CN115326995B - 一种酱油中酱油酮的定量分析方法 - Google Patents

一种酱油中酱油酮的定量分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种酱油中酱油酮的定量分析方法，属于化学检测技术领域。本发明方法包括：将酱油样品采用二氯甲烷萃取后，氮吹浓缩，得浓缩液A；所述酱油样品与二氯甲烷的体积比为1：(0.25～0.3)；浓缩液A采用展开剂进行薄层层析处理后进行复溶处理，得层析处理品B；所述展开剂为乙酸乙酯和丙酮的混合液，两者的体积比为(7.5:2.5)～(8.5:1.5)；配制酱油酮的标准溶液，将层析处理品B和标准溶液进行UHPLC‑DAD检测，对酱油样品中的酱油酮进行定量分析。该测试方法可针对酱油酮单一物质进行准确定量，同时前处理及检测过程操作简单，无需额外施加环境或使用设备，前处理及分析时间短，经济性价比高。

Description

一种酱油中酱油酮的定量分析方法
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，具体涉及一种酱油中酱油酮的定量分析方法。
背景技术
酱油酮(环高呋喃酮)具有典型的焦糖香气，被认为是酱油中的关键香气活性物质，因此对酱油中酱油酮的快速准确定量可以辅助进行酱油品质的判定和监控。一般情况下，酱油酮在酱油中的含量约为0.1～50mg/L，而目前主要用于检测酱油中酱油酮等香气成分的手段包括LLE(液液萃取)、SDE(同时蒸馏萃取)、SPME(顶空固相微萃取)和SAFE(溶剂辅助蒸馏)等前处理方法结合GCMS(气质联用)的检测技术。然而由于酱油酮含量少，极性大，SDE和SPME结合GCMS技术很难检测出酱油酮成分，而LEE结合GCMS虽然可以对酱油酮进行定性，但响应信号差，分析耗时长；SAFE前处理手段虽然可以有效提纯酱油酮，但处理过程繁琐，耗时长且需要特定的SAFE设备，难以做到高性价比高效检测。另一方面，GCMS检测技术主要适合用于多组分的定性定量分析，耗时很长，同样难以针对酱油酮这一单独物质进行快速定量，而酱油中除了酱油酮外，还包含了各种无机和有机基质，干扰物种类多，同时酱油酮本身的极性强，热稳定性差，因此若不进行高效提纯，很难提升酱油酮在定量时的信号强度。
综上所述，现有技术对于酒品中酱油酮的定量分析难以同时做到设备要求低、操作简练高效、测定干扰小及准确性高的特点。
发明内容
基于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供了一种酱油中酱油酮的定量分析方法，该方法通过LEE法结合氮吹处理对酱油中的有机活性物质进行富集浓缩，随后对浓缩液采用薄层层析法进行二次提纯以去除大部分杂质干扰，最终采用UHPLC-DAD进行酱油酮的定量分析，该测试方法可以针对酱油酮这一物质进行准确定量，同时前处理及检测过程操作简单，无需额外施加环境或使用设备，前处理及分析时间短，经济性价比高。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种酱油中酱油酮的定量分析方法，包括以下步骤：
(1)将酱油样品采用二氯甲烷萃取后，氮吹浓缩，得浓缩液A；所述酱油样品与二氯甲烷的体积比为1：(0.25～0.3)；
(2)浓缩液A采用展开剂进行薄层层析处理后进行复溶处理，得层析处理品B；所述展开剂为乙酸乙酯和丙酮的混合液，两者的体积比为(7.5:2.5)～(8.5:1.5)；
(3)配制酱油酮的标准溶液，将层析处理品B和标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对酱油样品中的酱油酮进行定量分析。
优选地，所述酱油样品包括特级酱油样品、一级酱油样品、二级酱油样品和三级酱油样品。
本发明所述酱油中酱油酮的定量分析方法中，首先通过二氯甲烷以LEE法进行酱油的有机相富集萃取，随后采用氮吹法进行浓缩，所得浓缩液再通过薄层层析处理，以特定合适的展开剂对浓缩液中的酱油酮进行有效分离，排出有机相其他物质的检测干扰，而该步骤并不需要引入额外的特殊环境或设备，相对SAFE法等现有技术耗时缩短，而经后续UHPLC-DAD检测可直接进行酱油酮的定量分析，所述分析出峰耗时仅需约10min，同时酱油酮的响应信号强，准确率高；所述定量分析方法适用性强，针对现有国标分类《酿造酱油》的各特级、一级、二级和三级酱油的酱油酮定量分析均具有效性。
