CN116465979A - 一种黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，属于化学检测技术领域。本发明所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法先通过特定的萃取剂萃取及浓缩处理对黄酒样品的葫芦巴内酯进行富集浓缩，随后采用薄层层析法对样品进行快速净化去除大部分杂质干扰，最终采用UHPLC‑DAD进行葫芦巴内酯的准确定量分析，测试结果干扰小，准确率高，所述操作步骤简单高效，实施成本低，经济性价比高，可用于工厂化大批量黄酒产品的质量把控当中。

Description

一种黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，具体涉及一种黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法。
背景技术
葫芦巴内酯是葡萄酒、黄酒、清酒等酒类的重要香气物质，其可以作为传统发酵型酒的一项重要质控指标。但是，葫芦巴内酯具有极性强、热稳定性差的特点，在酒类中含量极低且在质谱检测中信号响应很差，常用的香气物质前处理及定量检测的方法如SPME、SBSE、Head space结合GC-MS的分析方法均很难准确对葫芦巴内脂进行定量分析。
目前葫芦巴内酯的主要检测方法有：(1)基于固相萃取技术和大体积进样技术实现微量葫芦巴内酯测定，该技术方案选用LiChrolut EN等特殊的吸附剂对样品中的葫芦巴内酯进行吸附萃取，然后采用微管大体积进样技术提高进样量，最终增加质谱对葫芦巴内酯信号的响应(例如《中国黄酒挥发性组分及香气特征研究》-陈双)，然而，该方法需要非常规的设备，检测成本高，不易推广。(2)采用液液微萃取结合GC-MS定量进行葫芦巴内酯定量分析，该技术方案经测试可快速处理大量样品(例如《黄酒陈酿关键香气组分及其形成影响隐因素的研究》-王程成)，但是黄酒中的成分非常复杂，萃取后直接进样检测干扰物质较多，且同样存在葫芦巴内酯质谱响应低的问题，导致检测结果准确性不足。(3)采用搅拌棒吸附萃取结合GC-MS分析黄酒香气组成(例如《气相色谱-质谱结合吸附萃取法测定陈酿黄酒挥发性香气物质》-于海燕)，但是该技术方案对于葫芦巴内脂没有特异性，对于低浓度样品存在较大误差。
发明内容
基于现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供了黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，该方法通过特定的萃取剂萃取及浓缩处理对黄酒样品的葫芦巴内酯进行富集浓缩，随后采用薄层层析法对样品进行快速净化去除大部分杂质干扰，最终采用UHPLC-DAD进行葫芦巴内酯的准确定量分析，测试结果干扰小，准确率高，所述操作步骤简单高效，实施成本低，经济性价比高，可用于工厂化大批量黄酒产品的质量把控当中。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，包括以下步骤：
(1)取黄酒样品采用萃取剂进行萃取，再经浓缩处理后，得浓缩液I；所述萃取剂为二氯甲烷，所述黄酒样品与二氯甲烷的体积比为1：(0.15～0.25)；
(2)将浓缩液I进行薄层层析处理，得层析处理品II；所述薄层层析处理的展开剂由乙醚和石油醚30-60按照体积比(0.8～1.2)：(0.8～1.2)配制得到；
(3)将层析处理品II和葫芦巴内酯标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对黄酒样品中的葫芦巴内酯进行定量分析。
优选地，所述黄酒样品包括元红酒样品、加饭酒样品、善酿酒样品和香雪酒样品。
本发明所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法中，以二氯甲烷这种溶解能力强且毒性较低的萃取剂按特定添加比例对葫芦巴内酯进行有效萃取分离；随后经浓缩处理后，相比于现有技术，本发明技术方案采用展开剂对浓缩液样品进行二次提纯，该步骤可以在简单操作的前提下，有效去除样品中大部分有机相干扰杂质；同时，经筛选，将乙醚和石油醚30-60按特定比例配置的混合展开剂相比于其他种类的选择对葫芦巴内酯具有更高的特异性分离性。最终，处理后样品经UHPLC-DAD(超高效液相色谱联用紫外检测)检测分析，可有效测定出包括元红酒、加饭酒、善酿酒、香雪酒等多种黄酒中痕量级别的葫芦巴内酯含量，简单高效。
优选地，所述步骤(1)中黄酒样品在萃取剂萃取前，还加入了氯化钠，所述氯化钠的添加量占黄酒样品质量含量的4～6％。
