CN109856288A - 一种检测酱油中4-甲基咪唑的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于酱油添加剂的检测领域，具体是一种检测酱油中4‑甲基咪唑的方法。包括以下步骤：1）样品提取，2）scx柱子固相萃取，3）制备标准溶液，4）液相色谱条件，5）质谱检测器进行检测。本发明具有检出限低、前处理便捷、稳定性好的优点，适用于酱油行业和酱油添加焦糖色素生产企业对酱油中4‑甲基咪唑的分析检测，而且检测结果受主观判断因素影响小，易于推广应用。

Description

一种检测酱油中4-甲基咪唑的方法

技术领域

本发明属于酱油添加剂的检测领域，具体是一种检测酱油中4-甲基咪唑的方法。

背景技术

焦糖色素是一种在食品工业中应用范围十分广泛的天然着色剂，是食品添加剂的重要一员。由于焦糖色素能使酱油变成棕褐色，而被广泛应用，目前焦糖色素已经发展成为全球范围内用量最大的色素。

当前国内外大部分厂家生产的焦糖色素普遍采用氨法在高压高温下生产而成，在此种方法生产焦糖色素的过程中不可避免地产生一定量的4-甲基咪唑。4-甲基咪唑（简称4-MI）是一种重要的有机中间体，主要用于合成大宗胃药西咪替丁，也可用作环氧树脂固化剂和金属表面防护剂等。酱油中的4-甲基咪唑是在以亚硫酸铵为原料生产焦糖色素时产生的。4-甲基咪唑是白色结晶粉末，溶于水和乙醇，有腐蚀性，4-甲基咪唑能导致动物长肿瘤，有可能给人体带来致癌风险。出于4-甲基咪唑对人体潜在的危险性考虑，联合国粮农组织（FAO），世界卫生组织（WHO），国际食品添加剂联合专家委员会（JECFA）均确认焦糖色素是安全的，但对4-甲基咪唑做了限量的规定，标准是每天每公斤体重不超过200毫克。我国的国家标准GB1886.64-2015《食品安全国家标准食品添加剂：焦糖色》规定，焦糖色素中4-甲基咪唑的含量不得超过200mg/kg。因此，为保障酱油的安全性，对酱油中的4-甲基咪唑进行检测分析具有重要意义。

目前，国内外检测4-甲基咪唑的方法主要有薄层层析法、液相色谱法、气相色谱法、离子色谱法、分光光度法等。硅胶薄层层析法，其操作步骤多，定量不准确，检测限高，灵敏度低；气相色谱法需要样品量大，操作复杂；液相色谱法、分光光度法，实际样品基质干扰严重，测定结果偏差较大。不适于对含有的微量4-甲基咪唑进行检测。因此研究检出限低、前处理便捷、稳定性好的分析方法对提升酱油、饮料等产品质量安全具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测酱油中4-甲基咪唑的方法，为酱油生产企业的产品质量安全提供技术保障，该方法具有检出限低、前处理便捷、稳定性好等优点，而且检测结果受主观判断因素影响小，易于推广应用。

本发明的技术方案为：一种检测酱油中4-甲基咪唑的方法，包括以下步骤：

1）样品提取

称取酱油样品1g，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，取0.5mL上述样品溶液，先加入8mL水，再加入0.5mL盐酸溶液，混匀后待固相萃取净化，得分析样品；

2）scx柱子固相萃取

依次加入2ml甲醇及2ml纯净水进行活化scx柱子，控制流速<0.5 mL/min，抽干，取步骤1）中提取好的样品用活化好的柱子进行固相萃取，上样后依次加入2 mL水和2mL甲醇进行淋洗，控制流速<1.0 mL/min，抽干，再用4mL浓度为5%的氨化甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，控制流速<0.5 mL/min，抽干，将收集洗脱液在<50℃条件下，氮气吹干，残渣用1 mL 浓度为0.1%甲酸水溶液定容，涡旋混合1 min，过0.22 µm水系微孔滤膜，滤液供LC-MS/MS测定，做空白对照实验；

3）制备标准溶液

分别吸取一定体积的标准使用液于5.0mL容量瓶中，配制成4-甲基咪唑浓度为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

4）液相色谱条件

选取色谱柱为SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，3 µm），流动相： A为0.1 %甲酸水溶液，B为0.1 %甲酸乙腈溶液（70+30，v/v），等度洗脱，控制柱温为30℃，进样量为10μL，控制流速为0.3 mL/min；

5）质谱检测器

使用质谱检测器进行检测，其使用电离方式为ESI电离或正离子，

离子喷雾电压中正离子为4000 v，挥发气温度为350 ℃，毛细管温度为3000 ℃，采用的扫描模式为多反应监测。

本发明的有益效果为：本发明具有检出限低、前处理便捷、稳定性好的优点，适用于酱油行业和酱油添加焦糖色素生产企业对酱油中4-甲基咪唑的分析检测，而且检测结果受主观判断因素影响小，易于推广应用。

具体实施方式

实施例1

1）样品制备

准确称取李锦记精选老抽样品1克置于100mL容量瓶中，加标：准确称取0.2mL浓度为0.5mg/mL的4-甲基咪唑也加到容量瓶中，加水定容至刻度，准确取定容液0.1ml到10mL比色管中，分别加入1.6mL水，0.1mL浓度为0.02mol/L盐酸溶液混匀后待固相萃取。

