CN104101711A - 一种改良的酶联免疫测定试剂盒及其检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种改良的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法。本发明所述的试剂盒包括：抗体预包被的微孔板、标准品、样品抗体稀释液、生物素标记的检测抗体、20倍浓缩洗液、增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素、底物，以及终止液；其中，所述的样品抗体稀释液是含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲液。与传统的酶联免疫测定方法相比，本发明采用了独创的样品抗体稀释液以及增强的抗生物素蛋白链菌素。本发明能降低普通酶联免疫检测方法的结果背景，提高灵敏度，尤其在检测较低浓度细胞因子样品时，对试剂盒的性能有较大提升，而且本试剂盒品质稳定、成本低廉，利于推广应用。

Description

一种改良的酶联免疫测定试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及一种酶联免疫检测试剂盒及检测方法，尤其涉及一种改良的酶联免疫检测试剂盒及其检测方法。
背景技术
酶联免疫吸附检测（Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA）是利用抗原抗体之间的特异性结合特性，对受检样本进行检测。由于结合于固相载体(一般为塑料96孔酶孔板)上的抗原或抗体仍具有免疫活性，因此通过它们之间的特异性结合，再配合酶对于底物的催化，可产生可见光或者非可见光的信号，因而可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用显色的深浅进行定量分析。根据待测样品以及结合方式的不同，可设计出各种不同类型的ELISA检测方法，主要有三明治法（sandwich）、间接法（indirect）以及竞争法（Competitive）这三种方法。
细胞因子（cytokine）是由细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物质的统称。在免疫应答过程中，细胞因子在免疫调节、炎症应答、肿瘤转移等生理和病理过程中起重要作用。细胞因子的检测不仅是基础免疫研究的有较手段，同时在临床疾病诊断、病程观察、疗效判断及细胞因子治疗监测方面具有重要价值。由于细胞因子在人体中含量很低，因此如何提高检测灵敏度显得十分重要。
影响ELISA检测灵敏度的主要因素是标准曲线斜率以及信噪比。为了提高灵敏度，可以通过增强抗原与抗体结合能力，对信号进行放大，对背景（噪音）进行降低等方法。但由于抗体与抗原结合的能力在抗体生产出来后就不受控制，好的抗体往往可遇不可求，所以提高灵敏度的主要手段是放大信号以及降低背景。
由于对抗体进行生物素标记方法简单，试剂价格低廉，且对抗体活性影响较小，同时生物素可以和抗生物素蛋白链菌素特异性的高效结合，故目前在夹心法ELISA中，大多采用生物素标记的抗体作为检测抗体，再通过与抗生物素蛋白链菌素偶联的酶催化底物产生结果来进行信号放大。同时，在对检测样品进行稀释的时候，目前一般通过在样品稀释液里添加动物血清或者牛血清白蛋白（BSA），以提高信号检测特异性，降低背景。
因为血清是一种潜在的传染源，目前采用牛血清蛋白或者动物血清的方法都会存在潜在的生物学风险。同时，动物血清获取不易，基本上为一次性获取，故应用成本较高。而且，直接使用动物血清还会存在批次间差异。
目前采用酶标记的链亲和素一般都只连接有一个辣根过氧化物酶，虽然通过催化底物的方式实现了信号放大，但在抗原浓度低、抗体-抗原-抗体-酶夹心物形成量少的情况下，信号放大效果仍不理想。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题以及不足之处，本发明的目的在于提供一种改良的酶联免疫试剂盒，该试剂盒能降低普通酶联免疫检测方法的结果背景，具有灵敏度高、品质稳定、成本低廉等优点。
本发明所述的一种改良的酶联免疫检测试剂盒，包括：抗体预包被的微孔板、标准品、样品抗体稀释液、生物素标记的检测抗体、20倍浓缩洗液、增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素、底物，以及终止液；其中，所述的样品抗体稀释液是含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲液。
根据本发明所述的酶联免疫检测试剂盒的进一步特征，所述的增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素是聚集多个辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白链菌素。
