CN1670532A - 检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法、检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法、检测方法，将包被用HCV重组抗原加至缓冲液中混匀，加至酶联板内，孵育过夜，用缓冲液洗涤酶联板后，再加入缓冲液，孵育后，弃去孔内液体，彻底干燥酶联板，完成预包被酶联板的制备；将标记用HCV重组抗原和辣根过氧化物酶用改良过碘酸钠法结合在一起，完成酶标记HCV抗原结合物的制备；试剂盒中还含有显色液A、显色液B、终止液、样品稀释液、阴性对照为正常人血清、阳性对照为含有HCV抗体的人血清。本发明的试剂盒具有更高的检测活性，一次检测，可同时检测血中的所有抗HCV抗体如IgG、IgM等，进一步缩短了窗口期，显著提高了检测的灵敏度和准确率。

Description

检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法、检测方法

(一)技术领域

本发明涉及一种检测丙型肝炎病毒抗体的诊断试剂盒及其制备方法、检测方法。

(二)背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)属于黄病毒科，是1989年发现的与输血有关的非甲、非乙型肝炎病毒。丙型肝炎呈全球性流行，据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3％，估计约1.7亿人感染了HCV，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。全国血清流行病学调查资料显示，我国一般人群抗-HCV阳性率为3.2％。HCV主要经血液传播，主要有：(1)经输血和血制品传播。(2)经破损的皮肤和粘膜传播。(3)母婴传播。HCV是肝硬化、肝功衰竭和肝细胞癌的常见病因。目前尚无有效方案治疗丙型肝炎，预防丙型肝炎最有效的方法是切断传染源，特别是杜绝携带HCV的人员献血，因此必须采用有效的检测试剂。

现有检测HCV的方法目前有聚合酶链式反应和HCV抗体检测。其中HCV抗体检测是献血员筛查的主要方法。机体感染HCV后，会产生针对HCV的抗体，最早出现的抗体类型为IgM，约在7～30天内出现，之后IgM消失IgG出现，约在30～60天出现。HCV感染机体后至出现可检测出抗体时的一段时间被称作窗口期。HCV抗体检测试剂当前已发展到第三代，窗口期约4～10周，但只能检测血中的IgG抗体，检测的灵敏度和特异性有待于进一步提高。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法、检测方法，解决现有技术只能检测IgG抗体的技术问题；还解决可同时检测血中的所有抗HCV抗体，进一步缩短窗口期、进一步提高检测灵敏度和特异性的问题。

本发明的技术方案：这种检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于试剂盒的组分包括：

(1)、用HCV抗原包被的预包被酶联板；

(2)、用辣根过氧化物酶(HRP)标记的HCV抗原结合物；

(3)、含有吐温的磷酸盐缓冲液的洗涤液；

(4)、含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液的显色液A；

(5)、含有四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液的显色液B；

(6)、含有硫酸溶液的终止液；

(7)、含有磷酸盐缓冲液的样品稀释液；

(8)、阴性对照正常人血清；

(9)、阳性对照含有HCV抗体的人血清。

这种检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：

I、用HCV抗原包被的预包被酶联板的制备：

将包被用HCV重组抗原加至碳酸盐缓冲液中混匀，加至酶联板内，每孔100微升，孵育过夜，用含有吐温的磷酸盐缓冲液洗涤酶联板后，再加入含有酪蛋白的Tris缓冲液，37℃孵育2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥酶联板，完成用HCV抗原包被的预包被酶联板的制备；

II、用辣根过氧化物酶标记的HCV抗原结合物的制备：

将标记用HCV重组抗原和辣根过氧化物酶用改良过碘酸钠法结合在一起，完成用辣根过氧化物酶标记的HCV抗原结合物的制备；

III、其它组分的制备：

洗涤液为含有吐温的磷酸盐缓冲液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液，显色液B为含有四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液，终止液为2M硫酸，样品稀释液为含有酪蛋白的磷酸盐缓冲液，阴性对照为正常人血清，阳性对照为含有HCV抗体的人血清。

这种用检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒检测样品中丙型肝炎病毒抗体存在的方法，其特征在于检测步骤如下：

a、加样：取用HCV抗原包被的预包被酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孔、阳性血清对照孔和样品孔，在各孔先加样品稀释液50μl，再依次加入阴性血清对照、阳性血清对照和样品各50μl，混匀，贴上不干胶条，置37℃温育30分钟；

b、洗板：弃去各孔内液体，将洗涤液用蒸馏水稀释20倍后，注满各孔，静置10-20秒，甩掉洗涤液，重复洗板，最后拍干；

c、加酶：在各孔加酶标记HCV抗原结合物100祃，空白对照孔不加，贴上不干胶条，置37℃温育30分钟；

d、洗板：方法同b；

e、显色：依次在各孔加显色剂A液、B液各50μl，混匀，置37℃避光温育10分钟；

f、终止：依次在各孔加终止液50μl，混匀；

g、测定：用酶标仪对空白孔调零，测定各孔的光吸收值(OD值)；

h、结果判定：根据测定OD值与临界值的比值。若比值大于1，则为阳性反应，说明样品中含有HCV抗体；若比值小于1，则为阴性反应，说明样品中不含有HCV抗体。

有益效果：本发明的试剂盒中采用双抗原夹心法，具有更高的检测活性，解决了现有技术只能检测IgG抗体的缺点，一次检测，可同时检测血中的所有抗HCV抗体如IgG、IgM等，从而可进一步缩短窗口期最早至2周以内。显著提高了检测的灵敏度和准确率，可进一步减小输血后HCV感染的机率。

