ES2967857T3 - Composición para el diagnóstico de la metástasis ósea del cáncer y kit que la contiene - Google Patents
Composición para el diagnóstico de la metástasis ósea del cáncer y kit que la contiene Download PDFInfo
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Abstract
Una composición y un kit de la presente invención pueden detectar osteocalcina y N-cadherina, que son biomarcadores separados de los osteoblastos circulantes en la etapa de micrometástasis ósea del cáncer y, como tales, pueden diagnosticar el cáncer de hueso metastásico en una etapa temprana. Además, se puede aumentar una mejora en la tasa de supervivencia de pacientes con cáncer de hueso metastásico a través de un método para proporcionar información sobre el diagnóstico temprano de metástasis ósea de cáncer según la presente invención. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composición para el diagnóstico de la metástasis ósea del cáncer y kit que la contiene
[Campo técnico]
La presente invención se refiere al uso in vitro de una composición para diagnosticar la metástasis ósea del cáncer y al uso in vitro de un kit que comprende la misma.
[Antecedentes de la técnica]
El cáncer óseo metastásico se produce cuando los tumores malignos destruyen el tejido óseo. Una vez diagnosticado el cáncer óseo metastásico, su pronóstico empeora rápidamente en muchos casos, independientemente del tipo de cáncer. La razón principal es que el diagnóstico del cáncer óseo metastásico mediante las pruebas de imagen actuales es muy tardío. De hecho, en el cáncer de mama que metastatiza fácilmente en los huesos, se realiza una "gammagrafía ósea" cada 6 a 12 meses para la prevención y el diagnóstico precoz de las metástasis óseas, mientras que la terapia de supresión hormonal suele realizarse durante 5 años, incluso después del tratamiento inicial. Sin embargo, incluso cuando la metástasis ósea se diagnostica mediante gammagrafía ósea sin síntomas como dolor, fractura o compresión nerviosa, la destrucción ósea ya ha progresado en la mayoría de los casos, de este modo la respuesta de los mismos al tratamiento es escasa.
En general, el cáncer óseo metastásico procede en el orden de una fase de reposo, una fase de metástasis ósea microscópica y una fase de metástasis ósea clínica.
En la fase de reposo, las células cancerosas sólo existen en los osteocitos, y no se produce ninguna interacción entre las células cancerosas y los osteocitos. Sin embargo, en la fase de metástasis ósea microscópica, las células cancerosas interactúan con los osteoclastos y se produce la proliferación celular. En la fase clínica de metástasis ósea, las células cancerosas y los osteoclastos destruyen el tejido óseo y aparecen síntomas tales como dolor y fractura.
DAVIES S R ET AL: "OSTEOCALCIN AS A PROGNOSTIC INDICATOR FOR BONE METASTASIS IN DUCTAL BREAST CANCER", CALCIFIED TISSUE INTERNATIONAL, vol. 83, No. 1, 1 de julio de 2008 (2008-07-01), páginas 27- 27, divulga el uso de la osteocalcina como marcador de la metástasis ósea del cáncer de mama.
GAO Y ET AL: "Predictive value of osteocalcin in bone metastatic differentiated thyroid carcinoma", CLINICAL BIOCHEMISTRY, ELSEVIER INC, US, CA, vol. 43, No. 3, 1 de febrero de 2010 (2010-02-01), páginas 291 -295, divulga el uso de la osteocalcina como marcador de la metástasis ósea del carcinoma de tiroides.
DI PALMA F ET AL: "Physiological strains remodel extracellular matrix and cell-cell adhesion in osteoblastic cells cultured on alumina-coated titanium alloy", BIOMATERIALS, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 25, No.
13, 1 de junio de 2004 (2004-06-01), páginas 2565-2575, divulga composiciones y kits que comprenden anticuerpos para osteocalcina y cebadores para RT-PCR de N-cadherina que son apropiados para determinar la metástasis ósea.
MUGURUMA YUKARI ET AL: "In Situ Visualization of Human MSC Engraftment in Bone Marrow: Integration into Murine Microenvironment and Interaction with Human HSC", BLOOD, AMERICAN SOCIETY OF HEMATOLOGY, US, vol. 104, No. 11, 16 de noviembre de 2004 (2004-11-16), página 1283, divulga composiciones que comprenden agentes que un anticuerpos marcados diferencialmente con fluorescencia que permiten una tinción inmunofluorescente multicolor de osteocalcina y N-cadherina que son apropiados para determinar la metástasis ósea.
El diagnóstico de la metástasis ósea del cáncer mediante pruebas de imagen convencionales sólo era posible en esta fase de metástasis ósea clínica y, en este caso, existían limitaciones en el sentido de que, dado que el tumor ya había progresado, resultaba difícil un tratamiento eficaz, y el diagnóstico era posible después de que se produjera el cambio morfológico del tejido óseo. De acuerdo con lo anterior, existe una creciente necesidad de una composición diagnóstica, un kit o un procedimiento para proporcionar información para el diagnóstico, un tratamiento eficaz mediante el diagnóstico precoz en la fase de metástasis ósea microscópica antes de que se destruya el tejido óseo.
[Divulgación]
[Problema técnico]
Un objeto de la presente invención es proporcionar un uso in vitro de una composición de diagnóstico y un uso in vitro de un kit capaz de diagnosticar la metástasis ósea del cáncer en una etapa temprana.
Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para proporcionar información para el diagnóstico de la metástasis ósea del cáncer.
[Solución técnica]
1. Uso in vitro de una composición que comprende un agente para detectar células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina para diagnosticar la metástasis ósea del cáncer.
2. El uso de 1, en el que la composición comprende además un agente para detectar células liberadas en la sangre que expresan N-cadherina.
