CN102181438A - 一种核苷酸检测序列及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种丙肝病毒的荧光定量型生物条形码，检测试剂盒，及其检测方法。所述生物条形码为DNA寡聚核苷酸链，其序列为：5′-CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3′。丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂盒，包括：包被有HCVcAg单抗的MMP探针，以及包被有HCVcAg多抗的NP探针。所述与NP探针联结的条形码DNA寡聚核苷酸链具有如权利要求1所述的核苷酸序列，互补探针NP链具有如下的核苷酸序列：5′-GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A₁₀-(CH₂)₆-SH-3′。本发明在丙肝病毒的检测及原料血浆的检验检疫领域中具有较大的实际意义，应用前景广阔。

Description

一种核苷酸检测序列及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域中病毒的检测方法，特别是丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法。

背景技术

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是全球关注的公共卫生难题，目前全球约有1.7亿人感染HCV，我国进行的全国HCV血清流行病学调查显示，我国一般人群抗-HCV阳性率约为3.2％，全国共约4000万人感染HCV，HCV是造成慢性肝炎、肝硬化及肝癌的重要原因之一。约50％-80％的HCV感染者会转变为慢性感染患者，而大约20％的患者会在20年内转变为肝硬化。一旦转为肝硬化，每年将会有1％-5％的病人发展成为肝癌，严重地威胁着人类的健康。

如图1所示，为HCV基因结构图。HCV属黄病毒科丙型肝炎病毒属，为单股正链RNA病毒，基因组全长9.6kb，含有一个开放的编码区，可编码一个多聚蛋白前体，由宿主和病毒的信号肽酶剪接成3个结构蛋E1(Core、E1、E2)和7个非结构蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。HCV C蛋白由191个氨基酸残基组成，是HCV基因组中较为保守的结构区域。5′UTR区最为保守，而3′UTR对于HCV RNA的正常复制是不可缺少的。

肝脏是HCV的主要存在场所。HCV是嗜肝病毒，主要在肝内复制，每克感染肝组织HCV RNA含量高于每毫升血清的10²至10⁴拷贝，HCV血症水平与肝组织中HCV复制活跃程度相关。因此，检测肝组织HCV RNA含量更能准确反映HCV在人体内的复制程度。HCV感染不但侵袭肝脏组织，而且侵袭体内各种肝外组织和器官，还能并发各种与丙肝病原学无关的疾病。有文献报道在丙型肝炎患者的肾、心、胰、肠、精液、唾液、乳液、尿液、汗液中均检出HCV。骨髓及外周血单个核细胞是T、B淋巴细胞、单核细胞及自然杀伤细胞等免疫活性细胞组成的集合体，在清除HCV感染和HCV持续感染过程中扮演双重角色。HCV感染早期，PBMC发挥着呈抗原、清除病毒作用，HCV持续感染期又可能成为病毒潜伏、复制的肝外场所。人体难以清除HCV的一个主要原因是其具有高度异质性，即HCV通过自身的变异达到逃避机体免疫监视的目的。在HCV RNA阳性者中，骨髓PBMC中HCV阳性率为36.4％，B细胞阳性率为27.2％，T细胞阳性率也为27.2％；外周血中也基本与骨髓中细胞阳性率相近，只是T细胞阳性率比较低0.9％)。血浆(或血清)中的HCVRNA的含量与肝组织HCV RNA呈正相关(r＝0.85，P＜0.01)。目前临床上大多采用血浆(或血清)HCV RNA定量检测，可直接反映丙型肝炎的病毒血症水平，对预测和评价干扰素治疗效果有重要作用。

现在HCV的实验室检测主要包括抗-HCV的检测和HCV-RNA的检测。抗-HCV的检测是最早出现的HCV检测技术，其检测方法包括间接酶联免疫吸附实验(间接ELISA)、双抗原夹心ELISA、重组免疫印迹法(RIBA)、免疫层析法以及蛋白芯片检测法。其中重组免疫印迹法(RIBA)是抗体检测的金标准，而ELISA是应用最广的抗体检测技术。现在广泛使用的是第三代抗-HCV ELISA检测试剂。

第三代抗-HCV ELISA检测试剂大多采用间接ELISA，特异性94％-100％，但由于丙肝患者“窗口期”的存在，仍有一定的漏检率。

HCV-RNA的检测由于HCV RNA的检测即是检测HCV病毒本身，故认为HCV RNA阳性即提示血中有HCV存在，是HCV确诊的标志。在血清ALT升高时和HCV抗体产生前检出血中HCV RNA。有利于HCV感染的早期诊断，如经治疗后阴转，则是治疗有效的标志，因此开展HCV RNA检测具有重要意义。