感染者血清中HCV标志物出现顺序参见图1，本发明可同时检测IgG和IgM类型抗体，较只能检测IgG类型抗体的现有HCV抗体检测试剂的窗口期约缩短20天。

本发明经中国药品生物制品检定所用国家标准品检定结果显示：外观检查、阴性标准品符合率、阳性标准品符合率、灵敏度、精密性、稳定性均符合国家标准。

检验项目	标准规定	检验结果
			阴性参考品30份	符合率≥29/30	29/30
阳性参考品30份	符合率≥29/30	29/30
			精密性	≤15％	≤10％
L1～L4	L1、L2阳性，L3阳性或阴性	L1、L2、L3阳性

本发明临床考核结果：分别委托中国人民解放军第302医院、河南省性病艾滋病防治研究所、北京市红十字血液中心进行了临床考核试验，结果如下表：

检验项目	检验结果	结果描述
			阴性血清标本716份	713/716	特异度为99.58％
阳性血清标本243份	242/243	敏感度为99.59％
			献血员随机样品864份	17/864	阳性率为1.97％

为了进一步考核本发明较现用技术的优越性，委托中国药品生物制品检定所标准化研究中心进行临床考核试验，结果在5份早期感染HCV血清中，本发明检出阳性1份，而现有技术没有1份能够检出。结果如下：

样品编号	PCR结果	现有技术试剂检测结果	本发明检测结果
				6	阳性	阴性	阳性

本发明与现有技术HCV抗体检测法相比较，本发明临床应用敏感度和特异度较高，能够完全符合临床使用要求。本发明适用于检测样品中丙型肝炎病毒抗体是否存在。可较现用技术大大缩短窗口期。

(四)、附图说明

图1是证明本发明有益效果的实验数据曲线图。

用本发明一次检测可同时检测血中的IgG、IgM抗HCV抗体，并可进一步缩短窗口期最早至2周以内。

(五)、具体实施方式

[1]、本发明检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒组份实施例：

(1)、用HCV抗原包被的预包被酶联板；

(2)、用辣根过氧化物酶标记的酶标记HCV抗原结合物；

(3)、含有吐温的磷酸盐缓冲液的洗涤液；

(4)、含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液的显色液A；

(5)、含有四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液的显色液B；

(6)、含有2M硫酸溶液的终止液；

(7)、含有酪蛋白的磷酸盐缓冲液的样品稀释液；

(8)、阴性对照正常人血清；

(9)、阳性对照含有HCV抗体的人血清。

[2]、本发明检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒的制备方法实施例：

I、用HCV抗原包被的预包被酶联板的制备：先制备用于包被酶联板的HCV基因重组结构区和非结构区抗原；将包被用HCV重组抗原加至碳酸盐缓冲液中混匀，加至酶联板内，每孔100微升，孵育过夜，用含有吐温的磷酸盐缓冲液洗涤酶联板后，再加入含有酪蛋白的Tris缓冲液，37℃孵育2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥酶联板。此即将HCV抗原包被于酶联板上。

II、用辣根过氧化物酶标记的HCV抗原结合物的制备：先制备用于辣根过氧化物酶标记的HCV基因重组结构区和非结构区抗原，此即区别于其它检测HCV抗体诊断试剂的酶标记物特征所在；将标记用HCV重组抗原和辣根过氧化物酶用改良过碘酸钠法结合在一起，即为酶标HCV抗原结合物。

改良过碘酸钠法，具体步骤如下：

氧化辣根过氧化物酶(HRP)：用纯化水将HRP配成4mg/ml溶液，加入0.2ml含有6mg过碘酸钠的溶液，室温避光反应20分钟；

透析：将氧化后HRP溶液用pH4.5 1mmol/l乙酸盐溶液透析，30分钟1次，共8次；

调节pH：用0.1mol/1，pH9.5的碳酸盐缓冲液将上述HRP溶液的pH调至9.0以上；

准备HCV抗原：用0.01mol/l，pH9.5的碳酸盐缓冲液将HCV抗原调配成8mg/ml浓度；

与HCV抗原交联：将上述HRP溶液与HCV抗原溶液以等体积比例，将抗原溶液缓慢加入HRP溶液中，室温搅拌2小时；

还原：将新鲜配制的2mg/ml硼氢化钠溶液，按0.2ml/4mgHRP的浓度加入上述HRP-HCV抗原溶液，4℃反应2小时；

透析：将HRP-HCV抗原结合物溶液，用100倍以上体积的0.01mol/l，pH7.2磷酸盐缓冲液透析过夜，至少换3次透析液；

分装保存：加入等量甘油，分装后低温保存。

III、试剂盒其它组分包括：洗涤液为含有吐温的磷酸盐缓冲液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液，显色液B为含有四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液，终止液为2M硫酸，样品稀释液为含有酪蛋白的磷酸盐缓冲液，阴性对照血清为正常人血清，阳性对照血清为含有HCV抗体的人血清。