本发明的另一个方面提供了采用所述的改良的酶联免疫检测试剂盒的检测方法。
本发明所述的改良的酶联免疫检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：用含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲液的样品抗体稀释液将标准品或者样品进行稀释；将稀释后的标准品或者样品加入到抗体预包被的酶孔板中，使标准品或样品中的待检测抗原特异地被酶孔板中的抗体所捕获并固定在固相表面；再加入含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲液的样品抗体稀释液稀释后的生物素标记的检测抗体，所述抗体特异地结合所测抗原，形成抗体-抗原-抗体夹心三文治；然后加入增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素，使其与检测抗体上的生物素标记结合；加入底物，进行底物显色反应；再加入终止液终止反应；测定待检测的抗原的浓度。
根据本发明所述的检测方法的进一步特征，所述的增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素是聚集多个辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白链菌素。
与传统的酶联免疫测定方法相比，本发明采用了独创的样品抗体稀释液以及增强的抗生物素蛋白链菌素。本发明能降低普通酶联免疫检测方法的结果背景，提高灵敏度，尤其在检测较低浓度细胞因子样品时，对试剂盒的性能有较大提升，而且本试剂盒品质稳定、成本低廉，利于推广应用。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：改良后的酶联免疫测定试剂盒的制备
一、抗体预包被的微孔板的制备
1.包被
Na2CO3                     1.6g
NaHCO3            2.9g
去离子水           1000ml
调整PH至9.0，加入适量包被抗体，混匀后按每孔100微升的量加入到微孔板各孔中，于4°C环境下放置过夜，然后甩去孔内液体，排干。
2.洗涤
NaHPO4·12H2O                                   3.72g
KH2PO4                                         0.43g
NaCl                                               6.8g
Tween-20                                       0.5ml
去离子水                                       1000ml
调整PH至7.2，按每孔300微升的量加入微孔板各孔中，震荡10秒后甩净，重复5次。
3.封闭
牛血清白蛋白                               10g
NaHPO4·12H2O                                   3.72g
KH2PO4                                         0.43g
NaCl                                               6.8g
去离子水                                       1000ml
按每孔125微升的量加入到微孔板中，于室温中封闭1.5小时。
4.干燥
封闭好的微孔板甩去孔内液体，拍干，在真空干燥柜中干燥5小时，然后放入有干燥剂的铝塑袋内封口，保存在-20°C环境中。
二、样品抗体稀释液制备：
酪蛋白                         13.7g
NaHPO4·12H2O                 3.72g
KH2PO4                           0.43g
NaCl                                 6.8g
去离子水                         1000ml
三、生物素标记的检测抗体的制备
在标记前，将待标记抗体用1升的磷酸盐缓冲液（PBS）透析三次，每次两小时。
将生物素标记试剂溶解在100微升磷酸盐缓冲液（PBS）中，按照每毫克抗体36微升生物素标记试剂将两者混合，常温涡旋孵育30分钟。
将标记好的抗体用1升的磷酸盐缓冲液（PBS）透析三次，每次两小时。
标记好的抗体保存在4摄氏度。
四、20倍浓缩洗液的制备
NaHPO4·12H2O                     74.4g
KH2PO4                           8.6g
NaCl                                 136g
