CN102393456A - 一种用于检测hps的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测HPS的试剂盒。本发明的用于检测Hepassocin的试剂盒，包括抗Hepassocin的抗体1和抗Hepassocin的抗体2，其中所述抗体1作为包被抗体，所述抗体2作为检测抗体。本发明试剂盒的灵敏度高、特异性高，在HPS的定量检测领域具有广阔应用前景。本发明试剂盒可用于肝损伤相关疾病的检测，对肝癌、肝硬化等相关疾病的诊断也有一定的临床意义。

Description

一种用于检测HPS的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种用于检测HPS的试剂盒。
背景技术
Hepassocin(HPS)是一种特异表达于肝脏实质细胞中的新型促肝细胞增殖因子。目前国内外对于该基因的研究多集中于生理功能和作用机制方面，已有研究结果表明：(1)HPS表达具有组织特异性，特异表达在肝脏组织；(2)HPS作用具有特异性，能够通过激活MAPK/ERK信号通路促进正常肝细胞系L02的增殖，但对肝癌细胞系和其它组织细胞系无刺激增殖作用；(3)在肝损伤过程中表达上调。HPS在肝损伤和肝部分切除后表达上调并能促进肝细胞增殖，加快损伤修复和肝再生过程；(4)与肝癌发生发展密切相关。在肝癌组织中，HPS表达普遍下调并起着生长抑制因子的作用，可能是一种新的抑癌基因。因此，可以通过检测的含量，帮助诊断肝损伤相关疾病，如肝癌、肝硬化等。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于检测Hepassocin的试剂盒。
本发明提供的用于检测Hepassocin的试剂盒，包括抗Hepassocin的抗体1和抗Hepassocin的抗体2，其中所述抗体1作为包被抗体，所述抗体2作为检测抗体；
所述抗体1为抗Hepassocin的单克隆抗体；所述抗体2为抗Hepassocin的多克隆抗体。
所述抗体1为HPS单克隆抗体，产品名称为1C8，购自北京蛋白质组研究中心，产品目录号为AB2010-002。
所述抗体2为HPS多克隆抗体，购自北京蛋白质组研究中心，产品目录号为AB2010-001。
上述试剂盒中，还包括标准品，所述标准品为Hepassocin。
Hepassocin购自北京蛋白质组研究中心，产品目录号为P2010-002。
上述任一所述试剂盒中，还包括样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液、终止液、包被缓冲液、封闭液、标准品稀释液和检测抗体稀释液。
上述任一所述试剂盒中，所述样本稀释液的组成：溶剂是20mM、pH6.0的PBS缓冲液，溶质及其在所述样本稀释液中的质量浓度或摩尔浓或体积浓度如下：0.2％明胶，0.2％酪蛋白，150mM NaCl，0.1ml/L吐温20，5％蔗糖，0.5/万溴钾酚紫，1ml/L防腐剂Proclin-300；
上述任一所述试剂盒中，所述浓缩洗涤液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度如下：116g/L Na2HPO4·12H2O，11.84g/L NaH2PO4·2H2O，180g/L NaCl，5ml/L吐温20，1ml/L防腐剂Proclin-300；
上述任一所述试剂盒中，所述显色液由显色液A和显色液B组成；
所述显色液A的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液A中的浓度如下：7.28g/L柠檬酸，23.75g/L磷酸氢二钠，0.5g/L过氧化氢尿；
所述显色液B的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液B中的浓度如下：100ml/L甲醇，1g/L PVA，1.5g/L Na2S2O3，1ml/L HCl，0.03％(质量百分含量)TMB，1％(质量百分含量)DMSO；
PVA是指聚乙烯醇，其数均分子量为17-22万。
上述任一所述试剂盒中，所述终止液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述终止液中的浓度如下：200ml/1.8L硫酸，1.35g/1.8L EDTA；
上述任一所述试剂盒中，所述包被缓冲液的组成：溶剂是0.05M、PH值为9.6CB缓冲液，溶质及其在所述包被缓冲液中的质量浓度如下：1/20万染料；
上述任一所述试剂盒中，所述封闭液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述封闭液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：20％小牛血清，0.5％酪蛋白，8％蔗糖，150mM NaCl，1ml/L防腐剂Proclin-300；
上述任一所述试剂盒中，所述标准品稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述标准品稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：1％酪蛋白，8％海藻糖，3％甘露醇，1mM EDTA，0.5％甘氨酸，150mM NaCl，1ml/L防腐剂Proclin-300；
上述任一所述试剂盒中，所述检测抗体稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述检测抗体稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：2％BSA，0.1％酪蛋白，150mM NaCl，0.1ml/L吐温20，5/万氨基比啉，1/20万染料，1ml/L防腐剂Proclin-300。