优选地，所述步骤(1)中酱油样品与浓缩液A的体积之比为(900～1100)：1。
由于酱油样品中的酱油酮一般浓度含量为0.1～50mg/L，含量较少，为了后续薄层层析处理的高效性，经筛选，富集浓缩后的浓缩液与原样品的体积比例在上述范围内最为合适。
优选地，所述步骤(2)中薄层层析处理所用层析板为GF254硅胶薄层层析板，所述复溶处理用的溶液为甲醇的水溶液，所得层析处理品B还经过0.22μm有机膜过滤。
GF254硅胶薄层层析板具有荧光剂且硬度适中，当采用该层析板进行薄层层析处理后，可以直接通过荧光下观察判断层析分离是否完全，同时可以直接采用裁切法对层析板中分离的酱油酮部分进行分离，操作简单高效。
优选地，所述步骤(3)中UHPLC-DAD检测所用色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱。
更优选地，所述UHPLC-DAD检测时色谱柱规格为1.8μm2.1mm×150mm，色谱柱柱温为35℃。
更优选地，所述UHPLC-DAD检测时的流动相条件为：以质量含量为0.1～0.15wt％的甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B进行洗脱，洗脱条件为：0～10min，流动相A和流动相B的体积比为80:20，流动相流速为0.3～0.35mL/min，层析处理品的进样量为1.5～2μL。
更优选地，所述UHPLC-DAD检测所用DAD检测波长为235nm。
UHPLC-DAD相比于普通HPLC联用检测具有分离效率高，单一物质测试结果准确的优点，配合特定的洗脱程序条件，可以有效在较短的时间内将酱油酮进行定性及定量，高效便捷，可重复性及可靠性高。
优选地，所述步骤(3)中UHPLC-DAD检测包括酱油酮的标准曲线的绘制，具体步骤为：将1000mg/L的酱油酮的标准溶液稀释并配置浓度为500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL以及7.81mg/mL的酱油酮的工作溶液，经UHPLC-DAD检测并绘制标准曲线。
本发明的另一目的在于提供所述酱油中酱油酮的定量分析方法在酱油生产及保藏、使用过程中的质量控制中的应用。
本发明所述定量分析方法操作步骤简单，对于设备的要求度低，过程耗时短，可实现对于酱油酮的单一物质快速定量分析，可在酱油的生产、保藏及使用过程中通过酱油酮这一关键香气物质的定性及含量从而判断和评价产品质量，并进一步进行反馈和调节。
本发明的有益效果在于，本发明提供了一种酱油中酱油酮的定量分析方法，该方法通过LEE法结合氮吹处理对酱油中的有机活性物质进行富集浓缩，随后对浓缩液采用薄层层析法进行二次提纯以去除大部分杂质干扰，最终采用UHPLC-DAD进行酱油酮的定量分析，该测试方法可以针对酱油酮这一物质进行准确定量，同时前处理及检测过程操作简单，无需额外施加环境或使用设备，前处理及分析时间短，经济性价比高。本发明还提供了该定量分析方法在酱油生产及保藏、使用过程中的质量控制中的应用，通过酱油酮这一关键香气物质的定性及含量从而在各阶段判断和评价酱油产品质量，并进一步进行反馈和调节。
附图说明
图1为本发明实施例1中酱油酮标准样品的标准曲线；
图2为本发明实施例1中酱油酮标准样品的DAD图谱；
图3为本发明比较例1中采用实施例1所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图4为本发明比较例1中采用对照组1所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图5为本发明比较例1中采用对照组2所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图6为本发明比较例1中采用对照组3所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图7为本发明比较例1中采用对照组4所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图8为本发明比较例1中采用对照组5所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图9为本发明比较例2中采用实施例1所述定量分析方法所得层析处理品的DAD图谱；