感染者在感染2个星期内血清中可检测到HCV RNA，在感染自然恢复前血清中HCV RNA将达到一个高峰，但HCV RNA在达到峰值或重新出现前数天或数周内偶尔也可能检测不到。在大多数向慢性转化的感染者中，HCV RNA含量降低速度逐渐减慢，最后趋于稳定，晚期肝病患者的HCVRNA水平很低，甚至无法测出，HCV RNA易被血细胞中的RNA酶降解，因此如果被检标本保存不当(例如反复冻融)将影响检测结果；HCV RNA还受进食的影响，易与血中脂质及脂蛋白结合，降低检出率。因此在一定程度上影响了NAT检测。

近年来发展的HCV核心抗原定性检测方法表明，外周血中HCV核心抗原和HCV RNA有良好的相关性，HCV核心抗原(HCVcAg)特异性99.5％，敏感性94.5％，可以明显地缩短HCV窗口期，适用于HCV感染的普查。对HCV感染者定量检测HCV核心抗原可以准确反映HCV复制情况。在丙肝的诊断中HCV RNA和/或HCV核心抗原可能有互补的作用。联合应用这两种标志物可以提高对丙肝病人的病毒血症和病毒复制的诊断率。在慢性丙肝抗病毒治疗中，干扰素持续应答与HCV核心抗原低于检测水平、HCV RNA国际单位降低2个对数单位以上有显著相关性。在单剂干扰素或联合治疗持续病毒学应答中，治疗1月后，83.2％HCV核心抗原低于检测水平，HCV RNA国际单位降低2个对数单位以上，近年发展起来的HCV核心抗原检测有可能在一定程度上替代核酸的检测。由于HCV核心抗原检测相对HCV RNA费用较低，可能更有利于丙肝病人抗病毒治疗效果的监测。

综上所述，建立高灵敏度丙肝病毒核心抗原检测技术，以及研制相应的检测试剂变得很迫切。

生物条形码检测技术(bio-bar codes assay，BCA)是美国西北大学Mirkin教授领导的课题组于2003年首次报道的一种新型标记免疫测定技术，其突出特点是具有极高的灵敏度，可达常规ELISA方法的10⁶倍。

如图2所示，普通生物条形码检测示意图。图中表示，BCA技术的基本原理是利用被检物单抗标记的磁性微球探针(magnetic microparticles，MMPs)和被检物多抗及特异DNA双链标记的金纳米颗粒探针(nanoparticle，NP)，通过形成MMP-被检物-NP三明治复合物后再利用去杂交将NP探针上标记的特异DNA链释放出来，通过常规PCR方法或芯片检测方法(金标银染法)鉴定这些释放的DNA链就可确定被检物的存在。

NP探针即是金纳米颗粒包被有双链DNA和抗被检物的多克隆抗体，双链DNA其中的一条和胶体金颗粒通过Au-S键相连，另一条和前者互补是用来指示被检物的条形码DNA；MMP探针即是对应于分选磁场的直径约为1μm的磁性微球探针，其表面包被有抗被检物的单克隆抗体。

从BCA技术的检测程序可以看出，其基本原理几乎等同于ELISA检测中双抗体夹心法高度特异地捕获抗原(被检物)，通过检测条形码DNA而实现对被检物的间接检测，由于PCR反应和芯片检测的放大效应，使检测灵敏度得到极大提高。

生物条形码检测过程可以分为条形码DNA的获取和条形码DNA的检测两大方面。条形码DNA的获取过程包括三步，第一步：抗原抗体作用。先用抗被检物的单抗功能化的MMP探针特异性地结合标本中可能的被检物，加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的被检物和不相关的杂质；第二步：洗脱和去杂交。加入被双链DNA和抗被检物的多抗修饰的NP探针，将被检物夹在中间，形成一个三明治结构，接着加上磁场，用磁铁固定MMP探针的同时，反复冲洗，除去未连接的NP探针；第三步：DNA分离。此步是一个去杂交步骤，三明治结构被磁场固定，在高温低盐条件下，NP探针上结合的数以百计的条形码DNA释放到溶液中，接着对条形码DNA链进行定量，从而间接检测被检物。条形码DNA链的检测现在有两种方式：一是对获取的条形码DNA链作普通的PCR扩增，然后凝胶电泳检测；二是通过芯片检测，芯片检测系统需要三种不同作用的核酸：1)与固相支持物(玻片等)连接的捕获探针(捕获DNA修饰的玻片)；2)产生信号的检测探针(DNA修饰的胶体金)；3)靶核酸(条形码DNA)，靶核酸在这个体系中起连接捕获探针和信号检测探针的作用。如体系中存在上述三种成分，靶核酸能与上述两种核苷酸杂交，洗脱去除杂质后能得到一个清晰的检测信号，如果靶核酸不与上述两种探针杂交，则信号探针无法连接在固相物上，洗脱后固相物上无信号应答，得到的信号可以用普通的平板扫描仪进行分析。

