CN103877748A - 通过混合模式液相色谱法分离聚糖 - Google Patents

通过混合模式液相色谱法分离聚糖 Download PDF

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Abstract

本发明的一种示例性多峰色谱介质包括与一种或多种反相和/或亲水相互作用色谱结合位点组合的一种或多种强阴离子交换、弱阴离子交换、强阳离子交换和/或弱阳离子交换的结合位点。在一个示例性实施例中，这些位点与一种聚糖混合物中的一种或多种聚糖相互作用，其方式为允许分离该混合物中的聚糖并且分析该聚糖混合物。将这种介质结合到用于色谱分析的装置和系统中。还提供了使用本发明的多峰介质来分析聚糖的方法。

Description

通过混合模式液相色谱法分离聚糖
发明背景
聚糖作为糖蛋白类、糖脂类、和蛋白聚糖类的一部分以游离状态以及共轭形式广泛分布在生物系统中。它们被包括在广泛范围的生物和生理过程中，这些生物和生理过程包括认知、调节功能、细胞交流、基因表达、蛋白质治疗的稳定性和活性、细胞免疫、生长和发育。聚糖的生物和生理功能常常取决于附接在这些蛋白质和脂类上的低聚糖的结构和类型。聚糖的结构由于转译后修饰和生理条件是相当多样和复杂的。因此，分析综合的聚糖谱（profiles）（即，糖组）并且确定用于临床用途的聚糖的结构是具有高度挑战性的。
HPAEC-PAD（具有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱）是对于聚糖分析开发的第一种常规测定方法。该离子色谱（IC）方法可以经由在高pH下聚糖的羟基基团与色谱介质的特殊相互作用来分离糖类。这些聚糖作为阴离子种类进行色谱分析并且基于聚糖电荷、尺寸、构成、异构体和连接键与柱相互作用。该分析方法提供存在于一种产品上的、或在一个特定糖基化位点上的整体糖基化或低聚糖群体的谱，这可以用于分批比较研究。然而，聚糖的HPAEC-PAD分离的一个显著缺点是需要使用相对高的盐浓度。在此种情况下，常常使用一种脱盐柱，以使得流动相与质谱法相兼容。
对于聚糖的分析已开发了不同模式的HPLC分离，包括正相或亲水相互作用（HILIC）、离子交换和反相。因为聚糖是高度亲水和极性的物质，所以HILIC广泛用于聚糖分析。这些分离柱典型地是酰胺、胺或基于两性离子的填充材料。该酰胺HILIC柱主要通过氢键合分离聚糖，导致基于尺寸和构成的分离。然而，用该方法可以实现不基于电荷的分离。基于胺的和两性离子的柱均显示了与带电聚糖（自然的或标记的）的相互作用，并且尽管它们基于电荷分离聚糖，它们提供了在具有相同电荷（例如，电荷的极性和/或大小）的聚糖之间的相对低的分辨率。此外，在多样的带电聚糖之间的固有地强烈的离子相互作用和固定相常常要求高洗脱缓冲剂浓度，不利地影响MS灵敏度。
一些报道已经描述了使用氨基的或季铵化胺基的柱作为用于聚糖分析的阴离子交换/HILIC混合模式柱（Ruhaak等人，分析化学和生物分析化学（Anal.Bioanal Chem）（2010）397:3457-3481；Anumula等人，分析生物化学（AnalBiochem）（2000）283:17-26；以及Neville等人，蛋白质组研究杂志（J ProteomeRes）（2009）8:681-687）。然而，以上参考的这些氨基或季铵化胺基的柱只具有一种模式，该模式是一种离子交换模式，并且因此不是混合模式。此外，这些柱只具有一种类型的色谱官能团，该色谱官能团在此种情况下是一种氨基亦或季铵化的胺基。以上这些参考文献未描述在该氨基基团将具有中性电荷（即，未质子化的）的pH范围内的分离条件。应注意，季铵化的胺基甚至在高pH下不能具有中性电荷。一种质子化的胺基基团将作为阴离子交换基团并且不作为HILIC基团。应该注意的是，尽管随着增加溶剂浓度而增加保留时间提供了一种HILIC相互作用的证据，但它还提供其他保留模式，如离子交换模式和盐与两性离子的相互作用模式的证据。这样，随着增加溶剂浓度而增加保留时间自身并不表明一种HILIC相互作用。氨基和季铵化的胺基的柱遭受具有长保留时间（例如，>60分钟）并且要求相对高的盐浓度的缺点影响。总体上，相对高的盐浓度干扰用质谱法检测聚糖。
报道已经描述了使用两性离子磺基甜菜碱柱作为一个两性离子的离子色谱（ZIC）/HILIC混合模式柱用于聚糖分析（Ruhaak等人，分析化学和生物分析化学（Anal.Bioanal Chem）（2010）397:3457-3481；Takegawa等人，色谱法杂志A辑（Journal of Chromatography A）（2006）1113:177-181；以及Takegawa等人，分离科学杂志（J Sep Sci）（2006）29:2533-2540）。然而，以上参考的这些两性离子柱只具有一种模式，该模式是一种基于磺基甜菜碱固定相的两性离子模式，并且因此不是混合模式。此外，这些柱只具有一种类型的色谱官能团，该官能团在此种情况下是一种两性离子磺基甜菜碱基团。此类磺基甜菜碱基团在非常广泛的pH范围内是净中性的，以取决于离子强度的方式经由静电机制与盐相互作用，这不同于不带电的HILIC机制。应该注意的是，尽管随着增加溶剂浓度而增加保留时间提供HILIC相互作用的证据，它还表明了其他保留模式，如离子交换模式和盐与两性离子的相互作用的模式。这样，随着增加溶剂浓度而增加保留时间自身并不表明一种HILIC相互作用。该两性离子相柱遭受对于具有相同电荷的聚糖基团显示相对差的分辨率的缺点影响。
通常非常希望的是通过使用质谱法检测和表征洗出液中的聚糖分析物，然而，本领域清楚地传授，当与质谱检测相结合时，在阴离子交换相是高度离子化的条件下进行工作是不可接受的。该两性离子模式经由一种盐交换保留机制进行工作，这比离子交换固有地具有更低的选择性。高溶剂浓度仅仅增加这些盐交换相互作用的强度。
申请人相信，存在对于新的多峰色谱介质以及使用这些介质分析聚糖的方法的需要，该方法将理想地提供在不同聚糖之间的高分辨率，基于尺寸、构成、结构（例如，异构体、连接键）、和/或电荷的单一选择性。而且，申请人还相信，如果可以通过不具有、或具有极小的清理或纯化后分析和预检测（例如，荧光标记）的标准方法学（例如，质谱法、荧光检测）来检测从该介质中洗脱出来的聚糖，这将大大简化并且有助于聚糖分析。本发明提供此类色谱介质以及使用它们的方法。
发明概述
在一个示例性实施例中，本发明提供一种在聚糖混合物的分析中具有独特使用特性的真正的多峰色谱介质（固定相）。本发明的色谱介质包括一个离子交换色谱部分和一个结合到一种固体基质（例如，颗粒、单块）上的不带电的色谱部分。在不同的实施例中，该不带电的色谱部分是一个反相色谱部分和一个亲水相互作用色谱部分中的一个或多个。这些离子交换部分是弱的或强的阴离子或阳离子交换部分。本发明的色谱介质是一种双峰或三峰的色谱介质，适合于分析广泛范围的聚糖，包括在含有聚糖的生物分子中存在的那些聚糖。
在它的优点之中，本发明的多峰色谱介质是用于通过HPLC分析聚糖的一种优异方法的一种组成部分，并且是基于提供对于不同聚糖的所希望的选择性的高度多用途的化学平台。此外，与现有技术相比，本发明提供基于在电荷、连接键、异构体和尺寸上的差异的对于复合聚糖的优异分辨率。因为该多峰介质的独特化学性质，来自在该介质上的聚糖的色谱分离的洗脱液与通过荧光和质谱法检测洗脱的聚糖是高度相兼容的。
在不同的实施例中，本发明提供在分析和/或分离聚糖混合物中使用这种多峰色谱介质的方法。在一个示例性实施例中，本发明提供一种将聚糖混合物的一种第一聚糖组分与一种第二聚糖组分分离的多峰色谱方法。一种示例性方法包括，(a)使该聚糖混合物与一种多峰色谱介质接触，该多峰色谱介质包含一个结合到一种第一基质上的离子交换色谱部分和一个结合到一种第二基质上的不带电的色谱部分。该不带电的色谱部分选自一个反相色谱部分、一个亲水相互作用色谱部分以及它们的组合。如在一种色谱程序中典型的，在有效地实现该聚糖混合物的至少两种组分的分离的条件下，通过使该介质和同介质结合的聚糖与一种洗脱液接触，将该聚糖混合物从该柱中洗脱出来。在一个示例性实施例中，所述洗脱液包含适合于在阴离子交换或阳离子交换色谱法中使用的并且与该色谱介质兼容的一种电解质。
在不同的实施例中，本发明还提供用于通过在离子交换的活化类似物与在一种固体载体上的具有互补反应性基团的不带电的色谱部分之间的反应来制备本发明的色谱介质的方法。
在本发明的所选择的实施例中还提供含有本发明的多峰介质的色谱装置（例如柱），以及使用该介质和此类装置进行聚糖的色谱分离和分析的方法。
在一个示例性实施例中，本发明提供了一种色谱系统，该色谱系统包括一种含有本发明的色谱介质的分离装置。该系统任选地进一步包括在进行一种聚糖的色谱分离中使用的部件，例如，一种质谱或荧光检测器。
在以下详细说明中提供本发明的其他目的、优点和方面。
附图简要说明
图1是示出通过一个填充有WAX/HILIC（相22，1.9μm）的柱从牛胎球蛋白中分离2AB连接的N-聚糖的色谱图。通过荧光检测来检测这些峰。该色谱分析是在Ultimate-3000UHPLC仪器上进行的。中性聚糖峰在单唾液酸化的聚糖之前被洗脱，单唾液酸化的聚糖在二唾液酸化的之前被洗脱，双唾液酸化的种类在三唾液酸化的峰之前被洗脱，三唾液酸化的在四唾液酸化的之前并且四唾液酸化的在五唾液酸化的种类之前被洗脱。
图2A和2B是示出通过一个填充有WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱的柱从人类IgG中分离2AA连接的N-聚糖的色谱图。该分离使用Ultimate3000UHPLC系统使用二元梯度条件进行。用Q-Exactive仪器记录MS光谱。A.通过一个荧光检测器检测峰，B.通过具有从400道尔顿至2200道尔顿的质谱扫描范围的处于负模式的MS检测来检测峰。通过来自Simglycan软件的LC-MS/MS数据来表征每个峰上的聚糖。在表1中示出了存在于IgG中的聚糖的清单。
图3A和3B是示出通过两种不同的柱从牛胎球蛋白中的2AB连接的N-聚糖的对比分离的色谱图。这两种柱的所有峰通过具有质谱扫描范围400道尔顿至2200道尔顿的处于负模式的MS检测来检测。A.在一个WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱中的色谱分析，B.在一个商业酰胺HILIC柱（1.7μm）中的色谱分析。该WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱提供就基于电荷、尺寸、极性的选择性和基于峰宽度的分辨率而言优于1.7μm商业酰胺HILIC柱的分离。在实例部分中提供用于分离的梯度条件。在表7中示出了在牛胎球蛋白中所识别的聚糖的清单。
图4是使用一个WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱的来自牛胎球蛋白的未标记的N-聚糖的LC-MS分析。未标记的聚糖是基于电荷、尺寸和极性而进行分离。所有的聚糖峰通过具有400道尔顿至2200道尔顿的质谱扫描范围的处于负模式的MS检测来检测。未标记的聚糖的N-聚糖谱定量地不同于来自牛胎球蛋白的同一样品的标记的聚糖。例如，在图4中未标记的聚糖的双唾液酸化的聚糖峰7-12的定量谱不同于图3A中的2AB-标记的二脱唾液酸化的聚糖峰11-15。
图5是使用WAX/RP（相21，1.9μm）混合模式柱从牛胎球蛋白中分离2AB-N-聚糖。聚糖是使用基于电荷、尺寸、异构体和极性的高分辨率（分辨出多达40个峰）来进行分离的。
该柱提供来自牛胎球蛋白的2AB标记的N-聚糖的峰的数量（～44）多于如分别在图3B和图3A中示出的一种示例性商业柱（≤26个峰）和WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱。