图10为本发明比较例2中采用对照组6所述定量分析方法所得层析处理品的DAD图谱。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及对比例对本发明作进一步说明，其目的在于详细地理解本发明的内容，而不是对本发明的限制。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施、对比例所设计的实验试剂、原料及仪器，除非特别说明，均为常用的普通试剂、原料及仪器。本发明中酱油酮的标准溶液配制所用酱油酮购自Sigma-Aldrich(中国上海)公司；GF254硅胶薄层层析板购自青岛海洋化工有限公司。
实施例1
本发明所述酱油中酱油酮的定量分析方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取100mL市售酱油样品I转入500mL分液漏斗中，以25mL二氯甲烷进行萃取，旋涡振荡60s后，待混合液静置分层，取下层有机相进行氮吹定量浓缩至100μL，得浓缩液A；
(2)将20μL浓缩液A用毛细管定量点样在GF254硅胶薄层层析板上，同步点板20μL的现配的1000mg/mL酱油酮标准溶液，用展开剂进行层析分离，分离完成后在荧光观察下观测确认，随后将与标准溶液相同层析距离的硅胶裁切分离，用0.5mL的体积含量50％的甲醇的水溶液对裁切硅胶中的酱油酮进行复溶，待移液枪吸出复溶液体后，重复同一操作，吸出液体与第一次复溶液体合并，过0.22μm有机膜后，得层析处理品B；所述薄层层析处理的展开剂为乙酸乙酯和丙酮按照体积比8:2配制的混合液；
(3)配制酱油酮的标准溶液，将层析处理品B和标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对酱油样品中的酱油酮进行定量分析，所述UHPLC-DAD检测的测试条件为：
测试仪器：超高效液相色谱仪Agilent 1290Infinity；
检测器：DAD；
检测波长：235nm；
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18；
色谱柱规格：1.8μm 2.1mm×150mm；
色谱柱柱温：35℃；
色谱柱进样量：2μL；
色谱柱流动相：
Time(min) A(％) B(％)
0 80 20
10 80 20
其中，以质量含量为0.1wt％的甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流动相流速为0.3mL/min；
具体步骤为：
(1)绘制酱油酮的标准曲线：采用酱油酮配制1000mg/L的酱油酮的标准溶液，逐步稀释并配置浓度为500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL以及7.81mg/mL的酱油酮的工作溶液，经UHPLC-DAD检测并绘制标准曲线；所述标准曲线绘制结果如图1所示，标准品的DAD图谱如图2所示，该标准曲线的参数如表1所示；从图2可以看出，本发明所述定量分析方法的酱油酮的出峰时间非常短，标准品中的酱油酮仅需8.5min左右便可在谱图中出现相应的特征峰。
表1
(2)将层析处理品B进行UHPLC-DAD检测，确定酱油酮的含量，平行测试三次，结果如表2所示。
表2
从表2可以看出，对于同一样品的平行测试准确率高，RSD％在5％以内。
随后，以酱油样品I为基底，在其中加入特定量的酱油酮以达到所需浓度，所得混合液按照上述处理方法再次进行处理及检测，结果如表3所示；其中回收率％＝(C2-C0)/C1×100％，C0为原始酱油样品I中酱油酮的浓度，C1为添加的酱油酮的浓度，C2为添加特定量的酱油酮后酱油样品I的酱油酮浓度。
表3
从表3可以看出，所述酱油样品I测定的回收率均可达到80～120％间，且RSD％在5％左右。
随后，配制模拟酱油溶液作为空白加标基底，加入特定量的酱油酮，采用上述处理方法进行处理及检测，结果如表4所示；其中模拟酱油溶液的配制方法为：将10g酒石酸、150g氯化钠、200g无水乙醇混合，加水定容至1000mL。
表4
最终，以模拟酱油溶液为基底，再在其中添加一定量酱油酮，所得混合液作为分析对象，每天检测3次，连续检测3天，测试结果如表5所示；其中测试结果当日精密度通过当日3次测试的相对标准偏差RSD表示，隔日精密度通过连续3天测试的相对标准偏差RSD表示。
表5
