CN110596269B

CN110596269B - 一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法

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Publication number: CN110596269B
Application number: CN201910892688.1A
Authority: CN
Inventors: 叶少文; 高芝炀; 苏昭仑; 李珍; 黄进丽; 黎小兰; 曾雪君
Original assignee: BY Health Co Ltd
Current assignee: BY Health Co Ltd
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2019-09-20
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2039-09-20
Also published as: CN110596269A

Abstract

本发明公开了一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，包括：精密称取样品，加入纯化水，超声提取，纯化水定容，摇匀，过水相滤膜，即得肌酸粉供试品；取肌酸粉供试品，采用HPLC进行检测，所述HPLC进行检测的条件为：采用C18色谱柱，以磷酸二氢钠溶液，并用氨水调节pH值至8‑11.5为流动相进行等度洗脱，根据HPLC检测结果，获得一水肌酸、肌酸酐、双氰胺的含量。本发明方法通过优化色谱条件可以实现对一水肌酸、肌酸酐和双氰胺这三种成分的快速分离，重现性好。本发明方法可排除肌酸粉中副产物双氰胺和肌酸酐对一水肌酸的干扰，能够同时准确检测肌酸粉中一水肌酸、肌酸酐和双氰胺三种成份的含量，有利于实现对肌酸粉质量的有效控制。

Description

一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法

技术领域

本发明涉及分析化学领域，具体涉及一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法。

背景技术

肌酸粉是能增加健美者瘦体重和肌肉的爆发力、耐久力的化学物质，同时肌酸粉可以把水带进肌肉，使得肌细胞的体积增大，有利于肌细胞吸收氨基酸。目前，检测肌酸粉中一水肌酸的检测方法有GB 24154-2015食品安全国家标准运动营养食品通则，QB/T2834-2006运动营养食品食用肌酸。GB 24154-2015和QB/T 2834-2006只要求对肌酸粉中一水肌酸的含量进行检测。

但由于肌酸粉在生产工艺中会产生副产物双氰胺和肌酸酐，而双氰胺是一种用于合成农药，合成医药，染料固色剂等用途的化工原料，摄入一定量会对人体健康产生危害，因而除了对肌酸粉中一水肌酸的含量进行质量监控，也很有必要对肌酸粉中的副产物进行质量监控。GB 24154-2015和QB/T 2834-2006检测方法采用甲醇-水(40：60)为流动相检测一水肌酸的含量，因一水肌酸和双氰胺的性质相似而难分离，检测图谱如图4所示，分离不理想，因而对一水肌酸含量测定造成干扰，从而影响肌酸粉的质量监控。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，该方法可以在同一色谱条件下同时检测一水肌酸、肌酸酐、双氰胺三种成份的含量，简便快捷，耗时短，有利于实现对肌酸粉的质量进行有效的控制。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，包括以下步骤：

(1)精密称取样品，加入纯化水，超声提取，纯化水定容，摇匀，过水相滤膜，即得肌酸粉供试品；

(2)取肌酸粉供试品，采用HPLC进行检测，所述HPLC进行检测的条件为：采用C18色谱柱，以磷酸二氢钠溶液，并用氨水调节pH值至8-11.5为流动相进行等度洗脱，根据HPLC检测结果，获得一水肌酸、肌酸酐、双氰胺的含量。