BCA技术已在某些病原标志物的检测上取得了很好的进展。Nam等人首先利用BCA技术对前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)进行了检测，利用BCA技术检测PSA的检测下限可达3a mol/L，检测下限比现有的传统ELISA方法低6个数量级；Georganopoulou等人利用BCA技术对β-淀粉样蛋白源性播散性配基(amyloid β-derived diffusible ligands，ADDL)进行了检测，其检测极限能在15μL脑脊液中检测到50个ADDL分子；Stoeva等人利用BCA技术对血清中的三种肿瘤标志物PSA、人体绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)和α胎儿球蛋白(α-fetoprotein，AFP)进行了联合检测，检测结果显示检测限度可达170f mol/L。

综上所述，BCA技术与现代标记免疫检测技术的金标准——ELISA技术相比，具有非常显著的优点，具体表现在以下几个方面：1)BCA技术显示了比常规的ELISA方法高出六个数量级(100万倍)的敏感性；2)针对不同的被检物设计不同长度和序列的条形码DNA，可分析复杂样本中的多种物质；3)具有较高的特异性，其特异性决定于检测系统使用的单克隆抗体的特异性，只要使用高特异的抗目标检物的单克隆抗体就能保证检测系统的高特异性；4)检测范围广，只要被检物具有单抗和多抗，就可对其进行检测，这使得它在检测一些不适宜用PCR技术检测的微量物质方面具有很大的优势。

但是，从BCA技术检测的过程和显示体系可以看出，这种技术存在着明显的缺陷，主要体现在对条形码DNA的检测上，具体有：1)传统的PCR检测是应用终点PCR来定量样品中模板的量，通常用凝胶电泳分离，并用荧光染色来检测PCR反应的最终扩增产物。但在PCR反应中，由于模板、试剂、焦磷酸盐分子的聚集等因素影响聚合酶反应，最终导致PCR反应不再以指数形式进行而进入“平台期”，一些反应的终产物比另一些要多，因此终点PCR反应方法定量不准确；其次终点PCR容易交叉污染，产生假阳性；2)条形码DNA的芯片检测由于银染试剂自身的缺点而易产生假阳性，阴阳性不易界定，染色结果因时间、环境因素变化很大；3)PCR检测体系和芯片检测体系都不能对被检物进行有效定量，这与现今免疫检测技术的发展要求及发展方向——不但能定性，而且能定量相比是落伍的，因此对常规BCA技术进行改进使之能克服上述缺点并能对被检物确切定量就显得很重要。

我们设想，将BCA技术与实时荧光定量PCR(Real-time fluorescentquantitative PCR，FQ-PCR)技术结合，在分析优化关键数据基础上，建立荧光定量型生物条形码检测技术即可克服上述缺陷和不足。

FQ-PCR技术创立于1996年，由美国Applied Biosystems公司推出，是一种在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。FQ-PCR技术是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。FQ-PCR技术融合PCR技术和DNA探针杂交技术的优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化使PCR的扩增及其分析过程均在同一封闭系统下完成，并在电脑分析软件支持下实现对PCR扩增产物的动态监测和自动定量，其特点主要有以下几个方面：1)定量原理独特，用产生荧光信号的多少来显示扩增产物的量，动态实时连续荧光监测，具有很好的可视性；2)荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大地提高了检测的灵敏度、特异性和精确性；3)只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速；4)结果重现性好，定量动态范围高达五个数量级。FQ-PCR作为PCR技术的发展，自1996年已来，在科研及临床诊断的许多领域显现出它的优越性，现在已广泛应用于生物学、基础医学、疾病诊断、食品、水质环保、药物开发等领域，被认为是核酸定量的金标准。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种核苷酸检测序列及其检测方法。本发明成功地将荧光定量PCR技术和普通生物条形码检测方法有机结合起来用于HCV的检测，为HCV的诊断提供可靠保障，提供了一种灵敏度较高的丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种丙肝病毒的荧光定量型生物条形码，所述生物条形码为DNA寡聚核苷酸链，其序列为：

5′- CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTT

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂盒，包括：包被有HCVcAg单抗的MMP探针，以及包被有HCVcAg多抗的NP探针。