酱油酮 当日精密度(RSD)％ 隔日精密度(RSD)％
相对标准偏差RSD 2.1 6.7
从上述测试结果可以知晓，本发明所述酱油酮的定量分析准确率高，当日精密度和隔日精密度的RSD均在10％以内，说明本实施例所述定量分析方法可满足酱油中酱油酮的定量要求。
实施例2
本发明所述酱油中酱油酮的定量分析方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取100mL市售酱油样品I转入500mL分液漏斗中，以30mL二氯甲烷进行萃取，旋涡振荡60s后，待混合液静置分层，取下层有机相进行氮吹定量浓缩至100μL，得浓缩液A；
(2)将20μL浓缩液A用毛细管定量点样在GF254硅胶薄层层析板上，同步点板20μL的现配的1000mg/mL酱油酮标准溶液，用展开剂进行层析分离，分离完成后在荧光观察下观测确认，随后将与标准溶液相同层析距离的硅胶裁切分离，用0.5mL的体积含量50％的甲醇的水溶液对裁切硅胶中的酱油酮进行复溶，待移液枪吸出复溶液体后，重复同一操作，吸出液体与第一次复溶液体合并，过0.22μm有机膜后，得层析处理品B；所述薄层层析处理的展开剂为乙酸乙酯和丙酮按照体积比8.5:1.5配制的混合液；
(3)配制酱油酮的标准溶液，将层析处理品B和标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对酱油样品中的酱油酮进行定量分析，所述UHPLC-DAD检测的测试条件为：
测试仪器：超高效液相色谱仪Agilent 1290Infinity；
检测器：DAD；
检测波长：235nm；
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18；
色谱柱规格：1.8μm 2.1mm×150mm；
色谱柱柱温：35℃；
色谱柱进样量：2μL；
色谱柱流动相：
Time(min) A(％) B(％)
0 80 20
10 80 20
其中，以质量含量为0.1wt％的甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流动相流速为0.35mL/min；
其余同实施例1。
实施例3
本发明所述酱油中酱油酮的定量分析方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取100mL市售酱油样品I转入500mL分液漏斗中，以25mL二氯甲烷进行萃取，旋涡振荡60s后，待混合液静置分层，取下层有机相进行氮吹定量浓缩至100μL，得浓缩液A；
(2)将20μL浓缩液A用毛细管定量点样在GF254硅胶薄层层析板上，同步点板20μL的现配的1000mg/mL酱油酮标准溶液，用展开剂进行层析分离，分离完成后在荧光观察下观测确认，随后将与标准溶液相同层析距离的硅胶裁切分离，用0.5mL的体积含量50％的甲醇的水溶液对裁切硅胶中的酱油酮进行复溶，待移液枪吸出复溶液体后，重复同一操作，吸出液体与第一次复溶液体合并，过0.22μm有机膜后，得层析处理品B；所述薄层层析处理的展开剂为乙酸乙酯和丙酮按照体积比7.5:2.5配制的混合液；
(3)配制酱油酮的标准溶液，将层析处理品B和标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对酱油样品中的酱油酮进行定量分析，所述UHPLC-DAD检测的测试条件为：
测试仪器：超高效液相色谱仪Agilent 1290Infinity；
检测器：DAD；
检测波长：235nm；
色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18；
色谱柱规格：1.8μm 2.1mm×150mm；
色谱柱柱温：35℃；
色谱柱进样量：2μL；
色谱柱流动相：
Time(min) A(％) B(％)
0 80 20
10 80 20
其中，以质量含量为0.15wt％的甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流动相流速为0.3mL/min；其余同实施例1。
效果例1