Tween-20                         10ml
去离子水                         1000ml
五、增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素的制备
反应在4摄氏度进行，先在辣根过氧化物酶中加入高碘酸钠（NaIO4），然后直接加链霉亲和素溶液混匀，再用碳酸盐缓冲液（pH 9.0）透析后，用KBH4终止反应：加饱和硫酸铵沉淀，离心后弃上清液，再用PBS复溶沉淀即得增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素结合物
六、底物的制备
Na2HPO4·12H2O             18g
柠檬酸·H2O                     6g
3% 双氧水                      0.4ml
EDTA                              150mg
二甲基亚砜                            5ml
3,3',5,5'-四甲基联苯胺   250mg                                      
七、终止液的制备
浓H2SO4                         100ml
双蒸水                             800ml
上述试剂组合后制备得到本发明所述的改良的酶联免疫检测试剂盒。
实施例2：改良后的酶联免疫测定试剂盒的检测实验
本实施例采用实施例2所制备的改良的酶联免疫检测试剂盒进行检测方法，包括以下步骤：
用含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲液的样品抗体稀释液将标准品或者样品进行稀释；
将稀释后的标准品或者样品加入到抗体预包被的酶孔板中，使标准品或样品中的待检测抗原特异地被酶孔板中的抗体所捕获并固定在固相表面；
再加入含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲液的样品抗体稀释液稀释后的生物素标记的检测抗体，所述抗体特异地结合所测抗原，形成抗体-抗原-抗体夹心三文治；
然后加入增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素，使其与检测抗体上的生物素标记结合；
加入底物，进行底物显色反应；
再加入终止液终止反应；
测定待检测的抗原的浓度。
本试剂盒的一个示例性具体操作步骤如下： 
1. 用样品抗体稀释液对标准品进行梯度稀释，使其浓度分别为60纳克/毫升、20纳克/毫升、6.667纳克/毫升、2.222纳克/毫升、0.741纳克/毫升、0.247纳克/毫升，并以样品抗体稀释液作为空白对照。
2. 在预包被好的微孔板中，每孔加入100微升稀释好的标准品或者样品，每个标准品或样品做一个重复。置于室温中反应2小时。
3. 将微孔板放入自动洗板仪内，采用1倍洗涤液（20倍浓缩洗液1毫升+19毫升去离子水即为工作洗涤液）进行洗涤。
4. 每孔加入用样品抗体稀释液稀释好的生物素标记检测抗体100微升，置于室温中反应1小时。
5. 重复步骤3。每孔加入100微升用样品抗体稀释液稀释好的增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素，置于室温中反应45分钟。
6. 重复步骤3。每孔加入100微升底物，置于室温黑暗处反应30分钟。
7. 每孔加入50微升终止液，并用酶标仪在450纳米波长读数。
实施例3：改良的样品抗体稀释液与普通的牛血清蛋白稀释液比较，普通酶标记抗生物素蛋白链菌素与增强酶标记抗生物素蛋白链菌素比较
1.分别用改良的样品抗体稀释液及普通的牛血清蛋白稀释液对标准品进行梯度稀释，使其浓度分别为60纳克/毫升、20纳克/毫升、6.667纳克/毫升、2.222纳克/毫升、0.741纳克/毫升、0.247纳克/毫升，对样品1及样品2按一定倍数稀释，并以样品抗体稀释液/牛血清蛋白缓冲液用作空白对照。
2.在预包被好的微孔板中，其中两块板中加入100微升用改良的样品抗体稀释液稀释好的标准品或者样品，每个标准品或样品两个重复孔；另两块微孔板加入用牛血清蛋白缓冲液稀释好的标准品或样品每个标准品或样品两个重复孔。置于室温中反应2小时。
3.将微孔板放入自动洗板仪内，采用1倍洗涤液（20倍浓缩洗液1毫升+19毫升去离子水即为工作洗涤液）进行洗涤。
4.对应不同的酶孔板，每孔加入用样品抗体稀释液/牛血清蛋白缓冲液稀释好的生物素标记检测抗体100微升，置于室温中反应1小时。
6.重复步骤3。
7.对应不同的酶孔板，每孔加入100微升用样品抗体稀释液/牛血清蛋白缓冲液稀释好的普通酶标记的抗生物素蛋白链菌素/增强酶标记抗生物素蛋白链菌素，置于室温中反应45分钟。
8.重复步骤3。
9.每孔加入100微升底物，置于室温黑暗处反应30分钟。