所述与NP探针联结的条形码DNA寡聚核苷酸链优选为：具有如权利要求1所述的核苷酸序列；互补探针NP链优选为：具有如下的核苷酸序列：

5′-GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A₁₀-(CH₂)₆-SH-3′。

所述试剂盒可以进一步包括进行荧光定量PCR检测的引物1和引物2，其序列分别为：

引物1：

5′-CGCATTCAGGATTGCATGAC-3′；

引物2：

5′-CAAGACGAGTGCAATCATGC-3′。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法，是以丙肝病毒核心抗原作为检测对象进行的荧光定量型生物条形码检测方法。

所述检测方法中使用的MMP探针可以包被有HCVcAg单抗，NP探针可以包被有HCVcAg多抗。

所述对丙肝病毒进行荧光定量型生物条形码检测的条形码DNA链可以具有如权利要求1所述的核苷酸序列，互补探针NP链可以具有如权利要求3所述的核苷酸序列。

所述丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法可以包括以下步骤：

1)NP探针的制备：用金纳米颗粒、HCVcAg多抗、所述互补探针NP链和所述条形码DNA链制备NP探针；

2)MMP探针的制备：用磁性微球和HCVcAg单抗制备MMP探针；

3)丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测：利用NP探针、MMP探针和丙肝病毒通过抗原、抗体作用制备NP-HCVcAg-MMP三明治复合物，然后在高温低盐条件下，释放条形码DNA链，最后对获得的条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测。

所述步骤1)中可以用柠檬酸三钠还原法制备金纳米颗粒，金纳米颗粒的直径为30nm；

所述步骤2)中磁性微球的直径可以为1um；

所述步骤1)和步骤2)中还可以包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。

所述方法也可以包括以下步骤：

a.寡核苷酸链的合成：

合成所述丙肝病毒荧光定量型生物条形码检测方法中所用的寡核苷酸链，序列如下：

条形码DNA链：长度为100bp；

5′- CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3′；

互补probe NP链：

5′-GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A₁₀-(CH₂)₆-SH-3′，长度为30bp；

引物1：

5′-CGCATTCAGGATTGCATGAC-3′；

引物2：

5′-CAAGACGAGTGCAATCATGC-3′；

b.金纳米颗粒的制备：

选择使用直径30nm的金纳米颗粒，利用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒：取500mL 0.01％HAuCl₄溶液在搅动的情况下加热至沸腾后迅速准确加入7.5mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min，整个过程始终用磁力搅拌器进行搅拌；当溶液的颜色渐渐加深，最后为深紫红色，停止加热；将制备好的纳米金用0.45μm的尼龙膜过滤，冷却至室温，放置于4℃避光保存；

c.抗HCVcAg蛋白的多克隆抗体的制备；

d.金纳米颗粒-HCVcAg多抗复合物的制备：

分别取1mL的金纳米颗粒和HCVcAg多抗，用0.1mol/L K₂CO₃调节至pH9.0；在搅拌下将金纳米颗粒和抗体混合，10min后加入5％BSA，使其最终浓度为1％；或加入1％聚乙二醇(PEG，分子量20kD)至标记物总量的1/10，以防止抗体蛋白和金纳米颗粒的聚合和发生沉淀；

e.NP探针的制备、纯化：

将终浓度为2μmol/L的互补探针NP链加入被HCVcAg多抗修饰的金纳米颗粒(浓度为4.5hmol/L)中，室温放置16小时；再以磷酸盐缓冲液调整pH至7.0，增强离子浓度至0.1mol/L NaCl，室温放置40小时，10000g离心30min得到含互补探针NP链修饰的金纳米颗粒；得到的深红色沉淀用0.1M NaCl，10mM PBS(pH7.0)溶液洗涤3次，去除未标记的金纳米颗粒；将条形码DNA链(终浓度为2μmol/L)加入上述标记有互补探针NP链修饰的金纳米颗粒中，室温杂交4小时，14,000g离心30分钟，得到NP探针；

f.HCVcAg单抗的制备；

g.MMP探针的制备、纯化：

将100μgHCVcAg单抗溶于20mL PBS中，将其加入到激活的磁珠中，剧烈振荡，然后将烧瓶置于混合器上反应16～24小时；磁性分离，弃去上清；在40mL PBS中重悬磁珠；加入20mL甘氨酸，剧烈振荡，将其放在混合器上反应30min；磁性分离，弃去上清；用PBS洗3次，磁性分离；用50mL洗液重悬磁珠，4℃保存；

