CN104807998A - 一种早期肝癌诊断试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种早期肝癌诊断试剂盒及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种早期肝癌诊断试剂盒，包括G1：5％SDS，G2：2.2单位/μL糖酰胺酶，G3A：100mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：唾液酸酶，GW：去离子水；还公开了试剂盒的使用方法；解决了甲胎蛋白对于肝癌的漏诊率高的问题；可以快速简便准确检测肝癌和跟踪检测肝癌治疗效果。

Description

一种早期肝癌诊断试剂盒及其使用方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种早期肝癌诊断试剂盒及其使用方法。
背景技术
HCC是全球最常见的恶性肿瘤之一，因病情进展快、预后差、早期诊断困难、治疗手段有限而死亡率高。糖蛋白链参与细胞识别、信号传导、免疫监视，维持着多细胞生物体内各项有序生命活动，因而糖链的异常改变通常与多种疾病包括肿瘤发生发展密切相关。
相比于目前诊断肝癌的各种成像技术，比如超声检查，计算机断层扫描，磁共振成像等，这些技术不能分辨良性的肝变化，例如发育不良的结节和硬化的大结节与肝癌的区别。业内主要选择血清肿瘤标志物来检测恶性肿瘤，而血清甲胎蛋白(AFP)作为唯一被广泛应用于诊断及复查肝癌的血清标志物，最近的分析显示AFP检测的灵敏度和特异性都有较大的波动范围，而且这些波动并不完全由于使用了不同的截止水平的阈值效应。目前，在临床上缺乏灵敏、特异的早期肝癌诊断标志物，能检测出的早期肝癌病例大约占所有肝癌病例的25％。因此，可以快速简便准确检测肝癌和跟踪检测肝癌治疗效果的检测产品具有十分广阔的市场。
发明内容
本发明的目的是提供一种可快速简便准确检测早期肝癌诊断试剂盒及其使用方法。
实现本发明目的的技术方案是一种早期肝癌诊断试剂盒，包括G1：5％SDS，G2：2.2单位/μL糖酰胺酶，G3A：100mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：唾液酸酶，GW：去离子水。
优选的所述G1的容积是90μL，G2的容积是54μL，G3A的容积是18μL，G3B的容积是18μL，G4的容积是36μL，GW的容积是3.6mL。
一种早期肝癌诊断试剂盒的使用方法，包括下列步骤：(1)在试管中先加入2μL的样本血清，再加入5μLG1，使用漩涡振荡器充分混匀，在95℃PCR加热5分钟进行高温变性处理再冷却到4℃得到样品；(2)在所述样品中加入3μL的G2，混匀离心，在培养箱中37℃保持3小时再冷却到4℃，对冷却后的样品加入50μL的GW终止反应可低温保存；(3)取10μL低温保存的样品在金属浴中干燥90分钟，再冷却到4℃，对干燥后的样品加入2μL按体积比1:1配置的G3A和G3B的混合液，离心处理，并在培养箱中37℃保持16小时进行荧光标记再冷却到4℃，再加入100μL的GW进行终止反应，混匀离心后可低温保存；(4)取2μL终止反应后样本加入2μLG4，混匀离心，在培养箱中37℃保持16小时，再加入40μL的GW终止反应，混匀离心后取样10μL通过基因测序仪进行N-寡糖链片段分离检测，余液可低温保存。
优选的所述步骤(2)、(3)和(4)中的低温保存温度是-20℃。
优选的所述步骤(2)、(3)和(4)中的终止反应时长是1分钟。
本发明具有积极的效果：通过对唾液酸酶的反应时间、浓度、温度进行调控，节省时间成本，缩短了整个反应周期，提高生产效率；原材料经济适用，利于规模扩大化生产；可以有效降低AFP(甲胎蛋白)对于肝癌的漏诊率，保证了可观的准确率。
具体实施方式
本发明试剂盒使用方法是通过高温使蛋白变性，游离出所需要的寡糖，并通过在寡糖末端加上带电荷的荧光基团，以增加其灵敏度，并实现可选择的分离，采用基因测序仪ABI3500分析并测量样本中荧光标记的N-寡糖链的含量或指纹图谱(简称G-Test图谱)，分析比较N-寡糖各组分的峰高，利用方程计算出NA3F/(NA2F+NA2FB)比值。