3. El uso de 1, en el que el agente para detectar células liberadas en sangre que expresan osteocalcina es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos, aptámeros, ADN, ARN, proteínas y polipéptidos.
4. El uso de 2, en el que el agente para detectar células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina y el agente para detectar células derivadas de la sangre que expresan N-cadherina son cada uno independientemente al menos uno seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos, aptámeros, ADN, ARN, proteínas y polipéptidos.
5. El uso de 1, en el que el cáncer es al menos uno seleccionado entre cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer colorrectal, cáncer de colon, leucemia, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de bazo, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer cerebral, cáncer de esófago, cáncer de riñón, cáncer del tracto biliar, cáncer de tiroides o cáncer de piel.
6. El uso de 1, en el que el cáncer es cáncer de mama o cáncer de tiroides.
7. Uso in vitro de un kit para diagnosticar metástasis óseas de cáncer, que comprende la composición utilizada según uno cualquiera de los puntos 1 a 6.
8. Un procedimiento para proporcionar información para el diagnóstico de metástasis óseas de cáncer, el procedimiento comprende una etapa de detección de células liberadas en sangre que expresan osteocalcina en una muestra aislada de un sujeto que se va a diagnosticar.
9. El procedimiento de 8, que comprende además una etapa de detección de células liberadas en la sangre que expresan N-cadherina en la muestra.
10. El procedimiento de 8, en el que el cáncer es al menos uno seleccionado entre cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer colorrectal, cáncer de colon, leucemia, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de bazo, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer cerebral, cáncer de esófago, cáncer de riñón, cáncer del tracto biliar, cáncer de tiroides o cáncer de piel.
11. El procedimiento del punto 8, en el que el cáncer es cáncer de mama o cáncer de tiroides.
[Efectos ventajosos]
Según la presente invención, es posible diagnosticar la metástasis ósea del cáncer mediante un procedimiento más sencillo que el escaneo óseo, y aumentar significativamente la tasa de supervivencia de un paciente adelantando drásticamente el momento en que se diagnostica la metástasis ósea del cáncer.
[Descripción de los dibujos]
La figura 1 es una vista que muestra un ejemplo de un procedimiento para proporcionar información para el diagnóstico precoz de metástasis óseas según la presente invención, y muestra los resultados de la cuantificación de células circulantes positivas a la osteocalcina (osteocalcina+) u positivas a la osteocalcina/positivas a la N-cadherina(osteocalcina+/N-cadherina+) en sangre de pacientes con cáncer mediante citometría de flujo.
La figura 2 muestra la preparación de un modelo de ratón de cáncer de mama metastásico óseo y los resultados de las imágenes de bioluminiscencia (BLI) y el examen histopatológico en el modelo de ratón a las 2 semanas, 3 semanas y 5 semanas.
La figura 3(A) es un gráfico que muestra que la metástasis ósea del cáncer puede diagnosticarse a partir de la semana 5 en BLI, pero las células circulantes positivas a la osteocalcina pueden diagnosticarse a partir de la semana 2 a 3, y la figura 3(B) muestra que el tamaño del tumor y el número (%) de células circulantes positivas a la osteocalcina son proporcionales entre sí.
La figura 4 muestra los resultados de inyectar una línea celular de cáncer de mama en el ventrículo izquierdo de un ratón para preparar un modelo de ratón lo más similar posible a una paciente real con cáncer de mama metastásico óseo, realizar imágenes de bioluminiscencia (BLI) en días variables y analizar el cálculo de células positivas a la osteocalcina mediante citometría de flujo en días variables.
La figura 5 muestra los resultados de la preparación de modelos de ratón usando diferentes especies de ratón y células de cáncer de mama asociadas a las especies de ratón, dividiendo los ratones en un grupo de metástasis ósea y un grupo de control, y analizando el cálculo de células positivas a la osteocalcina por citometría de flujo.
La figura 6 muestra los resultados de la medición del número de células positivas a la osteocalcina de cálculo en pacientes con cáncer de mama metastásico con o sin metástasis ósea.
La figura 7 muestra los resultados del análisis del cálculo de células positivas a la osteocalcina en un grupo estable sin progresión de la enfermedad y un grupo progresivo con progresión de la enfermedad en función de si la enfermedad ósea metastásica es activa o inactiva.
La figura 8 muestra los resultados de determinar un valor de corte óptimo capaz de predecir la progresión de la enfermedad ósea metastásica, dividir a los pacientes con cáncer óseo metastásico en dos grupos en función del valor de corte y realizar un análisis de la supervivencia sin progresión (SLP).
La figura 9(A) muestra los resultados del análisis del cálculo de células positivas a la osteocalcina en pacientes con cáncer de tiroides metastásico divididos en un grupo inactivo y un grupo activo según si la metástasis ósea está activa o inactiva en el momento del análisis del % de cOC. La figura 9(B) muestra los resultados del análisis del cálculo de células positivas a la osteocalcina en un grupo estable sin progresión de la enfermedad y un grupo progresivo con progresión de la enfermedad.
[Modo de invención]
En lo sucesivo se describirá en detalle la presente invención.
Como se usa en la presente memoria, el término "diagnóstico" significa identificar la presencia o las características de una condición patológica. Con respecto al propósito de la presente invención, el término "diagnóstico" puede significar identificar la presencia de metástasis ósea del cáncer, o confirmar si la metástasis ósea del cáncer está progresando o es grave.
Como se usa en la presente memoria, el término "diagnóstico" puede abarcar la determinación de la susceptibilidad de un sujeto a una determinada enfermedad o trastorno, la determinación de si un sujeto está afectado con una determinada o trastorno, la determinación del pronóstico de un sujeto afectado con una determinada o trastorno, o la terametría (por ejemplo, la monitorización del estado de un sujeto para proporcionar información sobre la eficacia terapéutica).