h.丙肝病毒荧光定量型生物条形码检测方法的建立：

将50μL抗HCVcAg蛋白的单抗功能化的磁性微球(5mg/mL)加入10μL已知浓度的HCVcAg蛋白或丙肝阳性病毒中，37℃下剧烈震荡1小时；加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗；加入被双链DNA和抗HCVcAg蛋白的多抗修饰的0.1nmol/L金纳米颗粒探针50μL，剧烈震荡30分钟，形成三明治结构；加上磁场，在用磁铁固定MMPs的同时，用500μL的PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针；加入50μL超纯水到三明治结构中，60℃剧烈震荡30分钟，使条形码DNA链去杂交；三明治复合物被磁性分离，收集上清液，内含条形码DNA链，用于定性定量检测；

i.条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测：

对获得的条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测，反应条件如下：

引物1：

5′-CGCATTCAGGATTGCATGAC-3′；

引物2：

5′-CAAGACGAGTGCAATCATGC-3′。

本发明丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法，是以丙肝病毒核心抗原(HCVcAg)为检测对象的灵敏度较高(可达100fg/mL)的检测方法。本发明与现有技术相比具有以下有益的技术效果：

1、首次建立了丙肝病毒的荧光定量生物条形码检测方法，利用此检测方法可以对肝脏、血液、细胞培养物等中的丙肝病毒进行高灵敏检测。

2、本检测方法与丙肝病毒的其它常规检测方法如检测抗-HCV或检测HCV RNA相比，具有相当高的灵敏度，检测灵敏度是常规ELISA方法的104倍。

3、本检测方法与丙肝病毒的其它常规检测方法如检测抗-HCV或检测HCVRNA相比，具有相当高的特异性，只要使用高特异的抗丙肝病毒核心抗原的单克隆抗体就能保证检测方法的高特异性。

4、本检测方法为研制丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂奠定了基础。

5、本检测方法为其它类似的被检物，尤其是那些不适于建立核酸检测方法的微量物质如毒素、生物战剂、脂类、维生素、肿瘤特异性标志物等的检测提供了新方法，对被检物建立类似检测体系起到了良好的借鉴作用。

综上所述，本发明在丙肝病毒的检测及原料血浆的检验检疫领域中具有较大的实际意义，应用前景广阔。

附图说明

图1为现有技术中HCV基因结构图；

图2为现有技术中普通生物条形码检测示意图；

图3为本发明实施例所述HCVcAg的灵敏度检测结果图；

图4为本发明实施例所述HCVcAg的特异性检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明丙肝病毒的荧光定量型生物条形检测方法，是以丙肝病毒核心抗原(HCVcAg)蛋白作为检测对象进行的荧光定量型生物条形码检测方法。所述MMP探针包被有HCVcAg单抗，NP探针包被有HCVcAg多抗。所述对丙肝病毒进行荧光定量型生物条形码检测的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。本发明在丙型肝炎的诊断及原料血浆的筛查领域中具有较大的实际意义，应用前景广阔。

本发明所提供的丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法，是以丙肝病毒的核心抗原(HCVcAg)作为检测对象进行的荧光定量型生物条形码检测方法。

所述HCVcAg单抗和HCVcAg多抗均可采用生物技术领域中的常规方法制备。

优选的对HCVcAg进行荧光定量型生物条形码检测的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQID No：2的核苷酸序列。

具体来讲，所述丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法可包括以下步骤：

1)NP探针的制备：用常规方法及金纳米颗粒、HCVcAg多抗、互补探针NP链和条形码DNA链制备NP探针；

2)MMP探针的制备：用磁性微球和HCVcAg单抗制备MMP探针；

3)丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测：利用NP探针、MMP探针和丙肝病毒通过抗原、抗体作用制备NP-HCVcAg-MMP三明治复合物，然后在高温低盐条件下，释放条形码DNA链，最后对获得的条形码DNA链进行荧光定量PCR检测，从而对丙肝病毒进行定性、定量检测。

在述丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法中，步骤1)中可利用柠檬酸三钠还源法制备金纳米颗粒，金纳米颗粒的直径可为20-40nm，优选30nm，可利用HCVcAg蛋白免疫新西兰大白兔制备HCVcAg多抗。

步骤2)中磁性微球的直径为0.5-1.5um，优选为1um，可通过将HCVcAg杂交瘤细胞株免疫BALB/c小鼠的方法制备HCVcAg单抗。

为获得更好的检测效果，所述步骤1)和步骤2)中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。

本发明的还提供一种丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，可包括包被有HCVcAg单抗的MMP探针，以及包被有HCVcAg多抗的NP探针。