10.每孔加入50微升终止液，并用酶标仪在450纳米波长读数。
对读数结果进行分析，得到表1、表2、表3及表4的结果。
表1 采用改良的样品抗体稀释液及增强酶标记抗生物素蛋白链菌素的结果
样品 OD值 OD值 OD均值 信噪比
样品1 0.467 0.469 0.468 5.44
样品2 0.221 0.223 0.222 2.58
表2 采用普通的牛血清蛋白稀释液及增强酶标记抗生物素蛋白链菌素的结果
样品 OD值 OD值 OD均值 信噪比
样品1 0.231 0.23 0.23 1.06
样品2 0.197 0.196 0.20 0.91
表3 采用改良的样品抗体稀释液及普通酶标记的抗生物素蛋白链菌素
样品 OD值 OD值 OD均值 信噪比
样品1 0.245 0.248 0.2465 2.87
样品2 0.139 0.138 0.1385 1.61
表 4 采用普通的牛血清蛋白稀释液及普通酶标记的抗生物素蛋白链菌素
样品 OD值 OD值 OD均值 信噪比
样品1 0.195 0.192 0.194 1.03
样品2 0.192 0.196 0.194 1.03
表1与表2比较，表3和表4比较，从空白对照可以看出，在同样使用增强酶标记抗生物素蛋白链菌素催化底物的情况下，采用了独特的样品抗体稀释液后，背景明显降低；同时还增强了测检样品（样品1和样品2）的信号强度或信号/背景比率。
表1与表3比较，表2和表4比较，从“均值”和“信噪比”两列可以看出，在相同稀释液情况下，使用聚集有40个辣根过氧化酶的增强酶标记抗生物素蛋白链菌素信号強度和信号/背景比率明显大于使用普通聚辣根过氧化物酶标记的抗生素蛋白链霉素信号强度；同时通过标准曲线吸光值和信号/背景比率的比较，使用聚集有40个辣根过氧化酶的增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素的灵敏度至少比使用普通聚辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白链菌素高3倍。
更重要的是，从表1可看出，同时使用聚集有40个辣根过氧化酶的增强酶标记的抗生素蛋白链霉素和独特的样品抗体稀释液，既可放大检测信号，又可降低背景，大大提高了检测系统的灵敏度和特异性，说明采用增强酶标记的抗生素蛋白链霉素和独特的样品抗体稀释液制备的酶联免疫检测试剂盒具有更高的灵敏度及更好的特异性，可达到临床检测要求。
在上述实施例中，在洗板步骤中使用了Biotek公司的ELX-80多通道自动洗板仪，在读数阶段采用了Biotek公司的ELX-800酶标仪。当然，在发明技术方案的上述步骤中，仪器和材料的采用并不局限于本实施例的列举，而是以能够解决本发明的技术问题，并实现相应的技术效果为依据。

Claims (4)

1.一种改良的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：抗体预包被的微孔板、标准品、样品抗体稀释液、生物素标记的检测抗体、20倍浓缩洗液、增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素、底物，以及终止液；其中，所述的样品抗体稀释液是含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述的增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素是聚集多个辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白链菌素。
3.采用根据权利要求1所述的改良的酶联免疫检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
用含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲液的样品抗体稀释液将标准品或者样品进行稀释；
将稀释后的标准品或者样品加入到抗体预包被的酶孔板中，使标准品或样品中的待检测抗原特异地被酶孔板中的抗体所捕获并固定在固相表面；
再加入含1.37%酪蛋白的pH7.4的磷酸盐缓冲液的样品抗体稀释液稀释后的生物素标记的检测抗体，所述抗体特异地结合所测抗原，形成抗体-抗原-抗体夹心三文治；
然后加入增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素，使其与检测抗体上的生物素标记结合；
加入底物，进行底物显色反应；
再加入终止液终止反应；
测定待检测的抗原的浓度。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：所述的增强酶标记的抗生物素蛋白链菌素是聚集多个辣根过氧化酶标记的抗生物素蛋白链菌素。
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