CN109725095A - 一种采用hplc同时检测酱油中多种生物胺含量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用HPLC同时检测酱油中多种生物胺含量的方法，属于酱油生产质量控制技术领域。包括以下步骤：将生物胺标准品溶液和内标混合，衍生处理后采用HPLC进行分析检测，得到所述生物胺标准品溶液的高效色相色谱图；将各待测样品酱油提取液进行衍生处理后采用HPLC进行分析检测，得到所述酱油提取液的高效液相色谱图；根据步骤（1）和步骤（2）得到的高效液相色谱图，确定所述酱油提取液中生物胺的种类和含量。该方法能更全面、更有效的将酱油中10种主要生物胺做到同时检测。

Description

一种采用HPLC同时检测酱油中多种生物胺含量的方法

技术领域

本发明涉及酱油生产质量控制技术领域，具体涉及一种采用HPLC同时检测酱油中多种生物胺含量的方法。

背景技术

生物胺（BAs）具有重要的生理活性和毒理效应，低剂量摄入是人体不可或缺的生理活性物质，但高剂量可引起头疼、过敏、肠胃不适、血压变化等不良症状，甚至危及生命。酱油是我国传统的发酵豆制品，发酵后含有丰富的游离氨基酸，为生物胺的形成提供了良好的条件，导致酱油产品中含有较高的生物胺含量。

目前，国际上没有通用的生物胺检测标准，因为发酵食品生物胺安全问题比较明显，各国研究人员都在开发各种各样的食品中生物胺检测方法。毛细管电泳法具有无需衍生直接检测的优点，且具有较高的灵敏度，其分离速度快、仪器简单，但样品前处理有一定的局限，不能引入过多的有机溶剂，这就限制了液液萃取法的应用。生物传感器法利用酶作为传感器具有较强的特异性、简便快速的特点，但该方法检测限较低，筛选酶的工作较困难且酶不易保存，导致此法成本较高，重现性也差。薄层色谱法不需要贵重的检测仪器，所需材料易得，成本低、操作简单、快速，但只能用于生物胺的定性与半定量的测定。气相色谱法衍生和检测较困难，目前研究的主要目的是样品中微量生物胺的检测方法，且其具有良好的重现性和实用性。

高效液相色谱（HPLC）法是目前众多方法中比较理想的检测方法，具有灵敏性高、选择性好、分析速度较快、分析准确的优点，且具有较好的重现性，这种方法是目前研究比较多的一种检测方法。且已有多种检测方法被报道，各种方法在灵敏度、精密度、特异性、费用成本和所耗时间等方面均不相同，各有利弊。我国在2016年制定了GB/T 5009.208-2016《食品安全国家标准 食品中生物胺的测定》，也是基于HPLC法建立的，但因为该标准为通用标准，并不适合所有食品，而酱油在我国消费量很大，且根据研究结果可见酱油中生物胺含量较高。目前利用HPLC法测量生物胺的方法所测生物胺的种类不同，没有专门用于检测酱油中生物胺的检测方法，故开发切实有效的酱油中生物胺检测方法是各研究机构的重要课题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种采用HPLC同时检测酱油中多种生物胺含量的方法，能够同时检测酱油中的多种生物胺。

一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将生物胺标准品溶液和内标混合，衍生处理后采用HPLC进行分析检测，得到所述生物胺标准品溶液的高效色相色谱图；

（2）将各待测样品酱油提取液进行衍生处理后采用HPLC进行分析检测，得到所述酱油提取液的高效液相色谱图；

（3）根据步骤（1）和步骤（2）得到的高效液相色谱图，确定所述酱油提取液中生物胺的种类和含量。

进一步的，所述的生物胺包括标准品腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍基丁胺。

进一步的，所述标准溶液配置方法：各种生物胺标准品按有效含量用0.1 mol/LHCl溶液配制成1 mg/mL的储备液，然后将腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍基丁胺10种生物胺储备液分别取相同体积，混合得到浓度为100μg/mL的混合标准品工作液；1mg/mL的内标庚胺储备液同样用0.1mol/L的HCl溶液稀释为100μg/mL的内标工作液；所有溶液均避光保存在4℃的冰箱中。

进一步的，所述步骤（1）和步骤（2）中的衍生方法：

分别取2mL不同浓度的稀释液，同时添加100 μL的内标工作液（100 μg/mL），1 mLNaOH溶液（2 mol/L），10 μL苯甲酰氯，然后旋涡振荡30 s，在30℃水浴条件下反应40 min，反应20 min时取出并漩涡振荡30 s；反应结束后加入2 mL饱和NaCl溶液终止反应；然后加入3mL乙醚萃取，1000×g离心10 min，移取乙醚层，重复此萃取过程，移取乙醚层合并于规格为10 mL的离心管中，氮气吹干，然后用1 mL乙腈（色谱级）溶解，0.45 μm偏氟膜过滤，待测；每个样品做3个平行；样品避光保存于4℃冰箱中，24 h内完成检测。