上述优选的与NP探针联结的条形码DNA链具有序列表中SEQ ID No：1的核苷酸序列，互补探针NP链具有序列表中SEQ ID No：2的核苷酸序列。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物及核苷酸序列均由大连TAKARA公司合成。

实施例1：丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测

用本发明的荧光定量型生物条形码检测方法对丙肝病毒进行定性、定量检测，具体方法包括以下步骤：

1、寡核苷酸链的合成

设计并合成本发明丙肝病毒荧光定量型生物条形码检测方法中所用的寡核苷酸链，序列如下：

条形码DNA链：长度为100bp。

5′- CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3′。(序列表中SEQ ID No：1)

互补probe NP链：

5′-GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A₁₀-(CH₂)₆-SH-3′，长度为30bp。

(序列表中SEQ ID No：2)

引物1：

5′-CGCATTCAGGATTGCATGAC-3′。(序列表中SEQ ID No：3)

引物2：

5′-CAAGACGAGTGCAATCATGC-3′(序列表中SEQ ID No：4)

2、金纳米颗粒的制备

本发明选择使用直径30nm的金纳米颗粒。利用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒。

取500mL 0.01％HAuCl₄溶液在搅动的情况下加热至沸腾后迅速准确加入7.5mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min，整个过程始终用磁力搅拌器进行搅拌；当溶液的颜色渐渐加深，最后为深紫红色，停止加热；将制备好的纳米金用0.45μm的尼龙膜过滤，冷却至室温，放置于4℃避光保存。

3、抗HCVcAg蛋白的多克隆抗体的制备

利用HCVcAg蛋白免疫新西兰大白兔制备HCVcAg蛋白多克隆抗体。每只雄性新西兰大白兔免疫前，都由耳缘静脉取血2mL，静置分离血清，-20℃保存，以待作为阴性对照用。首次免疫，每只家兔注射2mL的乳化抗原，于足掌及肘窝淋巴结周围，背部两侧、领下、耳后等处皮下多点注射，对照兔子注射等量生理盐水。2周后以同样的剂量(含等体积弗氏不完全佐剂)加强免疫，背部多点注射，2周后再次加强免疫。10天后进行第3次加强免疫，约10天以后进行末次免疫，直接用2mL乳化抗原静脉注射。每次加强免疫后7～10天从兔耳缘静脉采血2～3mL，用间接ELISA法检测抗体效价，末次免疫后7天即用颈动脉放血法采血，4℃静置过夜，次日4000rpm离心10min，收集上清，分装后-20℃保存。

4、金纳米颗粒-HCVcAg多抗复合物的制备

分别取1mL的金纳米颗粒和最适量的HCVcAg多抗，用0.1mol/L K₂CO₃调节至pH9.0。在搅拌下将金纳米颗粒和抗体混合，10min后再加入一定量的稳定剂，常用者为5％BSA，使其最终浓度为1％；或加入1％聚乙二醇(PEG，分子量20kD)至标记物总量的1/10，以防止抗体蛋白和金纳米颗粒的聚合和发生沉淀。

5、NP探针的制备、纯化

将互补探针NP链(终浓度为2μmol/L)加入被HCVcAg多抗修饰的金纳米颗粒(浓度为4.5nmol/L)中，室温放置16小时；再以磷酸盐缓冲液调整pH至7.0，增强离子浓度至0.1mol/L NaCl，室温放置40小时，10,000g离心30min得到含互补探针NP链修饰的金纳米颗粒；得到的深红色沉淀用0.1M NaCl，10mM PBS(pH7.0)溶液洗涤3次，去除未标记的金纳米颗粒；将条形码DNA链(终浓度为2μmol/L)加入上述标记有互补探针NP链修饰的金纳米颗粒中，室温杂交4小时，14,000g离心30分钟，得到NP探针。

6、HCVcAg单抗的制备

利用本室制备的HCVcAg杂交瘤细胞免疫BALB/c小鼠制备HCVcAg单克隆抗体。采用6-8周雌性BALB/c小鼠，在注射杂交瘤细胞前7天，预先腹腔注射0.5mL灭菌液体石蜡；每只鼠腹腔注射含1～5×106杂交瘤细胞的0.5mL的培养液；当小鼠产生腹水时(1～3周)，腹部穿刺放出腹水(1～5mL)，隔天穿刺直至小鼠死亡；3000rpm离心15min，除去腹水中的细胞；上清无菌储存或加0.01％叠氮钠置于-70℃冰箱保存备用。