试剂盒只需要一滴血，通过运用基于糖蛋白糖链检测的肝癌疗效评价技术，一般仅需要2，3天就可以准确的检测出肝癌情况，同时对于未患肝癌的肝脏进行健康评估，能准确、快速、方便的检测肝癌发病情况，清晰的疗效评价指标对于病情发展有着重要的作用，在检测过程中灵敏度高，检测结果准确，具有安全无损伤，快速简捷等特点。
这种早期肝癌诊断试剂盒，包括G1：5％SDS，90μL/瓶；G2：2.2单位/μL糖酰胺酶，54μL/瓶；G3A：100mM三磺酸三钠盐荧光标记物，18μL/瓶；G3B：1M有机物还原剂，18μL/瓶；G4：唾液酸酶，36μL/瓶；GW：去离子水，3.6mL/瓶，其中的G1，G2，G3A，G3B，G4，GW均为无色透明的液体，均在4℃下保存，其中G3A与G3B需避光保存，有效期为一个月，对于肝癌的检测准确度达到85％。
使用方法的步骤包括：(1)在试管中先加入2μL的样本血清，再加入5μLG1，使用漩涡振荡器充分混匀，在95℃PCR加热5分钟进行高温变性处理再冷却到4℃得到样品；(2)在所述样品中加入3μL的G2，混匀离心，在培养箱中37℃保持3小时再冷却到4℃，对冷却后的样品加入50μL的GW终止反应1分钟可低温-20℃保存；(3)取10μL低温保存的样品在金属浴中干燥90分钟，再冷却到4℃，对干燥后的样品加入2μL按体积比1:1配置的G3A和G3B的混合液，离心处理，并在培养箱中37℃保持16小时进行荧光标记再冷却到4℃，再加入100μL的GW进行终止反应1分钟，混匀离心后可低温-20℃保存；(4)取2μL终止反应后样本加入2μLG4，混匀离心，在培养箱中37℃保持16小时，再加入40μL的GW终止反应1分钟，混匀离心后取样10μL通过基因测序仪进行N-寡糖链片段分离检测，余液可低温-20℃保存。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种早期肝癌诊断试剂盒，其特征在于：包括G1：5％SDS，G2：2.2单位/μL糖酰胺酶，G3A：100mM三磺酸三钠盐荧光标记物，G3B：1M有机物还原剂，G4：唾液酸酶，GW：去离子水。
2.根据权利要求1所述的早期肝癌诊断试剂盒，其特征在于：所述G1的容积是90μL，G2的容积是54μL，G3A的容积是18μL，G3B的容积是18μL，G4的容积是36μL，GW的容积是3.6mL。
3.一种如权利要求1或2所述的早期肝癌诊断试剂盒的使用方法，包括下列步骤：(1)在试管中先加入2μL的样本血清，再加入5μLG1，使用漩涡振荡器充分混匀，在95℃PCR加热5分钟进行高温变性处理再冷却到4℃得到样品；(2)在所述样品中加入3μL的G2，混匀离心，在培养箱中37℃保持3小时再冷却到4℃，对冷却后的样品加入50μL的GW终止反应可低温保存；(3)取10μL低温保存的样品在金属浴中干燥90分钟，再冷却到4℃，对干燥后的样品加入2μL按体积比1:1配置的G3A和G3B的混合液，离心处理，并在培养箱中37℃保持16小时进行荧光标记再冷却到4℃，再加入100μL的GW进行终止反应，混匀离心后可低温保存；(4)取2μL终止反应后样本加入2μLG4，混匀离心，在培养箱中37℃保持16小时，再加入40μL的GW终止反应，混匀离心后取样10μL通过基因测序仪进行N-寡糖链片段分离检测，余液可低温保存。
4.根据权利要求3所述的早期肝癌诊断试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)和(4)中的低温保存温度是-20℃。
5.根据权利要求3所述的早期肝癌诊断试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)和(4)中的终止反应时长是1分钟。
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