TWI714426B - 液相層析試劑組 - Google Patents

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Abstract

一種液相層析試劑組包括移動相濃縮液以及樣品回溶液。移動相濃縮液包括第一溶劑、緩衝劑以及酸鹼調節劑。樣品回溶液包括第二溶劑以及抗吸附劑。緩衝劑的體積莫耳濃度與酸鹼調節劑的體積莫耳濃度的比值為400：1至1：1。抗吸附劑的體積莫耳濃度至少小於或等於緩衝劑的體積莫耳濃度的250倍。

Description

液相層析試劑組
本發明是有關於一種試劑組，且特別是有關於適用於液相層析法的一種液相層析試劑組。
色層分析法(chromatography)簡稱為層析法是一種可將複雜的混合物分離純化和分析方法。近年來，層析法已廣泛應用於各個領域，成為多組分混合物的重要分析方法之一，於科學領域中有著重要作用。層析法可依據移動相與固定相分類為氣相層析法(gas chromatography，GC)以及液相層析法(liquid chromatography，LC)。
在液相層析中使用具有強離子性化合物，如結構上具有硫酸基、磷酸基等陰離子官能基，或是二級胺、三級胺或四級胺等強陽離子官能基，可在分析時得到較強的訊號。不過，強離子性的官能基彼此之間的作用影響，會使離子吸附於層析過程中所接觸的金屬管柱或金屬表面，造成樣品損失以及降低靈敏度。因此，如何提升液相層析法的靈敏度及效果，為本領域亟需解決的問題。
本發明提供一種液相層析試劑組，其能提升液相層析法的靈敏度並提升偵測的效果。
本發明的液相層析試劑組包括移動相濃縮液以及樣品回溶液。移動相濃縮液包括第一溶劑、緩衝劑以及酸鹼調節劑。樣品回溶液包括第二溶劑以及抗吸附劑。緩衝劑的體積莫耳濃度與酸鹼調節劑的體積莫耳濃度的比值為400：1至1：1。抗吸附劑的體積莫耳濃度至少小於或等於緩衝劑的體積莫耳濃度的250倍。
在本發明的一實施例中，上述的緩衝劑與酸鹼調節劑的體積莫耳濃度的比值為40：1至10：1。
在本發明的一實施例中，上述的緩衝劑的體積莫耳濃度為20毫莫耳每升（mM）至200毫莫耳每升。
在本發明的一實施例中，上述的酸鹼調節劑的體積莫耳濃度為0.5毫莫耳每升至20毫莫耳每升。
在本發明的一實施例中，上述的第一溶劑為選自於由水、甲醇、乙醇、異丙醇以及乙腈所組成的群組中的一者。
在本發明的一實施例中，上述的緩衝劑為選自於由甲酸銨、乙酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、氟化銨以及檸檬酸銨所組成的群組中的一者。
在本發明的一實施例中，上述的酸鹼調節劑為選自於由甲酸、乙酸、檸檬酸、碳酸以及氨水所組成的群組中的一者。
在本發明的一實施例中，上述的抗吸附劑的體積莫耳濃度至少小於或等於5000毫莫耳每升。
在本發明的一實施例中，上述的第二溶劑為選自於由水、甲醇、乙醇、異丙醇以及乙腈所組成的群組中的一者。
在本發明的一實施例中，上述的抗吸附劑為選自於由甲酸、乙酸、檸檬酸、碳酸、氨水、甲酸銨、乙酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、氟化銨、檸檬酸銨、甲酸鈉、乙酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氟化鈉以及檸檬酸鈉所組成的群組中的一者。
在本發明的一實施例中，上述的液相層析試劑組更包括連接管以及層析管柱。層析管柱連接至連接管。連接管的材質為非金屬材質。層析管柱的材質為非金屬材質。
基於上述，本發明一實施例的液相層析試劑組，由於使用了抗吸附劑，因此可以減少離子於液相層析過程中吸附至所接觸的金屬表面的機率，以減少造成樣品損失。此外，由於抗吸附劑可以減少離子吸附至金屬表面，還可以改善所偵測的到的峰形、避免延遲出峰，以提升液相層析法的靈敏度及偵測的效果。