图6是示出使用一步梯度条件使用一个WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱从牛胎球蛋白中分离2AB标记的N-聚糖的色谱图。该流动相具有的水性比例高于在图1中使用的，导致具有共同电荷的所有聚糖作为一个单一峰聚结在一起并且允许对于这些电荷状态各自的容易和准确的定量。通过荧光检测来检测这些峰。由每个峰的曲线下相对面积（AUC）（表10）来确定对于每个电荷状态聚糖的定量。
图7示出了WAX/RP混合模式介质的制备。
图8是对于阴离子交换/反相混合模式相的阴离子交换容量测定的色谱图。柱：相21（1.9-μm）；尺寸：2.1×150-mm；流动相：乙腈/100mM乙酸铵缓冲剂，pH5=50/50（v/v）；流速：0.21mL/min；注射体积：1μL；温度：30℃；检测：220nm下的UV；峰：1.尿嘧啶；2.辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基铵（octylphenoxyethoxyethyl dimethylbenzyl ammonium）；3.甲苯磺酸钠；以及4.丙基苯。
图9示出了WAX/HILIC混合模式介质的制备。
图10是对于HILIC/阴离子交换混合模式相的阴离子交换容量测定的色谱图。柱：相22（1.9-μm）；尺寸：2.1×150-mm；流动相：乙腈/100mM乙酸铵缓冲剂，pH5=90/10（v/v）；流速：0.21mL/min；注射体积：1μL；温度：30℃；检测：220nm下的UV；峰：1.醋氨酚；2.水杨酸；以及3.乙酰水杨酸。
图11是HILIC/WAX/SCX混合三峰介质(33)和HILIC/WAX/WCX混合三峰介质(34)的示意图。
发明详细说明
I.前言
本领域的液相柱色谱法是用于从样品中分离物质并且用于分析样品的成分的一种古老和熟知的方法。取决于样品和有待从其中分离的材料，各种各样的液相柱色谱法模式中的一种或多种用于实现该分离。此类色谱模式包括尺寸排除（SEC）、离子交换、反相、正相、亲水相互作用、疏水相互作用、亲和、供体-受体、离子对以及手性分离色谱法。
不同分离方式的组合也可以在分离和分析中使用。混合模式色谱法是其中一种色谱介质通过多于一种的相互作用模式与溶质（分析物）相互作用的色谱法类型。混合模式色谱法介质可以将IEX和RP特性或IEX和HILIC特性进行组合。混合模式色谱法可以提供高分辨率、可调节的选择性、高样品负载、不需要离子配对试剂（MS-相容性）、以及在某些环境中替换两个常规的相对应的柱的能力。
当与其中生物聚合物（像蛋白质或核酸）与小分子（如药物、代谢物、污染物、外毒素和内毒素，等等）一起存在的大量生物样品一起使用时，许多双峰分离失效。由于样品预处理，像溶剂萃取、固相萃取或超滤是费时和冗长的，已经开发了新的色谱介质，这些色谱介质可以防止用于在反相或离子交换色谱法中分离的基团之间的接触。大多使用具有防止大分子渗透到珠粒中的非常小的孔的介质（全排除）。由粘在珠粒表面上的蛋白质造成的柱的阻塞通过提供具有亲水基团的表面而被抑制。近来综述了该方法（Pinkerton T.C.，色谱（J.Chromatogr.），544,(1991)13；Haginaka J.，分析化学发展趋势（Trends Anal Chem.），10,(1991)17）它可以被称为假多峰，作为这些模式之一，实际上不是一种色谱法，而是一种简单的类过滤分离（超过一种尺寸限制的所有分子的全排除）。
本发明提供了具有多种独特色谱特性的色谱介质，该色谱介质作为固定相对于聚糖的色谱分离和分析、以及固相萃取（SPE）是有用的。在某些实施例中，本发明的色谱介质包括两个或更多个具有阴离子交换能力、阳离子交换能力、反相能力或亲水相互作用能力的不同色谱部分。在不同的实施例中，这些两个或更多个不同的色谱部分被结合到固体载体的同一单元上（例如，至同一颗粒上）。在其他实施例中，该介质通过将具有一个或多个结合到固体载体的同一单元上的色谱部分的两种或更多种材料进行组合而形成。
在示例性实施例中，本发明还提供使用本发明的介质来分离和分析聚糖混合物的方法、在这些方法中使用的装置以及结合有此类装置的系统。
在更加详细地描述本发明之前，应当理解的是，本发明不限制于在此描述的具体实施例，因为此类实施例可以变化。还应当理解的是，在此使用的术语仅是为了描述具体实施例的目的，并且该术语并非旨在是限制性的。本发明的范围将只受所附权利要求书限制。除非另外定义，在此使用的所有的技术和科学术语具有如本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。当提供了数值的范围时，应当理解的是，在该范围的上限和下限之间的每个居中值（至该下限的单位的十分之一，除非上下文清楚地另外规定），以及在所陈述范围内的任何其他陈述的或居中的值被涵盖在本发明内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在这些更小范围内并且还被涵盖在本发明内，经受在所陈述范围中的任何具体地排除的极限。当所述的范围包括这些极限中的一个或两个时，排除这些被包括的极限中的任一个或两个的范围也被包括在本发明中。某些范围用冠以术语“大约”的数值在此提出。术语“大约”在此用于为其后的精确数字、以及接近或近似该术语先于的数字提供字面支持。在确定一个数字是否接近或近似一个具体叙述的数字时，该接近或近似的未叙述的数字可以是在它被提出的上下文中提供该具体叙述的数字的实质等价物的一个数字。本说明书引用的所有公开、专利、和专利申请通过引用而结合于此至与如同对每个单独的公开、专利、或专利申请具体地和单独地表明通过引用被结合相同的程度。此外，每个引用的公开物、专利、或专利申请通过引用结合在此，以便披露和描述与所引用公开相关的主题。任何公开物的引用是为了在申请日之前的其披露并且应该被解释为承认在此描述的本发明没有资格早于借助在先发明的此类公开。另外，提供的公开日可能不同于实际的公开日，这可能需要独立地进行确认。
应注意的是，这些权利要求可以被起草以排除任何任选的元素。这样，这种陈述旨在作为使用与权利要求元素的叙述有关的此类排他性术语如“仅（solely）”、“只（only）”等等，或使用“否定性”限制的前提基础。如当阅读本披露时，将对本领域普通技术人员清楚的是，在此描述和说明的这些单独实施例各自具有分立的组成部分和特征，它们可容易地与其他几个实施例中任何一个的特征分离或与其结合，而不脱离本发明的范围或精神。任何所叙述的方法可以按所叙述事件的顺序或按逻辑上可能的任何顺序来进行。尽管与在此描述的那些类似或等价的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试中，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
在描述本发明中，以下术语将被使用，并且是如以下所表明的而定义的。
II.缩写
弱阴离子交换（“WAX”）；强阴离子交换（“SAX”）；弱阳离子交换（“WCX”）；强阳离子交换（“SCX”）；亲水相互作用液相色谱法（“HILIC”）；2-氨基苯甲酰胺（2AB）；2-氨基苯甲酸（2AA）；去离子的（D.I.）。
III.定义
在取代基是通过它们从左向右所书写的常规化学式来说明的情况下，它们任选地涵盖将因从右向左书写该结构而产生的化学上相同的取代基，例如，-CH2O-旨在也叙述-OCH2-。
除非另外说明，否则术语“烷基”独自或作为另一个取代基的一部分意指一个直链或支链、或环状烃基、或其组合，该烷基可以是完全饱和的、单或多不饱和的，并且可以包括具有指定碳原子数（即，C1-C10意指一个至十个碳）的二价和多价基团。饱和烃基的实例包括（但不限于）如下基团：如甲基、乙基、正丙基（例如，-CH2-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-）、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基是具有一个或多个双键或三键的基团。不饱和烷基的实例包括（但不限于）乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及更高级的同系物和异构体。除非另外指出，否则术语“烷基”还意在包括以下更详细定义的烷基的衍生物，如“杂烷基”。限于烃基的烷基被称为“同源烷基（homoalkyl）”。在烷基是一个二价基团的情况下，术语“烷基”还可以意指“亚烷基”或“烷二基”以及次烷基（alkylidene）。
术语“亚烷基”或“烷二基”独自或作为另一个取代基的一部分意指衍生自烷基的二价基团，如由（但不限于）-CH2CH2CH2-（亚丙基或丙烷-1,3-二基）所举例说明，并且进一步包括以下描述为“杂亚烷基”的那些基团。典型地，一个烷基（或亚烷基）将具有从1个到约30个碳原子、优选地是从1个到约25个碳原子、更优选地是从1个到约20个碳原子、甚至更优选地是从1个到约15个碳原子并且最优选地是从1个到约10个碳原子。一个“低级烷基”、“低级亚烷基”或“低级烷二基”是一个较短链的烷基、亚烷基或烷二基，总体上具有约10个或更少个碳原子、约8个或更少个碳原子、约6个或更少个碳原子、或约4个或更少个碳原子。
术语“烷氧基”、“烷氨基”以及“烷硫基”（或硫代烷氧基）是在它们的常规意义上使用的，并且各自是指经由一个氧原子、一个氨基或一个硫原子连接到分子的其余部分上的那些烷基。
除非另外说明，否则术语“杂烷基”独自或与另一个术语组合意指一个稳定的直链或支链、或环状烃基、或其组合，该杂烷基由规定数目的碳原子和至少一个选自下组的杂原子组成，该组由O、N、Si、S以及B组成，并且其中这些氮和硫原子可以任选地被氧化，并且该氮杂原子可以任选地被季铵化。该一个或多个杂原子O、N、B、S以及Si可以被放置在杂烷基的任何内部位置上，或在该烷基与分子的其余部分相连接的位置上。实例包括，但不限于：-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-NH-CH3、-CH2-CH2-N(CH3)-CH3、-CH2-S-CH2-CH3、-CH2-CH2-S(O)-CH3、-CH2-CH2-S(O)2-CH3、-CH=CH-O-CH3、-Si(CH3)3、-CH2-CH=N-OCH3、以及-CH=CH-N(CH3)-CH3。最高达两个杂原子可以是连续的，例如-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”独自或作为另一个取代基的一部分意指一个衍生自杂烷基的二价基团，如由（但不限于）-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-所举例说明。对于杂亚烷基，杂原子还可以占据链末端的任何一端或两端（例如，亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基等）。更进一步，对于亚烷基和杂亚烷基连接基团，连接基团的取向并非由书写该连接基团的化学式的方向所暗示。举例来讲，化学式-CO2R'代表-C(O)OR'和-OC(O)R'。
除非另外说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”独自或与其他术语组合各自表示“烷基”和“杂烷基”的环状型式。另外，对于杂环烷基，一个杂原子可以占据该杂环与分子的其余部分相连接的位置。环烷基的实例包括（但不限于）环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括（但不限于）1-(1,2,5,6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。
