CN109633176A - 一种肾病基因治疗诊断试剂盒 - Google Patents

一种肾病基因治疗诊断试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于试剂盒技术领域，公开了一种肾病基因治疗诊断试剂盒，肾病基因治疗诊断试剂盒包括35倍浓缩洗涤液、酶标试剂、酶标包被板、样品稀释液、显色剂A、显色剂B、终止液、标准品、标准品稀释液、质谱仪、生物素标记试剂Sulfo‑NHS‑LC‑Biontin、缓冲溶液、casein盐溶液、链霉素亲和素和底物TMB。本发明能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测肾病基因标签基因型，利于肾病基因标签检测预测疾病的发生、发展风险；同时，提供的稀释液检测结果精确可靠，分散效果良好，可长期稳定保存，并且可通用于不同的临床免疫诊断项目的样本稀释液，对于临床医学诊断具有重要意义。

Description

一种肾病基因治疗诊断试剂盒
技术领域
本发明属于试剂盒技术领域，尤其涉及一种肾病基因治疗诊断试剂盒。
背景技术
肾脏疾病的主要临床表现有蛋白尿、血尿、水肿、高血压、肾功能不全等。多年来,临床医生根据患者的病史、体检和化验检查进行综合分析,总结出肾小球疾病的几大临床症候群,如急性肾炎综合征、肾病综合征、急进性肾炎综合征、慢性肾炎综合征等作为临床诊断的依据并指导治疗,在肾活检技术开展以前,对肾脏病的诊断与治疗起到了积极的作用。临床综合征诊断的局限性是显而易见的,它必须结合肾组织病理学诊断,才有可能对疾病的病理生理机制和病因进行分析,进而指导诊断和治疗。目前,在一些尚不能开展肾活检的基层医院,仍然停留在临床综合征诊断水平。然而，现有肾病基因治疗诊断试剂盒诊断复杂，诊断结果误差大；同时，检测灵敏度差。
综上所述，现有技术存在的问题是：
现有肾病基因治疗诊断试剂盒诊断复杂，诊断结果误差大；同时，检测灵敏度差。现有肾病基因治疗诊断试剂盒不能检测肾病基因标签单核甘酸多态性位点，功能单一；同时，现有血清或血浆样本粘稠度都较高，采用单纯采用人阴性血清或血浆、小牛血清进行稀释，受检测时间限制，往往难以稀释混合均匀，导致检测结果容易存在一定的偏差。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肾病基因治疗诊断试剂盒。
本发明是这样实现的，一种肾病基因治疗诊断试剂盒包括：
35倍浓缩洗涤液、酶标试剂、酶标包被板、样品稀释液、显色剂A、显色剂B、终止液、标准品、标准品稀释液、质谱仪、生物素标记试剂Sulfo-NHS-LC-Biontin、缓冲溶液、casein盐溶液、链霉素亲和素和底物TMB；
终止液为HCl和H2SO4；
显色剂A由：PBS缓冲液，柠檬酸，ED-TA乙二氨四乙酸，ProcLin-350，过氧化氢组成；
显色剂B由PBS缓冲液，柠檬酸，ED-TA乙二氨四乙酸，ProcLin-350，硫代硫酸钠组成；生物素标记试剂Sulfo-NHS-LC-Biontin、缓冲溶液、casein盐溶液、链霉素亲和素和底物TMB。
进一步，所述缓冲溶液为pH7.0、0.1M的PBS；
所述链霉素亲和素的稀释倍数为1:3000，所使用的稀释液为casein盐溶液。
进一步，酶标包被板内填充有G1：5％SDS，G2：2.3单位/μL蛋白酶，G3A：110mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：尿酸酶，GW：去离子水。
进一步，所述肾病基因治疗诊断试剂盒还包括：
肾蛋白捕获抗体，浓度为1μg/mL；
还包含封闭剂，封闭剂为3.5％BSA溶液，用于封闭酶标包被板；
还包含第一氧化剂，第一氧化剂为pH4.0的含有100mM NaIO 4和50mM柠檬酸的溶液，用于酶标包被板的氧化；
还包含生物素标记的抗体；
还包含采集样品装置及操作说明书。
进一步，样品稀释液为0.15M Tris-HCl、0.18M NaCl、1.5mM CaCl 2、1.5mM MgCl2、pH 7.5的溶液。
进一步，所述G1的容积是100μL，G2的容积是60μL，G3A的容积是20μL，G3B的容积是20μL，G4的容积是45μL，GW的容积是4.5mL；
进一步，所述标准品稀释液进一步包括：缓冲溶液、白蛋白，所述白蛋白的含量为10～100g/L，所述稀释液的pH值为6.0～8.0。
进一步，白蛋白选自血清蛋白、尿液蛋白；
缓冲溶液选自磷酸缓冲溶液PB、磷酸盐缓冲溶液PBS、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液Tris-HCl或其组合。
本发明的另一目的在于提供一种肾病基因治疗诊断试剂盒使用方法包括下列步骤：