进一步的，所述HPLC采用乙酸铵-乙腈进行梯度洗脱；所述乙酸铵的浓度为0.005mol/L，所述乙腈为色谱级纯度。

进一步的，所述的乙酸铵作为流动相A；所述的乙腈为流动相B；

所述梯度洗脱的程序设置为：0-2min为60%流动相A，2-5min为60%流动相A到38%流动相A，5-10min为38%流动相A，10-16min为38%流动相A到20%流动相A，16-20min为20%流动相A，20-21min为20%流动相A到0%流动相A，21-25min为0%流动相A，25-27min为0%流动相A到60%流动相A，27-36min为60%流动相A。

进一步的，所述HPLC的色谱条件为：

色谱柱：Inertsil ODS-3 250 mm×4.6 mm（GL Science Inc., Tokyo, Japan），5 μm；柱温：30℃；进样量：20 μL；紫外检测：254 nm；色谱工作站，美国Waters公司的Breeze系统。

进一步的，所述的生物胺提取方法为：吸取5.0 mL待测样品置于50 mL离心管中，加250 μL内标（1000 μg/mL庚胺储备液），再加20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液分散，均质1min，振荡提取5 min，静置5 min，然后5000×g离心35 min；将上清液移入50 mL容量瓶中，用20 mL高氯酸溶液重复提取1次，上清液合并至相应容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度，取2 mL该溶液，衍生处理；本试验中对每个样品的处理均重复3次。

进一步的，所述混合标准衍生样品进行精密度测定，测定方法为取质量浓度为10μg/mL 的混合标准衍生样品，平行进样6次，根据测定结果计算相对标准偏差RSD。

进一步的，对质量浓度为0.1 μg/mL的混合标准品衍生物用乙腈稀释，以信噪比（S/N）大于3作为检出限的判断标准，以信噪比（S/N）大于10作为定量限的判断标准。

将腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、苯乙胺、色胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍基丁胺作为酱油中主要考虑的生物胺目标物进行方法建立，该方法能更全面、更有效的将酱油中10种主要生物胺做到同时检测。

附图说明

图 1 生物胺标准品衍生物色谱图（5 μg /mL）；

图 2 酱油样品中10种生物胺衍生物色谱图。

具体实施方式

下面结合说明书附图对本发明的技术方案做进一步说明。

1 同时检测酱油中多种生物胺的HPLC方法如下：

1.1 试剂与样品

标准品腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、组胺、酪胺、苯乙胺、胍基丁胺、庚胺、苯甲酰氯，纯度均在97%以上，美国Sigma-aldrich公司；5-羟色胺，纯度98%，美国Alfa公司；乙腈，色谱级，美国Tedia公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；其它试剂均为分析纯级。

酱油样品采购自杭州各超市。

1.2 仪器

高效液相色谱仪（1525）、双波长紫外检测器（2487），美国Waters公司；

恒温水浴锅（HW37-HHS114），江苏省金坛市环宇科学仪器厂；

漩涡振荡器（XE-3-WH-2），郑州南北仪器设备有限公司；

大容量离心机（LD5-10），北京医用离心机厂；

氮吹仪（ZDKDN-24A），上海新拓分析仪器科技有限公司；

高速电动匀浆器（FSH-Ⅱ），江苏金坛市振兴仪器厂；

PH计（DETTA 320-S）， 梅特斯-托利多仪器（上海）有限公司；

电子称（YP1201N），上海菁海仪器有限公司。

1.3 样品前处理

瓶装或袋装酱油，每个样品从三个包装中分别用移液管移出10mL，装入50mL离心管中，混合均匀，待测。

1.4 生物胺检测

1.4.1 标准溶液配制

各种生物胺标准品按有效含量用0.1 mol/L HCl溶液配制成1 mg/mL的储备液，然后将腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍基丁胺10种生物胺储备液分别取相同体积，混合得到浓度为100μg/mL的混合标准品工作液；1mg/mL的内标庚胺储备液同样用0.1mol/L的HCl溶液稀释为100μg/mL的内标工作液。所有溶液均避光保存在4℃的冰箱中。