本发明采用纯化水对肌酸粉进行超声提取，因一水肌酸会在水溶液中缓慢转换成肌酸酐，因此样品供试品需现配现测定，不可放置超过半小时。

作为优选，步骤(1)中，所述超声提取的温度为25-35℃，超声提取的时间为5-10min。

在本发明提供的一些实施例中，超声提取的温度为30℃，超声提取的时间为5min。

作为优选，步骤(2)中，所述HPLC检测的波长为220nm。

本发明通过优选流动相以及对流动相pH值的优化，可实现对双氰胺与一水肌酸的快速分离，重现性好，可同时检测一水肌酸、肌酸酐、双氰胺三种成分的含量。

作为优选，步骤(2)中，所述C18色谱柱的规格为5μm，250mm×4.6mm。

在本发明提供的一些实施例中，C18色谱柱更优选为Phenomenex Kinetex 5μmXB-C18 100A LC Column 250mm×4.6mm。

作为优选，步骤(2)中，所述磷酸二氢钠溶液的摩尔浓度为5-20mmol/L。

在本发明提供的一些实施例中，磷酸二氢钠溶液的摩尔浓度更优选为10mmol/L。

作为优选，步骤(2)中，所述用氨水调节pH值至8-11.5。

在本发明提供的一些实施例中，所述用氨水调节pH值至10.5。

作为优选，步骤(2)中，所述HPLC检测的流动相的流速为0.8-1.0mL/min。

在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的流动相的流速为0.8mL/min。

作为优选，步骤(2)中，所述HPLC检测的柱温为30-35℃。

在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的柱温为30℃。

作为优选，步骤(2)中，所述HPLC检测的运行时间为15-20min。

在本发明提供的一些实施例中，HPLC检测的运行时间为15min。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：

本发明方法通过优化色谱条件可以实现对一水肌酸、肌酸酐和双氰胺这三种成分的快速分离，重现性好。

本发明方法可排除肌酸粉中副产物双氰胺和肌酸酐对一水肌酸的干扰，能够同时准确检测肌酸粉中一水肌酸，肌酸酐和双氰胺三种成份的含量，有利于实现对肌酸粉质量的有效控制。

本发明的检测方法灵敏度高，三种成分的色谱峰分离度好，其线性、精密度试验、回收率试验，均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求。

附图说明

图1为一水肌酸线性关系图；

图2为双氰胺线性关系图；

图3为肌酸酐线性关系图；

图4为流动相为甲醇：水(40：60)的色谱图；

图5为流动相为甲醇：磷酸二氢钠溶液(40：60)的色谱图；

图6为流动相为乙腈：磷酸二氢钠溶液(40：60)的色谱图。

图7为流动相为10mmol/L磷酸二氢钠溶液(用氨水调节pH值至5)的色谱图；

图8为流动相为10mmol/L磷酸二氢钠溶液(用氨水调节pH值至10.5)的色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1：

一、仪器与试剂

1.仪器

安捷伦1260高效液相色谱仪(附紫外检测器)、超声仪、电子天平

2.试剂

氨水、一级用水、磷酸二氢钠(色谱纯)

肌酸酐对照品：上海源叶(批号:YS0923JA14，纯度:98％)

双氰胺对照品：中国食品药品检定研究所(批号:100206-201103，纯度:100％)

一水肌酸对照品:上海源叶(纯度：98％)

肌酸粉：汤臣倍健股份有限公司提供。

二.方法

2.1色谱条件：

色谱柱：Phenomenex Kinetex 5μm XB-C18 100A LC Column 250mm×4.6mm；

流动相：10mmol/L磷酸二氢钠溶液(用氨水调节pH值至10.5)；

流速:0.8mL/min；

柱温：30℃；

波长：220nm；

运行时间：15min。

为验证方法的科学有效性，本发明对该检测方法进行了方法学验证，因肌酸粉中一水肌酸与肌酸酐和双氰胺的含量相差较大，为方便操作，故将一水肌酸与肌酸酐和双氰胺分开分别进行验证。

三、一水肌酸含量测定方法学验证

3.1对照品溶液的制备：

一水肌酸对照品溶液：取51.48mg的一水肌酸对照品，精密称定，用纯化水溶解定容至50mL棕色容量瓶中,于4℃避光储存，即得一水肌酸对照品溶液。

3.2标准曲线的绘制：

分别精密吸取一水肌酸对照品溶液1μL、2μL、3μL、4μL、5μL，注入高效液相色谱仪，以一水肌酸峰面积为纵坐标，一水肌酸对照品溶液浓度(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线。