在不同试管中先加入2.5μL的含肾蛋白样本，再分别加入5μL G1，使用漩涡振荡器充分混匀，在98℃PCR加热5分钟进行高温变性处理再冷却到4℃得到样品。
在含G1样品试管中加入3.5μL的G2，在含样品试管中加入3.5μL的生物素标记的抗体和3.5μL肾蛋白捕获抗体；混匀离心，在培养箱中37℃保持4小时再冷却到4℃，对冷却后的样品分别加入60μL的去离子水GW终止反应-20℃保存。
分别取15μL低温保存的样品在金属浴中干燥100分钟，再冷却到4℃，对干燥后的含有G1、G2样品试管中加入2.5μL按体积比1:1配置的G3A和G3B的混合液，离心处理，并在培养箱中37℃保持16小时进行荧光标记再冷却到4℃，再加入120μL的GW进行终止反应，混匀离心后-20℃保存；取2.5μL终止反应后样本加入2.5μLG4，混匀离心，在培养箱中37℃，保持20小时，再加入50μL的GW终止反应，混匀离心后取样15μL通过基因测序仪进行分离检测，余液-20℃保存。
在干燥后的含有3.5μL的生物素标记的抗体的样品试管中检测肾蛋白。
本发明的另一目的在于提供一种肾病基因治疗诊断试剂盒检测方法包括：
步骤一，标准品加入标准品稀释液进行稀释；
步骤二，加样；
分别设空白孔，、标准孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加最终稀释度为5倍的待测样品10μl；加样将样品加于酶标板孔底部，不触及孔壁，晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂，剩余各步采用此步骤未使用的试剂液进行标注，操作相同；
步骤三，用封板膜封板后置37℃温育35分钟；
步骤四，将35倍浓缩洗涤液用蒸馏水35倍稀释后备用；
步骤五，揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置35秒后弃去，如此重复5次，拍干；
步骤六，每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；重复步骤三和步骤五操作；
步骤七，每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
步骤八，每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；
步骤九，利用高效液相串联质谱仪对上述液体进行检测，得到肾蛋白含量色谱图。
本发明的优点及积极效果为：本发明通过适宜方法的组合，能够实现快速、简便、准确、高效、实用、经济的检测肾病基因标签基因型，可用于肾病基因在疾病遗传易感性的关联研究，能够满足临床检验实际工作的需要，利于肾病基因标签检测预测疾病的发生、发展风险。
与现有技术相比，其应用焦磷酸测序技术可以快速、准确地进行短基因序列分析，便于构建标准化操作流程，具有高精准、高通量、低成本等优点；操作简便，样品用量少；同时，提供的稀释液检测结果精确可靠，分散效果良好，可长期稳定保存，并且可通用于不同的临床免疫诊断项目的样本稀释液，对于临床医学诊断具有重要意义。
本发明试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对肾病诊断具有重要的临床价值。
附图说明
图1是本发明实施例提供的肾病基因治疗诊断试剂盒检测方法流程图。
具体实施方式
为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。
现有肾病基因治疗诊断试剂盒诊断复杂，诊断结果误差大；同时，检测灵敏度差。
为解决上述问题，下面结合具体方案对本发明作详细的描述。
本发明实施例提供的肾病基因治疗诊断试剂盒包括：
35倍浓缩洗涤液、酶标试剂、酶标包被板、样品稀释液、显色剂A、显色剂B、终止液、标准品、标准品稀释液、质谱仪、生物素标记试剂Sulfo-NHS-LC-Biontin、缓冲溶液、casein盐溶液、链霉素亲和素和底物TMB；
终止液为HCl和H2SO4；
显色剂A由：PBS缓冲液，柠檬酸，ED-TA乙二氨四乙酸，ProcLin-350，过氧化氢组成。
显色剂B由PBS缓冲液，柠檬酸，ED-TA乙二氨四乙酸，ProcLin-350，硫代硫酸钠组成；生物素标记试剂Sulfo-NHS-LC-Biontin、缓冲溶液、casein盐溶液、链霉素亲和素和底物TMB。
作为本发明优选实施例，所述缓冲溶液为pH7.0、0.1M的PBS。
所述链霉素亲和素的稀释倍数为1:3000，所使用的稀释液为casein盐溶液。
作为本发明优选实施例，酶标包被板内填充有G1：5％SDS，G2：2.3单位/μL蛋白酶，G3A：110mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：尿酸酶，GW：去离子水。
