CN106610410A - 一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于食品分析及安全领域，具体涉及一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法。本发明提供了一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法，结合丹磺酰氯柱前衍生法，利用反相高效液相色谱(RP‑HPLC)法构建了适用于鱼肉及其制品中生物胺检测的色谱条件以及梯度洗脱程序，实现了多种生物胺的最佳化分离；整个实验过程无需对样品进行净化处理，衍生过程简单，可减少有效成分的损失，使测量限达到μg/L级别，而且耗时短，可以实现大批量的样品的检测。
Description
技术领域
本发明属于食品分析及安全领域，具体涉及一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法。
背景技术
生物胺是一类含氮的碱性有机化合物的总称，分子量低，在人体及动植物的组织中都含有少量的生物胺，是生物有机体内的正常活性成分，在机体内起着重要的生理作用。腐胺，精胺，亚精胺和尸胺等在调节核酸和蛋白质的合成及生物膜稳定性方面起着重要作用，是生物活性细胞必不可少的部分。同时多种食品和一些发酵产品中也普遍存在着生物胺，一般认为，食品中的生物胺大多是在食品中的微生物所产生的氨基酸脱羧酶的作用下，脱去氨基酸的羧基而生成的，故含有蛋白质和氨基酸的食品，在一定条件下经过发酵或生化反应便可产生生物胺，目前已发现水产品、肉制品、乳制品、葡萄酒等食品中均含有多种生物胺。
然而，过量的生物胺会对人体造成严重的毒害作用，可造成人体神经系统和心血管系统的损伤，引起头痛、平滑肌痉挛、胃酸分泌过多、过敏、血压过高或过低等症状。此外，生物胺还有潜在的致癌性，组胺和多胺可与H2受体作用或促进血管生成而直接导致细胞转化和肿瘤。而且，生物胺与亚硝酸盐等食品防腐剂可互相反应生成具有明显诱变性和潜在致癌性的亚硝胺而间接致癌。生物胺往往发生于食品腐烂或发酵过程中，食物中毒的发作和某些毒理学特性和组胺及酪胺有密切联系。因此，对生物胺的研究和认识可以提高、改善食品的质量及安全性。
目前，用于同时测定鱼肉食品中的多种生物胺的技术主要为离子色谱(IC)、毛细管电泳(CE)、生物传感器或薄层电泳(TLC)等。然而，这些方法普遍存在精确度低、重现性和稳定性差等问题。因此，寻找一种精确度高、重现性好的用于检测鱼肉食品中生物胺的方法，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种精确度高、重现性好的鱼肉及其制品中生物胺的检测方法。
本发明的具体实施方案如下：
本发明提供了一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法，包括：
a)将生物胺标准品溶液和内标混合，衍生处理后采用RP-HPLC进行分析检测，得到所述生物胺标准品溶液的高效液相色谱图；
b)将鱼肉制品提取液进行衍生化处理后采用RP-HPLC进行分析检测，得到所述鱼肉制品提取液的高效液相色谱图；
c)根据步骤a)和步骤b)得到的高效液相色谱图，确定所述鱼肉制品提取液中的生物胺种类及其含量。
优选的，所述RP-HPLC采用乙酸铵-乙腈作为流动相进行梯度洗脱；
所述乙酸铵的浓度为0.1mol/L，所述乙腈为色谱纯。
优选的，所述乙酸铵作为流动相A，所述乙腈作为流动相B；
所述梯度洗脱的程序设置为：0-5min为40％流动相A，5-15min为40％流动相A到30％流动相A，15-20min为30％流动相A到20％流动相A，20-24min为20％流动相A到10％流动相A，24-28min为10％流动相A到40％流动相A，28-35min为40％流动相A。
优选的，所述鱼肉制品提取液的制备包括：将鱼肉制品、三氯乙酸溶液和内标混合，震荡提取。
优选的，所述三氯乙酸溶液的质量百分比浓度为5％；
每毫升所述三氯乙酸溶液中添加0.5g所述鱼肉制品。
优选的，所述鱼肉制品为木鱼花。
优选的，所述RP-HPLC的流速为1.0mL/min；紫外检测波长为254nm；柱温为40℃。
优选的，所述衍生处理采用丹磺酰氯柱前衍生法。
优选的，所述生物胺标准品溶液中包含：色胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。