3.3样品测定：

取混合均匀的样品适量(约相当于一水肌酸18-22mg)，精密称定，置50ml容量瓶中，加入水适量，振摇，使样品充分分散均匀，30℃超声处理5分钟，取出用水定容至容量瓶刻度，摇匀，提取液过0.45μm滤膜，即得样品供试液。吸取样品供试液5μL注入液相色谱仪中，得到峰面积，根据标准曲线得到样品供试液中一水肌酸的浓度。

3.4结果计算

试样中一水肌酸的含量按下式计算

式中：X—试样中一水肌酸的含量，％；

C—从标准曲线得到待测液的一水肌酸浓度，mg/mL；

V—试样的稀释体积，mL，按此方法稀释体积为50mL；

M—试样的质量，g。

3.5方法学验证：

3.5.1线性范围确认，试验数据如下表1所示：

表1：

结果：以一水肌酸峰面积为纵坐标，一水肌酸对照品溶液浓度(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线，如图1所示。结果显示：相关系数R为0.9999,所以用该方法测定一水肌酸的含量，在检测浓度0.203943168mg/ml至1.01971584mg/ml之间呈现良好的线性关系,符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求(GB/T 27404-2008要求相关系数≥0.99)。

3.5.2精密度试验：

称取6份样品，按3.3的方法测定样品中的一水肌酸含量,计算其RSD(％)，试验数据如下表2所示：

表2：

结果：6份样品中一水肌酸的平均含量为：99.9％，RSD(％)为0.3％，其RSD(％)小于1.3％，表明该方法有较好的精密度,符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求(GB/T 27404-2008要求RSD(％)≤1.3％)。

3.5.3空白方法对测定结果的影响

用一级用水做空白同3.3处理，与一水肌酸对照品溶液的出峰时间对比，结果显示：用空白方法处理的溶液在一水肌酸对照品溶液的出峰时间处无吸收峰，对测定结果基本无干扰。

3.5.4测定低限

分析方法的定量检出限和定性检出限由信噪比(S/N)计算。当S/N＝10时，测得仪器的定量检出限为0.4μg/ml；当S/N＝3时，定性检出限为0.2μg/ml。当称样量为0.02g,稀释倍数为50mL时,方法的定量检出限为1.1mg/g，定性检出限为0.51mg/g。

3.5.5回收率试验

加标样品的处理：精密称取约0.02g的样品9份，分成3组，每组3份样品，置于50ml容量瓶中，每组分别精密加入一水肌酸对照品约10mg、15mg、21mg，加入水适量，振摇，使样品充分分散均匀，密塞，超声处理(功率100W，频率40kHz，50℃)10分钟，放冷。用水定容，提取液过0.45μm滤膜，得加标供试液，按3.3项的方法测定加标样品中的一水肌酸，试验数据如下表3所示：

表3：

测得对照品投入量＝加标样品测得量-样品含量；

回收率(％)＝测得对照品投入量/理论加标量。

结果：一水肌酸粉中一水肌酸加标的平均回收率为100.5％，RSD(％)为0.9％，结果符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求(GB/T 27404-2008要求回收率为95％～105％)。

3.5.6结论

通过对肌酸粉中的一水肌酸的限度含量测定方法进行线性、精密度、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对肌酸粉中一水肌酸限度含量起到质量控制的目的。

四、肌酸酐和双氰胺含量测定方法学验证

4.1溶液制备

4.1.1肌酸酐对照储备液：称取肌酸酐5.41mg至50ml容量瓶中，加入适量的纯化水，室温超声至溶解，用纯化水定容至容量瓶刻度，摇匀，即得肌酸酐对照储备液。

4.1.2双氰胺对照储备液：称取双氰胺5.31mg至50ml容量瓶中，加入适量的纯化水，室温超声至溶解，用纯化水定容至容量瓶刻度，摇匀，即得双氰胺对照储备液。

4.1.3对照供试液：取肌酸酐对照储备液1ml，双氰胺对照储备液100ul,共同加入50ml容量瓶中，用纯化水稀释至容量瓶刻度，摇匀，过0.45um水相滤膜，即得对照供试液。