La presente invención se dirige al uso in vitro de una composición que comprende un agente para detectar células liberadas en sangre que expresan osteocalcina diagnosticando metástasis ósea de cáncer.
Los presentes inventores han descubierto que las células positivas a la osteocalcina se liberan en la sangre en la fase de metástasis ósea microscópica, que es una fase temprana de la metástasis ósea del cáncer, para formar células circulantes positivas a la osteocalcina, y la metástasis ósea del cáncer puede diagnosticarse en una fase temprana detectando las células circulantes positivas a la osteocalcina, completando así la presente invención.
El agente para detectar células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina no está limitado siempre que pueda detectar osteocalcina, pero ejemplos de ello incluyen anticuerpos, aptámeros, ADN, ARN, proteínas y polipéptidos, que se dirigen a la osteocalcina, ARNm que se traduce a osteocalcina, ADN que se transcribe en el ARNm o ADN que tiene una secuencia complementaria al mismo.
Cuando la composición comprende el agente para detectar células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina, puede usarse para el diagnóstico de metástasis óseas del cáncer. Sin embargo, para un diagnóstico más preciso de la metástasis ósea del cáncer, la composición puede comprender además un agente para detectar células liberadas a la sangre que expresen N-cadherina.
El agente para detectar células liberadas en la sangre que expresan N-cadherina no está limitado siempre que pueda detectar N-cadherina, pero ejemplos de ello incluyen anticuerpos, aptámeros, ADN, ARN, proteínas y polipéptidos, que se dirigen a N-cadherina, ARNm que se traduce a N-cadherina, ADN que se transcribe en el ARNm o ADN que tiene una secuencia complementaria al mismo.
Como se usa en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a una molécula proteica específica de un sitio antigénico. Con respecto a los fines de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a la proteína marcadora osteocalcina o N-cadherina, y puede incluir todos los anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales y anticuerpos recombinantes.
El anticuerpo monoclonal puede producirse usando un procedimiento de hibridoma bien conocido en la técnica o una técnica de biblioteca de anticuerpos de fagos, pero no se limita a esto.
El anticuerpo policlonal puede producirse por un procedimiento bien conocido en la técnica, que comprende inyectar el antígeno proteico en un animal, recoger sangre del animal y aislar el suero que contiene el anticuerpo. Este anticuerpo policlonal puede producirse a partir de cualquier especie animal hospedadora, tal como cabras, conejos, ovejas, monos, caballos, cerdos, vacas o perros, pero no se limita a estos.
Además, los anticuerpos de la presente solicitud también pueden incluir anticuerpos especiales tales como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos humanos.
El "péptido" tiene la ventaja de una alta afinidad de unión con el material diana, y no se desnaturaliza ni siquiera durante el tratamiento térmico/químico. Además, dado que el péptido tiene un tamaño molecular pequeño, puede unirse a otra proteína y usarse como proteína de fusión. Específicamente, dado que el péptido puede usarse unido a una cadena de proteína polimérica, puede emplearse en un kit de diagnóstico y como material de administración de fármacos.
El "aptámero" se refiere a un tipo de polinucleótido consistente en un tipo especial de ácido nucleico monocatenario (ADN, ARN o ácido nucleico modificado) capaz de unirse a una molécula diana con gran afinidad y especificidad, al tiempo que posee una estructura tridimensional estable. Como se ha descrito anteriormente, el aptámero está compuesto por un polinucleótido que puede unirse específicamente a una sustancia antigénica de la misma manera que un anticuerpo y, al mismo tiempo, es más estable que una proteína, tiene una estructura simple y es fácil de sintetizar. De este modo, el aptámero puede usarse en lugar de un anticuerpo.
Además, el cáncer puede ser al menos uno seleccionado entre cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer colorrectal, cáncer de colon, leucemia, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de bazo, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer cerebral, cáncer de esófago, cáncer de riñón, cáncer del tracto biliar, cáncer de tiroides o cáncer de piel. Preferentemente, el cáncer puede ser al menos uno seleccionado entre cáncer de mama, cáncer de tiroides o cáncer de próstata. Más preferentemente, el cáncer puede ser cáncer de mama o cáncer de tiroides, pero sin limitarse a ellos.
La presente invención también se dirige al uso in vitro de un kit para diagnosticar la metástasis ósea del cáncer, el kit que comprende la composición anterior.
El kit para el uso de la presente invención puede comprender un anticuerpo que se une específicamente a un componente marcador, un anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta que desarrolla color por reacción con un sustrato, una solución de sustrato cromogénico para la reacción con la etiqueta, y una solución de lavado, y una solución de parada de la reacción enzimática, y puede estar hecho de una pluralidad de envases o compartimentos separados que incluyen los componentes reactivos usados, pero no se limita a estos.
El kit para su uso de la presente invención puede comprender no sólo un agente capaz de medir el nivel de expresión de osteocalcina o N-cadherina en una muestra de paciente, sino también una o más composiciones, soluciones o dispositivos apropiados para el análisis del nivel de expresión. Por ejemplo, el kit puede comprender un sustrato, una solución tampón adecuada, un anticuerpo secundario conjugado con una etiqueta de detección y un sustrato cromogénico, para la detección inmunológica de un anticuerpo, pero sin limitarse a esto.