除非另外说明，否则术语“卤基”或“卤素”独自或作为另一个取代基的一部分意指一个氟、氯、溴或碘原子。另外，如“卤烷基”的术语意在包括单卤烷基和多卤烷基。举例来说，术语“卤(C1-C4)烷基”意在包括（但不限于）三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。
除非另外说明，否则术语“芳基”意指一个多不饱和、芳香族的取代基，该取代基可以是单个环或多个环（优选地是从1个到3个环），这些环稠合在一起或共价连接。术语“杂芳基”是指包含从一个到四个选自N、O、S、Si以及B的杂原子的芳基（或环），其中这些氮和硫原子是任选地被氧化，并且该一个或多个氮原子是任选地被季铵化。一个杂芳基可以通过一个杂原子连接到分子的其余部分上。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基以及6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环体系中的每一个的取代基是选自以下所描述的可接受取代基的组。
为了简便起见，术语“芳基”在与其他术语（例如，芳氧基、芳基硫氧基、芳烷基）组合使用时包括如上文所定义的芳基和杂芳基环两者。因此，术语“芳烷基”意在包括其中一个芳基被附接到一个烷基上的那些基团（例如，苯甲基、苯乙基、吡啶基甲基等），该烷基包括其中一个碳原子（例如一个亚甲基）已经被例如一个氧原子替换的那些烷基（例如，苯氧基甲基、2-吡啶氧基甲基、3-(1-萘氧基)丙基等）。
以上术语（例如，“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”）中的每一个均意在包括所指明基团的被取代和未被取代的形式两者。以下提供了每种类型的基团的优选取代基。
这些烷基和杂烷基（包括常被称为亚烷基、烯基、杂亚烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基的那些基团）的取代基一般被称为“烷基取代基”，并且它们可以是选自（但不限于）以下各项的多种基团中的一个或多个：被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂环烷基、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR'"、-S(O)R'、-S(O)2R'、-OS(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN以及-NO2，数目范围是从零到（2m'+1），其中m'是这类基团中的碳原子的总数。R'、R"、R"'以及R""各自优选地独立地是指氢、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的芳基（例如，被1-3个卤素取代的芳基）、被取代或未被取代的烷基、烷氧基或硫烷氧基、或芳烷基。当一种本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，每一个R基团独立地被选择，当存在R'、R"、R'"以及R""基团中的一个以上时，这些基团中的每一个也同样如此。当R'和R"被连接到同一个氮原子上时，它们可以与该氮原子组合形成5-、6-或7-元环。举例来说，-NR'R"意在包括（但不限于）1-吡咯烷基和4-吗啉基。从以上关于取代基的讨论中，本领域的技术人员将了解到，术语“烷基”意在包括包含与除了氢基以外的基团结合的碳原子的基团，如卤烷基（例如，-CF3和-CH2CF3）和酰基（例如，-C(O)CH3、-C(O)CF3、-C(O)CH2OCH3等）。
类似于对于烷基所描述的取代基，芳基和杂芳基的取代基一般被称为“芳基取代基”。这些取代基选自，例如：被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的芳基、被取代或未被取代的杂芳基、被取代或未被取代的杂环烷基、-OR'、=O、=NR'、=N-OR'、-NR'R"、-SR'、-卤素、-SiR'R"R"'、-OC(O)R'、-C(O)R'、-CO2R'、-CONR'R"、-OC(O)NR'R"、-NR"C(O)R'、-NR'-C(O)NR"R"'、-NR"C(O)2R'、-NR-C(NR'R"R'")=NR""、-NR-C(NR'R")=NR'"、-S(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)2NR'R"、-NRSO2R'、-CN和-NO2、-R'、-N3、-CH(Ph)2、氟代(C1-C4)烷氧基以及氟代(C1-C4)烷基，数目范围是从零到芳香族环系统上的开放价态的总数；并且其中R'、R"、R"'以及R""优选地独立地选自氢、被取代或未被取代的烷基、被取代或未被取代的杂烷基、被取代或未被取代的芳基以及被取代或未被取代的杂芳基。当一种本发明的化合物包括一个以上R基团时，例如，每一个R基团独立地被选择，当存在R'、R"、R'"以及R""基团中的一个以上时，这些基团中的每一个也同样如此。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被具有化学式-T-C(O)-(CRR')q-U-的一个取代基替换，其中T和U独立地是-NR-、-O-、-CRR'-或一个单键，并且q是从0到3的一个整数。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被具有化学式-A-(CH2)r-B-的一个取代基替换，其中A和B独立地是-CRR'-、-O-、-NR-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-S(O)2NR'-或一个单键，并且r是从1到4的一个整数。如此所形成的新环的这些单键中的一个可以任选地被一个双键替换。可替代地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的取代基中的两个可以任选地被具有化学式(CRR')s-X-(CR"R"')d-的一个取代基替换，其中s和d独立地是从0到3的整数，并且X是-O-、-NR'-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-或-S(O)2NR'-。取代基R、R'、R"以及R"'优选地独立地选自氢或被取代或未被取代的(C1-C6)烷基。
如在此所使用，术语“稠环体系”意指至少两个环，其中每个环具有至少2个与另一个环共有的原子。“稠环体系”可以包括芳香族以及非芳香族环。“稠环体系”的实例是萘、吲哚、喹啉、色烯等。
如在此所使用，术语“杂原子”包括氧（O）、氮（N）、硫（S）、硅（Si）以及硼（B）。
符号“R”是代表选自以下基团的取代基的通用缩写：取代或未取代的烷基、取代或未取代的杂烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、以及取代或未取代的杂环烷基。
术语“基质”与“载体”或“固体载体”可互换使用。
当本发明的化合物含有相对碱性或酸性的官能团时，此类化合物的盐被包括在本发明的范围内。盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所希望的酸或碱（纯净的亦或在一种合适的惰性溶剂中）接触而获得。本发明的相对酸性化合物的盐的实例包括钠、钾、钙、铵、有机氨基、或镁的盐，或类似的盐。当本发明的化合物包含相对碱性的官能团时，酸加成盐可以通过使此类化合物的中性形式与足够量的所希望的酸（纯净的亦或在一种合适的惰性溶剂中）接触而获得。酸加成盐的实例包括衍生自有机酸像盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸、单氢碳酸、磷酸、单氢磷酸、二氢磷酸、硫酸、单氢硫酸、氢碘酸、或亚磷酸，等等的盐，以及衍生自有机酸像乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、富马酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸、甲磺酸，等等的盐。还包括氨基酸的盐如精氨酸盐等等，以及有机酸像葡糖醛酸或半乳糖醛酸的盐等等（参加，例如，Berge等人，药物科学杂志（Journal of PharmaceuticalScience）1977,66:1-19）。本发明的某些具体化合物包含碱性和酸性官能团两者，这些官能团允许这些化合物被转化为碱的亦或酸的加成盐。
这些化合物的中性形式优选通过使该盐与一种碱或酸接触并且以常规方式分离该母体化合物而进行再生。该化合物的母体形式在某些物理性质（如在极性溶剂中的溶解度）上不同于这些不同的盐形式，但对于本发明的目的，这些盐在其他方面等价于该化合物的母体形式。
术语“颗粒的平均直径”、“粒径”、“平均粒径”、“中值粒径”或其任何语法变体是指对于一种本发明的基质（固体载体）的粒径规格。粒径典型地由制造商提供。粒径可以是指任何类型的颗粒，包括球形和不规则形状的颗粒。
“流动相”和“洗脱液”可互换地使用，是指使有待从一个色谱柱或其他分离装置中分离的一种混合物的溶解的组分（例如，一种聚糖）移动的一种液体。该流动相常常含有多于一种化合物并且是一种不同溶剂的混合物或一种盐、酸、碱，等等的溶液。
“溶剂”是一种液体有机化合物（例如，一种单一化合物）。一种示例性溶剂是至少部分地可与水混溶的。在不同的实施例中，一种溶剂是完全可与水混溶的。在不同的实施例中，“溶剂”是指乙腈。
“流动相强度”是指就例如极性、在反相色谱法中的有机改性剂浓度、在离子交换色谱法或亲水相互作用色谱法中的缓冲剂离子强度而言的流动相的强度。在一个示例性实施例中，该术语是指该流动相的离子强度。
在本发明中使用的一种示例性流动相包括与从约50%至约85%的溶剂（例如，乙腈）组合的一种从约2mM至约30mM的电解质。在一个示例性实施例中，该洗脱液用于在一个HILIC/WAX方案中分离聚糖。在本发明中使用的一种另外的示例性流动相包括与从约0%至约50%的溶剂（例如，乙腈）组合的从约2mM至约30mM的一种电解质。在一个示例性实施例中，该洗脱液用于在一个RP/WAX方案中分离聚糖。
一种“洗脱液”是结合有本发明色谱介质的分离装置的洗脱液。
如在此使用的，术语“电解质”是指一种流动相（例如一种缓冲剂）的一种离子组分。
“梯度”是随着时间在流动相的构成上的改变。
“色谱介质”是指在固体载体上具有结合位点的一种物质组合物。
“结合位点”、“色谱部分”和“色谱结合位点”是可互换地使用的，以指在能够结合到一种聚糖分析物的本发明色谱介质上的一个部分。
“聚糖”是指单聚的、二聚的或更高“聚的”糖类、低聚糖和多糖。术语“聚糖”还指包括一种聚糖组分，例如，糖脂类、糖聚合物类和糖肽类的种类。在一个示例性实施例中，该聚糖混合物是一种糖类混合物。一种示例性聚糖包括一种或多种附接唾液酸的部分。
“糖类”是一种聚糖的种类，在其结构内不包括脂质或多肽部分。
在本发明中使用涉及离子强度（例如，一种洗脱剂）的大小的术语。如在此使用的，术语“低离子强度”是指小于或等于约30mM的溶液电解质组分的浓度。术语“高离子强度”是指大于或等于约100mM的溶液电解质组分的浓度。相对应地，术语“中等离子强度”是指大于约30mM并且小于约100mM的溶液电解质组分的浓度。
在本发明中使用涉及一种水性溶液（例如，一种洗脱剂）中的溶剂浓度的术语。如在此使用的，术语“低溶剂含量”是指小于或等于约50%的水性溶液中的溶剂浓度。如在此使用的，术语“高溶剂含量”是指大于约50%的水性溶液中的溶剂浓度。
IV.色谱介质
在一个示例性实施例中，本发明提供一种多峰色谱介质。一种示例性介质具有带电和不带电两种的结合位点。在一个示例性实施例中，该介质包括由不同模式（例如，离子交换、和RP或HILIC）进行工作的两个结合位点。