4.1.4样品供试液：精密称取均匀试样约150mg至50ml容量瓶中，加入适量的纯化水，30℃超声5min，待试样完全溶解，取出用纯化水定容至容量瓶刻度，摇匀，过0.45um水相滤膜，即得。样品供试液需现配现测定，不可放置超过半小时，因一水肌酸会在水溶液中缓慢转换成肌酸酐。

4.2测定

分别精密吸取对照供试液5μl、20μl、30μl、40μl、60μl及样品供试液20μl，注入高效液相色谱仪，建立标准曲线方程。样品供试液色谱峰应呈现与对照供试液色谱峰保留时间相同的色谱峰。

4.3结果计算

X＝C×V×K/M

式中：X—试样中肌酸酐，双氰胺的含量，g/100g；

C—试样中肌酸酐，双氰胺的浓度，ug/mL；

M—试样的质量，mg；

K—单位转换系数，0.1；

V—试样稀释的体积，mL。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过计算平均值的10％。

4.4方法学验证

4.4.1方法空白实验

不称取样品，按4.1.4步骤处理空白溶液，按2.1色谱条件测定空白溶液，与肌酸酐，双氰胺对照供试的出峰时间对比。结果显示，空白溶液在肌酸酐，双氰胺的出峰时间处无吸收峰，表明空白对测定结果无干扰。

4.4.2线性范围确认，试验数据见下表4-5所示：

表4：

表5：

以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线如图2-3所示，结果显示：双氰胺的相关性为0.99999，所以用该方法测定双氰胺在浓度0.0531ug/ml至0.6372ug/ml之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求相关性≥0.99】。肌酸酐的相关性为0.99995，所以用该方法测定肌酸酐在浓度0.530ug/ml至6.36216ug/ml之间呈现良好的线性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求相关性≥0.99】。

4.4.3检出限和定量限

分析方法的定性检出限DL和定量检出限QL由信噪比(S/N)计算。DL定义为S/N＝3时对应的待分析浓度，QL定义为S/N＝10时对应的待分析浓度。

4.4.3.1定性检出限

当信噪比(S/N)为3时，双氰胺的定性检出限为0.0021μg/ml，得到双氰胺方法定性检出限为0.7μg/g。肌酸酐的定性检出限为0.021μg/ml，得到肌酸酐方法定性检出限为7.0μg/g。4.4.3.2定量检出限

当信噪比(S/N)为10时，双氰胺的定量检出限为0.0069μg/ml，得到双氰胺方法定量检出限为2.3μg/g。肌酸酐的定量检出限为0.069μg/ml，得到肌酸酐方法定量检出限为23.3μg/g。

4.4.4精密度试验

称取6份样品，按4.1.4步骤处理样品，检测样品含量，计算其RSD(％)，试验数据见下表6-7：

表6：

表7：

结果：6份样品肌酸酐含量的RSD(％)为2.3％，双氰胺含量的RSD(％)为1.5％，表明该方法有较好的重复性，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求RSD(％)≤3.8％】。

4.4.5回收率试验

加标：精密称取约150mg样品[已知样品中双氰胺含量为：0.0022g/100g，肌酸酐含量为：0.088g/100g]9份，分成3组，每组3份，置于50ml容量瓶中，各组分别精密加入双氰胺对照储备液(0.1062mg/ml)52ul，65ul，78ul；各组分别加入肌酸酐对照储备液(0.106mg/ml)0.8ml,1.0ml,1.2ml，再加纯化水适量，室温超声溶解后，取出用纯化水定容至容量瓶刻度，摇匀，过0.45um水相膜，即得加标供试液。加标供试液需现配现测，不可放置超过半个小时。试验数据如下表8-9所示：