通过在黄酒样品有机萃取前引入适量的氯化钠，可有效减少有效物质在水相中的溶解度，提升萃取剂的萃取率。
优选地，所述步骤(2)中薄层层析处理所用层析板为GF254硅胶薄层层析板。
GF254硅胶薄层层析板是常用的鉴定/分离层析板，作为荧光敏感型侧吸板对经浓缩处理后的浓缩液I进行层析处理时，可通过紫外光荧光观察葫芦巴内酯的净化程度，同时，经过层析处理后的样品可以直接切割对应的硅胶部分进行分离，本领域技术人员也可以根据实际选择使用复溶剂对样品进行复溶处理。
优选地，所述步骤(3)中UHPLC-DAD检测所用色谱柱为Eclipse Plus C18系列色谱柱，所述UHPLC-DAD检测时色谱柱规格为1.8μm2.1mm×150mm，色谱柱柱温为30～40℃。
更优选地，所述UHPLC-DAD检测时，洗脱的流动相A为质量含量为0.08～0.12wt％的三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇，洗脱时的具体程序为：进样量为1.8～2.2μL，0～10min，流动相A和流动相B的体积比为85:15，流动相流速为0.28～0.32mL/min。更优选地，所述步骤(3)中UHPLC-DAD检测时的DAD检测波长为200～250nm。
UHPLC-DAD检测应用于不同浓度的黄酒中葫芦巴内酯的定量检测时具有分离效率高，测试结果准确的优点，而由于该技术方案所用色谱柱填料粒径小，耗时短，检测器检测信息多，分析范围集中，因此需要待测样品的洗脱及检测条件具有特异性，经筛选，上述条件下设定的检测配合前期提纯处理适用于各种黄酒产品的葫芦巴内酯的高效定量分析。
优选地，所述步骤(3)中UHPLC-DAD检测还包括葫芦巴内酯的标准曲线的绘制，具体步骤为：以葫芦巴内酯的标准溶液稀释配置浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、40mg/mL以及100mg/mL的葫芦巴内酯的工作溶液，经UHPLC-DAD检测并绘制标准曲线。
本发明的另一目的在于提供所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法在黄酒批量生产过程中的质量控制中的应用。
由于黄酒中挥发物质较多，而在密封保存前的生产过程中，这些物质非常容易发生挥发或变质，直接影响黄酒产品的品质，因此对于黄酒在生产，尤其是批量生产时的质量控制非常重要。本发明所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法分析效率高，针对葫芦巴内酯这一黄酒中的活性物质灵敏度高，耗时短，不依赖特殊设备，开展方便，尤其适用于批量黄酒在生产过程中的质量把控。
本发明的有益效果在于，本发明提供了一种黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，该方法先通过特定的萃取剂萃取及浓缩处理对黄酒样品的葫芦巴内酯进行富集浓缩，随后采用薄层层析法对样品进行快速净化去除大部分杂质干扰，最终采用UHPLC-DAD进行葫芦巴内酯的准确定量分析，测试结果干扰小，特征峰出峰时间短，准确率高，所述操作步骤简单高效，实施成本低，经济性价比高，可用于工厂化大批量黄酒产品的质量把控当中。
附图说明
图1为本发明实施例1中葫芦巴内酯标准样品的标准曲线；
图2为本发明实施例1中葫芦巴内酯标准样品的DAD图谱；
图3为本发明比较例1中采用实施例1所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图4为本发明比较例1中采用对照组1所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图5为本发明比较例1中采用对照组2所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图6为本发明比较例1中采用对照组3所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图7为本发明比较例1中采用对照组4所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图8为本发明比较例1中采用对照组3所述展开剂进行样品薄层层析处理后的层析图；
图9为本发明比较例2中采用实施例1所述定量分析方法所得层析处理品的DAD图谱；
