CN101178405B

CN101178405B - 肿瘤相关抗原50化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN101178405B
Application number: CN2006101144886A
Authority: CN
Inventors: 唐宝军; 胡国茂; 应希堂
Original assignee: KEMEI DONGYA BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: Chemclin Diagnostics Corp
Priority date: 2006-11-10
Filing date: 2006-11-10
Publication date: 2011-05-18
Anticipated expiration: 2026-11-10
Also published as: CN101178405A

Abstract

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种肿瘤相关抗原50化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。根据本发明的试剂盒包括：1)肿瘤相关抗原50校准品；2)肿瘤相关抗原50的单克隆抗体包被载体；3)肿瘤相关抗原50的单克隆抗体酶标记物；以及4)化学发光底物。进一步，根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：1)以肿瘤相关抗原50纯品配制肿瘤相关抗原50校准品；2)以肿瘤相关抗原50的单克隆抗体包被载体；3)分装上述肿瘤相关抗原50校准品和化学发光底物；以及4)组装为成品。本发明的试剂盒具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。

Description

肿瘤相关抗原50化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种肿瘤相关抗原50(CA50)化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

肿瘤是一类严重威胁人类生命和健康的恶性疾病。WHO指出及早诊断和治疗是对抗癌症的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是非常重要的。

目前发现的肿瘤标志物已经有一百多种，由于大多数情况下体内肿瘤标志物的含量都非常低，一般的检测方法很难对其进行精确的定量。CA50是一种非特异性的广谱肿瘤标志物，其对胰腺、肝脏、结肠等消化系统肿瘤的诊断有较高的价值。因此，如何能够有效地在肿瘤诊断中应用CA50一直是人们关注并希望解决的问题。

近十年来标记免疫分析技术的研究和应用发展迅速，已广泛应用于生物医学基础理论研究及临床疾病诊断各领域。其中技术工艺成熟，具有先进性且实用性强，易于推广的主要有：放射免疫分析、酶免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和化学发光免疫分析等四种。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为：化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。放射免疫分析法存在诸多缺点，如操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等。

化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，然而，目前化学发光免疫分析技术在CA50免疫分析产品的应用方面仍是空白。一方面，产业应用需要解决成品的高效性和稳定性问题。另一方面，现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒均为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒可应用于开放式的化学发光测量仪，使用成本低，更易推广应用。

发明内容

本发明同时解决了上述问题，即将化学发光技术与CA50的免疫分析学有效地结合，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测CA50的试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种肿瘤相关抗原50(CA50)化学发光免疫分析定量测定试剂盒。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

根据本发明的试剂盒包括：1)肿瘤相关抗原50校准品；2)包被有肿瘤相关抗原50的单克隆抗体的载体；3)酶标记的肿瘤相关抗原50的单克隆抗体；以及4)上述酶所作用的化学发光底物。

进一步，根据本发明的制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：

1)以肿瘤相关抗原50纯品配制肿瘤相关抗原50校准品；

2)用酶标记肿瘤相关抗原50的单克隆抗体；

3)以肿瘤相关抗原50的单克隆抗体包被载体；

4)分装上述肿瘤相关抗原50校准品、酶标记的肿瘤相关抗原50的单克隆抗体和该酶所作用的化学发光底物；以及

5)组装为成品。

在上述根据本发明的试剂盒及其制备方法中，所述载体可以为固相载体、优选微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。所述酶可以为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。所述化学发光底物可以为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述1，2-二氧乙烷类衍生物可以为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。

在根据本发明的方法中，其中所述包被载体的步骤3)包括以下步骤：

1)包被

配制包被液，基于1000mL所述包被液包含7.30g的柠檬酸三钠和4.45g的柠檬酸，所述包被液的pH值为4.5～4.8，然后将制备的包被液与肿瘤相关抗原50的单克隆抗体混合，并将所得混合液负载于载体上；

2)用生理盐水洗涤上述载体；以及

3)封闭

配制封闭液，基于 1000mL 所述封闭液包含0.2gNaH₂PO₄·2H₂O，2.9gNaH₂PO₄·12H₂O、10gBSA、和1mL生物防腐剂，所述封闭液的pH值为7.0～7.5，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的载体上。

具体的上述试剂盒可以包括CA50校准品、抗体包被板、酶标记物与化学发光底物液、20倍浓缩洗涤液等。其中，所述CA50校准品为标准级，纯度不低于90％、抗体包被板为48或96孔的微孔板条、酶标记CA50单抗为偶联碱性磷酸酶、化学发光底物液为AMPPD、浓缩洗涤液为Tris-HCl。