上述试剂盒中，各种溶液中的％均表示质量百分含量。
上述试剂盒中，上述各种溶液中的染料均是食品红。
上述任一所述试剂盒中还包括HRP，并且所述HRP和所述检测抗体以HRP标记检测抗体的形式存在。
上述任一所述试剂盒中还包括包被有所述包被抗体的酶标板；
上述任一所述试剂盒中，所述包被有所述包被抗体的酶标板按照如下方法制备：
将所述包被抗体溶于所述包被缓冲液中至包被抗体浓度为2μg/ml，得到混合液；将所述混合液加入微孔板的孔中，每孔0.1ml，在37℃放置2小时或在2-8℃放置16-20小时；再向每孔中加入所述封闭液，每孔0.2ml，在37℃放置2小时，得到所述酶标板。
本发明的另一个目的是提供一种用上述试剂盒检测的方法。
本发明所提供的用上述任一所述试剂盒检测的方法，包括如下步骤：
用所述标准品稀释液溶解所述标准品，得到标准品工作液，使所述标准品在标准品工作液中的浓度依次为0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml；
用检测抗体稀释液稀释所述HRP标记检测抗体，得到检测抗体工作液，使HRP标记检测抗体在检测抗体工作液中的浓度为2μg/ml。
上述任一所述试剂盒在制备诊断肝损伤相关疾病的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述肝损伤相关疾病为肝癌。
本试剂盒采用双抗体夹心法测定血清中Hepassocin浓度水平。用一株单抗包被微孔板制成固相抗体，用多抗标记辣根过氧化物酶(HRP)制成酶标记物。在包被板微孔中加入含有HPS蛋白的标准品或待测血清及酶标记物，温育后即形成固相抗体-抗原-酶标抗体的复合物，充分洗涤后加入酶联免疫TMB底物液测定其OD值，显色强度与样品中HPS的浓度成正比。通过酶标仪检测吸光度(OD值)，按照HPS校准品制定浓度曲线，计算样品中HPS的含量。样品的OD值随Hepassocin浓度的增加而升高。
本发明试剂盒的灵敏度高、特异性高，在HPS的定量检测领域具有广阔应用前景。本发明试剂盒可用于肝损伤相关疾病的检测，对肝癌、肝硬化等相关疾病的诊断也有一定的临床意义。
附图说明
图1为本发明试剂盒的标准曲线。
图2为OD值与HPS浓度关系图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、试剂盒的组成
一、组成
1、包被有包被抗体的酶标板
所述酶标板按照如下方法制备：
将所述包被抗体溶于所述包被缓冲液中至包被抗体浓度为2μg/ml，得到混合液；
将所述混合液加入微孔板的孔中，每孔0.1ml，在37℃放置2小时或在2-8℃放置16-20小时；再向每孔中加入所述封闭液，每孔0.2ml，在37℃放置2小时；置25-35℃干燥间内，湿度＜40％，干燥时间20-24小时，得到酶标板。
包被抗体为HPS单克隆抗体，产品名称为1C8，购自北京蛋白质组研究中心，产品目录号为AB2010-002。
所述包被缓冲液的组成：溶剂是0.05M PH9.6CB缓冲液，溶质及其在所述包被缓冲液中的质量浓度如下：1/20万食品红；
所述封闭液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述封闭液中的浓度如下：20％(质量百分含量)小牛血清(NBS)，0.5％(质量百分含量)酪蛋白，8％(质量百分含量)蔗糖，150mM NaCl，1ml/L防腐剂Proclin-300；
2、酶结合物：HRP标记的检测抗体
检测抗体为HPS多克隆抗体，购自北京蛋白质组研究中心，产品目录号为AB2010-001。
HRP标记的检测抗体的制备方法：
(1)抗体纯化、定量后，在0.01M pH9.0-9.5的碳酸盐缓冲溶液中透析，终浓度约为5mg/ml；
(2)取10mg HRP溶解于2ml H20，终浓度为5mg/ml；
(3)向HRP溶液中加入0.4ml NaIO4(浓度37.5mg/ml)，室温避光搅拌20min；
(4)氧化后的酶液在1mM pH4.4的醋酸盐缓冲液4℃透析(截留12000-14000)过夜，换液3次；
(5)取出透析袋中溶液，加入0.2M Na2CO3缓冲溶液，调至pH为9.0-9.5，并迅速与pH9.0的抗体1∶1混合，室温避光轻微搅拌2h；
(6)加入新配的6mg/ml NaBH4溶液约100ul，混匀，4℃反应2h；
(7)还原后的反应体系，于0.15M pH7.4PBS中4℃透析过夜，换液3次；
(8)加入BSA使终浓度为2-3mg/ml，混匀，10000rpm×3min，收集上清，分装冻存。
3、标准品
标准品为Hepassocin，购自北京蛋白质组研究中心，产品目录号为P2010-002。
4、各种溶液：
样本稀释液的组成：溶剂是20mM、pH6.0的PBS缓冲液，溶质及其在所述样本稀释液中的浓度如下：0.2％(质量百分含量)明胶，0.2％(质量百分含量)酪蛋白，150mMNaCl，0.1ml/L Tween-20，5％(质量百分含量)蔗糖，0.5/万(质量)溴钾酚紫，1ml/L防腐剂Proclin-300；
浓缩洗涤液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度如下：116g/LNa2HPO4·12H2O，11.84g/L NaH2PO4·2H2O，180g/L NaCl，5ml/L吐温20，1ml/L防腐剂Proclin-300；
显色液由显色液A和显色液B组成；
显色液A的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液A中的浓度如下：7.28g/L柠檬酸，23.75g/L磷酸氢二钠，0.5g/L过氧化氢尿；