优选的，所述内标为1,7-二氨基庚烷。
本发明提供了一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法，结合丹磺酰氯柱前衍生法，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法构建了适用于鱼肉及其制品中生物胺检测的色谱条件以及梯度洗脱程序，实现了多种生物胺的最佳化分离；整个实验过程无需对样品进行净化处理，衍生过程简单，可减少有效成分的损失，使测量限达到μg/L级别，而且耗时短，可以实现大批量的样品的检测。
本发明选择了乙酸铵和纯乙腈作为RP-HPLC的洗脱系统，其中乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185-205nm处检测的要求；乙酸铵缓冲盐用于调节检测溶液的pH值大小，有效抑制了组分离解，增强保留。两者共同使用，增强了检测样品中各种生物胺的分离效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为实施例1中生物胺标准品溶液的RP-HPLC色谱图；
图2为实施例1中待测木鱼花溶液的RP-HPLC色谱图；
图3为对比例1中生物胺标准品溶液的RP-HPLC色谱图；
图4为对比例2中生物胺标准品待测溶液的RP-HPLC色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法，结合丹磺酰氯柱前衍生法，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法构建了适用于鱼肉及其制品中生物胺检测的色谱条件以及梯度洗脱程序。本发明方法具体包括以下步骤：
a)将生物胺标准品溶液和内标混合，衍生处理后采用RP-HPLC进行分析检测，得到所述生物胺标准品溶液的高效液相色谱图；
b)将鱼肉制品提取液进行衍生化处理后采用RP-HPLC进行分析检测，得到所述鱼肉制品提取液的高效液相色谱图；
c)根据步骤a)和步骤b)得到的高效液相色谱图，确定所述鱼肉制品提取液中的生物胺种类及其含量。
在一些实施例中，所述RP-HPLC分析检测采用乙酸铵-乙腈作为流动相进行梯度洗脱。
优选的，所述乙酸铵的浓度为0.1mol/L，所述乙腈为色谱纯。
更优选的，所述乙酸铵作为流动相A，所述乙腈作为流动相B；
所述梯度洗脱的程序设置为：0-5min为40％流动相A，5-15min为40％流动相A到30％流动相A，15-20min为30％流动相A到20％流动相A，20-24min为20％流动相A到10％流动相A，24-28min为10％流动相A到40％流动相A，28-35min为40％流动相A。
本发明选择了乙酸铵和纯乙腈作为RP-HPLC的洗脱系统，其中乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185-205nm处检测的要求；乙酸铵缓冲盐用于调节检测溶液的pH值大小，有效抑制了组分离解，增强保留。两者共同使用，增强了检测样品中各种生物胺的分离效果。
在一些实施例中，所述鱼肉制品提取液的制备包括：将鱼肉制品、三氯乙酸溶液和内标混合，震荡提取。
优选的，所述三氯乙酸溶液的质量百分比浓度为5％；
每毫升所述三氯乙酸溶液中添加0.5g所述鱼肉制品。
优选的，所述鱼肉制品为木鱼花。
在一些实施例中，所述RP-HPLC的流速为1.0mL/min；紫外检测波长为254nm；柱温为40℃。
由于生物胺无紫外吸收，也无荧光效应，一般需对其进行衍生化处理,衍生分为柱前衍生法和柱后衍生法，柱后衍生法是待测样品经过色谱柱分离后进入特殊的衍生设备进行衍生，然后通过检测器进行检测。相对于柱前衍生法，两者均适用于大批量样品的检测，耗时少，重复性好，检测过程都可以通过程序的设定完成，比较便利，但柱后衍生法的仪器设备更昂贵，故多数研究者会选择柱前衍生法。优选的，所述衍生处理采用丹磺酰氯柱前衍生法。
在一些实施例中，所述生物胺标准品溶液中包含：色胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。优选的，所述生物胺标准品中各生物胺的终浓度为100mg/L。
在一些实施例中，所述内标为1,7-二氨基庚烷。优选的，1,7-二氨基庚烷的终浓度为100mg/L。