下文將詳細描述本發明的例示性實施例，且其可由本領域技術人員容易地執行。然而，本發明可用多種不同形式實施，且不應理解為受限於本文所闡述的例示性實施例。
再者，本說明書中的基（原子團）的表述中，未記載經取代及未經取代的表述是包含不具有取代基的基（原子團）並且亦包含具有取代基的基（原子團）的表述。例如，所謂「烷基」，不僅包含不具有取代基的烷基（未經取代的烷基），而且亦包含具有取代基的烷基（經取代的烷基）。
以下所記載的構成要件的說明有時是基於本發明的具代表性的實施方式而成，本發明並不受到此種實施方式的限定。再者，本說明書中，使用「～」表示的數值範圍是指包含「～」前後所記載的數值作為下限值及上限值的範圍。
下文描述了根據本發明一實施例的液相層析試劑組。
根據本發明一實施例的液相層析試劑組包括：移動相濃縮液以及樣品回溶液。移動相濃縮液包括第一溶劑、緩衝劑以及酸鹼調節劑。樣品回溶液包括第二溶劑以及抗吸附劑。在一些實施例中，液相層析試劑組還包括連接管以及層析管柱。層析管柱可連接至連接管，但不以此為限。
在本實施例中，移動相濃縮液舉例為包括溶於第一溶劑中的緩衝劑以及酸鹼調節劑。第一溶劑可包括水或有機溶劑。舉例來說，第一溶劑例如為選自於由水、甲醇（methanol）、乙醇（ethanol）、異丙醇(isopropanol)以及乙腈（acetonitrile）所組成的群組中的一者，但本發明不以此為限。在本實施例中，水舉例可為去離子水或蒸餾水，但不以此為限。在一些實施例中，第一溶劑還可包括異丁醇（isobutyl alcohol）、醚（ether）、酮（ketone）或其他合適的溶劑，但本發明不以此為限。
在本實施例中，緩衝劑可包括鹽類(salt)，例如金屬離子或銨根離子（ammonium，NH 4 +）與酸根離子或非金屬離子接合的化合物。本實施例的鹽類可包括有機鹽類或無機鹽類。舉例來說，緩衝劑例如為選自於由甲酸銨(ammonium formate)、乙酸銨(ammonium acetate)、碳酸銨(ammonium carbonate)、碳酸氫銨(ammonium bicarbonate)、氟化銨(ammonium fluoride)以及檸檬酸銨(ammonium citrate)所組成的群組中的一者或其他合適的鹽，但本發明不以此為限。
在本實施例中，移動相濃縮液中的緩衝劑的體積莫耳濃度（molarity）為20毫莫耳每升（mM）至200毫莫耳每升，但本發明不以此為限。
在本實施例中，移動相濃縮液中的酸鹼調節劑可包括酸或鹼。舉例來說，本實施例的酸鹼調節劑例如為選自於由甲酸(formic acid)、乙酸(acetic acid)、檸檬酸(citric acid)、碳酸(carbonic acid)以及氨水(ammonia water)所組成的群組中的一者或其他合適的酸或鹼，但本發明不以此為限。在一些實施例中，酸鹼調節劑還可包括磷酸(phosphoric acid)，但不以此為限。
在本實施例中，移動相濃縮液中的酸鹼調節劑的體積莫耳濃度（molarity）為0.5毫莫耳每升至20毫莫耳每升，但本發明不以此為限。
在本實施例中，液相層析試劑組中的緩衝劑的體積莫耳濃度與酸鹼調節劑的體積莫耳濃度的比值為400：1至1：1，但不以此為限。在上述的體積莫耳濃度的比值下，本實施例的液相層析試劑組能提升液相層析的分離校能，且能提升液相層析的靈敏度。
在一些實施例中，緩衝劑與酸鹼調節劑的體積莫耳濃度的比值可調整為40：1至10：1，但不以此為限。上述的體積莫耳濃度的比值為在第一溶劑中緩衝劑與酸鹼調節劑所添加的體積莫耳濃度比例。在上述的體積莫耳濃度的比值範圍下，本實施例的液相層析試劑組能提升液相層析的分離校能，且能提升液相層析的靈敏度。