显色液B的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液B中的浓度如下：100ml/L甲醇，1g/L PVA，1.5g/LNa2S2O3，1ml/L HCl，0.03％(质量百分含量)TMB，1％(质量百分含量)DMSO，
终止液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述终止液中的浓度如下：200ml/1.8L硫酸，1.35g/1.8L EDTA；
标准品稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述标准品稀释液中的浓度如下：1％(质量百分含量)酪蛋白，8％(质量百分含量)海藻糖，3％(质量百分含量)甘露醇，1mM EDTA，0.5％(质量百分含量)甘氨酸，150mM NaCl，1ml/L防腐剂Proclin-300；
检测抗体稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述检测抗体稀释液中的浓度如下：2％(质量百分含量)BSA，0.1％(质量百分含量)酪蛋白，150mM NaCl，0.1ml/L吐温20，5/万(质量百分含量)氨基比啉，1/20万(质量含量)食品红，1ml/L防腐剂Proclin-300。
二、用试剂盒检测的步骤
(一)标准曲线的制作
使用前配制如下溶液：
(1)用检测抗体稀释液稀释所述HRP标记检测抗体，使HRP标记检测抗体的浓度为2μg/ml；
(2)用所述标准品稀释液溶解所述标准品，使所述标准品的浓度依次为0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml。
检测步骤如下：
1.配液：将浓缩洗涤液(20×)用蒸馏水或去离子水1∶20稀释备用(30ml洗涤液稀释至600ml，50ml洗涤液稀释至1000ml)。
2.编号：将样品对应微孔按序编号。
3.加样：分别在相应孔中加入校准品溶液50μl，轻轻振荡混匀。
4.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
5.洗涤：将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。
6.加酶：每孔加入酶结合物100μl，轻轻振荡混匀。
7.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
8.洗涤：用洗涤液充分洗涤5遍，扣干。
9.显色：每孔加入显色液A、B液各50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10分钟。
10.测定：每孔加终止液50μl，轻拍混匀，设定酶标仪波长于450nm处(建议用双波长450/630nm检测)，用空白孔调零点后测定各孔OD值。
11.数据处理：
使用双对数log-log线性拟和方式进行数据处理。以各校准品的OD值(需减去S0的OD值)的对数为纵坐标(Y轴)，各校准品的浓度的对数为横坐标(X轴)作图，得到标准曲线。得到的标准曲线如图1所示。
标准曲线的方程式为y＝437.92x-41.773，相关系数为0.9990。
(二)待测样本的检测
在实验(一)中的步骤3中，加入的是待测样本溶液，在步骤11中，是将待测样本溶液的OD值代入标准曲线，得到待测样本溶液中HPS含量。其余步骤均与实验一中相同。
待测样本为新鲜血清或是新鲜血浆样本，静脉采血后24小时内分离。血清血浆样本在4℃储存时间不得超过1周。如果无法在采血后1周内进行测定，则将血清样本密封后，置于-20℃以下，避免反复冻融。严重溶血、脂血样本不得用于检测。
实施例2、试剂盒的效果
1.测定范围：10～1000ng/ml。
检测方法：将HPS抗原稀释成10、20、50、100、200、500、1000、2000、4000ng/ml，得到HPS系列校准品。每孔加入100μl系列校准品，轻轻振荡混匀。置37℃温育30分钟。洗板5次，每孔加入酶结合物(即酶标抗体)100μl，置37℃温育30分钟。洗板5次，每孔加入显色液A、B液各50μl，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μl，在酶标仪上用450/630nm双波长检测。
结果如表1所示，其中校准品的检测范围为10～1000、相关系数为0.999的拟合曲线如图2所示。
表1、试剂盒测定范围实验结果
Figure BDA0000085665870000071
由上表结果可见，在10～4000ng/ml范围内，随HPS浓度增高，OD值一直上升，直到4000ng/ml未见HOOK效应，但当HPS浓度到达1000ng/ml以上后，OD值的增加速度变缓。从剂量-反应曲线的线性来看，在10～1000ng/ml范围内相关系数大于0.990，考虑到临床实际使用的方便性，将试剂盒校准品的范围定为10～1000ng/ml。
2.相关系数：r≥0.9900
3.分析灵敏度：≤5ng/ml。
每孔加入50μl校准品，其中S0加20孔，其它校准品加双孔。轻轻振荡混匀。置37℃温育30分钟。洗板5次，每孔加入酶结合物100μl，置37℃温育30分钟。洗板5次，每孔加入显色液A、B液各50μl，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μl，在酶标仪上用450/630nm双波长检测。
根据各校准点OD值及相应浓度作Log-Log拟合。计算20孔零校准品OD值的平均值(Mean)和标准差(SD)，由拟合方程计算出OD值为Mean+2×SD时的浓度值为最低检出限即分析灵敏度。