本发明提供了一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法，结合丹磺酰氯柱前衍生法，利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法构建了适用于鱼肉及其制品中生物胺检测的色谱条件以及梯度洗脱程序，实现了多种生物胺的最佳化分离；整个实验过程无需对样品进行净化处理，衍生过程简单，可减少有效成分的损失，使测量限达到μg/L级别，而且耗时短，可以实现大批量的样品的检测。
下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例只是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本领域技术人员应当理解，对本发明的具体实施例进行修改或者对部分技术特征进行同等替换，而不脱离本发明技术方案的精神，均应涵盖在本发明保护的范围中。
实施例1
1、生物胺标准品溶液的配制
精确称取色胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺等7种生物胺标准品适量，分别置于7个10mL规格的容量瓶中，然后加入0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，混匀，配制成浓度均为1000mg/L的单一生物胺标准品。然后分别吸取1.00mL的单一生物胺标准品，置于同一个容量瓶中，加入0.1mol/L的盐酸稀释至刻度，混匀，配制终浓度为10mg/L的生物胺标准品溶液。
取0.5mL生物胺标准品，加入20μL的1,7-二氨基庚烷作为内标，混匀，使得内标的终浓度为100mg/L；然后加入1.5mL的饱和碳酸氢钠溶液调节pH值至弱碱性，再加入1.0mL10mg/mL的丹磺酰氯-丙酮溶液，振荡使其混合均匀，并置于40℃培养箱中避光衍生化反应45min，中间振荡两次；待反应完全后取出，加入0.1mL 25％氨水暗处静置30min，再60℃水浴15min以除去丙酮，冷却至室温后用乙腈定容至5mL，振荡混匀，再用0.22μm有机膜过滤后采用RP-HPLC进行检测。
2、木鱼花提取液的制备及其生物胺柱前衍生化
准确称取已绞碎的木鱼花5.00g，加入10mL 5％三氯乙酸溶液和1.0mL浓度为100mg/L的1,7-二氨基庚烷作为内标，混匀，振荡提取60min，转移至25mL离心管中，3600r/min，取上清液。沉淀继续置于25mL容量瓶中，如此连续提取两次，合并上清液，然后用5％三氯乙酸稀释至刻度，得到木鱼花提取液。
将木鱼花提取液采用0.45μm有机膜进行过滤，然后取0.5mL滤液，加入50μL 2mol/L的氢氧化钠溶液中和滤液中的三氯乙酸，再依次加入1.5mL饱和碳酸氢钠溶液、1.0mL10mg/mL的丹磺酰氯-丙酮溶液，振荡混合均匀，并置40℃培养箱中避光反应45min，中间振荡两次；待反应完全后取出，加入0.1mL25％氨水暗处静置30min，再60℃水浴15min以除去丙酮，冷却至室温后用乙腈定容至5mL，振荡混匀，再用0.22μm有机膜过滤后采用RP-HPLC进行检测。
3、RP-HPLC分析检测条件
色谱柱选择C18柱(15mm×4.6mm，内径5um)，紫外检测波长设为254nm，进样量10μL，柱温40℃，流速1.0mL/min，流动相为0.1mol/L乙酸铵-乙腈；其中，0.1mol/L的乙酸铵水溶液作为流动相A，乙腈作为流动相B；梯度洗脱条件设置如表1。
表1
图1为生物胺标准品溶液的RP-HPLC色谱图；图2为待测木鱼花溶液的RP-HPLC色谱图。通过对比图1和图2的各色谱峰的保留时间，对图2出现的各色谱峰进行指认，发现图3中保留时间为13-20min之间出现了4个色谱峰，分别对应图2中的腐胺、尸胺、组胺和1,7-二氨基庚烷(内标)，说明待测木鱼花溶液中存在腐胺、尸胺和组胺等3个生物胺；而且，这3个生物胺的色谱峰均实现了基线分离，说明本发明方法所提供的色谱条件以及梯度洗脱程序，可实现多种生物胺的最佳化分离，适用于鱼肉及其制品中生物胺检测，灵敏度较高。进一步的，通过内标法对这3种生物胺进行定量，得到腐胺、尸胺和组胺的含量依次为11.5785mg/kg、3.8112mg/kg、0.3378mg/kg，这3种生物碱的含量均超过(或低于)FDA限量标准50mg/kg，说明该木鱼花产品是用新鲜的鱼肉制成，可以放心食用。
