酶结液，稀释生物素标记的HCV抗体至1∶500～1∶2000的体积浓度，得生物素标记的HCV抗体使用液，4℃保存备用。
实施例4
辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液的的制备：
所述辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：按照常规的方法将多克隆HCV抗体与辣根过氧化物酶标记结合成辣根过氧化物酶标记的HCV抗体原液；用磷酸盐缓冲液PBS+2％体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释辣根过氧化物酶标记HCV抗体原液至1∶1000的体积浓度，得辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液，4℃保存备用。
实施例5
丙型肝炎病毒抗原的检测方法一(BA-ELISA)：
本实施例所用的待检样品为纯化的HCV多表位复合抗原和HCV-RNA诊断试剂国家参考品(批号701)，其中10份为HCV-RNA阳性样品，10份为HCV-RNA阴性样品。
1.将待检样品与实施例1的HCV抗原检测板及实施例3、实施例4及其它配套试剂从冰箱取出，室温平衡30分钟；
2.在1ml待检的纯化HCV多表位复合抗原样品中加入1mlPBS稀释液，混匀，即成2倍稀释样品；取2倍稀释样品1ml加入1mlPBS即成4倍稀释样品，依次对倍稀释至2048倍，得待检稀释样品；
3.用微量移液器在1步骤的HCV抗原检测板的孔中加入样品缓冲液50μl/孔，再加入2步骤的稀释后的HCV多表位复合抗原待检稀释样品及HCV-RNA诊断试剂国家参考品，50μl/孔，同时加入抗原阳性、阴性对照各2孔，50μl/孔，设空白调零孔1孔，放入湿盒中，37℃保温2小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
4.在3步骤的HCV抗原检测板的孔中加入实施例3的生物素标记的HCV抗体使用液，100μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
5.在4步骤的HCV抗原检测板的孔中加入市购的常规辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液100μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
6.在5步骤的HCV抗原检测板的孔中加入TMB显色液A、B液各50μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温10分钟；
7.在6步骤的HCV抗原检测板的孔中加入终止液，50μl/孔；
8.用波长为450nm的酶标仪对空白孔调零后，测吸光度(A)值见表5、表6。
表5
表6
9.结果判定：
阳性对照平均A值(1.696)-阴性对照平均A值(0.055)≥0.4，本次试验成立。
Cutoff值＝0.055×2.1＝0.116，(阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值算)。
按照若检测样品A值≥Cutoff值，则检测样品判定为HCV阳性样品，若检测样品A值＜Cutoff值，则检测样品判定为HCV阴性样品的原则，本次检测的样品1∶2-1∶1024稀释度均为阳性，1∶2048为阴性，故该HCV多表位复合抗原效价检测为1∶1024
本次检测的10份HCV-RNA阳性样品用本发明方法检测有9份阳性，1份阴性：10份HCVRNA阴性均全部为阴性。
实施例6
丙型肝炎病毒抗原的检测方法二(ELISA)：
本实施例所用的待检样品与实施例5的样品相同。
1.与实施例5中的步骤1相同；
2.与实施例5的步骤2相同；
3.与实施例5的步骤3相同；
4.在3步骤的HCV抗原检测板的孔中加入实施例4的辣根氧化物酶标记的HCV抗体使用液，100μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板5次；
5.与实施例5中的步骤6相同；
6.与实施例5中的步骤7相同；
7.用波长为450nm的酶标仪对空白孔调零后，测吸光度(A)值见表7、表8；
9.结果判定：
阳性对照平均A值(1.890)-阴性对照平均A值(0.056)≥0.4，本次试验成立。
Cutoff值＝0.056×2.1＝0.118，(阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值算)。
按照若检测样品A值≥Cutoff值，则检测样品判定为HCV阳性样品，若检测样品A值＜Cutoff值，则检测样品判定为HCV阴性样品的原则，本次检测的样品1∶2-1∶1024稀释度均为阳性，1∶2048为阴性，故该HCV多表位复合抗原效价检测为1∶1024
本次检测的10份HCV-RNA阳性样品用本发明方法检测有9份阳性，1份阴性：10份HCVRNA阴性均全部为阴性。
溶液配方
1.PBS储液
磷酸氢二钠 58g
磷酸二氢钾 4g
氯化钠 160g
加注射用水至1000ml。
2.磷酸盐缓冲液PBS：将PBS储液作20倍稀释即可。
3.碳酸盐缓冲液
无水碳酸钠 1.6g
碳酸氢钠 2.93g
加注射用水至1000ml。
4.终止液
浓硫酸54ml
加注射用水至500ml。
6.TMB显色液-A液
TMB 50mg
二丙基亚砜50ml
加注射用水50ml。
7.TMB显色液-B液
醋酸钠 6g
醋酸 0.2ml
双氧水 2.5ml
加注射用水至50ml。
8.样品缓冲液
Triton 0.1-5ml
PBS 85-99ml
小牛血清 1-15ml
表7
表8
Claims (5)
1.一种HCV抗原检测板，其特征在于：将纯化的抗多表位HCV多克隆抗体按常规稀释至5-50μg/ml，按50-200μl/孔的量加入到聚苯乙烯板的孔中，2-8℃过夜，洗板；再在聚苯乙烯板的孔中，按100-300μl/孔的量加入常规牛血清白蛋白封闭检测板，2-8℃过夜，洗板，晾干，2-8℃保存，即得HCV抗原检测板。