1.4.2 标准曲线制作

生物胺混合标准品工作液（100 μg/mL）用0.1 mol/L HCl溶液稀释至80、50、20、10、5、1、0.5、0.1 μg/mL。衍生过程参考刘振峰和钟建军的方法。具体方法是：分别取2mL不同浓度的稀释液，同时添加100 μL的内标工作液（100 μg/mL），1 mLNaOH溶液（2 mol/L），10 μL苯甲酰氯，然后旋涡振荡30 s，在30℃水浴条件下反应40 min，反应20 min时取出并漩涡振荡30 s。反应结束后加入2 mL饱和NaCl溶液终止反应。然后加入3 mL乙醚萃取，1000×g离心10 min，移取乙醚层，重复此萃取过程，移取乙醚层合并于规格为10 mL的离心管中，氮气吹干，然后用1 mL乙腈（色谱级）溶解，0.45 μm偏氟膜过滤，待测。每个样品做3个平行。样品避光保存于4℃冰箱中，24 h内完成检测。

1.4.3 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-3 250 mm×4.6 mm（GL Science Inc., Tokyo, Japan），5 μm；柱温：30℃；流动相A：0.005 mol/L乙酸铵溶液；流动相B：乙腈；流动相梯度洗脱方法见表1；进样量：20 μL；紫外检测：254 nm；色谱工作站，美国Waters公司的Breeze系统。

1.4.4 检出限和定量限

对质量浓度为0.1 μg/mL的混合标准品衍生物用乙腈适当稀释，以信噪比（S/N）大于3作为检出限的判断标准，以信噪比（S/N）大于10作为定量限的判断标准。

1.4.5 精密度测定

取质量浓度为10 μg/mL 的混合标准衍生样品，平行进样6次，根据测定结果计算相对标准偏差RSD。

表1 生物胺衍生样品的分离洗脱梯度

时间（min）	0	2	5	10	16	20	21	25	27	36
											流速（mL/min）	1	1	1	1	1	1	1	1	1	1
A（%）	60	60	38	38	20	20	0	0	60	60
											B（%）	40	40	62	62	80	80	100	100	40	40
梯度曲线类型	-	1	5	1	6	1	6	1	6	1

1.4.6 生物胺提取

吸取5.0 mL待测样品置于50 mL离心管中，加250 μL内标（1000 μg/mL庚胺储备液），再加20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液分散，均质1 min，振荡提取5 min，静置5 min，然后5000×g离心35 min；将上清液移入50 mL容量瓶中，用20 mL高氯酸溶液重复提取1次，上清液合并至相应容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度，取2 mL该溶液，按标准品的衍生方法处理。本试验中对每个样品的处理均重复3次。

1.4.7 回收率及重现性测定

按照1.4.6步骤，在样品中加入质量浓度为100 μg /mL的混合标准品工作液，使之添加量相当于样品10倍稀释液中分别添加5 μg/mL的混合标准品。平行测定6次。各种生物胺的回收率=（实际测定添加量/实际添加量）× 100，计算回收率的RSD，即重现性。

1.5 数据处理

所有数据利用统计软件SPSS进行分析，实验结果以平均数±标准差表示。

2 同时检测酱油中十种生物胺的HPLC方法效果分析

2.1 标准样品和实际样品图谱

采用梯度洗脱，10种生物胺标准品图谱见图1。各生物胺（5μg/mL）和内标衍生物均能有效分离，样品被洗脱的速度快，20min内所有待检衍生物全部被洗脱出来。从实际样品的典型图谱图2可看出，各生物胺衍生物峰形对称，且无杂质干扰，因此该流动相梯度是可行的。

2.2 标准曲线回归方程、检测限及定量限

将混合的0.1、0.5、1、5、10、20、50、80、100 μg/mL标准溶液依次进样，各标准品按照峰面积与内标峰面积的比值对相应的标准溶液浓度作标准曲线，计算标准曲线的回归方程及相关系数（表2）。各生物胺衍生物线性回归方程在0.10-80 μg/mL线性范围的线性相关系数均大于0.99，符合测定的要求；各生物胺的检出限在0.01-0.03 μg/mL之间，定量限在0.03-0.10μg/mL之间。该方法灵敏度高，可满足样品测定的要求。

表2生物胺衍生物标准曲线的回归方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限

线性方程中 x 表示标准品峰面积与内标峰面积的比值；y 表示标准溶液质量浓度（μg/mL）。

2.3 精密度、加标回收率和重现性

在对10 μg/mL的混合标准衍生样品连续进样6次的试验中，腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、色胺、苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍基丁胺测定结果的 RSD 值分别为：0.85%、1.26%、0.74%、0.65%、0.48%、0.82%、0.55%、0.62%、0.62% 和 0.53%，RSD值均小于2%，精密度符合检测要求。

表3 酱油样品生物胺的回收率(n=6)