[3]、用检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒检测样品中丙型肝炎病毒抗体存在的检测步骤实施例：

a、加样：取用HCV抗原包被的预包被酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孔、阳性血清对照孔和样品孔，在各孔先加样品稀释液50祃，再依次加入阴性血清对照、阳性血清对照和样品各50祃，混匀，贴上不干胶条，置37℃温育30分钟；

b、洗板：弃去各孔内液体，将洗涤液用蒸馏水稀释20倍后，注满各孔，静置10-20秒，甩掉洗涤液，重复洗板，最后拍干；

c、加酶：在各孔加酶标记HcV抗原结合物100μl，空白对照孔不加，贴上不干胶条，置37℃温育30分钟；

d、洗板：方法同b；

e、显色：依次在各孔加显色剂A液、B液各50μl，混匀，置37℃避光温育10分钟；

f、终止：依次在各孔加终止液50μl，混匀；

g、测定：用酶标仪对空白孔调零，测定各孔的光吸收值(OD值)；

h、结果判定：根据测定OD值与临界值的比值。若比值大于1，则为阳性反应，说明样品中含有HCV抗体；若比值小于1，则为阴性反应，说明样品中不含有HCV抗体。

Claims (3)

1.一种检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒，其特征在于试剂盒的组分包括：

(1)、用HCV抗原包被的预包被酶联板；

(2)、用辣根过氧化物酶标记的酶标记HCV抗原结合物；

(3)、含有吐温的磷酸盐缓冲液的洗涤液；

(4)、含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液的显色液A；

(5)、含有四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液的显色液B；

(6)、含有硫酸溶液的终止液；

(7)、含有磷酸盐缓冲液的样品稀释液；

(8)、阴性对照正常人血清；

(9)、阳性对照含有HCV抗体的人血清。

2.一种检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：

I、用HCV抗原包被的预包被酶联板的制备：

将包被用HCV重组抗原加至碳酸盐缓冲液中混匀，加至酶联板内，每孔100微升，孵育过夜，用含有吐温的磷酸盐缓冲液洗涤酶联板后，再加入含有酪蛋白的Tris缓冲液，37℃孵育2小时后，弃去孔内液体，彻底干燥酶联板，完成用HCV抗原包被的预包被酶联板的制备；

II、用辣根过氧化物酶标记的酶标记HCV抗原结合物的制备：

将标记用HCV重组抗原和辣根过氧化物酶用改良过碘酸钠法结合在一起，完成用辣根过氧化物酶标记的酶标记HCV抗原结合物的制备；

III、其它组分的制备：

洗涤液为含有吐温的磷酸盐缓冲液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸盐缓冲液，显色液B为含有四甲基联苯胺的柠檬酸盐缓冲液，终止液为2M硫酸，样品稀释液为含有酪蛋白的磷酸盐缓冲液，阴性对照为正常人血清，阳性对照为含有HCV抗体的人血清。

3.一种用检测丙肝病毒抗体诊断试剂盒检测样品中丙型肝炎病毒抗体存在的方法，其特征在于检测步骤如下：

a、加样：取用HCV抗原包被的预包被酶联板，每次实验设空白对照孔、阴性血清对照孔、阳性血清对照孔和样品孔，在各孔先加样品稀释液50μl，再依次加入阴性血清对照、阳性血清对照和样品各50μl，混匀，贴上不干胶条，置37℃温育30分钟；

b、洗板：弃去各孔内液体，将洗涤液用蒸馏水稀释20倍后，注满各孔，静置10-20秒，甩掉洗涤液，重复洗板，最后拍干；

c、加酶：在各孔加酶标记HCV抗原结合物100μl，空白对照孔不加，贴上不干胶条，置37℃温育30分钟；

洗板：方法同b；

e、显色：依次在各孔加显色剂A液、B液各50μl，混匀，置37℃避光温育10分钟；

f、终止：依次在各孔加终止液50μl，混匀；

g、测定：用酶标仪对空白孔调零，测定各孔的光吸收值(OD值)；

h、结果判定：根据测定OD值与临界值的比值。若比值大于1，则为阳性反应，说明样品中含有HCV抗体；若比值小于1，则为阴性反应，说明样品中不含有HCV抗体。

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