本发明的一种示例性多元色谱介质包括与一个或多个反相和/或亲水相互作用色谱结合位点相组合的一个或多个强阴离子交换、弱阴离子交换、强阳离子交换和/或弱阳离子交换的结合位点。在一个示例性实施例中，这些位点与一种聚糖混合物中的一种或多种聚糖相互作用，以一种允许分离该混合物中的聚糖并且分析该聚糖混合物的方式。
在不同的实施例中，该离子交换部分是一种胺。
在一个示例性实施例中，该不带电的第二结合位点是一个亲水相互作用位点并且是一种脲，例如，一个不带电的脲部分。
在一个示例性实施例中，本发明提供一种色谱介质，该色谱介质具有一个阴离子交换位点（例如，一个WAX结合位点）和一个HILIC结合位点以及约3μm的粒径。在另一个示例性实施例中，本发明的色谱介质具有一个阴离子交换位点和一个RP结合位点，并且该粒径是约1.9μm。
在不同的实施例中，该介质包括第一和第二离子交换位点两者。示例性的第一和第二结合位点是基于结构上彼此不同的部分的不同位点。在一个示例性实施例中，该第一离子交换结合位点是一个阴离子结合位点并且所述第二离子交换结合位点是一个阳离子交换结合位点。
该色谱介质还包括一个或多个不带电的结合位点，并且类似于这些离子交换位点，当存在两个或更多个不带电的结合位点时，它们是基于具有彼此不同的结构的部分。
在一个示例性实施例中，本发明的介质包括一个阳离子结合位点、一个阴离子结合位点、以及一个反相结合位点和一个亲水相互作用结合位点中的一个或两个。
这些结合位点直接地或通过一个连接体被结合到该基质上。在一个示例性实施例中，该离子交换色谱部分通过一个第一连接体部分被结合到该第一基质上。在不同的实施例中，该不带电的色谱部分通过一个第二连接体部分被结合到该第二基质上。
在不同的实施例中，该第一连接体部分和该第二连接体部分是单独的化学种类，以使得该离子交换色谱部分和该不带电的色谱部分可以独立地分别被连接到该第一基质和该第二基质上。该第一基质可以是与该第二基质相同的，或可替代地该第一个和该第二基质可以是不同的。独立连接的方式意指该离子交换色谱部分和该不带电的色谱部分不被附接到一个共同的共享的连接体基团上。此外，该独立连接的离子交换色谱部分和不带电的色谱部分不是直接地被连接至彼此的。
在本发明的组合物中使用的连接体可以具有任何有用的结构。例如，在一个示例性实施例中，该第一连接体部分和/或该第二连接体部分中的任一个或两个是被取代的或未被取代的烷基或杂烷基部分。该连接体具有任何有用的长度。在本发明的化合物中使用的示例性连接体包括在长度上从约3个碳至约40个碳，例如8个碳至约30个碳的那些。当该连接体是被取代的或未被取代的杂烷基时，该碳链被一个或多个杂原子中断，然而，该连接体的总长在长度上是从约3个碳至约40个碳。
在一个示例性实施例中，该离子交换结合位点和该第一连接体具有以下化学式：
Figure BDA0000442517990000171
其中R2和R3独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；并且n是一个从3至30的整数。
当该基质是一种二氧化硅基质时，在一个示例性实施例中，该结合位点、连接体和该连接体被结合到其上的该基质的部分具有以下化学式：
该第一和第二基质可以是相同的基质（例如，同样的颗粒）或不同的基质（例如，不同的颗粒）。
在一个另外的示例性实施例中，该结合位点和该连接体具有以下化学式：
Figure BDA0000442517990000173
其中R1、R2和R3独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；并且m和p是独立地选自从8至40的整数。
在一个其中该基质是二氧化硅的示例性实施例中，该结合位点、连接体和该连接体被结合到其上的该基质的部分具有以下化学式：
Figure BDA0000442517990000181
在以上这些结构的每一个中，R1、R2和R3是如在前一段落中所述的。
在一个示例性实施例中，本发明提供一种多峰色谱介质，该多峰色谱介质包括：(a)一种微粒二氧化硅基质；(b)一个结合到所述基质上的第一离子阴离子交换结合位点；以及(c)一个不带电的结合位点，它是选自也结合到所述基质上的一个亲水相互作用色谱结合位点、一个反相色谱结合位点以及它们的组合的一个成员，其中所述介质提供在以下这些色谱条件下根据图10的一个试样的色谱图：(i)一个填充有所述介质的具有尺寸2.1×150mm的柱；(ii)一种流动相：乙腈/100mM乙酸铵缓冲剂，pH=5，90:10（v/v）；(iii)约0.21mL/min的流速；(iv)约1μL的注射体积；(v)约30℃的所述柱的温度；以及(vi)在约220nm下的UV检测，其中该试样实质上由在一种稀释剂中的醋氨酚、水杨酸、以及乙酰水杨酸组成。
在不同的实施例中，本发明提供一种多峰色谱介质，该多峰色谱介质包括：(a)一种微粒二氧化硅基质；(b)一个结合到所述基质上的第一阴离子交换结合位点；以及(c)一个不带电的结合位点，该不带电的结合位点是也被结合到所述基质上的一个反相色谱结合位点，其中所述介质提供在以下这些色谱条件下根据图8的一个试样的色谱图：(i)一个填充有所述介质的具有尺寸2.1×150-mm的柱；(ii)一种流动相：乙腈/100mM乙酸铵缓冲剂，pH=5=50/50（v/v）；(iii)约0.21mL/min的流速；(iv)约1μL的注射体积；(v)约30℃的柱温度；以及(vi)在约220nm下的UV检测，其中该试样实质上由尿嘧啶、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基铵、甲苯磺酸钠、以及丙基苯组成。
在一个示例性实施例中，本发明提供一种多峰色谱介质，该多峰色谱介质包括：(a)一种微粒二氧化硅基质；(b)一个结合到所述基质上的第一离子交换结合位点；(c)一个不带电的结合位点，该不带电的结合位点是选自也结合到所述基质上的一个亲水相互作用色谱结合位点、和一个反相色谱结合位点的一个成员；以及(d)选自一个第二离子交换结合位点和一个第二不带电的结合位点的一个成员，该第二不带电的结合位点是选自也结合到该基质上的一个亲水相互作用色谱结合位点、和一个反相色谱结合位点的一个成员。
一个容量因子，k'，可以用于表征一个柱中的色谱材料，如在方程1中所示的。
k ′ = t i - t m t m      （方程1）
术语tm表示流动相穿过柱所需要的时间并且ti表示对应于色谱图上的化合物i的特定峰的保留时间。可以计算一个选择性因子来描述两种化学种类的分离，如在方程2中所示的。
α = k A ′ k B ′        （方程2）
术语kA′表示化学种类A的容量因子，并且kB′表示化学种类B的容量因子。在一个示例性实施例中，α可以在从约0.15至约0.60的范围，其中化学种类A是甲苯磺酸盐并且化学种类B是丙基苯。
在一个示例性实施例中，根据方程1和2，α可以在从约0.10至约0.40的范围，化学种类A是醋氨酚并且化学种类B是乙酰水杨酸。
固体载体
本发明的色谱介质的基质或固体载体可以是包括多孔和无孔固体的可用作色谱法中的色谱介质/填充材料的任何材料（例如，颗粒）。
在不同的实施例中，该固体载体选自微粒或单块。示例性颗粒包括二氧化硅颗粒、二氧化硅/有机混合颗粒、核-壳颗粒、TiO2颗粒、ZrO2颗粒、以及Al2O3颗粒。
示例性基质包括交联和非交联的聚合物。其他基质包括基于硅（例如，氧化硅）、基于钛（例如，氧化钛）、基于锗（例如，氧化锗）、基于锆（例如，氧化锆）、和基于铝（例如氧化铝）的，碳化的材料，和金属。
该固体载体可以由任何合成树脂材料形成。示例性合成聚合物离子交换树脂包括聚(苯酚-甲醛)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚腈、胺-环氧氯丙烷共聚物、苯乙烯在聚乙烯或聚丙烯上的接枝聚合物、聚(2-氯甲基-1,3-丁二烯)、聚(乙烯基芳香族)树脂（如衍生自苯乙烯、α-甲基苯乙烯、氯苯乙烯、氯甲基苯乙烯、乙烯基甲苯、乙烯基萘或乙烯基吡啶的那些树脂）、丙烯酸和甲基丙烯酸的相应酯、以及类似的不饱和单体、单亚乙烯基单体（包括含单亚乙烯基环的氮杂环化合物）、以及以上树脂的任何共聚物。另外的实例包括基于丙烯酸缩水甘油酯和基于甲基丙烯酸缩水甘油酯的材料（例如，甲基丙烯酸2-缩水甘油氧基乙酯、乙烯基苯甲基缩水甘油醚、2-(4-乙烯基苯甲氧基)乙基缩水甘油醚），以及衍生自乙烯基苯甲基氯化物、乙烯基苯甲醇、2-(4-乙烯基苯甲氧基)乙醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚乙烯甲酰胺的那些材料。
以上材料中的任何一种可以任选地与结合有离子的或可离子化的、反相和HILIC的官能团的单体进行共聚。
在一个实施例中，该载体包含交联的聚合物或共聚物。一种示例性共聚物是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物（例如，PS-DVB）。在一个实例中，该苯乙烯-二乙烯基苯共聚物包含按重量计约2%到约100%之间的二乙烯基苯单体。在另一个实例中，该苯乙烯-二乙烯基苯共聚物包含按重量计约25%到约80%之间的二乙烯基苯单体。该共聚物可以例如根据Ikada等人，聚合物科学杂志（Journal of PolymerScience），第12卷，1829-1839(1974)的方法或如在Meitzner等人的美国专利号4,382,124中所描述来制备。
在一个实例中，该固体载体包括一种二氧化硅、氧化铝、氧化锆或二氧化钛-聚合树脂混合材料。示例性二氧化硅-有机混合物描述于美国专利号6,528,167和美国专利申请公开2006/0070937（申请序列号：11/240,695）中，它们的这些披露出于所有目的通过引用结合在此。
在一个实施例中，在本发明中使用的一种固体载体是通过熟知的悬浮聚合技术而形成的。在这个实例中，这些颗粒典型地来源于一种单体混合物，该混合物在将与这些颗粒相接触的溶剂中是不可溶的。示例性基质是通过在一种合适的乳化剂存在下加热并搅拌多种单体在一种合适的溶剂中的悬浮液而形成。可替代地，可以通过一种悬浮、本体或溶液方法来进行这种聚合，接着通过机械装置（例如，球磨机、棒磨机等）将树脂研磨成所希望的大小。
固体载体可以具有任何形式，包括微粒（例如，立方的、颗粒的、球形的，基本上球形；例如，树脂珠粒）、碎片、大块、块料、单块料等。当基质呈微粒形式时，这些颗粒（例如，不规则形状或珠粒形状，例如，基本上球形）具有中值粒径（即，直径）。在一个实例中，基质（例如球形硅胶）的中值粒径是在约0.1（例如，二氧化硅微球体）与约10,000μm（微米）之间。在一个实例中，基质的中值粒径是在约1与约5000微米之间、在约1与约1000微米之间、在约1与约500微米之间、在约1与约400微米之间、在约1与约300微米之间、在约1与约200微米之间或在约1与约100微米之间。在又另一个实例中，基质的中值粒径是在约1与约80微米之间、在约1与约70微米之间、在约1与约60微米之间、在约1与约50微米之间、在约1与约40微米之间、在约1与约30微米之间、在约1与约20微米之间或在约1与约10微米之间。在其他实例中，基质的中值粒径是在约10与约100微米之间、在约10与约80微米之间、在约40与约200微米之间、在约40与约100微米之间、在约40与约80微米之间、在约60与约200微米之间、在约60与约100微米之间、在约70与约200微米之间、在约80与约200微米之间、在约100与约200微米之间、在约200与约600微米之间、在约200与约500微米之间或在约200与约400微米之间。
在一个示例性实施例中，该固体载体是一种约1.5μm至约20μm，例如从约1.9μm至约3μm的颗粒。在不同的实施例中，该固体载体是约1.9μm。在不同的实施例中，该固体载体是约3μm。
一般来说，适用于任何填充床色谱应用（例如，LC、HPLC或超高压色谱）的基质颗粒均适合用于本发明的色谱介质中。