图10为本发明比较例2中采用对照组6所述定量分析方法所得层析处理品的DAD图谱。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及对比例对本发明作进一步说明，其目的在于详细地理解本发明的内容，而不是对本发明的限制。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施、对比例所设计的实验试剂、原料及仪器，除非特别说明，均为常用的普通试剂、原料及仪器。本发明中葫芦巴内酯的标准溶液配制所用葫芦巴内酯购自Sigma-Aldrich(中国上海)公司；GF254硅胶薄层层析板购自青岛海洋化工有限公司。
实施例1
本发明所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取100mL市售黄酒样品Z转入500mL分液漏斗中，加入样品质量占比为5wt％氯化钠混合均匀后，以20mL二氯甲烷分两次进行萃取，旋涡振荡30s后，待混合液静置分层，取下层有机相进行合并，氮吹定量浓缩至100μL，得浓缩液I；
(2)用毛细管取20微升浓缩液I定量点样在GF254硅胶薄层层析板上，同步点板相同量的1000mg/mL葫芦巴内酯标准溶液，用乙醚和石油醚30-60按照体积比1:1配制的混合液作为展开剂进行层析分离，分离完成后在荧光观察下观测确认，随后将与标准溶液相同层析距离的硅胶直接切割以分离活性物质葫芦巴内酯，用0.25mL的体积含量50％的甲醇的水溶液对裁切硅胶中的葫芦巴内酯进行复溶，待移液枪吸出复溶液体后，重复同一操作，吸出液体与第一次复溶液体合并，过0.22μm有机膜后，得层析处理品II；(3)将层析处理品II和葫芦巴内酯标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对黄酒样品中的葫芦巴内酯进行定量分析，所述UHPLC-DAD检测采用的测试仪器为超高效液相色谱仪Agilent 1290Infinity，附带235nm检测波长的DAD检测器；具体测试条件为：采用规格为1.8μm 2.1mm×150mm的ZORBAXEclipse Plus C18色谱柱，在35℃下进样2微升，采用如下流动相进行处理：
Time(min) A(％) B(％)
0 85 15
10 85 15
其中，以质量含量为0.1wt％的三氟乙酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流动相流速为0.3mL/min；
具体步骤为：
(1)绘制葫芦巴内酯的标准曲线：采用标准品葫芦巴内酯配制1000mg/L的葫芦巴内酯初始标准溶液，随后逐步稀释并配置浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、40mg/mL以及100mg/mL的葫芦巴内酯的工作溶液，经UHPLC-DAD检测并绘制标准曲线；所述标准曲线绘制结果如图1所示，标准品的DAD图谱如图2所示，该标准曲线的参数如表1所示；从图2可以看出，本发明所述定量分析方法的葫芦巴内酯出峰时间非常短，仅需5min左右便可在谱图中出现相应的特征峰。
表1
(2)将层析处理品B进行UHPLC-DAD检测，确定原黄酒样品Z(加标基底)中葫芦巴内酯的含量浓度，平行测试三次，结果如表2所示。
表2
从表2可以看出，对于同一样品的平行测试准确率高，RSD％在5％以内。
随后，以黄酒样品Z为基底，在其中加入一定量葫芦巴内酯，所得混合液按照上述处理方法进行处理及检测，结果如表3所示；其中回收率％＝(C2-C0)/C1×100％，C0为加额外添加葫芦巴内酯前基底的葫芦巴内酯浓度，C1为添加的葫芦巴内酯的浓度，C2为额外添加葫芦巴内酯后基底的葫芦巴内酯浓度。
表3
从表3可以看出，所述黄酒样品测定的回收率均可达到80～120％间，且RSD％在5％以内。
随后，配制模拟黄酒溶液作为空白加标基底，加入一定量的葫芦巴内酯，采用上述处理方法进行处理及检测，结果如表4所示；其中模拟黄酒溶液的配制方法为：将5g酒石酸、5g葡萄糖、150g无水乙醇混合，加水定容至1000mL。
表4
最终，以模拟黄酒溶液为基底，在其中添加一定量葫芦巴内酯，所得混合液作为分析对象，每天检测3次，连续检测3天，测试结果如表5所示；其中测试结果当日精密度通过当日3次测试的相对标准偏差RSD表示，隔日精密度通过连续3天测试的相对标准偏差RSD表示。
表5
葫芦巴内酯 当日精密度(RSD)％ 隔日精密度(RSD)％
相对标准偏差RSD 1.48 5.12
从上述测试结果可以知晓，本发明所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析准确率高，当日精密度和隔日精密度的RSD均在10％以内，说明本实施例所述定量分析方法可满足黄酒中葫芦巴内酯的定量要求。