表1分析灵敏度实验结果
  批号   第一批   第二批   第三批
  S0   0.024   0.022   0.021
  S0   0.026   0.026   0.013
  S0   0.016   0.020   0.013
  S0   0.014   0.020   0.016
  S0   0.014   0.025   0.014
  S0   0.024   0.022   0.020
  S0   0.014   0.017   0.017
  S0   0.024   0.019   0.016
  S0   0.013   0.020   0.014
  S0   0.013   0.020   0.025
  S0   0.013   0.015   0.017
  S0   0.019   0.023   0.018
  S0   0.014   0.027   0.013
  S0   0.027   0.012   0.012
  S0   0.021   0.021   0.016
  S0   0.027   0.019   0.025
  S0   0.013   0.022   0.020
  S0   0.020   0.021   0.023
  S0   0.027   0.026   0.013
  S0   0.020   0.017   0.025
  Mean   0.019   0.021   0.018
  SD   0.005   0.004   0.004
  Mean+2SD   0.029   0.029   0.026
  S1(10ng/ml)   0.289   0.306   0.300
  S2(100ng/ml)   0.502   0.513   0.555
  S3(200ng/ml)   1.001   1.075   0.999
  S4(500ng/ml)   2.057   2.002   2.063
  S5(1000ng/ml)   3.057   3.002   3.063
  分析灵敏度(ng/ml)   2.2   2.73   2.69
由上表数据可见，三批试剂盒的分析灵敏度均在10ng/ml以下。
4.特异性：和其它物质的交叉反应数据如下：
检测方法：分别在相应孔中加入标准品或交叉反应物质(200ng/mL癌胚抗原CEA)100μl，轻轻振荡混匀。置37℃温育30分钟。洗板5次，每孔加入酶结合物100μl，置37℃温育30分钟。洗板5次，每孔加入显色液A、B液各50μl，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50μl，在酶标仪上用450/630nm双波长检测。
根据各校准点OD值及相应浓度作Log-Log拟合。根据标准曲线计算各交叉反应物质的HPS测值，此浓度为本试剂与HSA、CEA的交叉值。
表2分析特异性实验结果
特异性是为了检测血液中其它物质对试剂盒测量的干扰。在人血液中容易对HPS的测量造成干扰的物质有癌胚抗原(CEA)，用高浓度的这些物质进行实验，结果表明，试剂盒与这些物质的交叉反应很低，不会对HPS的测量造成干扰。
  反应物质   浓度   交叉反应值
  癌胚抗原(CEA)   200ng/mL   ≤5ng/mL
5.批内变异系数≤15.0％
分析内精密性是在同一块微孔板内测定精密性得到的CV，每个质控血清需在一块板内随机做20孔精密性测定，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，分析内精密度(CV％)＝SD/Mean×100％。
分析间精密性是不同次分析、不同批次间的精密性，随机抽取同一批试剂及不同批次的试剂盒，用这些试剂盒测定质控血清3次，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，分析间精密度(CV％)＝SD/Mean×100％。
本实验中的质控浓度如下：
Q1范围：59.2-93.6ng/ml
Q1靶值：76.4ng/ml；
Q2范围：285.6-401.8ng/ml；
Q2靶值：343.7ng/ml。
表3批内精密实验结果
Figure BDA0000085665870000092
Figure BDA0000085665870000101
从上表数据可知，用三批试剂盒测定高浓度和低浓度两个质控，批内精密度都小于10％，表明试剂盒的均一性良好，结果具有重复性。
表4批间精密实验结果
  Q1   Q2
  第一批   75.9   331
  第二批   76.8   327
  第三批   77.7   351
  平均值   76.8   336
  SD   6.238   23.196
  CV   8.12％   6.90％
从上表数据可知，用三批试剂盒测定高浓度和低浓度两个质控品，批间精密度小于15％，表明不同批次的试剂盒之间变异很小，测量结果具有重复性。
实施例3、用于肝癌诊断
从302医院收集临床样本，共收集到正常人血清482份，良性肝病患者血清236份，肝癌标本171份，用HPS定量测定试剂盒(酶联免疫法)检测各血清样本的HPS含量。
(1)正常人样品测定值分布统计
  浓度范围(ng/ml)   例数
  ＜10   7
  10～30   16
  30～50   61
  50～70   104
  70～90   114
  90～110   96
  110～130   55
  130～150   22
  ＞150   7
  共计   482
(2)良性肝病患者样品测定值统计
  浓度范围(ng/ml)   例数
  ＜50   15
  50～70   12
  70～90   23