在本實施例中，樣品回溶液舉例為包括溶於第二溶劑中的抗吸附劑。第二溶劑可包括水或有機溶劑。舉例來說，第二溶劑例如為選自於由水、甲醇、乙醇、異丙醇以及乙腈（acetonitrile）所組成的群組中的一者，但本發明不以此為限。在本實施例中，水舉例可為去離子水或蒸餾水，但不以此為限。在一些實施例中，第二溶劑還可包括異丁醇、醚、酮或其他合適的溶劑，但本發明不以此為限。在本實施例中，第二溶劑可以與第一溶劑相同或不同，本發明不以此為限。
在本實施例中，抗吸附劑為選自於由甲酸、乙酸、檸檬酸、碳酸、氨水、甲酸銨、乙酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、氟化銨、檸檬酸銨、甲酸鈉(sodium formate)、乙酸鈉(sodium acetate)、碳酸鈉(sodium carbonate)、碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)、氟化鈉(sodium fluoride)以及檸檬酸鈉(sodium citrate)所組成的群組中的一者或其他合適的化合物，但本發明不以此為限。
值得說明的是，在本實施例中，抗吸附劑的體積莫耳濃度為至少小於或等於5000毫莫耳每升。藉此，抗吸附劑的體積莫耳濃度至少小於或等於緩衝劑的體積莫耳濃度的250倍。在一些實施例中，抗吸附劑的體積莫耳濃度也可以為緩衝劑的體積莫耳濃度的25倍至250倍。當抗吸附劑的體積莫耳濃度與緩衝劑的體積莫耳濃度的比例在上述的範圍中時，抗吸附劑可以減少離子於液相層析過程中吸附至所接觸的金屬表面的機率，以減少造成樣品損失。此外，由於抗吸附劑可以減少離子吸附至金屬表面，還可以改善所偵測的到的峰形、避免延遲出峰，以提升液相層析法的靈敏度及偵測的效果。
在本實施例中，液相層析試劑組所包括的連接管可以將層析管柱連接至液相層析儀的自動進樣器。也就是說，層析管柱可以從自動進樣器將離子性化合物（包括待測的樣品以及液相層析試劑組的混合液）導入層析管柱中以進行層析分離。在本實施例中，連接管的材質為非金屬材質，且層析管柱的材質為非金屬材質。舉例來說，非金屬材質可包括玻璃、橡膠、高分子聚合物或其他合適的材質，但本發明不以此為限。如此一來，本實施例的液相層析試劑組可以透過非金屬材質的層析管柱與連接管，以減少樣品與金屬接觸的面積，進一步降低樣品中的離子吸附至金屬表面的機率。此外，樣品回溶液中的抗吸附劑可持續地由移動相流動而施加於液相層析儀的樣品通道中。藉此，在樣品與液相層析儀中的金屬表面所接觸的部分，可透過抗吸附劑來保護樣品，以減少及/或避免樣品中的離子吸附至金屬表面上，而能減少樣品損失、提升液相層析法的靈敏度及偵測的效果。
以下透過液相層析法對實施例1至實施例2及比較例1至比較例3進行多種化合物的分離。下文將參照實施例1至實施例2及比較例1至比較例3，更具體地描述本發明的特徵。雖然描述了以下實驗例1及實施例2，但是在不逾越本發明範疇之情況下，可適當地改變所用材料、其量及比率、處理細節以及處理流程等等。因此，不應由下文所述的實驗例對本發明作出限制性地解釋。
＜比較例1＞
圖1A是比較例1中使用0.1%甲酸對多種毒素進行液相層析所獲得的梯度分析圖。在比較例1中，使用甲酸與水及甲醇的混合物得到一般常用的0.1%甲酸的移動相。
然後，將待測的多種毒素樣品溶於上述的移動相中，以配置成待測溶液。
接著，將上述的待測溶液經由習知的金屬連接管及金屬層析管柱上機進行液相層析，並透過質譜儀進行檢測，得到圖1A的梯度分析圖。
＜實施例1＞