实施例2
本发明所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取100mL市售黄酒样品Z转入500mL分液漏斗中，加入样品质量占比为4wt％氯化钠混合均匀后，以25mL二氯甲烷分两次进行萃取，旋涡振荡30s后，待混合液静置分层，取下层有机相进行合并，氮吹定量浓缩至100μL，得浓缩液I；
(2)用毛细管取20微升浓缩液I定量点样在GF254硅胶薄层层析板上，同步点板相同量的1000mg/mL葫芦巴内酯标准溶液，用乙醚和石油醚30-60按照体积比0.8:1.2配制的混合液作为展开剂进行层析分离，分离完成后在荧光观察下观测确认，随后将与标准溶液相同层析距离的硅胶直接切割以分离活性物质葫芦巴内酯，用0.25mL的体积含量50％的甲醇的水溶液对裁切硅胶中的葫芦巴内酯进行复溶，待移液枪吸出复溶液体后，重复同一操作，吸出液体与第一次复溶液体合并，过0.22μm有机膜后，得层析处理品II；(3)将层析处理品II和葫芦巴内酯标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对黄酒样品中的葫芦巴内酯进行定量分析，所述UHPLC-DAD检测采用的测试仪器为超高效液相色谱仪Agilent 1290Infinity，附带235nm检测波长的DAD检测器；具体测试条件为：采用规格为1.8μm 2.1mm×150mm的ZORBAXEclipse Plus C18色谱柱，在35℃下进样2微升，采用如下流动相进行处理：
Time(min) A(％) B(％)
0 85 15
10 85 15
其中，以质量含量为0.12wt％的三氟乙酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流动相流速为0.32mL/min；
其余同实施例1。
实施例3
本发明所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法的一种实施例，包括以下步骤：
(1)取100mL市售黄酒样品Z转入500mL分液漏斗中，加入样品质量占比为6wt％氯化钠混合均匀后，以15mL二氯甲烷分两次进行萃取，旋涡振荡30s后，待混合液静置分层，取下层有机相进行合并，氮吹定量浓缩至100μL，得浓缩液I；
(2)用毛细管取20微升浓缩液I定量点样在GF254硅胶薄层层析板上，同步点板相同量的1000mg/mL葫芦巴内酯标准溶液，用乙醚和石油醚30-60按照体积比1.2:0.8配制的混合液作为展开剂进行层析分离，分离完成后在荧光观察下观测确认，随后将与标准溶液相同层析距离的硅胶直接切割以分离活性物质葫芦巴内酯，用0.25mL的体积含量50％的甲醇的水溶液对裁切硅胶中的葫芦巴内酯进行复溶，待移液枪吸出复溶液体后，重复同一操作，吸出液体与第一次复溶液体合并，过0.22μm有机膜后，得层析处理品II；(3)将层析处理品II和葫芦巴内酯标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对黄酒样品中的葫芦巴内酯进行定量分析，所述UHPLC-DAD采用的测试仪器为超高效液相色谱仪Agilent 1290Infinity，附带235nm检测波长的DAD检测器；具体测试条件为：采用规格为1.8μm 2.1mm×150mm的ZORBAXEclipse Plus C18色谱柱，在35℃下进样2微升，采用如下流动相进行处理：
Time(min) A(％) B(％)
0 85 15
10 85 15
其中，以质量含量为0.08wt％的三氟乙酸水溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，流动相流速为0.28mL/min；
其余同实施例1。
比较例1
为了验证本发明所述薄层层析分离所用展开剂的优选性，按照实施例1所述步骤(1)和(2)方法将黄酒样品Z进行薄层层析处理，待分离完成后在荧光观察下观测，平行测试3次；同时，设置对照组1～5，其中对照组1所用展开剂被替换为纯丙酮，对照组2所用展开剂被替换为纯石油醚30-60，对照组3所用展开剂被替换为纯乙醚，对照组4所用展开剂为丙酮和石油醚30-60按照体积比1:1配制的混合液，对照组5所用展开剂为丙酮和乙醚按照体积比1:1配制的混合液。各实验组及对照组荧光观察下的层析图如图3～8所示，可以直观看出，相比于采用不合适或者单一一种展开剂进行分离提纯处理，本发明所述定量分析方法中采用特定组合的展开剂进行薄层层析处理的分离效果更佳。