7、MMP探针的制备、纯化

将100μgHCVcAg单抗溶于20mL PBS中，将其加入到激活的磁珠中，剧烈振荡，然后将烧瓶置于混合器上反应16～24小时；磁性分离，弃去上清；在40mL PBS中重悬磁珠；加入20mL淬灭剂(甘氨酸)，剧烈振荡，将其放在混合器上反应30min；磁性分离，弃去上清；用PBS洗3次，磁性分离；用50mL洗液重悬磁珠，4℃保存。

8、丙肝病毒荧光定量型生物条形码检测方法的建立

将50μL抗HCVcAg蛋白的单抗功能化的磁性微球(5mg/mL)加入10μL已知浓度的HCVcAg蛋白或丙肝阳性病毒中，37℃下剧烈震荡1小时；加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗，除去未连结的HCVcAg蛋白和不相关的蛋白；加入被双链DNA和抗HCVcAg蛋白的多抗修饰的0.1nmol/L金纳米颗粒探针50μL，剧烈震荡30分钟，形成三明治结构；加上磁场，在用磁铁固定MMPs的同时，用500μL的PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针。形成三明治结构后，接着加上磁场，在用磁铁固定MMPs的同时，用500μL的PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针；加入50μL超纯水到三明治结构中，60℃剧烈震荡30分钟，使条形码DNA链去杂交。三明治复合物被磁性分离，收集上清液，内含条形码DNA链，用于定性定量检测。

9、条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测

对获得的条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测，反应条件如下：

引物1：序列表中SEQ ID No：3

引物2：序列表中SEQ ID No：4

条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测中HCVcAg蛋白浓度分别为100pg/mL、10pg/mL、1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL、0g/mL。分析结果时，基线和阈值可取仪器默认值，一般情况下取前6-15个循环的荧光信号为基线。此外，在进行数据分析时，一般需要进行托运设置，把数据纵轴改为线性。检测结果表明本检测的HCVcAg蛋白检测灵敏度可达100fg/mL。

以下将结合附图及实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。

如图3所示，为本发明实施例所述荧光定量型生物条形码技术的灵敏度检测结果(HCVcAg蛋白)。图中不同浓度的HCVcAg蛋白FQ-BCA检测结果为：从左至右VP7蛋白浓度依次为：1pg/mL、100fg/mL、10fg/mL、1fg/mL、100ag/mL、10ag/mL、1ag/mL。

如图4所示，为本发明实施例荧光定量型生物条形码技术的特异性检测结果图。图中FQ-BCA检测的特异性结果为：用建立的FQ-BCA检测体系对丙肝病毒阳性血清标本，甲肝病毒阳性血清标本、乙肝病毒阳性血清标本进行特异性交叉试验，3次重复。

Claims (10)

1.一种丙肝病毒的荧光定量型生物条形码，其特征在于，所述生物条形码为DNA寡聚核苷酸链，其序列为：

5′- CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3′。

2.一种丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测试剂盒，其特征在于，包括：包被有HCVcAg单抗的MMP探针，以及包被有HCVcAg多抗的NP探针。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述与NP探针联结的条形码DNA寡聚核苷酸链具有如权利要求1所述的核苷酸序列，互补探针NP链具有如下的核苷酸序列：

5′-GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A₁₀-(CH₂)₆-SH-3′。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒进一步包括进行荧光定量PCR检测的引物1和引物2，其序列分别为：

引物1：

5′-CGCATTCAGGATTGCATGAC-3′；

引物2：

5′-CAAGACGAGTGCAATCATGC-3′。

5.一种丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法，其特征在于，是以丙肝病毒核心抗原作为检测对象进行的荧光定量型生物条形码检测方法。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法中使用的MMP探针包被有HCVcAg单抗，NP探针包被有HCVcAg多抗。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于：所述对丙肝病毒进行荧光定量型生物条形码检测的条形码DNA链具有如权利要求1所述的核苷酸序列，互补探针NP链具有如权利要求3所述的核苷酸序列。

8.根据权利要求5～7中任一项所述的检测方法，其特征在于：所述丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测方法包括以下步骤：

1)NP探针的制备：用金纳米颗粒、HCVcAg多抗、所述互补探针NP链和所述条形码DNA链制备NP探针；

2)MMP探针的制备：用磁性微球和HCVcAg单抗制备MMP探针；

3)丙肝病毒的荧光定量型生物条形码检测：利用NP探针、MMP探针和丙肝病毒通过抗原、抗体作用制备NP-HCVcAg-MMP三明治复合物，然后在高温低盐条件下，释放条形码DNA链，最后对获得的条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测。