2.如权利要求1所述的HCV抗原检测板，其特征在于所述纯化的抗HCV多克隆抗体经过下列方法制得：
A、抗HCV血清的制备：
A1、取浓度为512-1024Eu/ml的四个高度保守区基因表达的重组HCV抗原NS3、NS4、NS5、C的等量混合液1-10ml，对猴、兔或其它适宜动物进行免疫注射；
A2、分别在2、3、4周采血，用常规丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒进行HCV抗体效价检测，效价未达1∶4000时，须进行加强免疫注射；
A3、当抗HCV血清效价大于1∶4000时，通过颈动脉采血，按常规方法制备血清，得到抗HCV血清，-20℃以下保存待用；
B、抗HCV抗体的纯化：
B1、取蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱，室温平衡10-60分钟，用2-10个柱体积的常规平衡液进行平衡；
B2、将上述A3所得抗HCV血清与常规平衡液进行等体积混合后上样至B1的蛋白A或蛋白A/G亲和层析柱上，用5-20个柱体积的常规平衡液洗脱杂蛋白；再用5-20个柱体积的磷酸盐缓冲液PBS将目的蛋白从亲和层析柱上洗脱下来，收集洗脱峰，用磷酸盐缓冲液PBS透析过夜，收集透析液，即得纯化的抗HCV多克隆抗体。
3.一种用权利要求1所述HCV抗原检测板检测丙型肝炎病毒抗原的方法，其特征在于经过下列步骤：
A、在权利要求1所述的HCV抗原检测板的孔中，先加入样品缓冲液50-200μl/孔，再加入待检样品50-200μl/孔，同时加入抗原阳性、阴性对照各2-3孔，设空白调零孔 1孔，之后放入湿盒中，37℃保温0.5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3-8次；
B、在A的检测板的孔中先加入生物素标记的HCV抗体使用液100-300μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3-8次；再在检测板的孔中加入常规辣根过氧化物酶标记链霉亲和素使用液100-300μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3～8次；
或者
B1、在A的检测板的孔中加入辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液100-300μl/孔，放入湿盒中，37℃保温0.5-3小时，用磷酸盐缓冲液PBS洗板3～8次；
C、在B或B1的检测板的孔中加入TMB显色液A、B液各50-100μl/孔，混匀，放入湿盒中，37℃保温5-30分钟，之后加入终止液，50-200μl/孔；
D、用波长为450nm的酶标仪对空白孔调零后，测吸光度(A)值；
E、结果判定：
阳性对照平均A值-阴性对照平均A值≥0.4时，表明检测成立，反之重试；Cutoff值＝阴性对照的平均A值×2.1，其中，阴性对照的平均A值大于0.05，按实际值算；阴性对照的平均A值小于0.05按0.05算；样品A值≥Cutoff值，该样品判定为HCV抗原阳性样品，样品A值＜Cutoff值，为阴性，该样品判定为HCV抗原阴性样品。
4.如权利要求3所述的检测丙型肝炎病毒抗原的方法，其特征在于所述生物素标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：将常规长臂生物素用注射用水按常规溶解后，与常规HCV单(多)克隆抗体按1∶10克分子比的比例混合；室温下放置30分钟，或4℃冰箱放置2小时后，用磷酸盐缓冲液PBS按常规透析过夜，加等量甘油，-20℃以下保存备用，得生物素标记的HCV抗体；用磷酸盐缓冲液PBS+1％-4％体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释生物素标记的HCV抗体至1∶500-1∶2000的体积浓度，得生物素标记的HCV抗体使用液。
5.如权利要求3所述的检测丙型肝炎病毒抗原的方法，其特征在于所述辣根过氧化物酶标记的HCV抗体使用液经过下列方法获得：按常规方法将单(多)克隆HCV抗体 与辣根过氧化物酶标记结合成辣根过氧化物酶标记HCV抗体原液；用磷酸盐缓冲液PBS+1％-4％％体积比的牛血清白蛋白酶结液稀释辣根过氧化物酶标记HCV抗体原液至1∶1000-1∶20000的体积浓度，得辣根过氧化物酶标记HCV抗体使用液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102954482A CN102043048A (zh) | 2010-09-29 | 2010-09-29 | Hcv抗原检测板及用该板检测hcv抗原的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010102954482A CN102043048A (zh) | 2010-09-29 | 2010-09-29 | Hcv抗原检测板及用该板检测hcv抗原的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102043048A true CN102043048A (zh) | 2011-05-04 |
Family
ID=43909390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010102954482A Pending CN102043048A (zh) | 2010-09-29 | 2010-09-29 | Hcv抗原检测板及用该板检测hcv抗原的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102043048A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103293299A (zh) * | 2012-02-24 | 2013-09-11 | 上海新波生物技术有限公司 | 拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒 |
Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993004089A1 (en) * | 1991-08-21 | 1993-03-04 | Abbott Laboratories | Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens from ns5 region |
| WO2003002749A2 (en) * | 2001-06-26 | 2003-01-09 | Abbott Laboratories | Methods for the simultaneous detection of hcv antigens and hcv antibodies |
| CN1502991A (zh) * | 2002-11-27 | 2004-06-09 | 虹 王 | 血清丙型肝炎抗原（HCV Ag）定量ELISA检测技术 |
| CN1877330A (zh) * | 2005-06-10 | 2006-12-13 | 湖南景达基因有限公司 | 丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒及其制备方法 |
| EP1978365A1 (en) * | 2007-03-16 | 2008-10-08 | Sysmex Corporation | Reagent kit and method for measuring HCV antibody |
| CN101419238A (zh) * | 2008-12-04 | 2009-04-29 | 山东莱博生物科技有限公司 | 丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒 |
| CN101458256A (zh) * | 2007-12-14 | 2009-06-17 | 武汉大学 | 丙型肝炎病毒包膜抗原elisa试剂盒及检测方法 |
| EP1939626B1 (en) * | 2005-09-12 | 2009-12-30 | Japan Science and Technology Agency | Method of quickly detecting antigen using fluorescence correlation spectroscopy or fluorescence cross-correlation spectroscopy |
| CN101694495A (zh) * | 2009-10-21 | 2010-04-14 | 北京市卫生局肝炎研究所 | 有丙肝ns3单克隆抗体的超顺磁性复合微球及制备方法 |
| CN101762694A (zh) * | 2009-06-24 | 2010-06-30 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测hcv抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 |
-
2010
- 2010-09-29 CN CN2010102954482A patent/CN102043048A/zh active Pending
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993004089A1 (en) * | 1991-08-21 | 1993-03-04 | Abbott Laboratories | Hepatitis c assay utilizing recombinant antigens from ns5 region |
| WO2003002749A2 (en) * | 2001-06-26 | 2003-01-09 | Abbott Laboratories | Methods for the simultaneous detection of hcv antigens and hcv antibodies |
| CN1502991A (zh) * | 2002-11-27 | 2004-06-09 | 虹 王 | 血清丙型肝炎抗原（HCV Ag）定量ELISA检测技术 |
| CN1877330A (zh) * | 2005-06-10 | 2006-12-13 | 湖南景达基因有限公司 | 丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫诊断试剂盒及其制备方法 |
| EP1939626B1 (en) * | 2005-09-12 | 2009-12-30 | Japan Science and Technology Agency | Method of quickly detecting antigen using fluorescence correlation spectroscopy or fluorescence cross-correlation spectroscopy |
| EP1978365A1 (en) * | 2007-03-16 | 2008-10-08 | Sysmex Corporation | Reagent kit and method for measuring HCV antibody |
| CN101458256A (zh) * | 2007-12-14 | 2009-06-17 | 武汉大学 | 丙型肝炎病毒包膜抗原elisa试剂盒及检测方法 |