作为本发明优选实施例，所述肾病基因治疗诊断试剂盒还包括：肾蛋白捕获抗体，浓度为1μg/mL。
还包含封闭剂，封闭剂为3.5％BSA溶液，用于封闭酶标包被板。
还包含第一氧化剂，第一氧化剂为pH4.0的含有100mM NaIO 4和50mM柠檬酸的溶液，用于酶标包被板的氧化。
还包含生物素标记的抗体。
还包含采集样品装置及操作说明书。
作为本发明优选实施例，样品稀释液为0.15M Tris-HCl、0.18M NaCl、1.5mM CaCl2、1.5mM MgCl 2、pH 7.5的溶液。
作为本发明优选实施例，所述G1的容积是100μL，G2的容积是60μL，G3A的容积是20μL，G3B的容积是20μL，G4的容积是45μL，GW的容积是4.5mL。
作为本发明优选实施例，所述标准品稀释液进一步包括：缓冲溶液、白蛋白，所述白蛋白的含量为10～100g/L，所述稀释液的pH值为6.0～8.0。
作为本发明优选实施例，白蛋白选自血清蛋白、尿液蛋白。
缓冲溶液选自磷酸缓冲溶液PB、磷酸盐缓冲溶液PBS、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液Tris-HCl或其组合。
在本发明实施例中，本发明提供一种肾病基因治疗诊断试剂盒使用方法包括下列步骤：
在不同试管中先加入2.5μL的含肾蛋白样本，再分别加入5μL G1，使用漩涡振荡器充分混匀，在98℃PCR加热5分钟进行高温变性处理再冷却到4℃得到样品。
在含G1样品试管中加入3.5μL的G2，在含样品试管中加入3.5μL的生物素标记的抗体和3.5μL肾蛋白捕获抗体；混匀离心，在培养箱中37℃保持4小时再冷却到4℃，对冷却后的样品分别加入60μL的去离子水GW终止反应-20℃保存。
分别取15μL低温保存的样品在金属浴中干燥100分钟，再冷却到4℃，对干燥后的含有G1、G2样品试管中加入2.5μL按体积比1:1配置的G3A和G3B的混合液，离心处理，并在培养箱中37℃保持16小时进行荧光标记再冷却到4℃，再加入120μL的GW进行终止反应，混匀离心后-20℃保存；取2.5μL终止反应后样本加入2.5μLG4，混匀离心，在培养箱中37℃，保持20小时，再加入50μL的GW终止反应，混匀离心后取样15μL通过基因测序仪进行分离检测，余液-20℃保存。
在干燥后的含有3.5μL的生物素标记的抗体的样品试管中检测肾蛋白。
如图1所示，本发明实施例提供肾病基因治疗诊断试剂盒检测方法包括：
S101:标准品加入标准品稀释液进行稀释。
S102:加样:分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加最终稀释度为5倍的待测样品10μl；加样将样品加于酶标板孔底部，不触及孔壁，晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同。
S103:用封板膜封板后置37℃温育35分钟。
S104:将35倍浓缩洗涤液用蒸馏水35倍稀释后备用。
S105:揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置35秒后弃去，如此重复5次，拍干。
S106:每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；重复步骤三和步骤五操作。
S107:每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
S108:每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。
S109:利用高效液相串联质谱仪对上述液体进行检测，得到肾蛋白含量色谱图。
步骤S102中，剩余各步采用此步骤未使用的试剂液进行标注，操作相同。
本发明以上实验步骤可按试剂盒操作说明书进行。
以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种肾病基因治疗诊断试剂盒，其特征在于，所述肾病基因治疗诊断试剂盒包括：
35倍浓缩洗涤液、酶标试剂、酶标包被板、样品稀释液、显色剂A、显色剂B、终止液、标准品、标准品稀释液、质谱仪、生物素标记试剂Sulfo-NHS-LC-Biontin、缓冲溶液、casein盐溶液、链霉素亲和素和底物TMB；
终止液为HCl和H2SO4；
显色剂A由：PBS缓冲液，柠檬酸，ED-TA乙二氨四乙酸，ProcLin-350，过氧化氢组成；
显色剂B由PBS缓冲液，柠檬酸，ED-TA乙二氨四乙酸，ProcLin-350，硫代硫酸钠组成；生物素标记试剂Sulfo-NHS-LC-Biontin、缓冲溶液、casein盐溶液、链霉素亲和素和底物TMB。