  90～110   32
  110～130   44
  130～150   31
  150～170   29
  170～190   24
  190～210   9
  210～230   4
  ＞230   13
  共计   236
(3)肝癌患者样品测定值统计
  浓度范围(ng/ml)   例数
  ＜50   13
  50～100   9
  100～150   29
  150～200   22
  200～250   18
  250～300   22
  300～350   29
  350～400   12
  400～450   10
  450～500   3
  ＞500   4
  共计   171
(4)、数据统计分析确定临界值
不同临界值下灵敏度与特异性表
  临界值   灵敏度％   95％CI   特异性％   95％CI   约登指数
  ＞140.0   73.68   66.42％to 80.11％   84.26   81.39％to 86.85％   0.5794
  ＞140.2   73.1   65.80％to 79.58％   84.4   81.54％to 86.98％   0.575
  ＞140.7   72.51   65.18％to 79.05％   84.4   81.54％to 86.98％   0.5691
  ＞141.5   72.51   65.18％to 79.05％   84.54   81.69％to 87.11％   0.5705
  ＞141.9   72.51   65.18％to 79.05％   84.68   81.83％to 87.24％   0.5719
  ＞142.0   72.51   65.18％to 79.05％   84.82   81.98％to 87.37％   0.5733
  ＞142.3   71.93   64.56％to 78.52％   84.82   81.98％to 87.37％   0.5675
  ＞143.2   71.93   64.56％to 78.52％   84.96   82.13％to 87.49％   0.5689
  ＞144.2   71.93   64.56％to 78.52％   85.1   82.28％to 87.62％   0.5703
  ＞144.5   71.35   63.94％to 77.99％   85.1   82.28％to 87.62％   0.5645
  ＞144.8   71.35   63.94％to 77.99％   85.24   82.43％to 87.75％   0.5659
  ＞145.2   71.35   63.94％to 77.99％   85.38   82.58％to 87.88％   0.5673
  ＞145.5   71.35   63.94％to 77.99％   85.52   82.73％to 88.01％   0.5687
  ＞145.8   71.35   63.94％to 77.99％   85.65   82.87％to 88.14％   0.57
  ＞146.0   71.35   63.94％to 77.99％   85.79   83.02％to 88.27％   0.5714
  ＞146.3   70.76   63.33％to 77.45％   85.79   83.02％to 88.27％   0.5655
  ＞146.7   70.76   63.33％to 77.45％   86.07   83.32％to 88.52％   0.5683
  ＞147.0   70.76   63.33％to 77.45％   86.21   83.47％to 88.65％   0.5697
  ＞147.2   70.76   63.33％to 77.45％   86.35   83.62％to 88.78％   0.5711
  ＞147.8   70.76   63.33％to 77.45％   86.49   83.77％to 88.91％   0.5725
  ＞148.4   70.76   63.33％to 77.45％   86.77   84.07％to 89.16％   0.5753
  ＞148.7   70.76   63.33％to 77.45％   87.05   84.37％to 89.42％   0.5781
  ＞148.8   70.18   62.72％to 76.92％   87.05   84.37％to 89.42％   0.5723
  ＞148.9   70.18   62.72％to 76.92％   87.19   84.52％to 89.54％   0.5737
  ＞149.1   70.18   62.72％to 76.92％   87.33   84.67％to 89.67％   0.5751
  ＞149.3   70.18   62.72％to 76.92％   87.47   84.82％to 89.80％   0.5765
  ＞149.6   70.18   62.72％to 76.92％   87.6   84.97％to 89.93％   0.5778
  ＞149.9   70.18   62.72％to 76.92％   87.74   85.12％to 90.05％   0.5792
  ＞150.0   70.18   62.72％to 76.92％   88.02   85.42％to 90.31％   0.582
  ＞150.3   70.18   62.72％to 76.92％   88.16   85.57％to 90.43％   0.5834