Como ejemplo específico, el kit puede ser un kit que comprenda elementos esenciales necesarios para realizar ELISA con el fin de implementar diversos métodos ELISA, tales como un kit de ELISA, un ELISA en sándwich, y similares. Este kit ELISA comprende un anticuerpo específico para la proteína. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal o un anticuerpo recombinante, que tiene alta especificidad y afinidad por la osteocalcina o la proteína N-cadherina y tiene poca reactividad cruzada con otras proteínas. Además, el kit de ELISA puede comprender un anticuerpo específico para una proteína de control. Además, el kit de ELISA puede comprender reactivos capaces de detectar anticuerpos unidos, por ejemplo, anticuerpos secundarios marcados, cromóforos, enzimas y otras sustancias capaces de unirse a sus sustratos o anticuerpos, pero sin limitarse a estos.
Además, el kit puede ser un kit para implementar un ensayo Western blot, un ensayo de inmunoprecipitación, un ensayo de fijación del complemento, una citometría de flujo o un ensayo de chip de proteínas, y puede comprender además componentes adicionales apropiados para cada procedimiento de ensayo. Mediante estos métodos de ensayo, es posible diagnosticar la metástasis ósea del cáncer comparando la cantidad de complejo antígeno-anticuerpo formado.
La presente invención también se dirige a un procedimiento para proporcionar información para el diagnóstico de metástasis óseas de cáncer, comprendiendo el procedimiento una etapa de detección de células liberadas en sangre que expresan osteocalcina en una muestra aislada de un sujeto que se va a diagnosticar.
El sujeto que se va a diagnosticar es un animal que actualmente tiene cáncer o tiene antecedentes de cáncer, y el animal puede ser un mamífero, incluido un ser humano.
La muestra se aísla del sujeto que se va a diagnosticar, y ejemplos de la misma incluyen, pero no se limitan a, tejido, células, sangre entera, plasma, suero, sangre o líquido cefalorraquídeo. Específicamente, la muestra puede ser sangre, plasma, suero o similar. Más específicamente, la muestra puede ser de células mononucleares de sangre periférica.
La detección se realiza para detectar la osteocalcina, y puede realizarse tratando la muestra con una composición para diagnosticar la metástasis ósea del cáncer que comprende un agente para detectar las células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina.
El procedimiento puede comprender además la detección de células liberadas en la sangre que expresan N-cadherina en la muestra. En este caso, la detección puede realizarse tratando la muestra con una composición para el diagnóstico de metástasis óseas del cáncer que comprende un agente para detectar células liberadas a la sangre que expresan osteocalcina y un agente para detectar células liberadas a la sangre que expresan N-cadherina.
Para aumentar aún más la precisión del diagnóstico, pueden detectarse tanto la osteocalcina como la N-cadherina, pero sin limitarse a estas.
El alcance del agente para detectar células liberadas en sangre que expresan osteocalcina o del agente para detectar células liberadas en sangre que expresan N-cadherina es el descrito anteriormente.
El alcance del cáncer es el descrito anteriormente.
El procedimiento de la presente invención está destinado a detectar células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina en una muestra aislada de un sujeto que se va a diagnosticar, o a detectar células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina y N-cadherina, y la detección puede realizarse usando, por ejemplo, un anticuerpo, péptido, aptámero o proteína específica para osteocalcina o N-cadherina, pero no se limita a estas.
Como ejemplo específico, el procedimiento de detección puede realizarse usando un anticuerpo específico para osteocalcina o N- cadherina mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en ensayo inmunoenzimático (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo de tipo sándwich, transferencia Western, inmunoprecipitación, tinción inmunohistoquímica, citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), ensayo colorimétrico de sustrato enzimático, agregación antígeno-anticuerpo y ensayo de chip de proteínas, pero no se limita a los mismos.
Como procedimiento adicional, es posible una técnica de detección de dos sustancias fluorescentes, que están a corta distancia, a una longitud de onda de fluorescencia usando una transferencia de energía de resonancia de fluorescencia que crea un nuevo desarrollo de color mediante la transferencia de energía de resonancia. Además, para aumentar la objetividad y la reproducibilidad de las pruebas distintas de la citometría de flujo, es posible usar una técnica que comprenda etiquetar las células con un anticuerpo, filtrar las células que tengan un tamaño igual o inferior a 10 pm a través de un filtro de malla, colocar las células en un portaobjetos, escanear automáticamente el portaobjetos y, a continuación, cuantificar el número de células positivas mediante inteligencia artificial.
Además, el procedimiento de la presente invención puede comprender además una etapa para determinar que el cáncer ha hecho metástasis en el hueso, cuando se detectan células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina.
Cuando se detectan células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina en la muestra del sujeto que se va a diagnosticar, puede determinarse que el cáncer ha hecho metástasis en el hueso, y a medida que aumenta la cantidad de osteocalcina detectada, puede determinarse que la fase de metástasis ósea del cáncer ha seguido progresando.
Cuando el procedimiento de la presente invención comprende además la etapa de detectar células liberadas en la sangre que expresan N-cadherina, si también se detecta N-cadherina, la metástasis ósea del cáncer puede diagnosticarse con mayor precisión.
Si es necesario, el procedimiento de la presente invención puede comprender además una etapa de tratamiento de la muestra, aislada del sujeto que se va a diagnosticar, con vitamina K.
La vitamina K puede ser vitamina KI o vitamina K2.
El tratamiento de la muestra con vitamina K puede y-carboxilar la osteocalcina y aumentar y estabilizar la expresión de la osteocalcina, de modo que la osteocalcina pueda detectarse más fácilmente.
La concentración de tratamiento de la vitamina K no está particularmente limitada, y puede ser, por ejemplo, de 10'5 M a 10'7 M. Específicamente, la concentración de tratamiento de cada una de las vitaminas KI y K2 puede ser de 10'5 M a 10'7 M. A la concentración de tratamiento descrita anteriormente, puede maximizarse el efecto de expresión de osteocalcina de las células circulantes positivas a la osteocalcina.