对比例1
按照实施例1中步骤(1)配制内标浓度为5mg/L的生物胺标准品，采用以下RP-HPLC分析检测条件进行检测：
流动相A：0.1mol/L乙酸铵水溶液；
流动相B：纯乙腈；
梯度洗脱程序设置如表2。
表2
图3为采用本对比例所设置的梯度洗脱程序所得到的生物胺标准品溶液的RP-HPLC色谱图，如图3所示，该生物胺标准品中的7种生物胺基本上实现了基线分离，并在15-35min内均已出峰，溶剂峰与有效峰互不干扰，干扰峰少。然而，将其与图1进行对比，保留时间接近的几种生物胺仍无法实现基线分离，其分离效果不如图1。说明采用实施例1中所设置的梯度洗脱程序能有效检测鱼肉制品中存在的各种生物胺。
对比例2
配制终浓度为10mg/L的生物胺标准品溶液
分别称取色胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺等7种生物胺，加入0.1mol/L的盐酸溶液，混匀，得到浓度为100mg/L的生物胺标准品待测溶液。然后，按照国标GB/T5009.208-2008所示步骤将该待测溶液净化，按照实施例1所述方法采用丹磺酰氯柱前衍生法进行衍生处理后，采用RP-HPLC进行检测。图4为该生物胺标准品待测溶液的RP-HPLC液相色谱图，如图4所示，各生物胺的色谱峰峰形都不是很好，而且杂峰多，其中腐胺和尸胺这两个色谱峰还没有完全分开。同时，在萃取以及衍生过程一共要经过三次吹氮过程，实际操作中很容易将有效成分带出，操作繁复，耗时较长，有机溶剂的消耗多。
Claims (10)
1.一种鱼肉及其制品中生物胺的检测方法，包括：
a)将生物胺标准品溶液和内标混合，衍生处理后采用RP-HPLC进行分析检测，得到所述生物胺标准品溶液的高效液相色谱图；
b)将鱼肉制品提取液进行衍生化处理后采用RP-HPLC进行分析检测，得到所述鱼肉制品提取液的高效液相色谱图；
c)根据步骤a)和步骤b)得到的高效液相色谱图，确定所述鱼肉制品提取液中的生物胺种类及其含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述RP-HPLC采用乙酸铵-乙腈作为流动相进行梯度洗脱；
所述乙酸铵的浓度为0.1mol/L，所述乙腈为色谱纯。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述乙酸铵作为流动相A，所述乙腈作为流动相B；
所述梯度洗脱的程序设置为：0-5min为40％流动相A，5-15min为40％流动相A到30％流动相A，15-20min为30％流动相A到20％流动相A，20-24min为20％流动相A到10％流动相A，24-28min为10％流动相A到40％流动相A，28-35min为40％流动相A。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述鱼肉制品提取液的制备包括：将鱼肉制品、三氯乙酸溶液和内标混合，震荡提取。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述三氯乙酸溶液的质量百分比浓度为5％；
每毫升所述三氯乙酸溶液中添加0.5g所述鱼肉制品。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述鱼肉制品为木鱼花。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述RP-HPLC的流速为1.0mL/min；紫外检测波长为254nm；柱温为40℃。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述衍生处理采用丹磺酰氯柱前衍生法。
9.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述生物胺标准品溶液中包含：色胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺和精胺。
10.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述内标为1,7-二氨基庚烷。
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