  ＞150.8   69.59   62.10％to 76.38％   88.16   85.57％to 90.43％   0.5775
  ＞151.1   69.59   62.10％to 76.38％   88.3   85.72％to 90.56％   0.5789
  ＞151.3   69.59   62.10％to 76.38％   88.44   85.87％to 90.69％   0.5803
  ＞152.8   69.01   61.49％to 75.84％   88.58   86.02％to 90.81％   0.5759
  ＞154.2   69.01   61.49％to 75.84％   88.72   86.17％to 90.94％   0.5773
  ＞154.6   68.42   60.89％to 75.30％   88.72   86.17％to 90.94％   0.5714
  ＞155.1   67.84   60.28％to 74.76％   88.86   86.33％to 91.07％   0.567
  ＞155.4   67.84   60.28％to 74.76％   89   86.48％to 91.19％   0.5684
  ＞156.1   67.25   59.67％to 74.22％   89   86.48％to 91.19％   0.5625
  ＞156.7   67.25   59.67％to 74.22％   89.14   86.63％to 91.32％   0.5639
  ＞156.8   67.25   59.67％to 74.22％   89.28   86.78％to 91.44％   0.5653
  ＞157.6   67.25   59.67％to 74.22％   89.55   87.08％to 91.69％   0.568
  ＞158.4   66.67   59.07％to 73.68％   89.55   87.08％to 91.69％   0.5622
  ＞158.6   66.08   58.46％to 73.13％   89.55   87.08％to 91.69％   0.5563
  ＞158.9   66.08   58.46％to 73.13％   89.69   87.23％to 91.82％   0.5577
  ＞159.1   66.08   58.46％to 73.13％   89.83   87.39％to 91.95％   0.5591
  ＞159.2   66.08   58.46％to 73.13％   89.97   87.54％to 92.07％   0.5605
  ＞159.3   66.08   58.46％to 73.13％   90.11   87.69％to 92.20％   0.5619
  ＞159.6   66.08   58.46％to 73.13％   90.25   87.84％to 92.32％   0.5633
  ＞160.1   66.08   58.46％to 73.13％   90.39   88.00％to 92.45％   0.5647
  ＞160.7   66.08   58.46％to 73.13％   90.53   88.15％to 92.57％   0.5661
(5)、综合以上结果，确定本试剂盒测定HPS的正常参考范围为：
非肝癌：＜80ng/ml
肝癌：≥80ng/ml
80-100ng/ml为可疑，测值高于100ng/ml时需要复检，若测出值仍高时，则要做动态观察。每周做一次，值无明显变化时，可排除肝癌，如果值升高很快，要继续观察，怀疑肝癌。

Claims (9)

1.一种用于检测Hepassocin的试剂盒，包括抗Hepassocin的抗体1和抗Hepassocin的抗体2，其中所述抗体1作为包被抗体，所述抗体2作为检测抗体；
所述抗体1为抗Hepassocin的单克隆抗体；所述抗体2为抗Hepassocin的多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括标准品，所述标准品为Hepassocin。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括样本稀释液、浓缩洗涤液、显色液、终止液、包被缓冲液、封闭液、标准品稀释液和检测抗体稀释液。
4.根据权利要求1-3中任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述样本稀释液的组成：溶剂是20mM、pH6.0的PBS缓冲液，溶质及其在所述样本稀释液中的质量浓度或摩尔浓或体积浓度如下：0.2％明胶，0.2％酪蛋白，150mMNaCl，0.1ml/L吐温20，5％蔗糖，0.5/万溴钾酚紫，1ml/L防腐剂Proclin-300；
所述浓缩洗涤液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述浓缩洗涤液中的浓度如下：116g/L Na2HPO4·12H2O，11.84g/L NaH2PO4·2H2O，180g/L NaCl，5ml/L吐温20，1ml/L防腐剂Proclin-300；
所述显色液由显色液A和显色液B组成；
所述显色液A的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液A中的浓度如下：7.28g/L柠檬酸，23.75g/L磷酸氢二钠，0.5g/L过氧化氢尿；
所述显色液B的组成：溶剂是水，溶质及其在所述显色液B中的浓度如下：100ml/L甲醇，1g/L PVA，1.5g/L Na2S2O3，1ml/L HCl，0.03％(质量百分含量)TMB，1％(质量百分含量)DMSO；