Se describe además, pero no se reivindica, un procedimiento de diagnóstico de metástasis óseas de cáncer mediante la detección de osteocalcina en una muestra aislada de un sujeto que se va a diagnosticar.
El alcance de la muestra es el descrito anteriormente.
La detección puede realizarse tratando la muestra con un agente para detectar osteocalcina.
El agente para detectar la osteocalcina es el descrito anteriormente.
Cuando se detecta osteocalcina, se puede determinar que el cáncer ha hecho metástasis en el hueso. Para un ejemplo más específico, la metástasis ósea del cáncer puede diagnosticarse midiendo el número (%) de células circulantes positivas a la osteocalcina en la muestra. Específicamente, la metástasis ósea del cáncer puede diagnosticarse comparando el número de células circulantes positivas a la osteocalcina en un paciente que tiene metástasis ósea con el número de células circulantes positivas a la osteocalcina en un paciente que no tiene metástasis ósea, pero no se limita a esto.
Además, el procedimiento puede comprender además una etapa de detección de N-cadherina en la muestra.
Esta etapa puede realizarse tratando la muestra con un agente para detectar N-cadherina, y el alcance del agente es el descrito anteriormente.
Cuando se detecta N-cadherina, la metástasis ósea del cáncer puede diagnosticarse con mayor precisión. Específicamente, es posible detectar células circulantes positivas a la osteocalcina en la muestra, y luego detectar células circulantes positivas a la N-cadherina, pero no se limita a estas.
En lo sucesivo, la presente invención se describirá en detalle con referencia a ejemplos.
Ejemplos
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica y citometría de flujo
(1) Método experimental
Para la citometría de flujo de células circulantes positivas a la osteocalcina en muestras de sangre aisladas de pacientes con cáncer, cada muestra se recogió mediante biopsia líquida, y se aislaron células mononucleares de sangre periférica de la muestra. se colocaron 4 cc de la muestra de sangre recogida del paciente que se iba a diagnosticar en un tubo de heparina que contenía Ficoll (Pharmacia) y se centrifugó a una velocidad de 1.800 rpm a una temperatura de 4 °C, durante 20 minutos para separar la sangre en plasma, una capa de células mononucleares, Ficoll y una capa de RBC. En este momento, sólo se aisló cuidadosamente la capa de células mononucleares (segunda capa) en la interfase entre el plasma separado y el Ficoll y se transfirió a un tubo nuevo. A continuación, las células mononucleares se lavaron con solución de PBS y se centrifugaron a una velocidad de 2000 rpm a una temperatura de 4°C, durante 5 minutos, y sólo se recogieron las células mononucleares limpiamente lavadas.
Se colocaron 106 células mononucleares lavadas en 500 pl de tampón que contenía FBS y se tiñeron mediante incubación con anticuerpos anti CD15-FITC (5 pl), anti-CD34-PE-Cy7 (5 pl), antiosteocalcina- APC (3 pl) y anti-N-cadherina-PE (5 pl) a temperatura ambiente durante 30 minutos. (Información sobre los anticuerpos usados: a-CD15 FITC (#555401,BD), a-CD34 PE-Cy7 (#34881, BD), a-osteocalcina APC (#SC-365797-AF647, Santa Cruz), y a-N- cadherina PE (#561554, BD) fueron adquiridos y usados).
Una vez finalizada la tinción, los anticuerpos unidos inespecíficamente y los no unidos se lavaron agregando 4 ml de tampón que contenía FBS, y se obtuvieron células mononucleares marcadas con anticuerpos por concentración a una velocidad de 1500 rpm a una temperatura de 4 °C, durante 5 minutos. Las muestras de sangre de pacientes con cáncer descritas anteriormente se obtuvieron de acuerdo con las regulaciones bajo la aprobación del IRB del Centro de Investigación Clínica del Hospital de la Universidad Nacional de Seúl para su uso en la investigación clínica de la presente invención.
Las células mononucleares teñidas se analizaron por citometría de flujo (BD FACSCanto II). Las células mononucleares teñidas con los anticuerpos mencionados se analizaron a nivel unicelular y se clasificaron en primer lugar en poblaciones de células CD15- y se volvieron a clasificar en poblaciones de células CD34- y osteocalcina+. Se cuantificó el número de células y se analizaron las células circulantes positivas a la osteocalcina. Además, se analizó el número de células N-cadherina+ en la población correspondiente y, por último, se cuantificaron las células CD15-/CD34-/osteocalcina+/N-cadherina+ circulantes específicas del cáncer óseo metastásico usando la ecuación 1 que figura a continuación. Se realizaron análisis de células circulantes positivas a la osteocalcina en muestras obtenidas de un total de 108 pacientes con cáncer (98 células de cáncer de mama y 10 pacientes con cáncer de tiroides), y los resultados de análisis representativos se muestran en la figura 1.
[Ecuación 1]
Células circulantes positivas a la osteocalcina (%) = {(número de células CD15-/CD34-/osteocalcina+/N-cadherina+)/(número de células CD15-) } X 100 (%)
(2) Resultados experimentales
En la citometría de flujo de la muestra de sangre del paciente con cáncer, se analizó un total de 1.000.000 de células, y entre ellas, se clasificaron 932.559 células excluyendo las células muertas. Posteriormente, se volvieron a clasificar 881.302 células CD15-, de las cuales se clasificaron 1.252 células osteocalcina+/CD34-. De 1.252 células, se clasificaron 869 células N-cadherina+. Los resultados se muestran en la figura 1.