在不同的实例中，载体是呈微粒形式，并且多个载体颗粒被放置在一个填充床中。举例来说，用这些载体颗粒填充一个塑料或金属柱。在一个示例性实施例中，本发明的介质由两种或更多种色谱介质组成。例如，一种色谱介质由具有一个离子交换结合位点的颗粒组成。将这种色谱介质与一种具有RP或HILIC结合位点的第二色谱介质进行混合。如将认识到的是，多种色谱介质（各自具有一个不同的结合位点）是可组合的以形成一种本发明的色谱介质。
在不同的实施例中，这些固体载体颗粒是基本上“单分散的”或基本上“均匀分散的”，这表明了这些颗粒中的大部分（例如，这些颗粒的80%、90%或95%）的粒径不会在中值粒径（M）以下或以上实质上（例如，不超过50%）变化。在一个示例性的单分散基质颗粒群体中，这些颗粒中的90%具有在约0.5倍M与约1.5倍M之间的平均粒径。在一个示例性实施例中，此类颗粒具有从约1.9μm至约3μm的尺寸。在不同的实施例中，此类颗粒是约1.9μm或约3μm。
在另一个实例中，基质是一种无机或有机单块。在一个实例中，固体载体包括一种二氧化硅单块。在另一个实例中，固体载体包括一种氧化铝单块。在又另一个实例中，固体载体包括一种氧化锆单块。在另一个实例中，固体载体包括一种二氧化钛单块。示例性的基于有机组合物的单块材料和制备此类材料的方法描述于美国专利号5,130,343；5,929,214；5,728,457；5,260,094；6,887,384；5,334,310；7,303,671；5,453,185以及7,074,331中。
在本发明中使用的一种示例性固体载体是通过在带有该结合位点的部分上和该固体载体上由在具有互补反应性的部分之间的反应，用所希望的结合位点使一种颗粒进行官能化而组装的。
在另一个示例性实施例中，本发明提供结合有在此所阐明的色谱介质的一种聚集的色谱材料。例如，一种本发明的色谱介质与一种具有相反电荷的第二离子交换介质在促进这两种离子交换材料的静电聚集的条件下相接触，从而形成一种静电聚集的离子交换介质。在不同的实施例中，本发明的色谱介质是带负电的，并且该第二离子交换介质是带正电的。在另一个示例性实施例中，本发明的离子交换色谱介质是带正电的，并且该第二离子交换色谱介质是带负电的。此种聚集的介质描述于例如斯莫尔（Small）等人的美国专利号4,101,460中，其中所描述的精细分散的不溶性材料是通过静电吸引结合到具有离子交换位点的基质颗粒上。本发明的色谱介质和该第二离子交换色谱介质中的任一种或两种可以在它们的结构内包括一个RP和/或HILIC结合位点。
V.装置和系统
本发明还提供结合有本发明的色谱介质的装置和系统。因此，在一个示例性实施例中，该色谱介质是在适合用作一种色谱装置的一种流通床中。在一个示例性实施例中，本发明提供一种填充有本发明的色谱介质的色谱柱。
在一个示例性实施例中，该装置是一种填充有本发明的色谱介质的柱。在本发明的一个实施例中的柱硬件包括用作色谱柱的刚性管（具有不同的形状，包括圆柱形、圆锥形的、长方形的和多边形的）或者这些管的一个组件。该管可以由本领域中已知的任何常规材料制成，这些常规材料包括金属、玻璃、二氧化硅、塑料或其他聚合物，更优选地不锈钢或玻璃。这个管的内部尺寸在直径、厚度、宽度、或深度上可以是从微米至米。该色谱介质可以跨越该管的整个截面积，其中这些样品的分离取决于分离模式通过轴向地或径向地（Lee,W-C，等人，“胰蛋白酶纯化的径向流动亲和色谱法（Radial Flow Affinity Chromatography for TrypsinPurification）”，蛋白质纯化（Protein Purification）（书），美国化学学会系列丛书（ACS Symposium Series）427，第8章，美国化学学会（American ChemicalSociety），华盛顿哥伦比亚特区，1990年），更确切地轴向流动或直流色谱法或者径向流动色谱法穿过该管而发生。该柱的内表面可以是非反应性或者可以被处理以增加对色谱介质表面的粘附。该管可以结合有本领域中已知的任何有用的接头以将它与其他仪器、更确切地色谱仪器连接。
在不同的实施例中，本发明提供一种色谱系统。在一个示例性实施例中，该系统是一种高效液相色谱（HPLC）系统。示例性系统包括一种或多种包含本发明的色谱介质的分离装置。一种示例性系统包括一个或多个分离装置，该分离装置与一个或多个用于调节至该分离装置的洗脱液供应的装置（例如，洗脱液产生器、泵）处于线上并处于流体连通；一个或多个检测装置，例如，质谱和/或荧光检测器；以及一个或多个将样品引入到该分离装置上的装置，例如，进样阀。
举例来说，用于HPLC分析的示例性系统典型地包括使用一种含有电解质的洗脱液的一个色谱分离区，和一个洗脱液抑制阶段，随后是检测，典型地由质谱仪或荧光检测器来进行。在该色谱分离阶段，将一种所注入样品的聚糖组分从分离柱中洗脱出来。
从一种来源供应洗脱液，该来源可以包括一个含有预制的洗脱液的容器或者它可以由一个洗脱液产生器产生。洗脱液产生器是本领域中已知的。一种示例性洗脱液产生器披露于美国专利号7,767,462中。
VI.方法
制造方法
本发明的色谱介质可以通过任何方便的方法来制备，这些方法包括（但不限于）将一种预形成的基质用包括一个或多个所希望的结合位点的一种反应性部分进行官能化，或者一个或多个所希望的结合位点官能化的单体的聚合。在此所附的这些实例提供用于制造一种本发明的色谱介质的示例性方法。
在一个示例性实施例中，该色谱介质是一种RP/WAX介质，并且该介质是通过含有反相和离子交换结合位点的部分与一种基质的反应来制备的。一种用于制备一种示例性介质的方法使用相对于含有离子交换结合位点的那些部分而言过量的含RP部分。一个示例性比例是从约10-20:1RP:离子交换位点，例如从约12-18:1。参见，实例6和7。在不同的实施例中，该离子交换结合位点是一个阴离子交换位点，例如，一个WAX位点。一种用于制备一种HILIC/WAX介质的示例性方法使用类似的条件。
色谱分析方法
本发明还提供使用本发明的多峰色谱介质进行色谱分离的方法。
在一个示例性实施例中，本发明提供使用一种本发明的多峰色谱介质将聚糖混合物的一种第一聚糖组分与一种第二聚糖组分分离的一种多峰色谱方法。该方法包括(a)使该聚糖混合物与一种本发明的多峰色谱介质和一种洗脱液接触。在一个示例性实施例中，该色谱介质具有一个结合到一种第一基质的离子交换色谱部分和一个结合到一种第二基质的不带电的色谱部分（例如，不同于该第一基质的一种第二基质，或与该第一色谱部分被结合到的那个基质相同的基质）。该不带电的色谱部分选自一个反相色谱部分、一个亲水相互作用色谱部分以及它们的组合。使一种聚糖混合物的聚糖组分与该色谱介质和该洗脱液在有效实现该聚糖混合物中的两种或更多种聚糖的分离的条件下接触。一种示例性洗脱液包括从约1mM至约50mM的电解质。在不同的实施例中，该有机溶剂以最高达所述洗脱液的45%、55%、65%、75%、85%或95%（v/v）的量存在于所述洗脱液中。
本发明的方法可以用任何适当的流动相来实践。用于液相色谱中的这些流动相是本领域中熟知的。适合的流动相总体上是水、带有或不带有非缓冲盐溶液的缓冲水性盐溶液、有机溶剂以及含有这些组分中的一种或多种的混合物。具体的实例包括带有一种电解质（例如，乙酸铵、甲酸铵）的水/乙腈、水/甲醇、水/丙醇、以及水/THF、TRIS-HCl缓冲液、TRIS-HCl缓冲液/NaCl、磷酸盐缓冲液/硫酸铵、乙腈/二乙胺、以及己烷/甲醇。
在一个示例性实施例中，该色谱分离是通过调节和控制有机溶剂、缓冲液浓度和/或流动相的pH（分别在0%至95%、1mM至100mM以及1至10的范围内）来优化的。
在本发明中使用的一种示例性洗脱液是一种组合物，该组合物与该聚糖混合物的组分的质谱法分析是相兼容的，而不需要脱盐或者另外操作通过本发明的方法分离的含有聚糖的洗脱液。
在一个示例性实施例中，该洗脱液的组成随着该分离进行而变化，即，该流动相是作为一个梯度而运行的。当使用一个梯度时，这些组分的比例以预定的方式在该色谱过程中变化。在该洗脱阶段的过程中，该溶剂可以是被改变的以分离彼此稍微不同的分子，而不改变分离模式。例如，在一种反相模式的过程中，可以以逐步方式增加该洗脱液中的溶剂浓度，以便在每一步过程中使一种不同的分子从其所附接的分离介质的表面基团上脱离。在每个步骤之间的溶剂浓度上的差异将取决于所使用的溶剂、有待分离的分子、该分离介质中的活性基团以及该洗脱阶段的持续时间。
在一个示例性实施例中，该梯度从约85%的溶剂至约30%的溶剂运行。示例性溶剂包括乙腈、甲醇、THF和丙醇。在不同的实施例中，该梯度从约1mM的电解质至约30mM的电解质运行。在一个示例性实施例中，该梯度从约85%的溶剂和1mM的电解质至约55%的溶剂和约30mM的电解质运行。根据该描述的梯度的一个示例性应用包括聚糖的WAX/HILIC分离。
在一个示例性实施例中，该梯度从约0%的溶剂至约50%的溶剂运行。示例性溶剂包括乙腈、甲醇、THF和丙醇。在不同的实施例中，该梯度从约1mM的电解质至约50mM的电解质运行。在一个示例性实施例中，该梯度从约0%的溶剂和1mM的电解质至约50%的溶剂和约50mM的电解质运行。根据该描述的梯度的一个示例性应用包括聚糖的WAX/RP分离。
可以使用本发明的色谱介质和本发明的方法分离的聚糖包括标记的和未标记的聚糖。这些聚糖可以是带电的或不带电的。示例性聚糖包括来自不同蛋白质和粘蛋白的N-聚糖和O-聚糖。在不同的实施例中，这些聚糖是来自蛋白质的标记的或未标记的还原的N-聚糖、来自蛋白质的标记或未标记的非还原的N-聚糖、来自蛋白质的标记或未标记的还原的O-聚糖、以及来自粘蛋白的标记或未标记的非还原的O-聚糖。
在不同的实施例中，该方法分离两种或更多种带电的聚糖，例如，硫酸化的非硫酸化的聚糖、来自GAG的解聚的聚糖、具有/没有明确的硫酸化的具有4种至8种糖类的肝素片段、以及磷酸化的聚糖。
使用本发明的色谱介质和方法分离的样品可以来自任何来源。示例性聚糖是来源自糖蛋白类，单克隆抗体类，重组糖蛋白类和生长激素类，细胞、血清和血浆蛋白类，癌蛋白质类，糖聚合物类，以及植物蛋白类。这些聚糖还可以是糖脂类的成分（例如，神经节苷脂、红细胞糖苷脂和鞘糖脂）。
本发明的色谱介质和方法用于对通过本发明的方法分离的一种聚糖混合物中的聚糖组分的绝对或相对的量进行定量。例如，本发明的方法可以用于估算混合物中的一种或多种聚糖的电荷状态（图6），估算一种或多种含唾液酸的聚糖的总量并且估算和α(2,3)和α(2,6)连接的聚糖的量。
在一个示例性实施例中，本发明的介质和方法用于分离ABO血型（例如，N-乙酰半乳胺糖、半乳糖）抗原（ABO(H)以及其变体，例如，A1、A2、H-型1、H-型2、H-型3、H-型4等等）的聚糖。在另一个实施例中，被分离的聚糖是路易斯（Lewis）血型（含人类海藻糖）抗原（例如，在糖脂、N-和O-聚糖骨架等等上的sLex、Lex、Lea、sLea、重复的Lex等等）。
本发明还提供一种方法，其中该分离过程导致一个色谱图，在该色谱图中，该第一聚糖组分和该第二聚糖组分具有与它们的电荷成比例的保留时间，使得具有与该第一聚糖组分或该第二聚糖组分相同的电荷的一种第三聚糖将具有与具有相同电荷的聚糖组分成组的保留时间。
在一个示例性实施例中，该聚糖混合物的两种或更多种聚糖是唾液酸化的并且该方法导致一个色谱图，在该色谱图中具有相同数量的唾液酸部分的唾液酸化的聚糖在该色谱图中被分组在一起。例如，图1示出了一个色谱图，其中双唾液酸化的聚糖被分组在一起（例如，峰9-16），三唾液酸化的聚糖也是如此（例如，峰17-21）。图5还示出了一个由本发明的方法产生的色谱图，其中双唾液酸化的聚糖被分组在一起（例如，峰16-28），并且三唾液酸化的聚糖被分组在一起（例如，峰29-39）。因此，本发明体提供基于它们的电荷极性和密度在分离过程中并且在色谱图上将带电的聚糖分组在一起的一种方法。
在一个示例性实施例中，在使用本发明的方法分析之前，将该聚糖从其被结合到的多肽中分离。因此，该方法包括步骤(b)，其中在步骤(a)之前，通过处理至少一种具有糖苷酶的糖蛋白的一种溶液来制备一种第一前体聚糖混合物，从而形成该第一前体聚糖混合物。示例性糖苷酶选自N-糖酰胺酶F（PNGase F）、N-糖酰胺酶A（PNGase A）以及它们的组合。