为了验证本发明所述薄层层析分离所用展开剂的优选性，按照实施例1所述步骤(1)和(2)方法将酱油样品I进行薄层层析处理，待分离完成后在荧光观察下观测，平行测试四次；同时，设置对照组1～5，其中对照组1所用展开剂被替换为纯丙酮，对照组2所用展开剂被替换为纯正己烷，对照组3所用展开剂被替换为纯二氯甲烷，对照组4所用展开剂被替换为丙酮和正己烷按体积比1:1配制的混合液，对照组5所用展开剂被替换为乙酸乙酯和丙酮按照体积比1:1配制的混合液。各实验组及对照组荧光观察下的层析图如图3～8所示，可以看出，并非任意的展开剂可以对浓缩液中的酱油酮实现良好的提纯分析效果，一些现有常用的分离剂或者非优选种类配合得到的混合展开剂均难以达到本发明所述以乙酸乙酯和丙酮按特定比例配合的展开剂的酱油酮分离效果，而即使采用乙酸乙酯和丙酮配合作为展开剂，若配比不当，同样难以取得理想的分离效果。
效果例2
为了验证本发明所述定量分析方法中采用薄层层析处理的优选性，设置对照组6，该对照组与实施例1所述方法的差距仅在于浓缩液A过0.22μm有机膜后得到的处理品直接进行UHPLC-DAD检测，其中实施例1所述定量分析方法处理所得层析处理品B的DAD图谱如图9所示，而对照组6所得处理品的DAD图谱如图10所示，从两个图谱可以直观看出，在经过薄层层析处理后，样品可以得到有效净化提纯，其含有的检测干扰物质显著减少。
效果例3
为了验证本发明所述定量分析方法对于各种酱油产品的普适性，根据酱油的国标分类等级不同(特级酱油、一级酱油、二级酱油和三级酱油)收集多种市售不同品牌的酱油产品，采用本发明所述酱油中酱油酮的定量分析方法进行检测，测试结果如表6所示。
表6
从表6可以看出，本发明所述酱油中酱油酮的定量分析方法适用于不同品牌、不同等级的酱油产品，且对于产品的酱油酮浓度0.1～5mg/L的范围均具有适用性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种酱油中酱油酮的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将酱油样品采用二氯甲烷萃取后，氮吹浓缩，得浓缩液A；所述酱油样品与二氯甲烷的体积比为1：(0.25～0.3)；
(2)浓缩液A采用展开剂进行薄层层析处理后进行复溶处理，得层析处理品B；所述展开剂为乙酸乙酯和丙酮的混合液，两者的体积比为(7.5:2.5)～(8.5:1.5)；所述薄层层析处理所用层析板为GF254硅胶薄层层析板，所述复溶处理用的溶液为甲醇的水溶液，所得层析处理品B还经过0.22μm有机膜过滤；
(3)配制酱油酮的标准溶液，将层析处理品B和标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对酱油样品中的酱油酮进行定量分析；所述UHPLC-DAD检测所用色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱，色谱柱规格为1.8μm 2.1mm×150mm，色谱柱柱温为35℃；
所述UHPLC-DAD检测时的流动相条件为：以质量含量为0.1～0.15wt％的甲酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B进行洗脱；
所述洗脱条件为：0～10min，流动相A和流动相B的体积比为80:20，流动相流速为0.3～0.35mL/min，层析处理品的进样量为1.5～2μL。
2.如权利要求1所述酱油中酱油酮的定量分析方法，其特征在于，所述酱油样品包括特级酱油样品、一级酱油样品、二级酱油样品和三级酱油样品。
3.如权利要求1所述酱油中酱油酮的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中酱油样品与浓缩液A的体积之比为(900～1100)：1。
4.如权利要求1所述酱油中酱油酮的定量分析方法，其特征在于，所述UHPLC-DAD检测所用DAD检测波长为235nm。
5.如权利要求1所述酱油中酱油酮的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中UHPLC-DAD检测包括酱油酮的标准曲线的绘制，具体步骤为：将1000mg/L的酱油酮的标准溶液稀释并配置浓度为500mg/mL、250mg/mL、125mg/mL、62.5mg/mL以及7.81mg/mL的酱油酮的工作溶液，经UHPLC-DAD检测并绘制标准曲线。
6.如权利要求1～5任一项所述酱油中酱油酮的定量分析方法在酱油生产及保藏、使用过程中的质量控制中的应用。
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