所述终止液的组成：溶剂是水，溶质及其在所述终止液中的浓度如下：200ml/1.8L硫酸，1.35g/1.8L EDTA；
所述包被缓冲液的组成：溶剂是0.05M、PH值为9.6CB缓冲液，溶质及其在所述包被缓冲液中的质量浓度如下：1/20万染料；
所述封闭液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述封闭液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：20％小牛血清，0.5％酪蛋白，8％蔗糖，150mM NaCl，1ml/L防腐剂Proclin-300；
所述标准品稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述标准品稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：1％酪蛋白，8％海藻糖，3％甘露醇，1mM EDTA，0.5％甘氨酸，150mM NaCl，1ml/L防腐剂Proclin-300；
所述检测抗体稀释液的组成：溶剂是20mM、pH7.4的PBS缓冲液，溶质及其在所述检测抗体稀释液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：2％BSA，0.1％酪蛋白，150mM NaCl，0.1ml/L吐温20，5/万氨基比啉，1/20万染料，1ml/L防腐剂Proclin-300。
5.根据权利要求1-4中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括HRP，并且所述HRP和所述检测抗体以HRP标记检测抗体的形式存在。
6.根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括包被有所述包被抗体的酶标板；
所述包被有所述包被抗体的酶标板按照如下方法制备：
将所述包被抗体溶于所述包被缓冲液中至包被抗体浓度为2μg/ml，得到混合液；将所述混合液加入微孔板的孔中，每孔0.1ml，在37℃放置2小时或在2-8℃放置16-20小时；再向每孔中加入所述封闭液，每孔0.2ml，在37℃放置2小时，得到所述酶标板。
7.用权利要求1-6中任一所述试剂盒检测的方法，包括如下步骤：
用所述标准品稀释液溶解所述标准品，得到标准品工作液，使所述标准品在标准品工作液中的浓度依次为0ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml；
用检测抗体稀释液稀释所述HRP标记检测抗体，得到检测抗体工作液，使HRP标记检测抗体在检测抗体工作液中的浓度为2μg/ml。
8.权利要求1-6中任一所述试剂盒在制备诊断肝损伤相关疾病的试剂盒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述肝损伤相关疾病为肝癌。
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Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103063661A (zh) * 2012-12-21 2013-04-24 杭州茂天赛科技有限公司 一种tmb显色液及其制备方法
CN104101711A (zh) * 2013-04-07 2014-10-15 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种改良的酶联免疫测定试剂盒及其检测方法
CN106483282A (zh) * 2016-09-29 2017-03-08 北京世纪沃德生物科技有限公司 一种抗原稳定剂及其制备方法与应用
CN107561287A (zh) * 2017-08-30 2018-01-09 潍坊市康华生物技术有限公司 一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法
CN108535494A (zh) * 2018-06-29 2018-09-14 湖南师范大学 一种il-6elisa检测试剂盒及其使用方法
CN109633176A (zh) * 2019-01-11 2019-04-16 广东医科大学附属医院 一种肾病基因治疗诊断试剂盒
CN109856408A (zh) * 2019-04-09 2019-06-07 潍坊市康华生物技术有限公司 一种柯萨奇病毒A6型和A10型IgM抗体联合检测试剂盒及其制备方法
CN110297085A (zh) * 2019-06-13 2019-10-01 武汉博士德生物工程有限公司 一种用于增强免疫印迹检测信号的抗体稀释液
CN110954702A (zh) * 2019-12-20 2020-04-03 江苏省中医院 一种血清蛋白hfrep1在类风湿性关节炎疾病状态诊断中的应用
CN113166972A (zh) * 2018-06-11 2021-07-23 耶鲁大学 新型免疫检查点抑制剂
CN113495156A (zh) * 2020-03-20 2021-10-12 郑州达诺生物技术有限公司 一种酶结合物稀释液、一种amh定量检测试剂盒及其使用方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007011896A2 (en) * 2005-07-18 2007-01-25 The Trustees Of Boston University Method to inhibit proliferation and growth of metastases