2类酱油中10种生物胺的加标回收率见表3。各样品加标回收率在96.7-105.9%之间，经计算其重现性RSD均小于10%，因此该方法用来检测酱油样品中生物胺的含量是可靠的。

结合已有国内外酱油中生物胺的研究结果，将腐胺、尸胺、亚精胺、精胺、苯乙胺、色胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍基丁胺作为酱油中主要考虑的生物胺目标物进行方法建立。与已有的国内外酱油生物胺 HPLC检测方法相比，该方法能更全面、更有效的将酱油中10种主要生物胺做到同时检测。

Claims (10)

1.一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）将生物胺标准品溶液和内标混合，衍生处理后采用HPLC进行分析检测，得到所述生物胺标准品溶液的高效色相色谱图；

（2）将各待测样品酱油提取液进行衍生处理后采用HPLC进行分析检测，得到所述酱油提取液的高效液相色谱图；

（3）根据步骤（1）和步骤（2）得到的高效液相色谱图，确定所述酱油提取液中生物胺的种类和含量。

2.根据权利要求1所述的一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于所述的生物胺包括腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍基丁胺。

3.根据权利要求2所述的一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于所述标准溶液配置方法：各种生物胺标准品按有效含量用0.1 mol/L HCl溶液配制成1mg/mL的储备液，然后将腐胺、尸胺、精胺、亚精胺、色胺、苯乙胺、组胺、5-羟色胺、酪胺和胍基丁胺10种生物胺储备液分别取相同体积，混合得到浓度为100μg/mL的混合标准品工作液；1mg/mL的内标庚胺储备液同样用0.1mol/L的HCl溶液稀释为100μg/mL的内标工作液；所有溶液均避光保存在4℃的冰箱中。

4.根据权利要求1所述的一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于所述步骤（1）和步骤（2）中的衍生方法：

分别取2mL不同浓度的稀释液，同时添加100 μL的内标工作液（100 μg/mL），1 mLNaOH溶液（2 mol/L），10 μL苯甲酰氯，然后旋涡振荡30 s，在30℃水浴条件下反应40 min，反应20 min时取出并漩涡振荡30 s；反应结束后加入2 mL饱和NaCl溶液终止反应；然后加入3mL乙醚萃取，1000×g离心10 min，移取乙醚层，重复此萃取过程，移取乙醚层合并于规格为10 mL的离心管中，氮气吹干，然后用1 mL乙腈（色谱级）溶解，0.45 μm偏氟膜过滤，待测；每个样品做3个平行；样品避光保存于4℃冰箱中，24 h内完成检测。

5.根据权利要求1所述的一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于所述HPLC采用乙酸铵-乙腈进行梯度洗脱；所述乙酸铵的浓度为0.005mol/L，所述乙腈为色谱级纯度。

6.根据权利要求5所述的一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于所述的乙酸铵作为流动相A；所述的乙腈为流动相B；

所述梯度洗脱的程序设置为：0-2min为60%流动相A，2-5min为60%流动相A到38%流动相A，5-10min为38%流动相A，10-16min为38%流动相A到20%流动相A，16-20min为20%流动相A，20-21min为20%流动相A到0%流动相A，21-25min为0%流动相A，25-27min为0%流动相A到60%流动相A，27-36min为60%流动相A。

7.根据权利要求1所述的一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于所述的色谱条件为：

色谱柱：Inertsil ODS-3 250 mm×4.6 mm（GL Science Inc., Tokyo, Japan），5 μm；柱温：30℃；进样量：20 μL；紫外检测：254 nm；色谱工作站，美国Waters公司的Breeze系统。

8.根据权利要求1所述的一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于所述的生物胺提取方法为：吸取5.0 mL待测样品置于50 mL离心管中，加250 μL内标（1000 μg/mL庚胺储备液），再加20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液分散，均质1 min，振荡提取5min，静置5 min，然后5000×g离心35 min；将上清液移入50 mL容量瓶中，用20 mL高氯酸溶液重复提取1次，上清液合并至相应容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度，取2 mL该溶液，衍生处理；本试验中对每个样品的处理均重复3次。

9.根据权利要求1所述的一种一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于所述混合标准衍生样品进行精密度测定，测定方法为取质量浓度为10 μg/mL 的混合标准衍生样品，平行进样6次，根据测定结果计算相对标准偏差RSD。

10.根据权利要求1所述的一种采用HPLC检测酱油中多种生物胺含量的方法，其特征在于对质量浓度为0.1 μg/mL的混合标准品衍生物用乙腈稀释，以信噪比（S/N）大于3作为检出限的判断标准，以信噪比（S/N）大于10作为定量限的判断标准。