本发明“肿瘤相关抗原50化学发光免疫分析定量测定试剂盒”可以非常专一地定量检测出病人CA50的含量，可以根据CA50含量的多少判断治疗胰腺、肝脏、结肠等消化系统肿瘤病人药物的效果及其病情的变化。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该CA50测定试剂盒(化学发光法)的各项指标均达到酶联免疫分析法。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。根据本发明的试剂盒，酶标记的CA50单抗与载体上包被的CA50单抗和被测样品的CA50抗原形成“双抗体夹心”结构，因此本发明采用的“双抗体夹心一步法”反应模式，既有效地利用了化学发光技术原理、又确保了检测的灵敏性。另外，这种模式还便于操作和生产。

本发明的试剂盒应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶联免疫分析中的显色底物，因而具有与酶联免疫分析同等的特异性，而灵敏度大大提高，比现今的酶联免疫吸附分析灵敏度提高约10倍，可为乳腺癌的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。

附图说明

图1说明了本发明的肿瘤相关抗原50定量测定试剂盒临界值的确定。

图2显示了天坛医院用本发明的定量测定试剂盒和PerkinElmer试剂盒检测69份肿瘤病人相关性的结果。

其中，PerkinElmer试剂盒的测定值为X轴，本发明的试剂盒的测定值为Y轴，结果经统计学处理得相关系数r＝0.9902，y＝0.9569x+3.0073。

图3显示了友谊医院用本发明的试剂盒和PerkinElmer试剂盒检测50份肿瘤病人相关性的结果。

其中，PerkinElmer试剂盒的测定值为X轴，本发明肿的试剂盒的测定值为Y轴，结果经统计学处理得相关系数r＝0.9835，y＝0.8940x+0.5785。

图4显示了北华医院用本发明的试剂盒和PerkinElmer试剂盒检测63份肿瘤病人相关性的结果。

其中，PerkinElmer试剂盒的测定值为X轴，本发明肿瘤相关抗原50定量测定试剂盒(化学发光法)的测定值为Y轴，结果经统计学处理得相关系数r＝0.9829，y＝0.9872x+0.1394。

具体实施方式

实施例1制备本发明的CA50定量测定试剂盒

一、酶标抗体制备

CA50单抗用戊二醛法与碱性磷酸酶偶联，对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存。

二、CA50校准品的制备

用CA50纯品配制，分装0、10、20、40、80、140U/ml共6瓶。

三、酶标抗体浓度选定

采用方阵法选择酶标抗体的工作浓度大于1：6000。

四、固相包被板的制备

(1)包被

柠檬酸三钠 2.92g

柠檬酸 1.78g

双蒸水 400ml

溶解混匀后，调整PH至4.8，加入适量CA50单抗混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔130μL，4℃24h。

(2)洗涤：用生理盐水洗三次。

(3)封闭

NaH₂PO₄·2H₂O 0.2g

Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g

BSA 10g

Proclin 3001ml

双蒸水定容至1000ml

将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，测定pH值为7.0。

每孔分别加入封闭液300μL，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2～8℃保存。

五、酶标单抗稀释液

Tris 12.120g

BSA 5g

Proclin 1ml

双蒸水 1000ml

六、化学发光底物液

NaH₂PO₄·2H₂O 4g

Na₂HPO₄·12H₂O 26g

双蒸水 1000mL

Proclin 3001mL

AMPPD 200ml

溶解后混合均匀。

七、20倍洗涤液

Tris 24g

NaCl 160g

KCl 4g

HCl 15ml

去离子水 1000ml

调整PH至7.4

八、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过特异性、精密性、灵敏度及稳定性检定合格才能组装成肿瘤相关抗原50定量测定试剂盒(化学发光法)。组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

综上，在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、ALP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被缓冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被缓冲液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于ALP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液。

本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了双抗体夹心一步法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响实验表明：在加入化学发光底物液后30-90分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。

实施例2～3制备本发明的CA50定量测定试剂盒

除以辣根过氧化酶标记CA50单抗、以鲁米诺(luminol)作为化学发光底物、分别以塑料珠和塑料管作为载体、包被液的pH值为4.5、封闭液的pH值为7.5外，其余均以与实施例1相同的方法制备CA50定量测定试剂盒。