CN101525614A (zh) * 2009-04-13 2009-09-09 大连美亿德生物科技有限公司 人卵巢癌肿瘤标志物he4酶联免疫诊断试剂盒
CN101672850A (zh) * 2009-01-05 2010-03-17 中山大学 肝硬化与早期肝癌鉴别诊断试剂盒及血清clusterin在制备该试剂盒中的应用
CN101706497A (zh) * 2009-11-05 2010-05-12 武汉三鹰生物技术有限公司 人tff3的elisa检测试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007011896A2 (en) * 2005-07-18 2007-01-25 The Trustees Of Boston University Method to inhibit proliferation and growth of metastases
CN101672850A (zh) * 2009-01-05 2010-03-17 中山大学 肝硬化与早期肝癌鉴别诊断试剂盒及血清clusterin在制备该试剂盒中的应用
CN101525614A (zh) * 2009-04-13 2009-09-09 大连美亿德生物科技有限公司 人卵巢癌肿瘤标志物he4酶联免疫诊断试剂盒
CN101706497A (zh) * 2009-11-05 2010-05-12 武汉三鹰生物技术有限公司 人tff3的elisa检测试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Biochem Biophys Res Commun》 20080125 Zhilin Liu et al Fibrinogen-like-protein 1, a hepatocyte derived protein is an acute phase reactant 第365卷, 第4期 *
MENG-MENG CAO ET AL: "Hepassocin Regulates Cell Proliferation of the Human Hepatic Cells L02 and Hepatocarcinoma Cells Through Different Mechanisms", 《JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY》, vol. 112, no. 10, 26 May 2011 (2011-05-26) *
ZHILIN LIU ET AL: "Fibrinogen–like–protein 1, a hepatocyte derived protein is an acute phase reactant", 《BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN》, vol. 365, no. 4, 25 January 2008 (2008-01-25) *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103063661B (zh) * 2012-12-21 2015-09-09 杭州茂天赛科技有限公司 一种tmb显色液及其制备方法
CN103063661A (zh) * 2012-12-21 2013-04-24 杭州茂天赛科技有限公司 一种tmb显色液及其制备方法
CN104101711A (zh) * 2013-04-07 2014-10-15 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种改良的酶联免疫测定试剂盒及其检测方法
CN104101711B (zh) * 2013-04-07 2016-03-23 广州瑞博奥生物科技有限公司 一种改良的酶联免疫测定试剂盒及其检测方法
CN106483282A (zh) * 2016-09-29 2017-03-08 北京世纪沃德生物科技有限公司 一种抗原稳定剂及其制备方法与应用
CN107561287A (zh) * 2017-08-30 2018-01-09 潍坊市康华生物技术有限公司 一种血管内皮细胞生长因子检测试剂盒及其制备和使用方法
CN113166972A (zh) * 2018-06-11 2021-07-23 耶鲁大学 新型免疫检查点抑制剂
CN108535494A (zh) * 2018-06-29 2018-09-14 湖南师范大学 一种il-6elisa检测试剂盒及其使用方法
CN109633176A (zh) * 2019-01-11 2019-04-16 广东医科大学附属医院 一种肾病基因治疗诊断试剂盒
CN109856408A (zh) * 2019-04-09 2019-06-07 潍坊市康华生物技术有限公司 一种柯萨奇病毒A6型和A10型IgM抗体联合检测试剂盒及其制备方法
CN110297085A (zh) * 2019-06-13 2019-10-01 武汉博士德生物工程有限公司 一种用于增强免疫印迹检测信号的抗体稀释液
CN110954702A (zh) * 2019-12-20 2020-04-03 江苏省中医院 一种血清蛋白hfrep1在类风湿性关节炎疾病状态诊断中的应用
CN113495156A (zh) * 2020-03-20 2021-10-12 郑州达诺生物技术有限公司 一种酶结合物稀释液、一种amh定量检测试剂盒及其使用方法

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