2）scx（强阳离子交换柱）柱子固相萃取

依次加入2mL甲醇、2mL纯净水进行活化scx（强阳离子交换柱）柱子，控制流速小于0.5mL/min，抽干，制备好的样品用活化好的柱子进行固相萃取，上样后依次加入2mL水和2mL甲醇进行淋洗，控制流速小于1.0 mL/min，抽干，再用4mL浓度为 5%的氨化甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，控制流速小于0.5 mL/min，抽干，将收集洗脱液在低于50 ℃条件下，氮气吹干，残渣用1 mL 0.1%甲酸水溶液定容，涡旋混合1 min，过0.22 µm水系微孔滤膜，滤液供LC-MS/MS测定。

3）制备标准溶液

分别吸取一定体积的标准使用液于5.0mL容量瓶中，配制成4-甲基咪唑浓度为20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL和1000 ng/mL备用；

4）液相色谱条件

选取色谱柱为SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，3 µm），流动相： A为0.1 %甲酸水溶液，B为0.1 %甲酸乙腈溶液（70+30，v/v），等度洗脱，控制柱温为30℃，进样量为10μL，控制流速为0.3 mL/min；

5）质谱检测器

使用质谱检测器进行检测，其使用电离方式为ESI电离或正离子，

离子喷雾电压中正离子为4000 v，挥发气温度为350 ℃，毛细管温度为3000 ℃，采用的扫描模式为多反应监测（MRM），离子参数详见表1

表1 多反应监测（MRM）

通过表1可以得出：在LC-MS/MS仪器分析测定得到加标回收率只有55.02%。

实施例2

1）样品制备

准确称取李锦记精选老抽样品1克置于100mL容量瓶中，加标：准确称取0.2mL浓度为0.5mg/mL的4-甲基咪唑也加到容量瓶中，加水定容至刻度，准确取定容液0.1mL到10mL比色管中，分别加入1.6mL水，0.1mL浓度为0.02mol/L盐酸溶液混匀后待固相萃取。

2）scx（阳离子柱子）柱子固相萃取

依次加入2mL甲醇、2mL纯净水进行活化scx（阳离子柱子）柱子，控制流速小于0.5mL/min，抽干，制备好的样品用活化好的柱子进行固相萃取，上样后依次加入2 mL水和2mL甲醇进行淋洗，控制流速小于1.0 mL/min，抽干，再用4mL5%的氨化甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，控制流速小于0.5 mL/min，抽干，将收集洗脱液在低于50 ℃条件下，氮气吹干，残渣用1mL 0.1%甲酸水溶液定容，涡旋混合1 min，过0.22 µm水系微孔滤膜，滤液供LC-MS/MS测定。

3）制备标准溶液

分别吸取一定体积的标准使用液于5.0 mL容量瓶中，配制成4-甲基咪唑浓度为 20ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL和1000 ng/mL备用。

4）液相色谱条件

选取色谱柱为SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，3 µm），流动相： A为0.1 %甲酸水溶液，B为0.1 %甲酸乙腈溶液（70+30，v/v），等度洗脱，控制柱温为30℃，进样量为10μL，控制流速为0.3 mL/min；

5）质谱检测器

使用质谱检测器进行检测，其使用电离方式为ESI电离或正离子，

离子喷雾电压中正离子为4000 v，挥发气温度为350 ℃，毛细管温度为3000 ℃，采用的扫描模式为多反应监测（MRM），离子参数详见表2

表2 多反应监测（MRM）

样品检测结果：在LC-MS/MS仪器分析测定得到加标回收率达到86%，说明酱油中4-甲基咪唑分析测定用SCX（强阳离子固相萃取柱子）明显比MCX(阳离子柱子）效果好。

Claims (1)

1.一种检测酱油中4-甲基咪唑的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）样品提取

称取酱油样品1g，置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，取0.5mL上述样品溶液，先加入8mL水，再加入0.5mL盐酸溶液，混匀后待固相萃取净化，得分析样品；

2）scx柱子固相萃取

依次加入2ml甲醇及2ml纯净水进行活化scx柱子，控制流速<0.5 mL/min，抽干，取步骤1）中提取好的样品用活化好的柱子进行固相萃取，上样后依次加入2 mL水和2mL甲醇进行淋洗，控制流速<1.0 mL/min，抽干，再用4mL浓度为5%的氨化甲醇溶液进行洗脱，收集洗脱液，控制流速<0.5 mL/min，抽干，将收集洗脱液在<50℃条件下，氮气吹干，残渣用1 mL 浓度为0.1%甲酸水溶液定容，涡旋混合1 min，过0.22 µm水系微孔滤膜，滤液供LC-MS/MS测定，做空白对照实验；

3）制备标准溶液

分别吸取一定体积的标准使用液于5.0mL容量瓶中，配制成4-甲基咪唑浓度为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和1000ng/mL；

4）液相色谱条件

选取色谱柱为SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，3 µm），流动相： A为0.1 %甲酸水溶液，B为0.1 %甲酸乙腈溶液（70+30，v/v），等度洗脱，控制柱温为30℃，进样量为10μL，控制流速为0.3 mL/min；

5）质谱检测器

使用质谱检测器进行检测，其使用电离方式为ESI电离或正离子，

离子喷雾电压中正离子为4000 v，挥发气温度为350 ℃，毛细管温度为3000 ℃，采用的扫描模式为多反应监测。