表8：

表9：

测得加入量＝加标样品测得量-样品测得量；

回收率(％)＝测得加入量/理论加入量。

结果显示：双氰胺平均回收率为：106.09％，相对标准偏差(RSD)为0.9％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为90—110％】。

肌酸酐平均回收率为：99.00％，相对标准偏差(RSD)为2.2％，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T27404-2008要求回收率为95—105％】。

4.4.6结论

通过对一水肌酸中的双氰胺和肌酸酐的限度含量测定方法进行线性、精密度、空白、检出限、定量限、回收率试验，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明含量测定方法科学有效，能对一水肌酸中双氰胺，肌酸酐限度含量起到质量控制的目的。

五、色谱条件的优化

要实现各成分色谱峰很好的分离，在同一色谱条件下同时测定肌酸粉中3种成分的含量，流动相的选择是关键技术。

本发明流动相的选择采用如下方法进行比较：

方法一：以甲醇：磷酸二氢钠溶液(40：60)为流动相，其HPLC色谱图如图5所示，发现三种成分无法很好分离。

方法二：以乙腈：磷酸二氢钠溶液(40：60)为流动相，其HPLC色谱图如图6所示，结果同方法一，三种成分仍无法分离。

方法三：因流动相中添加有机相后，双氰胺和一水肌酸的分离效果不好，所以弃去有机相的添加，使用全水相作为流动相。本发明在研究中发现，在全水相流动相试验中，关键参数为流动相的pH值。pH值的大小对一水肌酸，双氰胺的分离有重要的影响。以10mmol/L磷酸二氢钠溶液(氨水调节pH值至5)为流动相，其HPLC色谱图如图7所示，分离效果仍不理想。

方法四：进一步调整pH值，以10mmol/L磷酸二氢钠溶液(氨水调节pH值至10.5)为流动相，其HPLC色谱图如图8所示，所出结果无论是混合对照品还是供试品溶液，其一水肌酸，肌酸酐和双氰胺三种成分的色谱峰能完全分离，且分离度好，峰型完整。因此优选将10mmol/L磷酸二氢钠溶液(氨水调节pH值至10.5)作为本发明的流动相。

综上所述，本发明通过优化色谱条件，提供的肌酸粉的检测方法具有简便快捷，分离度好，其线性、精密度试验、回收率试验，均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》的要求。该方法能够在同一色谱条件下同时检测肌酸粉中有效成分和副产物的含量，使得对肌酸粉的质量控制更加全面、有效，为肌酸粉的质量控制提供了重要保障。

Claims

1.一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）精密称取样品，加入纯化水，超声提取，纯化水定容，摇匀，过水相滤膜，即得肌酸粉供试品；

（2）取肌酸粉供试品，采用HPLC进行检测，所述HPLC进行检测的条件为：采用C18色谱柱，以磷酸二氢钠溶液，并用氨水调节pH值至8-11.5为流动相进行等度洗脱，根据HPLC检测结果，获得一水肌酸、肌酸酐、双氰胺的含量。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（1）中，所述超声提取的温度为25-35℃，超声提取的时间为5-10min。

3.根据权利要求1所述的一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述HPLC检测的波长为220nm。

4.根据权利要求1所述的一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述C18色谱柱的规格为5μm，250mm×4.6mm。

5.根据权利要求1所述的一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述磷酸二氢钠溶液的摩尔浓度为5-20mmol/L。

6.根据权利要求5所述的一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述磷酸二氢钠溶液的摩尔浓度为10mmol/L。

7.根据权利要求1所述的一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述用氨水调节pH至10.5。

8.根据权利要求1所述的一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述HPLC检测的流动相的流速为0.8-1.0mL/min。

9.根据权利要求1所述的一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述HPLC检测的柱温为30-35℃。

10.根据权利要求1所述的一种同时检测肌酸粉中多种成分的含量测定方法，其特征在于，步骤（2）中，所述HPLC检测的运行时间为15-20min。