在不同的实施例中，该方法包括一个或多个预分析预备步骤以便在一种第一前体聚糖混合物的分析之前将其“清理（clean up）”，从而形成一种第二前体聚糖混合物。该第二前体聚糖混合物使用一种本发明的色谱介质进行分析。一种示例性方法包括这些步骤，(i)将一种第一前体聚糖混合物中的蛋白质沉淀，形成一种包含沉淀的蛋白质和上清液的混合物；(ii)通过将步骤(i)的混合物离心来将该沉淀的蛋白质造粒，形成一种两相混合物；(iii)将该上清液从该两相混合物中去除，形成一种分离的上清液；并且(iv)将该分离的上清液进行透析，从而形成该第二前体聚糖混合物。可替代地，使该第一前体聚糖混合物经受反相高效液相色谱法，从而形成所述第二前体聚糖混合物。
在一个示例性实施例中，本发明的方法进一步包括(d)：在步骤(c)之后，制备一种标记的聚糖混合物，该标记的聚糖混合物包括该第一聚糖组分的一种标记的类似物和该第二聚糖组分的一种标记的类似物。用一种可检测的标记进行标记典型地是在有效地用该可检测的标记来标记该第二前体聚糖混合物中的一种聚糖的条件下，使该第二前体聚糖混合物经受一种包含反应性的、可检测的标记的混合物，从而制备该标记的聚糖混合物来完成的。在一个示例性方法中，该聚糖是通过在该聚糖上的一个还原基团与具有一个反应性胺部分的可检测标记的一种类似物的还原氨化来进行标记的。如将由本领域普通技术人员认识到的，该第一前体聚糖混合物的聚糖可以可替代地使用公认程序进行标记。
在不同的实施例中，本发明的方法进一步包括步骤(c)之后的(d)，用唾液酸酶A、唾液酸酶B或它们的组合来处理该第二前体聚糖混合物，从而制备该聚糖混合物。
由于它们洗脱掉了本发明的介质，在一种本发明的方法中检测到该聚糖混合物的组分，该本发明的方法包括步骤(d)之后的(e)，使该第一聚糖组分和该第二聚糖组分经受通过质谱法或荧光检测的分析。
在示例性实施例中，其中该聚糖混合物包括标记的聚糖，在一种方法中检测这些种类，该方法进一步包括在步骤(a)之后，使该标记的第一聚糖组分和该标记的第二聚糖组分经受通过质谱法或荧光检测的分析。
任何可检测标记可以用于本发明的方法中。一种示例性可检测的标记是一种荧光标记。一种示例性荧光标记是一种芳香胺，例如，2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基吡啶、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸、2-氨基吖啶酮、以及9-氨基芘-1,3,6-三磺酸。
还提供改进在一种多峰色谱介质上的一种未唾液酸化的第一聚糖和一种未唾液酸化的第二聚糖的色谱分离的一种方法。一种示例性介质是一种本发明的介质，该介质包括一个结合到一种第一基质上的离子交换色谱部分和一个结合到一种第二基质上的不带电的色谱部分，它们是相同的或者不同的基质。如在此所讨论的，该不带电的色谱部分是一个反相色谱部分、一个亲水相互作用色谱部分以及它们的组合。该方法包括，(a)用一种包括一个带电部分的可检测标记将该第一未唾液酸化的聚糖和该第二未唾液酸化的聚糖进行衍生，形成一种标记的第一聚糖和一种标记的第二聚糖；并且(b)使该多峰色谱介质与该标记的第一聚糖以及该标记的第二聚糖在有效地分离该第一和第二标记的聚糖的条件下接触。在一个示例性实施例中，根据这种方法的分离的结果相对于在该多峰色谱介质上的该第一未唾液酸化的聚糖和该第二未唾液酸化的聚糖的分离是得到改进的。因此，在不同的实施例中，该共轭标记的存在改进了该方法的分辨率。图2。
在一个示例性实施例中，该第一和第二聚糖是用一个带电的部分进行衍生的，该带电的部分本身不是一个可检测的部分（例如，它本质上是非荧光性的）。
装置
本发明的混合模式的混合模式介质容易地被结合到分离装置（例如，柱）、和单块中。在不同的实施例中，该装置是一种填充有本发明的微粒介质的柱。示例性柱内径尺寸是从约0.050mm至约2000mm。示例性柱长度是从约5mm至约10,000mm。本发明的示例性柱包括被填充到一个具有尺寸2.1mm×150mm、2.1mm×50mm、3mm×150mm、1mm×150mm、0.4mm×150mm、2.1mm×250mm或3mm×250mm的柱内的一种本发明的混合模式介质。还提供了结合有本发明的色谱介质的单块。
检测
本发明的方法提供用于在一些条件下分离聚糖的色谱介质和方法，在一个示例性实施例中，这些条件与通过质谱法、荧光检测、UV检测、和/或基于气溶胶的检测（例如，带电的气溶胶检测、蒸发光散射检测等等）的聚糖检测是相兼容的。
在一个示例性实施例中，由一种本发明的方法分离的聚糖混合物中的一种或多种聚糖用一种可检测的标记进行标记。示例性标记包括通过紫外/可见检测、荧光检测、和质谱检测可检测的那些。在不同实施例中，该检测方式是紫外/可见并且该可检测的标记是一种UV-可检测的发色团。在不同的实施例中，该检测方式是荧光检测并且该可检测的标记是一种荧光团。在一个示例性实施例中，该检测方式是质谱法并且该可检测的标记是一种质量标记。
在不同的实施例中，该色谱介质的选择性和本发明的方法可以基于共轭至该聚糖混合物的一种或多种聚糖的标记来进行调整（图2）。
以下实例说明以非限制性的方式说明本发明的不同实施例。
实例
实例1.化合物10的制备
将二甲胺(2)与过量的三乙胺（2.0当量）在无水CH2Cl2中进行混合并且保持在约0℃与约5℃之间持续20分钟。逐滴添加一种在CH2Cl2中的10-十一烯酰氯(1)（1.0当量）并且将该混合物在环境温度下搅拌12小时。将该反应混合物用水洗涤，用Na2SO4干燥并且在真空中将该溶剂去除以产生化合物3。将过量的甲基二乙氧基硅烷(4)（10当量）添加至化合物3中，随后添加一种催化剂溶液（0.1mol%）（例如，在最小量乙醇中的六氯合铂酸）。在50℃下搅拌24小时之后，在真空中去除残余硅烷和溶剂以提供化合物10。图7。
实例2.化合物11的制备
一种在THF中的5℃的11-溴代-1-十一碳烯(5)溶液逐滴添加到一种在THF中的二甲基胺(2)（10当量）溶液并且在环境温度下搅拌12小时。在真空中去除这些挥发物并且将残余物分配在CH2Cl2与H2O之间，用Na2SO4干燥，这随后是在真空中去除溶剂以提供化合物6。将过量的甲基二乙氧基硅烷(4)（10当量）添加至化合物6中，随后添加一种催化剂溶液（0.1mol%）（例如，在最小量乙醇中的六氯合铂酸）。在50℃下搅拌24小时之后，在真空中去除残余硅烷和溶剂以提供甲硅烷基化合物11。图7。
实例3.相21的制备
将化合物10和11在甲苯中以预定的比例进行混合。然后将预定量的粗硅胶添加到该溶液中，同时搅拌，直到获得均匀性。将该反应混合物在回流下保持3天。将所得到的混合物过滤，用丙酮洗涤，并且在50℃下在真空中干燥5小时，以给出组合物21的官能化的二氧化硅。还可以结合一个使用三烷基氯硅烷和/或二烷基二氯硅烷的封端步骤，以产生一种用于色谱分离的填充材料。图7。
在一个示例性实验方案中，将18g的化合物10、1g的化合物11和15g的粗硅胶（粒径，1.9-μm；孔径，
Figure BDA0000442517990000301
表面面积，225m2/g）分散在一个250-mL的圆底烧瓶中的50mL甲苯（无水）中并且在甲苯中进行混合。然后将预定量的粗硅胶添加到该溶液中，同时搅拌，直到获得均匀性。将该反应混合物机械地搅拌并且在回流下保持72小时。将所得到的混合物过滤并且用200mL的甲苯洗涤。将滤饼在环境温度下在一个真空烘箱中干燥20小时，以给出相21的官能化的二氧化硅。注意，还可以包括一个使用三烷基氯硅烷和/或二烷基二氯硅烷的封端步骤。
实例4.相22的制备
将脲基丙基三甲氧基硅烷(12)和3-氨基丙基三甲氧基硅烷(13)在甲苯中以预定的比例进行混合。然后将预定量的粗硅胶添加到该溶液中，同时搅拌，直到均匀。将该反应混合物在回流下保持3天。将所得到的混合物过滤，用乙腈洗涤，并且在50℃下在真空烘箱中干燥5小时，以给出相22的官能化的二氧化硅。图9。
在一个示例性实验方案中，10g的脲基丙基三甲氧基硅烷(12)和1g的3-氨基丙基三甲氧基硅烷(13)在30mL甲苯（无水）中进行混合。然后将15g的粗硅胶（粒径，1.9-μm；孔径，
Figure BDA0000442517990000311
；表面面积，225m2/g）添加到该溶液中，同时搅拌，直到均匀。将该反应混合物在回流下保持2天。将所得到的混合物过滤，用乙腈洗涤，并且在环境温度下在真空烘箱中干燥20小时，以给出相22的官能化的二氧化硅。图9。
实例5.反相/阴离子交换混合模式相
柱填充
使用高压匀浆填充技术以用于色谱评价的相21来填充2.1mm（内径）×150mm（长度）316不锈钢HPLC柱外壳。
流动相制备[乙腈/100mM乙酸铵缓冲剂，pH5=50/50（v/v）]
步骤1-将7.75±0.03g乙酸铵、2.00±0.01g乙酸和998.0±0.5g去离子水放入一个1000-mL的洗脱液瓶中。通过超声处理充分混合。步骤2-称量500.0±0.2g的上述溶液和391.0±0.5g乙腈到一个1000-mL洗脱液瓶中。通过超声处理充分混合。所得到的溶液用作流动相用于确定该反相/阴离子交换混合模式相的阴离子交换容量。
测试样本
该测试混合物含有溶解在该流动相中的尿嘧啶（0.1mg/mL）、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵（0.1mg/mL）、甲苯磺酸钠（0.2mg/mL）和丙基苯（0.4mg/mL）。
色谱条件
柱：以2.1×150-mm格式填充的1.9-μm的相21的颗粒
流动相：乙腈/100mM乙酸铵缓冲剂，pH5=50/50（v/v）
流速：0.21mL/min；
注射体积：1μL；
温度：30℃；
检测：在220nm下的UV；
样品：溶解在该流动相中的尿嘧啶（0.1mg/mL）、辛基苯氧基乙氧基乙基二甲基苄基氯化铵（0.1mg/mL）、甲苯磺酸钠（0.2mg/mL）和丙基苯（0.4mg/mL）。
所得到的色谱图是图8。
实例6.HILIC/阴离子交换混合模式相
柱填充
使用高压匀浆填充技术以用于色谱评价的相22来填充2.1mm（内径）×150mm（长度）316不锈钢HPLC柱外壳。
流动相制备[乙腈/100mM乙酸铵缓冲剂，pH5=90/10（v/v）]
步骤1-将7.75±0.03g乙酸铵、2.00±0.01g乙酸和998.0±0.5g去离子水放入一个1000-mL的洗脱液瓶中。通过超声处理充分混合。步骤2-称量100.0±0.2g的上述溶液和704.0±0.5g乙腈到一个1000-mL洗脱液瓶中。通过超声处理充分混合。所得到的溶液用作流动相用于确定该HILIC/阴离子交换混合模式相的阴离子交换容量。
测试样本
该测试混合物含有0.1mg/mL浓度下的溶解在流动相中的醋氨酚、水杨酸和乙酰水杨酸（阿司匹林）。该乙酰水杨酸的保留是该相的阴离子交换容量的指示物。醋氨酚和乙酰水杨酸的洗脱顺序表明选择性。
色谱条件
柱：以2.1×150mm格式填充的1.9-μm的相22的颗粒
流动相：乙腈/100mM乙酸铵缓冲剂，pH5=90/10（v/v）
流速：0.21mL/min；
注射体积：1μL；
温度：30℃；
检测：在220nm下的UV；
样品：醋氨酚、水杨酸和乙酰水杨酸（在流动相中各自为0.1mg/mL）。
所得到的色谱图是图10。
实例7.HILIC/阴离子交换/阳离子交换三峰相
HILIC/WAX/SCX三峰相的制备
将10g的相22分散在100mL的乙酸铵缓冲剂（100mM，pH5）中。分开地，用氨水和乙酸将100mL的磺化乳胶调节至pH6。将相22的混合物和磺化乳胶进行组合并且将所得到的混合物在环境温度下搅拌3小时。将官能化的二氧化硅颗粒过滤掉，并且用去离子水、随后乙腈充分洗涤，以给出物质33，如在图11中所示的。因此，物质33包括处于一种弱阴离子交换部分形式的一个第一离子交换位点、处于一种亲水相互作用部分形式的一个不带电的结合位点、以及处于一种强阳离子交换部分形式的一个第二离子交换位点。该强阳离子交换部分是来自该磺化乳胶。