圖1B是實施例1中使用本發明的液相層析試劑組對多種毒素進行液相層析所獲得的梯度分析圖。在實施例1中，使用本發明的液相層析試劑組並依據前述的緩衝劑的體積莫耳濃度與酸鹼調節劑的體積莫耳濃度的比值配置移動相濃縮液。接著，對上述移動相濃縮液進行200倍稀釋以獲得上機移動相。上機移動相中的緩衝劑的體積莫耳濃度為0.1mM至1mM，且上機移動相中的酸鹼調節劑的體積莫耳濃度為0.0025mM至0.1mM。
接著，依據前述的抗吸附劑的體積莫耳濃度配置樣品回溶液濃縮液。然後，對上述樣品回溶液濃縮液進行200倍稀釋以獲得上機樣品回溶液。上機樣品回溶液中的抗吸附劑的體積莫耳濃度為小於或等於25mM。
接著，將待測的多種毒素樣品溶於上機樣品回溶液以及上機移動相中，以配置成待測溶液。
接著，將上述的待測溶液經由液相層析試劑組中的非金屬連接管及非金屬層析管柱上機進行液相層析，並透過質譜儀進行檢測，得到圖1B的梯度分析圖。
如圖1A所示，比較例1的梯度分析圖顯示了可在12.5分鐘（X軸）內將毒素樣品完成分離。由圖1A可知，以一般0.1%甲酸與水/甲醇所製備的移動相可得到毒素的最強峰值約為0.6x1,000,000的離子強度（Y軸）訊號。
請同時參考圖1A及圖1B，如圖1B所示，使用了本發明的液相層析試劑組的實施例1於梯度分析圖顯示了，可在相同的時間內將毒素樣品完成分離。此外，以本發明的液相層析試劑組所製備的移動相與抗吸附劑的組合可得到毒素的最強峰值約為1.8x1,000,000的離子強度訊號。也就是說，在使用了本發明的液相層析試劑組後，可大幅的提升液相層析法的靈敏度。相較於比較例1，使用了本發明的液相層析試劑組的實施例1的離子強度訊號有了至少3倍至5倍的成長。此外，部分的毒素樣品的離子強度訊號更有了約10倍以上的成長。也就是說，使用本案的液相層析試劑組可以有效的避免離子吸附至金屬表面上，而能減少樣品損失、減少延遲出峰和訊號峰變形等現象。如此一來，本案的液相層析試劑組能有效提升液相層析法的靈敏度，大幅提升偵測的效果。
＜比較例2-3＞
圖2A是比較例2中使用5mM醋酸銨對多種農藥進行液相層析所獲得的梯度分析圖。在比較例2中，移動相的配置方法包括使用醋酸銨與水及甲醇的混合物得到一般常用的5mM醋酸銨的移動相。
然後，將待測的203種農藥的樣品溶於上述的5mM醋酸銨的移動相中，以配置成待測溶液。
接著，將上述的待測溶液經由層析管柱上機進行液相層析，並透過質譜儀進行檢測，得到圖2A的梯度分析圖。
圖2B是比較例3中使用5mM醋酸銨與本發明的液相層析試劑組對多種農藥進行液相層析所獲得的梯度分析圖。比較例3的移動相的配置方法與比較例2大致相似，其差別在於：將本發明的液相層析試劑組所包括的移動相濃縮液與樣品回溶液進行200倍稀釋後，與比較例2中的5mM醋酸銨的移動相混合，以得到含本發明的液相層析試劑組的5mM醋酸銨的移動相。
然後，將待測的203種農藥的樣品溶於上述的含本發明的液相層析試劑組的5mM醋酸銨移動相中，以配置成待測溶液。
接著，將上述的待測溶液經由層析管柱上機進行液相層析，並透過質譜儀進行檢測，得到圖2B的梯度分析圖。
>實施例2>
圖2C是實施例2中使用本發明的液相層析試劑組對多種農藥進行液相層析所獲得的梯度分析圖。實施例2使用的是本發明的液相層析試劑組，包括使用本發明的液相層析試劑組所配置的移動相濃縮液。接著，對上述移動相濃縮液進行200倍稀釋以獲得上機移動相。
接著，對本發明的液相層析試劑組所配置的樣品回溶液濃縮液進行200倍稀釋以獲得上機樣品回溶液。
然後，將待測的203種農藥的樣品溶於上機樣品回溶液以及上機移動相中，以配置成待測溶液。
接著，將上述的待測溶液經由液相層析試劑組中的非金屬連接管及非金屬層析管柱上機進行液相層析，並透過質譜儀進行檢測，得到圖2C的梯度分析圖。