2. Preparación del modelo de ratón de cáncer óseo metastásico
(1) Método experimental
Para el análisis de las células circulantes positivas a la osteocalcina en un estudio preclínico, se preparó un modelo de ratón que facilita el análisis de los entornos de la médula ósea y las células circulantes positivas a la osteocalcina de pacientes reales con cáncer óseo metastásico. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con una normativa estricta y con la aprobación del Comité de Ética Experimental Animal de la Universidad Nacional de Seúl (SNU-170607-6-2). Se preparó un modelo animal ideal similar al de los pacientes con cáncer óseo metastásico inyectando una línea celular de cáncer de mama humano directamente en la tibia de cada ratón inmunodeficiente (ratón desnudo Balb/c). Específicamente, la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se preparó en PBS (tampón inyectable en el cuerpo del ratón) en una cantidad de 1x105 células/20 pl/ratón, y se inyectó en la tibia derecha de cada ratón desnudo. A las 2, 3 y 5 semanas de la inyección de las células cancerosas, se observó la formación y el crecimiento de tumores en la tibia mediante imágenesin vivo(Xenogen IVIS, PerkinElmer). Para confirmar la formación sustancial de tumores en cada semana, se practicó la eutanasia al ratón, se aisló la tibia formada por el tumor y se procedió a preparar una muestra para el análisis histológico. El tejido aislado se fijó mediante almacenamiento en frío en una solución de paraformaldehído al 4 % durante 3 días y, a continuación, se separó la porción muscular del hueso, que se descalcificó en una solución de EDTA 0,5 M durante unas 2 semanas. (Durante el procedimiento de descalcificación, el tejido se conservó en frío y se sustituyó la solución de EDTA 0,5 M cada 3 días). A continuación, el tejido se embebió en parafina y se seccionó, y las secciones de parafina se colocaron en portaobjetos y se tiñeron con H&E. Los resultados de las imágenesin vivoy la tinción de tejidos se muestran en la figura 2.
(2) Resultados experimentales
Como resultado de realizar imágenes BLI del modelo de ratón de cáncer de mama metastásico óseo preparado en cada semana, se pudo confirmar que la formación y el crecimiento del tumor se podían encontrar incluso a las 5 semanas. Además, los resultados del examen histopatológico coincidían con los resultados de las imágenes BLI. A las 3 semanas, se observó que se había formado un tumor muy pequeño en la tibia, y a las 5 semanas, se pudo observar que se había formado un tumor grande en la tibia. Estos resultados sugieren que un tumor microscópico es difícil de diagnosticar por imagen, y el tumor puede diagnosticarse cuando ha crecido significativamente durante 5 semanas o más (Figura 2).
3. Análisis del cambio en las células circulantes positivas a la Osteocalcina causado por el crecimiento del tumor
(1) Método experimental
Para analizar los cambios en las células circulantes positivas a la osteocalcina en función del tamaño del tumor en el modelo de ratón de cáncer óseo metastásico preparado en el ejemplo 2, se realizó un muestreo de sangre. Específicamente, se anestesió al ratón y se le extrajo aproximadamente 1 ml de sangre total mediante punción cardíaca. Para evitar la coagulación de la sangre durante la extracción, el interior de la jeringa se recubrió con una solución de heparina antes de la toma de muestras de sangre, y la sangre extraída se agregó a una solución de lisis de hematíes inmediatamente después de la toma de muestras y se sometió a un procedimiento de lisis de hematíes. La muestra se dejó reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos y, a continuación, se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos y se eliminó el sobrenadante. Este procedimiento se repitió hasta que se eliminaron completamente los glóbulos rojos, y las células de las que se habían eliminado completamente los glóbulos rojos se agregaron a un tampón que contenía FBS. En lo sucesivo, las células se tiñeron con anti-CD45-PE (#561087, BD) y el anticuerpo antiosteocalcina descrito en el ejemplo 1 anterior, y las células CD45+/osteocalcina+ circulantes se analizaron por citometría de flujo. Se compararon la intensidad de las imágenes de bioluminiscenciain vivo(ph/s) y el número (%) de células circulantes positivas a la osteocalcina (cOC) en función del tamaño del tumor. Los resultados se muestran en la figura 3.
(2) Resultados experimentales
En el modelo de ratón de cáncer óseo metastásico preparado con células de cáncer de mama, pudo observarse que las células circulantes positivas a la osteocalcina (cOC) aumentaban antes del diagnóstico en la técnica de imagen, y que las células tumorales podían detectarse mediante análisis histopatológico cuando estas células empezaban a formar microcúmulos en la superficie ósea (véase la figura 2). Se pudo confirmar que la metástasis ósea del cáncer se podía diagnosticar a las 5 semanas en las imágenes BLI convencionales, pero se podía diagnosticar a las 2 o 3 semanas según la presente invención (Figura 3(A)).
Además, en el modelo de ratón de cáncer óseo metastásico preparado usando células de cáncer de mama, las células circulantes positivas a la osteocalcina (cOC) mostraron una buena correlación con el tamaño del tumor medido mediante análisis patológico que puede considerarse como patrón oro (Figura 3(B)).4
4. Preparación de un modelo microscópico de ratón de cáncer de mama metastásico óseo y análisis de las células circulantes positivas a la osteocalcina
(1) Método experimental
Como modelo de ratón diferente del modelo de ratón de metástasis ósea preparado inyectando células cancerosas en la tibia, se preparó un modelo de ratón inyectando células de cáncer de mama directamente en el ventrículo izquierdo de cada ratón para realizar un estudio preclínico en un entorno lo más similar posible a un paciente real de cáncer de mama metastásico óseo. Se inyectaron células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 directamente en el ventrículo izquierdo de cada ratón inmunodeficiente (ratones desnudos Balb/c) para establecer un modelo de ratón en el que las células cancerosas hicieran metástasis en la tibia o el fémur tras la circulación sistémica.