2.如权利要求1所述肾病基因治疗诊断试剂盒，其特征在于，所述缓冲溶液为pH7.0、0.1M的PBS；
所述链霉素亲和素的稀释倍数为1:3000，所使用的稀释液为casein盐溶液。
3.如权利要求1所述肾病基因治疗诊断试剂盒，其特征在于，酶标包被板内填充有G1：5％SDS，G2：2.3单位/μL蛋白酶，G3A：110mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：尿酸酶，GW：去离子水。
4.如权利要求1所述肾病基因治疗诊断试剂盒，其特征在于，所述肾病基因治疗诊断试剂盒还包括：
肾蛋白捕获抗体，浓度为1μg/mL；
还包含封闭剂，封闭剂为3.5％BSA溶液，用于封闭酶标包被板；
还包含第一氧化剂，第一氧化剂为pH4.0的含有100mM NaIO4和50mM柠檬酸的溶液，用于酶标包被板的氧化；
还包含生物素标记的抗体；
还包含采集样品装置及操作说明书。
5.如权利要求1所述肾病基因治疗诊断试剂盒，其特征在于，样品稀释液为0.15MTris-HCl、0.18M NaCl、1.5mM CaCl2、1.5mM MgCl2、pH 7.5的溶液。
6.如权利要求3所述的肾病基因治疗诊断试剂盒，其特征在于，所述G1的容积是100μL，G2的容积是60μL，G3A的容积是20μL，G3B的容积是20μL，G4的容积是45μL，GW的容积是4.5mL。
7.如权利要求1所述的肾病基因治疗诊断试剂盒，其特征在于，所述标准品稀释液进一步包括：缓冲溶液、白蛋白，所述白蛋白的含量为10～100g/L，所述稀释液的pH值为6.0～8.0。
8.如权利要求7所述的肾病基因治疗诊断试剂盒，其特征在于，白蛋白选自血清蛋白、尿液蛋白；
缓冲溶液选自磷酸缓冲溶液PB、磷酸盐缓冲溶液PBS、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液Tris-HCl或其组合。
9.一种如权利要求1所述的肾病基因治疗诊断试剂盒使用方法，其特征在于，肾病基因治疗诊断试剂盒使用方法包括下列步骤：
在不同试管中先加入2.5μL的含肾蛋白样本，再分别加入5μL G1，使用漩涡振荡器充分混匀，在98℃ PCR加热5分钟进行高温变性处理再冷却到4℃得到样品；
在含G1样品试管中加入3.5μL的G2，在含样品试管中加入3.5μL的生物素标记的抗体和3.5μL肾蛋白捕获抗体；混匀离心，在培养箱中37℃保持4小时再冷却到4℃，对冷却后的样品分别加入60μL的去离子水GW终止反应-20℃保存；
分别取15μL低温保存的样品在金属浴中干燥100分钟，再冷却到4℃，对干燥后的含有G1、G2样品试管中加入2.5μL按体积比1:1配置的G3A和G3B的混合液，离心处理，并在培养箱中37℃保持16小时进行荧光标记再冷却到4℃，再加入120μL的GW进行终止反应，混匀离心后-20℃保存；取2.5μL终止反应后样本加入2.5μLG4，混匀离心，在培养箱中37℃，保持20小时，再加入50μL的GW终止反应，混匀离心后取样15μL通过基因测序仪进行分离检测，余液-20℃保存；
在干燥后的含有3.5μL的生物素标记的抗体的样品试管中检测肾蛋白。
10.一种如权利要求1所述的肾病基因治疗诊断试剂盒的检测方法，其特征在于，所述肾病基因治疗诊断试剂盒检测方法包括：
步骤一，标准品加入标准品稀释液进行稀释；
步骤二，加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加最终稀释度为5倍的待测样品10μl；加样将样品加于酶标板孔底部，不触及孔壁，晃动混匀；空白对照孔不加样品及酶标试剂，剩余各步采用此步骤未使用的试剂液进行标注，操作相同；
步骤三，用封板膜封板后置37℃温育35分钟；
步骤四，将35倍浓缩洗涤液用蒸馏水35倍稀释后备用；
步骤五，揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置35秒后弃去，如此重复5次，拍干；
步骤六，每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；重复步骤三和步骤五操作；
步骤七，每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
步骤八，每孔加终止液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色；
步骤九，利用高效液相串联质谱仪对上述液体进行检测，得到肾蛋白含量色谱图。
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