如圖2A、圖2B及圖2C所示，比較例2、比較例3及實施例2的梯度分析圖顯示了可在12分鐘（X軸）內將多種農藥層析分離並取得離子濃度訊號(Y軸)。由圖2A可知，在比較例2中，以一般5mM醋酸銨與水/甲醇所製備的移動相所偵測到的農藥的最強峰值約為1.2x1,000,000的離子強度訊號。由圖2B可知，在比較例3中，以5mM醋酸銨與水/甲醇混合本案的液相層析試劑組所製備的移動相所偵測到的農藥的最強峰值約為1.6x1,000,000的離子強度訊號。由圖2C可知，以本案的液相層析試劑組所製備的移動相與抗吸附劑的組合所偵測到的農藥的最強峰值約為2.6x1,000,000的離子強度訊號。也就是說，在使用了本發明的液相層析試劑組後，可大幅的提升液相層析法的靈敏度。此外，由於比較例3使用了本案液相層析試劑組（包括：緩衝劑、酸鹼調節劑以及抗吸附劑）與5mM醋酸胺，因此平均靈敏度相較於比較例2提升了約2.8倍。另外，由於實施例2僅使用本案液相層析試劑組，因此平均靈敏度相較於比較例2提升了約5.2倍。
下表1及下表2記載了實施例2與比較例3相對於比較例2的靈敏度倍數，及對應靈敏度倍數的農藥樣品的數量。表1對於上述靈敏度倍數的定義為，在實施例2中所偵測到的各農藥樣品的離子濃度(例如：各峰的面積)除以在比較例2所偵測到的各農藥樣品的離子濃度(例如：各峰的面積)，或在比較例3中所偵測到的各農藥樣品的離子濃度除以在比較例2所偵測到的各農藥樣品的離子濃度。
表1
靈敏度倍數 （例：以峰的面積計算） 比較例3 實施例2
>0.5 9 5
0.5~1 10 3
1~2 56 18
2~5 98 109
5~10 26 45
>10 4 23
總數 203 203
表2對於上述靈敏度倍數的定義為，在實施例2中所偵測到的各農藥樣品的離子強度訊號(例如：各峰的最大高度)除以在比較例2所偵測到的各農藥樣品的離子強度訊號(例如：各峰的最大高度)，或在比較例3中所偵測到的各農藥樣品的離子強度訊號除以在比較例2所偵測到的各農藥樣品的離子強度訊號。
表2
靈敏度倍數 （例：以峰的最大高度計算） 比較例3 實施例2
>0.5 10 6
0.5~1 11 10
1~2 79 21
2~5 80 108
5~10 19 42
>10 4 16
總數 203 203
由上表1可知，比較例3所使用的移動相可提升液相層析法對於203種農藥樣品中98種農藥樣品的靈敏度至2倍至5倍。此外，由上表2可知，比較例3所使用的移動相可提升液相層析法對於203種農藥樣品中80種農藥樣品的靈敏度至2倍至5倍。也就是說，相較於比較例2，在比較例3中使用一般常用的移動相混合本發明的液相層析試劑組已具有提升靈敏度的效果。
此外，由表1的內容可知，實施例2所使用的本發明的液相層析試劑組（僅包括本案液相層析試劑組的內容）可更進一步提升液相層析法對於109種農藥樣品的靈敏度至2倍至5倍，對於45種農藥樣品的靈敏度至5倍至10倍以及對於23種農藥樣品的靈敏度至大於10倍。另外，由表2的內容也可得知，實施例2所使用的本發明的液相層析試劑組可進一步提升液相層析法對於多種農藥樣品的靈敏度。也就是說，本發明的液相層析試劑組可以提升對於偵測更多種農藥的靈敏度，且所提升的靈敏度倍數更高，因此能大幅提升液相層析法所偵測到的訊號強度。從另一角度來說，使用本發明液相層析試劑組進行的液相層析法能大幅減少樣品中的離子接觸金屬表面的機率，而具有極為優秀靈敏度，能大幅提升偵測的效果。
綜上所述，本發明一實施例的液相層析試劑組，由於使用了抗吸附劑，因此可以減少離子於液相層析過程中吸附至所接觸的金屬表面的機率，以減少造成樣品損失。此外，由於抗吸附劑可以減少離子吸附至金屬表面，還可以改善所偵測的到的峰形、避免延遲出峰，以提升液相層析法的靈敏度及偵測的效果。另外，由於液相層析試劑組所提供的連接管與層析管柱的材質為非金屬材質，因此可以減少樣品與金屬接觸的面積，進一步降低樣品中的離子吸附至金屬表面的機率，進而能大幅提升液相層析法所偵測到的訊號強度，以提升液相層析法的靈敏度及偵測的效果。