Específicamente, la línea de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se preparó en PBS (tampón inyectable en el cuerpo del ratón) en una cantidad de 1x105 células/100 pl/ratón, y se inyectó directamente en el ventrículo izquierdo de cada ratón desnudo. A los 3, 7, 14 y 22 días de la inyección de las células cancerosas, se observó la formación y el crecimiento del tumor que hizo metástasis en el hueso del ratón mediante imágenesin vivo(Xenogen IVIS, PerkinElmer). Además, se estableció y analizó una región de interés (ROI) y se analizó numéricamente el crecimiento del tumor que metastatizó en el hueso del ratón. En los días descritos anteriormente, se practicó la eutanasia a cada ratón, se tomaron muestras de sangre total del ratón, se aislaron las PBMC y se analizaron las células circulantes positivas a la osteocalcina. La toma de muestras de sangre y el procedimiento de aislamiento de PBMC, así como la tinción de anticuerpos para citometría de flujo son como los descritos en el ejemplo 3 anterior.
Los resultados de las imágenesin vivoy de las células circulantes positivas a la osteocalcina se muestran en la figura 4.
(2) Resultados experimentales
Como resultado de la preparación del modelo de ratón de cáncer de mama metastásico óseo microscópico y la realización de imágenes BLI del modelo de ratón en días variables en la fase temprana de la metástasis ósea, se pudo confirmar que la metástasis ósea se podía diagnosticar a los 14 días después de la inyección de las células cancerosas y que los resultados del análisis significativo del valor ROI se podían obtener sólo a los 22 días después de la inyección de las células. Sin embargo, los resultados del análisis de las células circulantes positivas a la osteocalcina indicaron que las células circulantes positivas a la osteocalcina ya aumentaban en el día 7, cuando la metástasis ósea no podía detectarse mediante imágenes BLI. Estos resultados son coherentes con los obtenidos en el modelo preparado inyectando células cancerosas directamente en la tibia, y sugieren que los tumores óseos metastásicos microscópicos son difíciles de diagnosticar mediante imágenes BLI, pero su diagnóstico precoz es posible mediante el análisis de las células circulantes positivas a la osteocalcina (Figura 4).
5. Análisis de las células circulantes positivas a la osteocalcina dependiendo de la presencia o ausencia de metástasis ósea
(1) Método experimental
Para analizar las células circulantes positivas a la osteocalcina dependiendo de la presencia o ausencia de metástasis ósea, se preparó el mismo modelo microscópico de cáncer de mama con metástasis ósea que el del ejemplo 4 inyectando células cancerosas en el ventrículo izquierdo. El modelo de ratón se preparó usando una línea celular de cáncer de mama derivada de la especie de ratón correspondiente en otras especies de ratón, con el fin de demostrar que el aumento cuantitativo de células circulantes positivas a la osteocalcina no es una respuesta específica de la especie de ratón o una respuesta específica de la línea celular de cáncer de mama. Específicamente, la línea celular 4T1 de cáncer de mama derivada de ratones Balb/c se preparó en PBS (tampón inyectable en el cuerpo del ratón) en una cantidad de 1x104 células/100 pl/ratón, y se inyectó directamente en el ventrículo izquierdo de cada ratón Balb/c. A los 7 días de la inyección de las células cancerosas, los ratones se dividieron en un grupo con metástasis ósea y un grupo sin metástasis ósea mediante imágenes BLI, y la intensidad de luminiscencia entre el grupo con metástasis ósea y el grupo de control se cuantificó mediante análisis ROI. En lo sucesivo, se sacrificó a los ratones, se extrajo sangre total y se analizaron las células circulantes positivas a la osteocalcina de la misma manera que se describe en el ejemplo anterior. Además, se analizó la correlación entre los resultados del análisis BLI y los resultados del análisis de células circulantes positivas a la osteocalcina. Los resultados se muestran en la figura 5.
(2) Resultados experimentales
Como resultado del análisis de las células circulantes positivas a la osteocalcina en el grupo de metástasis ósea y en el grupo de control, se pudo confirmar un aumento cuantitativo significativo de las células circulantes positivas a la osteocalcina en el grupo de metástasis ósea en comparación con el grupo de control. Además, como resultado del análisis de la correlación entre el resultado de las imágenes BLI y el aumento cuantitativo de las células circulantes positivas a la osteocalcina, se demostró que el aumento cuantitativo de las células circulantes positivas a la osteocalcina tenía una correlación significativa con la presencia de metástasis ósea. Esto demuestra que las células circulantes positivas a la osteocalcina pueden servir como marcador no sólo para el diagnóstico precoz del cáncer de mama metastásico óseo microscópico, sino que también son capaces de detectar la presencia de metástasis óseas (Figura 5).
6. Estudio clínico en pacientes con cáncer de mama metastásico (1) Método experimental
Para evaluar si las células circulantes positivas a la osteocalcina presentes en la sangre de pacientes reales con cáncer óseo metastásico tienen valor diagnóstico clínico mediante el análisis de las células circulantes positivas a la osteocalcina, se midió el número (%) de células circulantes positivas a la osteocalcina en 96 pacientes de cáncer de mama con cáncer óseo metastásico. La toma de muestras de sangre del paciente, el aislamiento de células mononucleares y los procedimientos de tinción celular se realizaron de la misma manera que se describe en el ejemplo 1 anterior, y el procedimiento de análisis también se realizó de la misma manera. Los resultados se muestran en la figura 6.