HILIC/WAX/WCX三峰相的制备
将10g的相22分散在100mL的乙酸铵缓冲剂（100mM，pH5）中。分开地，用氨水和乙酸将100mL的羧化胶乳调节至pH6。将相22的混合物和一种羧化乳胶进行组合并且将所得到的混合物在环境温度下搅拌3小时。将官能化的二氧化硅颗粒过滤掉，并且用去离子水、随后乙腈充分洗涤，以给出物质34，如在图11中所示的。因此，物质34包括处于一种弱阴离子交换部分形式的一个第一离子交换位点、处于一种亲水相互作用部分形式的一个不带电的结合位点、以及处于一种弱阳离子交换部分形式的一个第二离子交换位点。该弱阳离子交换部分是来自该羧化乳胶。
该乳胶根据在共同所有的共同未决的美国预授公开号2009/0277838A1中阐明的步骤进行合成。
实例8：用于荧光基团标记的N-聚糖分离的HILIC/阴离子交换混合模式相。
图1是从牛胎球蛋白中分离2AB连接的N-聚糖的色谱图。通过荧光检测来检测这些聚糖。图2A示出由荧光和MS检测方法两者检测的使用WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱从人类IgG多克隆抗体中分离2AA连接的N-聚糖。使用一种含有甲酸铵、水和乙腈的挥发性流动相（如在以下实例9的表3中所示），从而所得到的方法与质谱法相兼容。表1提供了存在于从人类IgG中分离的2AA连接的N-聚糖中的聚糖结构的清单。与图3B中使用的商业柱相比，每个峰的分离的选择性和分辨率以及基于电荷的峰分离是独特的。该峰宽和峰分辨率与商业聚糖柱是高度可比较的（基于1.7μm的基质颗粒）。参见图3A，与该商业聚糖柱相比，使用WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱的色谱图提供更快的分离（例如，约40分钟）。表7（在以下实例9中提供）提供了存在于从牛胎球蛋白中分离的2AB连接的N-聚糖中的聚糖结构的清单。该商业柱不提供基于电荷的分离，这使得表征极少量不同电荷状态的聚糖，因为这些种类在商业柱中是与其他主峰共同洗脱的。
表1：通过使用WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱从人类IgG中分离2AA标记的N-聚糖对存在于每个峰中的聚糖的结构表征。
Figure BDA0000442517990000341
Figure BDA0000442517990000371
实例9：用于未标记的O-和N-聚糖分离的HILIC/阴离子交换混合模式相。图4是使用一个WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱将未标记的N-聚糖从牛胎球蛋白分离的色谱图。通过MS检测来检测这些聚糖。这些洗脱液和梯度条件与用于使用甲酸铵（0mM-100mM）、水和乙腈作为洗脱液的荧光基团标记的N-聚糖分离的梯度条件（以下所示的）是相同的。如图4中所示，未标记的聚糖是基于电荷、尺寸和极性而进行分离。所有的峰由MS检测器进行检测并且在表2中列出。聚糖谱和更高唾液酸连接的聚糖的数量不同于荧光基团标记的聚糖的谱。观察在荧光基团标记过程中就每个电荷状态和单独聚糖的定性和定量量值而言的聚糖谱的变化。分离的未标记的聚糖还提供足够的MS/MS裂解用于存在于每个峰中的聚糖的表征。标记的聚糖的MS/MS裂解要求的样品与未标记的聚糖所要求的量相比更少。因此，该WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱对于取决于可供使用的样品量的未标记和标记的N-聚糖两者的分析是有用的。如果样品量不是顾虑，那么使用WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱分析未标记聚糖是一种合适的策略用以确定自然结构而不通过标记来改性。O-聚糖通过还原性化学消化方法来释放，这提供了来自蛋白质和粘蛋白的O-聚糖的还原形式。O-聚糖的荧光标记是具有挑战性的，因为这些释放的聚糖在这些聚糖的C1位置上缺少一个反应醛基基团。O-聚糖还是一种唾液酸连接的带电聚糖和中性聚糖的混合物。因此，该WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱是用于O-聚糖分离以及通过质谱法检测的一种理想柱。
表2：通过使用WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱从牛胎球蛋白中分离还原的未标记的N-聚糖对存在于每个峰中的聚糖的结构表征。
Figure BDA0000442517990000372
Figure BDA0000442517990000381
Figure BDA0000442517990000401
Figure BDA0000442517990000411
图1的通过WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱将N-聚糖从标记的牛胎球蛋白中分离的实验条件：三元梯度条件：
柱：相22，1.9μm
尺寸：2.1×150mm
流动相：A-乙腈；B-水；C-甲酸铵（100mM，pH=4.4）
流量：0.4mL/min
温度：30℃
注射：50皮摩尔
检测：荧光（FLD3400）
样品：来自牛胎球蛋白的2AB-N-聚糖
表3：用于使用WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱从牛胎球蛋白中分离2AB-N-聚糖的梯度条件。
Figure BDA0000442517990000421
图3A和图4的在WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱上从标记的和未标记的牛胎球蛋白中分离N-聚糖的实验条件：二元梯度条件
柱：相22，1.9μm
流动相：A：80%乙腈+20%水
     B：甲酸铵（80mM，pH=4.4）
流量：0.4mL/min
温度：30℃
检测：荧光（FLD3400）和MS检测器
MS仪器：Q-Exactive（赛默飞科技（Thermo Scientific），圣何塞（San Jose），加利福尼亚（California）
MS模式：负的
默认电荷状态：2
FT-MS（全MS）
微扫描：1
分辨率：70,000
扫描范围：m/z=380-2200
MS/MS（MS2）
微扫描：1
分辨率：17,500
FT-MS范围：m/z=400-2200
注射：对于来自牛胎球蛋白的2AB连接的N-聚糖为50皮摩尔；对于来自牛胎球蛋白的未标记的N-聚糖为500皮摩尔
样品：来自牛胎球蛋白的未标记的和2AB标记的-N-聚糖
表4：用于使用WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱从牛胎球蛋白中分离N-聚糖的梯度条件。
Figure BDA0000442517990000431
在WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱上从人类IgG中分离2AA连接的N-聚糖的实验条件（图2A和图2B）：二元梯度条件。
柱：相22，1.9μm
流动相：A：80%乙腈+20%水
     B：甲酸铵（80mM，pH=4.4）
流量：0.4mL/min
温度：30℃
检测：荧光（FLD3400）和MS检测器
MS仪器：Q-Exactive
MS模式：负的
FT-MS范围：m/z=400-2200
注射：50皮摩尔
样品：来自人类IgG的2AA-N-聚糖
表5：用于使用WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱从人类IgG中分离2AA N-聚糖的梯度条件。
Figure BDA0000442517990000441
用于在一个商业酰胺HILIC柱（1.7μm）从牛胎球蛋白中分离2AB连接的N-聚糖的实验条件（图3B）。应注意到，图3A的使用WAX/HILIC柱的聚糖分离比图3B的使用商业酰胺HILC柱的色谱图快得多，快了约20分钟。此外，图3A的WAX/HILIC柱洗脱的聚糖顺序地基于自然电荷的大小，而图3B的商业酰胺HILIC柱不是如此。例如，图3B的商业酰胺HILIC柱洗脱的峰9具有一个负2电荷，随后是具有一个负1电荷的峰6，以及然后具有一个负2电荷的峰11a。
流动相：A：乙腈
B：甲酸铵（100mM，pH=4.4）
流量：0.4mL/min
温度：30℃
检测：MS检测器
MS仪器：Q-Exactive
MS模式：负的
FT-MS范围：m/z=400-2200
注射：50皮摩尔
样品：来自牛胎球蛋白的2AB-N-聚糖
表6：用于使用一种商业酰胺HILIC柱（1.7μm）从牛胎球蛋白中分离2AB N-聚糖的梯度条件
Figure BDA0000442517990000451
表7：通过使用WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱从牛胎球蛋白中分离2AB标记的N-聚糖对存在于每个峰中的聚糖的结构表征。
Figure BDA0000442517990000452
Figure BDA0000442517990000461
Figure BDA0000442517990000471
Figure BDA0000442517990000481
实例10：用于荧光标记的N-聚糖分离的WAX/RP混合模式相。
图5是使用一个WAX/RP（相21，1.9μm）柱从牛胎球蛋白中分离2AB连接的N-聚糖的色谱图。通过荧光检测来检测这些聚糖。用于聚糖分离的洗脱液（甲酸铵（0mM-100mM）、水和乙腈）与质谱法是高度相兼容的。该WAX/RP柱从低有机溶剂至高有机溶剂条件下运行。如图4中所示，该WAX/RP（相21，1.9μm）柱基于电荷、尺寸、异构体和极性进行分离。观察到的峰的数量比较地高于其他商业柱并且还高于混合模式柱（相22，1.9μm）。对于来自牛胎球蛋白的N-聚糖，该WAX/RP提供了比商业柱更多数量的峰。该HPLC柱通过荧光检测提供高数量的可检测峰（～44）。此外，该WAX/RP提供了比商业柱更高的峰分辨率。这些梯度和实验条件如下所示。
色谱条件
柱：相21，1.9μm
尺寸：2.1×150mm
流动相：A：乙腈
B：甲酸铵（100mM，pH=4.4）
C：水
流量：0.4mL/min
温度：30℃
注射：100皮摩尔
检测：荧光（FLD3400）
样品：来自牛胎球蛋白的2AB-N-聚糖
表8：用于使用WAX/RP（相21，1.9μm）柱从牛胎球蛋白中分离2AB N-聚糖的梯度条件
Figure BDA0000442517990000491
实例11：用于基于电荷对来自蛋白质的未标记的N-聚糖的定量分析的HILIC/阴离子交换混合模式相
图6示出在一个WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱上基于低聚糖中的唾液酸的电荷或数量的来自牛胎球蛋白的2AB标记的N-聚糖的分离谱。与实例9相比，该流动相具有一个单步梯度以及与有机溶剂相比相对更高的水性比例。该相对高的水性比例导致这些HILIC相互作用被减弱并且基于极性的色谱相互作用（亲水性程度）和尺寸被增加。作为降低的HILIC相互作用的结果，共享一个共同电荷的聚糖峰组，如图1中所示，聚结在一起，如图6中所示。具有相同电荷的所有聚糖作为一个单峰一起洗脱。因此，可以容易和准确地确定该聚糖量值，如在表10中所示。此外，这些WAX/HILIC（相22）相对于通过MS检测的未标记的N-和O-聚糖的定量是有用的。
图6的色谱条件。