| CN101419238A (zh) * | 2008-12-04 | 2009-04-29 | 山东莱博生物科技有限公司 | 丙型肝炎病毒核心抗原化学发光酶联免疫检测试剂盒 |
| CN101762694A (zh) * | 2009-06-24 | 2010-06-30 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 一种检测hcv抗体的磁性免疫层析试纸条及其制备方法 |
| CN101694495A (zh) * | 2009-10-21 | 2010-04-14 | 北京市卫生局肝炎研究所 | 有丙肝ns3单克隆抗体的超顺磁性复合微球及制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 杨蓉，等: "Protein A/G亲和层析在HCV抗体纯化中的应用效果", 《医学研究杂志》 * |
| 谢忠平,等: "利用HCV多表位符合抗原制备高效价抗体", 《中国生物制品学杂志》 * |
| 谢忠平,等: "抗-HCV 多表位抗体在检测HCV抗原中的应用", 《中国生物制品学杂志》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103293299A (zh) * | 2012-02-24 | 2013-09-11 | 上海新波生物技术有限公司 | 拓宽双抗体夹心免疫检测浓度范围的方法及其试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102072957B (zh) | 丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法 | |
| CN101738473B (zh) | 梅毒螺旋体抗体诊断试剂盒及其制备方法 | |
| JP3408793B2 (ja) | ウイルスの検出又は測定方法 | |
| Li et al. | Development of a convenient immunochromatographic strip for the diagnosis of infection with Japanese encephalitis virus in swine | |
| CN110927390A (zh) | 一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法、试剂盒及应用 | |
| Parida et al. | The application of new techniques to the improved detection of persistently infected cattle after vaccination and contact exposure to foot-and-mouth disease | |
| CN102731615A (zh) | Prrsv的检测试剂和检测方法 | |
| Ying et al. | Urine is a viral antigen reservoir in hepatitis E virus infection | |
| CN105675866A (zh) | 用于检测o型fmdv抗体的固相阻断elisa试剂盒 | |
| CN102236021A (zh) | 人类免疫缺陷病毒抗体时间分辨免疫荧光分析法及试剂盒 | |
| CN101393217A (zh) | 一种原发性肝癌血清标志物的检测试剂盒 | |
| CN109374887A (zh) | 牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金检测试剂盒及其应用 | |
| CN104407143A (zh) | 一种丙型肝炎病毒抗原-抗体联合检测试剂盒 | |
| US6723502B2 (en) | Hepatitis C antigen—antibody combination assay for the early detection of infection | |
| CN104280551A (zh) | 鸭坦布苏病毒病e-elisa检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN101609097A (zh) | Ev71中和抗体的竞争酶联免疫检测方法、试剂盒或试剂及其制备方法 | |
| CN101738474B (zh) | 一种巨细胞病毒、风疹病毒联合检测试剂检测卡 | |
| CN109682980B (zh) | 一种检测口蹄疫病毒o型保护性抗体的试剂盒和检测方法 | |
| CN102043048A (zh) | Hcv抗原检测板及用该板检测hcv抗原的方法 | |
| CN102181438A (zh) | 一种核苷酸检测序列及其检测方法 | |
| Shehat et al. | Recombinant expression of the alternate reading frame protein (ARFP) of hepatitis C virus genotype 4a (HCV-4a) and detection of ARFP and anti-ARFP antibodies in HCV-infected patients | |
| CN109613249A (zh) | 一种森林脑炎病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN102778565A (zh) | 1型登革热快速金标诊断试纸条 | |
| CN101556284B (zh) | 甲型肝炎病毒抗原检测方法 | |
| CN105974115A (zh) | 一种丙型肝炎病毒抗体时间分辨检测试剂盒及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110504 |