無
圖1A是比較例1中使用0.1%甲酸對多種毒素進行液相層析所獲得的梯度分析圖。 圖1B是實施例1中使用本發明的液相層析試劑組對多種毒素進行液相層析所獲得的梯度分析圖。 圖2A是比較例2中使用5mM醋酸銨對多種農藥進行液相層析所獲得的梯度分析圖。 圖2B是比較例3中使用5mM醋酸銨與本發明的液相層析試劑組對多種農藥進行液相層析所獲得的梯度分析圖。 圖2C是實施例2中使用本發明的液相層析試劑組對多種農藥進行液相層析所獲得的梯度分析圖。

Claims (11)

  1. 一種液相層析試劑組，包括： 移動相濃縮液，包括： 第一溶劑； 緩衝劑；以及 酸鹼調節劑；以及 樣品回溶液，包括： 第二溶劑；以及 抗吸附劑， 其中，所述緩衝劑的體積莫耳濃度與所述酸鹼調節劑的體積莫耳濃度的比值為400：1至1：1， 其中，所述抗吸附劑的體積莫耳濃度至少小於或等於所述緩衝劑的體積莫耳濃度的250倍。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，其中所述緩衝劑與所述酸鹼調節劑的體積莫耳濃度的比值為40：1至10：1。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，其中所述緩衝劑的體積莫耳濃度為20毫莫耳每升(mM)至200毫莫耳每升。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，其中所述酸鹼調節劑的體積莫耳濃度為0.5毫莫耳每升至20毫莫耳每升。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，其中所述第一溶劑為選自於由水、甲醇、乙醇、異丙醇以及乙腈所組成的群組中的一者。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，其中所述緩衝劑為選自於由甲酸銨、乙酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、氟化銨以及檸檬酸銨所組成的群組中的一者。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，其中所述酸鹼調節劑為選自於由甲酸、乙酸、檸檬酸、碳酸以及氨水所組成的群組中的一者。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，其中所述抗吸附劑的體積莫耳濃度為至少小於或等於5000毫莫耳每升。
  9. 申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，其中所述第二溶劑為選自於由水、甲醇、乙醇、異丙醇以及乙腈所組成的群組中的一者。
  10. 申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，其中所述抗吸附劑為選自於由甲酸、乙酸、檸檬酸、碳酸、氨水、甲酸銨、乙酸銨、碳酸銨、碳酸氫銨、氟化銨、檸檬酸銨、甲酸鈉、乙酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氟化鈉以及檸檬酸鈉所組成的群組中的一者。
  11. 申請專利範圍第1項所述的液相層析試劑組，更包括： 連接管；以及 層析管柱，所述層析管柱連接至所述連接管， 其中，所述連接管的材質為非金屬材質， 其中，所述層析管柱的材質為非金屬材質。
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