柱：相22，1.9μm
尺寸：2.1×150mm
流动相：A：乙腈
        B：甲酸铵（50mM，pH=4.4）
C：水
流量：0.4mL/min
温度：30℃
注射：50皮摩尔
检测：荧光（FLD3400）
样品：来自牛胎球蛋白的2AB-N-聚糖
表9：用于使用一个WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱从牛胎球蛋白中定量分离2AB N-聚糖的梯度条件
Figure BDA0000442517990000501
表10：使用一个WAX/HILIC（相22，1.9μm）柱的来自牛胎球蛋白的2AB-N-聚糖的每个电荷状态聚糖的定量量值。该定量数据对应于图6的这些峰。
Figure BDA0000442517990000502
Figure BDA0000442517990000511
出于说明和描述目的，已经呈现了本发明的多种具体实施例的前文描述。它们不旨在是详尽无遗的或者将本发明限制于披露的精确形式，并且鉴于上文传授内容，许多修改和变化显然都是可行的。选择和描述了这些实施例以便于最佳解释本发明的原理以及其实际应用，从而允许本领域的其他技术人员最佳利用本发明和具有如适合于所涵盖的具体用途的多种修改的多种实施例。旨在本发明的范围由此处所附的权利要求书以及其等效物来界定。
在此引用的所有公开、专利和专利申请出于所有目的通过引用以其全部内容结合在此。

Claims (41)

1.一种将一种聚糖混合物的一种第一聚糖组分与一种第二聚糖组分分离的多峰色谱方法，所述方法包括：
(a)使所述聚糖混合物在有效实现所述分离的条件下与一种多峰色谱介质以及一种水性洗脱液接触，该多峰色谱介质包括一个结合到一种第一基质上的离子交换色谱部分和一个结合到一种第二基质上的不带电的色谱部分，所述不带电的色谱部分选自一个反相色谱部分、一个亲水相互作用色谱部分以及它们的组合，该水性洗脱液包括一种电解质和一种有机溶剂，从而分离所述第一聚糖组分和所述第二聚糖组分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分是一个阴离子交换部分。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分是一种胺。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二色谱部分是一个亲水相互作用色谱部分并且是一种脲。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分通过一个第一连接体部分被结合到所述第一基质上。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述不带电的色谱部分通过一个第二连接体部分被结合到所述第二基质上。
7.如权利要求6所述的方法，其中，选自所述第一连接体部分、所述第二连接体部分以及它们的组合的一个成员是一个被取代的或未被取代的烷基部分。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述被取代的或未被取代的烷基连接体在长度上是从约3个碳至约40个碳。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一连接体在长度上是从约3个碳至约30个碳。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，所述第二连接体在长度上是从约8个碳至约40个碳。
11.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一基质和所述第二基质是相同的基质。
12.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一基质和所述第二基质是不同的基质。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分与所述第一连接体一起具有以下化学式：
Figure FDA0000442517980000021
其中
R2和R3独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；并且n是一个从3至30的整数。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述离子交换色谱部分与所述第一连接体一起具有以下化学式：
Figure FDA0000442517980000022
15.根据权利要求9所述的方法，其中，所述不带电的色谱部分与所述第二连接体一起具有一个化学式，该化学式是一个选自以下化学式的成员：
Figure FDA0000442517980000031
其中
R1、R2、和R3独立地选自H、被取代的或未被取代的烷基和被取代的或未被取代的杂烷基；并且
m和p是独立地选自从8至40的整数。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述不带电的色谱部分与所述第二连接体一起具有一个化学式，该化学式是一个选自以下化学式的成员：
Figure FDA0000442517980000032
17.根据权利要求6所述的方法，其中，选自所述第一基质、所述第二基质以及它们的组合的一个成员是一种二氧化硅基质。
18.根据权利要求6所述的方法，其中，选自所述第一基质、所述第二基质以及它们的组合的一个成员是一种颗粒。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，选自所述第一基质、所述第二基质以及它们的组合的一个成员是一种二氧化硅颗粒，该二氧化硅颗粒具有从约1μm至约20μm的直径。
20.根据权利要求1所述的方法，其中，所述电解质以从约1mM至约50mM的量存在。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述有机溶剂以最高达所述洗脱液的约95%（v/v）的量存在于所述洗脱液中。
22.根据权利要求1所述的方法，进一步包括(b)：在步骤(a)之前，通过处理至少一种具有糖苷酶的糖蛋白的一种溶液来制备一种第一前体聚糖混合物，从而形成所述第一前体聚糖混合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，在所述糖苷酶中是一个选自N-糖酰胺酶F、N-糖酰胺酶A以及它们的组合的成员。
24.根据权利要求22所述的方法，进一步包括(c)：在步骤(b)之后，通过一种方法制备一种第二前体聚糖混合物，该第二前体聚糖混合物包括所述第一聚糖组分和所述第二聚糖组分，该制备方法包括：
(i)将在所述第一前体聚糖混合物中的蛋白质沉淀，形成一种包含沉淀的蛋白质和上清液的混合物；
(ii)通过将所述步骤(i)的混合物离心来将所述沉淀的蛋白质造粒，形成一种两相混合物；
(iii)将所述上清液从所述两相混合物中去除，形成一种分离的上清液；并且
(iv)将所述分离的上清液进行透析，从而形成所述第二前体聚糖混合物；或者
(i)使所述第一前体聚糖混合物经受反相高效液相色谱法，从而形成所述第二前体聚糖混合物。
25.如权利要求24所述的方法，进一步包括(d)：在步骤(c)之后，通过一种方法制备一种标记的聚糖混合物，该标记的聚糖混合物包括一种标记的所述第一聚糖组分和标记的所述第二聚糖组分，该制备方法包括使所述第二前体聚糖混合物经受一种包含一种反应性的、可检测的标记的混合物，在有效地用所述可检测的标记来标记所述第二前体聚糖混合物中的一种聚糖的条件下，从而制备所述标记的聚糖混合物。
26.如权利要求25所述的方法，其中，所述可检测的标记是一种荧光标记。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述条件是对于通过具有选自所述第一聚糖组分、所述第二聚糖组分和它们的组合的一个成员的一个还原部分来进行的所述可检测的标记的还原氨化而言是有效的，其中所述可检测的标记包括一个反应性胺部分。
28.如权利要求26所述的方法，其中，所述荧光标记是一种芳香胺。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述芳香胺是选自2-氨基苯甲酸、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基吡啶、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸、2-氨基吖啶酮、以及9-氨基芘-1,3,6-三磺酸的一个成员。
30.如权利要求24所述的方法，进一步包括(d)：在步骤(c)之后，用选自唾液酸酶A、唾液酸酶B以及它们的组合的一个成员来处理所述第二前体聚糖混合物，从而制备所述聚糖混合物。
31.如权利要求30所述的方法，进一步包括(e)：在步骤(a)之后，使所述第一聚糖组分和所述第二聚糖组分经受通过质谱法的分析。
32.如权利要求25所述的方法，进一步包括，在步骤(a)之后，使所述标记的第一聚糖组分和所述标记的第二聚糖组分经受通过质谱法的分析。
33.如权利要求1所述的方法，其中，所述分离导致一个色谱图，其中所述第一聚糖组分和所述第二聚糖组分具有与它们的电荷成比例的保留时间，使得具有与所述第一聚糖组分或所述第二聚糖组分相同的电荷的一种第三聚糖将具有与具有相同电荷的聚糖组分成组的保留时间。
34.一种改进在一种多峰色谱介质上的一种未唾液酸化的第一聚糖和一种未唾液酸化的第二聚糖的色谱分离的方法，所述介质包括一个结合到一种第一基质上的离子交换色谱部分和一个结合到一种第二基质上的不带电的色谱部分，所述不带电的色谱部分选自一个反相色谱部分、一个亲水相互作用色谱部分以及它们的组合，所述方法包括：
(a)用一种包括一个带电部分的可检测标记将所述第一未唾液酸化的聚糖和所述第二未唾液酸化的聚糖进行衍生，形成一种标记的第一聚糖和一种标记的第二聚糖；并且
(b)使所述多峰色谱介质在有效地分离所述第一和第二标记的聚糖的条件下与所述标记的第一聚糖以及所述标记的第二聚糖接触，其中所述分离相对于在所述多峰色谱介质上的所述第一未唾液酸化的聚糖和所述第二未唾液酸化的聚糖的一种分离是改进的。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述分离是通过在有效地实现所述分离的条件下，使一种洗脱液流过所述多峰色谱介质，使得所述第一标记的聚糖和所述第二标记的聚糖与所述介质接触而实现的，其中所述洗脱液包含不大于30%的电解质，从而形成包含与所述第二聚糖组分分离的所述第一聚糖组分的一种洗脱液。
36.一种多峰色谱介质，包含：
(a)一种微粒二氧化硅基质；
(b)一个结合到所述基质上的第一离子交换结合位点；
(c)一个不带电的结合位点，该不带电的结合位点是选自也结合到所述基质上的一个亲水相互作用色谱结合位点、和一个反相色谱结合位点的一个成员；以及
(d)一个选自一个第二离子交换结合位点和一个第二不带电的结合位点的成员，该第二不带电的结合位点是选自也结合到所述基质上的一个亲水相互作用色谱结合位点、和一个反相色谱结合位点的一个成员。
37.根据权利要求36所述的色谱介质，其中，所述第一离子交换结合位点是一个阴离子结合位点。
38.根据权利要求36所述的色谱介质，进一步包括一个第二离子交换结合位点。
39.根据权利要求38所述的色谱介质，其中，所述第一离子交换结合位点是一个阴离子结合位点并且所述第二离子交换结合位点是一个阳离子交换结合位点。
40.根据权利要求39所述的色谱介质，其中，所述不带电的结合位点是一个反相结合位点。
41.根据权利要求39所述的色谱介质，其中，所述不带电的结合位点是一个亲水相互作用结合位点。
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