Para evaluar el valor clínico adicional, se realizaron diversos métodos de análisis. En el momento del análisis del % de cOC y tras un seguimiento continuo, los pacientes se dividieron en un grupo con enfermedad ósea metastásica activa y un grupo con enfermedad inactiva y se analizaron. Los resultados se muestran en la figura 7. Además, basándose en los resultados del análisis de seguimiento, se determinó un valor de corte óptimo capaz de predecir la progresión de la enfermedad ósea metastásica y, basándose en dicho valor de corte, se realizó un análisis de la supervivencia sin progresión (probabilidad de SLP). Los resultados se muestran en la figura 8.
(2) Resultados experimentales
1. Entre 96 pacientes con cáncer de mama metastásico, 63 pacientes con metástasis óseas tenían un % de cOC significativamente alto en comparación con 33 pacientes sin metástasis óseas (figura 6).
2. Cuando los pacientes con metástasis ósea se dividieron en un grupo inactivo de 26 pacientes y un grupo activo de 37 pacientes según si la enfermedad ósea metastásica estaba activa o inactiva en el momento del análisis del cOC%, no hubo diferencias en el % de cOC entre los dos grupos. Sin embargo, cuando se dividió a los pacientes en un grupo estable sin progresión de la enfermedad ósea metastásica y un grupo progresivo con progresión de la enfermedad ósea metastásica tras un seguimiento de 15 meses, se pudo confirmar que, tanto en el grupo inactivo como en el activo, el % de cOC basal del grupo progresivo era significativamente superior al del grupo estable (Figura 7).
3. El valor de corte óptimo que permite predecir la progresión de la enfermedad ósea metastásica mediante el % de cOC podría determinarse como 0,45% (Figura 8(A)). Cuando los pacientes con cáncer óseo metastásico se dividieron en dos grupos basándose en el 0,45%, se pudo confirmar que había una diferencia significativa en la supervivencia sin progresión entre los dos grupos (Figura 8(B)).
7. Estudio clínico en pacientes con cáncer de tiroides metastásico
(1) Método experimental
Para evaluar si las células circulantes positivas a la osteocalcina presentes en la sangre de pacientes reales con cáncer óseo metastásico tienen valor diagnóstico clínico mediante el análisis de las células circulantes positivas a la osteocalcina, se midió el número (%) de células circulantes positivas a la osteocalcina en 14 pacientes de cáncer de tiroides con cáncer óseo metastásico. La toma de muestras de sangre del paciente, el aislamiento de las células mononucleares y los procedimientos de tinción celular se realizaron de la misma manera que la descrita en el ejemplo 1 anterior. En el momento del análisis del % de cOC y tras un seguimiento continuo, los pacientes se dividieron en un grupo activo con progresión de la enfermedad ósea metastásica y un grupo inactivo sin progresión de la enfermedad ósea metastásica y se analizaron. Los resultados se muestran en la figura 9.
(2) Resultados experimentales
1. De los 14 pacientes con cáncer de tiroides metastásico, 12 pacientes con metástasis óseas se dividieron en un grupo inactivo de 5 pacientes y un grupo activo de 7 pacientes dependiendo de si la enfermedad ósea metastásica estaba activa o inactiva en el momento del análisis del cOC%, y como resultado, el % de cOC del grupo activo fue significativamente superior al del grupo inactivo (Figura 9 (A)).2
2. Cuando se dividió a los pacientes en un grupo estable sin progresión de la enfermedad ósea metastásica y un grupo progresivo con progresión de la enfermedad ósea metastásica tras un seguimiento de 6 meses, el % de cOC basal del grupo progresivo fue superior al del grupo estable, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 9(B)).
Claims (11)
1. Uso in vitro de una composición que comprende un agente para detectar células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina para diagnosticar la metástasis ósea del cáncer.
2. El uso de la reivindicación 1, en el que la composición comprende además un agente para detectar células liberadas en la sangre que expresan N-cadherina.
3. El uso de la reivindicación 1, en el que el agente para detectar células liberadas en sangre que expresan osteocalcina es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos, aptámeros, ADN, ARN, proteínas y polipéptidos.
4. El uso de la reivindicación 2, en el que el agente para detectar células liberadas en la sangre que expresan osteocalcina y el agente para detectar células derivadas de la sangre que expresan N-cadherina son cada uno independientemente al menos uno seleccionado del grupo que consiste en anticuerpos, aptámeros, ADN, ARN, proteínas y polipéptidos.
5. El uso de la reivindicación 1, en el que el cáncer es al menos uno seleccionado entre cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer colorrectal, cáncer de colon, leucemia, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de bazo, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer cerebral, cáncer de esófago, cáncer de riñón, cáncer del tracto biliar, cáncer de tiroides o cáncer de piel.
6. El uso de la reivindicación 1, en el que el cáncer es cáncer de mama o cáncer de tiroides.
7. Uso in vitro de un kit para diagnosticar metástasis óseas de cáncer, que comprende la composición usada según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Un procedimiento para proporcionar información para el diagnóstico de metástasis óseas de cáncer, el procedimiento comprende una etapa de detección de células liberadas en sangre que expresan osteocalcina en una muestra aislada de un sujeto que se va a diagnosticar.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, que comprende además una etapa de detección de células liberadas en la sangre que expresan N-cadherina en la muestra.
10. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el cáncer es al menos uno seleccionado entre cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer de útero, cáncer colorrectal, cáncer de colon, leucemia, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de bazo, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer cerebral, cáncer de esófago, cáncer de riñón, cáncer del tracto biliar, cáncer de tiroides o cáncer de piel.
11. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el cáncer es cáncer de mama o cáncer de tiroides.
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