9.根据权利要求5～8中任一项所述的检测方法，其特征在于：

所述步骤1)中用柠檬酸三钠还原法制备金纳米颗粒，金纳米颗粒的直径为30nm；

所述步骤2)中磁性微球的直径为1um；

所述步骤1)和步骤2)中还包括对NP探针和MMP探针进行纯化的步骤。

10.根据权利要求5～9中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.寡核苷酸链的合成：

合成所述丙肝病毒荧光定量型生物条形码检测方法中所用的寡核苷酸链，序列如下：

条形码DNA链：长度为100bp；

5′- CGCATTCAGGATTGCATGACGTGCCTCGTCTTAACGGTCTCAACTCGTAATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGTCATCGCATGATTGCACTCGTCTTG-3′；

互补probe NP链：

5′-GACGAGGCACGTCATGCAATCCTGAATGCG A₁₀-(CH₂)₆-SH-3′，长度为30bp；

引物1：

5′-CGCATTCAGGATTGCATGAC-3′；

引物2：

5′-CAAGACGAGTGCAATCATGC-3′；

b.金纳米颗粒的制备：

选择使用直径30nm的金纳米颗粒，利用柠檬酸钠还原法制备金纳米颗粒：取500mL 0.01％HAuCl₄溶液在搅动的情况下加热至沸腾后迅速准确加入7.5mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min，整个过程始终用磁力搅拌器进行搅拌；当溶液的颜色渐渐加深，最后为深紫红色，停止加热；将制备好的纳米金用0.45μm的尼龙膜过滤，冷却至室温，放置于4℃避光保存；

c.抗HCVcAg蛋白的多克隆抗体的制备；

d.金纳米颗粒-HCVcAg多抗复合物的制备：

分别取1mL的金纳米颗粒和HCVcAg多抗，用0.1mol/L K₂CO₃调节至pH9.0；在搅拌下将金纳米颗粒和抗体混合，10min后加入5％BSA，使其最终浓度为1％；或加入1％聚乙二醇(PEG，分子量20kD)至标记物总量的1/10，以防止抗体蛋白和金纳米颗粒的聚合和发生沉淀；

e.NP探针的制备、纯化：

将终浓度为2μmol/L的互补探针NP链加入被HCVcAg多抗修饰的金纳米颗粒(浓度为4.5nmol/L)中，室温放置16小时；再以磷酸盐缓冲液调整pH至7.0，增强离子浓度至0.1mol/L NaCl，室温放置40小时，10000g离心30min得到含互补探针NP链修饰的金纳米颗粒；得到的深红色沉淀用0.1M NaCl，10mM PBS(pH7.0)溶液洗涤3次，去除未标记的金纳米颗粒；将条形码DNA链(终浓度为2μmol/L)加入上述标记有互补探针NP链修饰的金纳米颗粒中，室温杂交4小时，14,000g离心30分钟，得到NP探针；

f.HCVcAg单抗的制备；

g.MMP探针的制备、纯化：

将100μgHCVcAg单抗溶于20mL PBS中，将其加入到激活的磁珠中，剧烈振荡，然后将烧瓶置于混合器上反应16～24小时；磁性分离，弃去上清；在40mL PBS中重悬磁珠；加入20mL甘氨酸，剧烈振荡，将其放在混合器上反应30min；磁性分离，弃去上清；用PBS洗3次，磁性分离；用50mL洗液重悬磁珠，4℃保存；

h.丙肝病毒荧光定量型生物条形码检测方法的建立：

将50μL抗HCVcAg蛋白的单抗功能化的磁性微球(5mg/mL)加入10μL已知浓度的HCVcAg蛋白或丙肝阳性病毒中，37℃下剧烈震荡1小时；加上磁场固定MMP探针，用PBS溶液反复冲洗；加入被双链DNA和抗HCVcAg蛋白的多抗修饰的0.1nmol/L金纳米颗粒探针50μL，剧烈震荡30分钟，形成三明治结构；加上磁场，在用磁铁固定MMPs的同时，用500μL的PBS缓冲液反复冲洗4次，除去未连接的NP探针；加入50μL超纯水到三明治结构中，60℃剧烈震荡30分钟，使条形码DNA链去杂交；三明治复合物被磁性分离，收集上清液，内含条形码DNA链，用于定性定量检测；

i.条形码DNA链的实时荧光定量PCR检测：

对获得的条形码DNA链进行实时荧光定量PCR检测，反应条件如下：

引物1：

5′-CGCATTCAGGATTGCATGAC-3′；

引物2：

5′-CAAGACGAGTGCAATCATGC-3′。

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