比较例2
为了验证本发明所述定量分析方法中采用薄层层析处理的优选性，设置对照组6，该对照组与实施例1所述方法的差距仅在于浓缩液I过0.22μm有机膜后得到的处理品直接进行UHPLC-DAD检测，其中实施例1所述定量分析方法处理所得层析处理品II的DAD图谱如图9所示，而对照组6所得处理品的DAD图谱如图10所示，直观比较可以看出，不进行薄层层析处理的浓缩样品中有机相干扰物质太多，难以进行葫芦巴内酯的定量分析，而经过处理后的检测干扰物质显著减少。
效果例1
为了验证本发明所述定量分析方法对于各种黄酒产品的普适性，根据黄酒的分类不同(元红酒、加饭酒、善酿酒和香雪酒)收集多种市售不同品牌的黄酒产品，采用本发明所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法进行检测，测试结果如表6所示。
表6
从表6可以看出，本发明所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法针对不同品种、不同葫芦巴内酯浓度的黄酒产品均具有普适性，可以有效测试出黄酒中葫芦巴内酯的具体含量。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.一种黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取黄酒样品采用萃取剂进行萃取，再经浓缩处理后，得浓缩液I；所述萃取剂为二氯甲烷，所述黄酒样品与二氯甲烷的体积比为1：(0.15～0.25)；
(2)将浓缩液I进行薄层层析处理，得层析处理品II；所述薄层层析处理的展开剂由乙醚和石油醚30-60按照体积比(0.8～1.2)：(0.8～1.2)配制得到；
(3)将层析处理品II和葫芦巴内酯标准溶液进行UHPLC-DAD检测，对黄酒样品中的葫芦巴内酯进行定量分析。
2.如权利要求1所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，其特征在于，所述黄酒样品包括元红酒样品、加饭酒样品、善酿酒样品和香雪酒样品。
3.如权利要求1所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(1)中黄酒样品在萃取剂萃取前，还加入了氯化钠，所述氯化钠的添加量占黄酒样品质量含量的4～6％。
4.如权利要求1所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(2)中薄层层析处理所用层析板为GF254硅胶薄层层析板。
5.如权利要求1所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中UHPLC-DAD检测所用色谱柱为Eclipse Plus C18系列色谱柱。
6.如权利要求5所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，其特征在于，所述UHPLC-DAD检测时色谱柱规格为1.8μm2.1mm×150mm，色谱柱柱温为30～40℃。
7.如权利要求6所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，其特征在于，所述UHPLC-DAD检测时，洗脱的流动相A为质量含量为0.08～0.12wt％的三氟乙酸水溶液，流动相B为甲醇，洗脱时的具体程序为：进样量为1.8～2.2μL，0～10min，流动相A和流动相B的体积比为85:15，流动相流速为0.28～0.32mL/min。
8.如权利要求1所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中UHPLC-DAD检测时的DAD检测波长为200～250nm。
9.如权利要求1所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法，其特征在于，所述步骤(3)中UHPLC-DAD检测还包括葫芦巴内酯标准曲线的绘制，具体步骤为：以葫芦巴内酯标准溶液稀释配置浓度分别为1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、40mg/mL以及100mg/mL的葫芦巴内酯的工作溶液，经UHPLC-DAD检测并绘制标准曲线。
10.如权利要求1～9任一项所述黄酒中葫芦巴内酯的定量分析方法在黄酒批量生产过程中的质量控制中的应用。
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