实施例4制备本发明的CA50定量测定试剂盒

除以磁性颗粒作为载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备CA50定量测定定剂盒。

实施例5本发明的试剂盒的使用方法

以上实施例1制备的CA50定量测定试剂盒的具体操作如下：

1)自4℃冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。

2)取出包被板条，插入板架上。

3)反应孔中分别加各浓度校准品每孔加0、10、20、40、80、140U/ml各25μl，每次实验设空白1孔，然后除空白孔外各孔加酶标记物100μl，用微量震荡器充分振荡混匀，37℃温育1小时。

4)甩去反应液，每孔加满稀释后的洗涤液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣干。

5)各孔加化学发光底物液50μl，用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20～25℃)避光反应30分钟。

6)必须于加化学发光底物液后的第30～90分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)，测量时间1秒/孔。

7)以校准品浓度为横坐标，RLU值为纵坐标绘出标准曲线，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的CA50的浓度。

实施例6本发明的试剂盒的方法学鉴定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，见下表1：

表1

检验项目	检验标准	检验结果
			准确性	平均回收率在90.0-110.0％	符合标准
特异性	与其类似物的交叉反应率≤0.01％	符合标准
			精密性CV(％)	≤15％(n＝10)	符合标准
灵敏度	≤1.00U/ml	符合标准
			稳定性	各试剂组分置37℃至少3天	符合标准

说明“肿瘤相关抗原50定量测定试剂盒(化学发光法)”的准确性、特异性、精密性、灵敏度和稳定性是完全合格的。

实施例7正常人的CA50含量及临界值的确定

随机取300例健康人血清用实施例1～4中制备的“肿瘤相关抗原50定量测定试剂盒(化学发光法)”测定结果如下：

300例健康人血清，求得出健康人测定值的平均值为13.16U/ml，标准偏差为6.02U/ml，计算出的平均值加上2.7倍的标准偏差所对应的浓度值作为临界值，其结果为29.41U/ml。

实施例8本发明的CA50定量测定试剂盒的临床应用与PerkinElmer试剂盒比较

首都医科大学附属天坛医院、首都医科大学附属友谊医院、北华大学附属医院使用实施例1的肿瘤相关抗原50定量测定试剂盒和PerkinElmer试剂盒同时检测肿瘤病人182份，以比较两种试剂盒之间的相关性。

一、临床血清标本的来源：

各医院临床收集肿瘤病人血清标本182份，正常人血清标本300份。

二、使用CA50定量测定试剂盒与PerkinElmer试剂盒比较

1、方法

三家医院分别使用本发明实施例1的“肿瘤相关抗原50定量测定试剂盒”(按其说明书操作)和PerkinElmer试剂盒(按其说明书操作)检测同样血样182份，并经统计学处理结果表明，该两种方法检测的结果高度相关，如图1-4显示所示。

2、结果

三家医院分别使用实施例1的“肿瘤相关抗原50定量测定试剂盒”和PerkinElmer试剂盒检测同样血样182份结果(见表2)

表2.三家医院两种方法比较

医院	血样数	相关系数(r)	P值	备注
					天坛	69	0.9902	<0.01	高度相关
友谊	50	0.9835	<0.01	高度相关
					北华	63	0.9829	<0.01	高度相关

三家医院使用“肿瘤相关抗原50定量测定试剂盒(化学发光法)”与PerkinElmer试剂盒检测同样血样的比较结果，两种方法均高度相关，P值均<0.01。说明两种方法具有同等的使用价值。上述结果表明：试剂盒的各项指标均达到或超过了ELISA法，且与ELISA法呈高度相关。试剂盒的稳定性实验进行了37℃恒温箱存放实验和4℃恒温储存试验。结果显示，4℃放置9个月，37℃放置3天，试剂盒各项指标符合稳定性要求。

Claims

1.一种肿瘤相关抗原50定量测试试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1)肿瘤相关抗原50校准品；

2)包被有肿瘤相关抗原50的单克隆抗体的载体；

3)酶标记的肿瘤相关抗原50的单克隆抗体；以及

4)上述酶所作用的化学发光底物，

其中，所述包被有肿瘤相关抗原50的单克隆抗体的载体经过以下步骤制备：

1)包被

2)用生理盐水洗涤上述载体；以及

3)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O，2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、10gBSA、和1mLProclin300，所述封闭液的pH值为7.0～7.5，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的载体上。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为固相载体。

3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺，(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

6.一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以肿瘤相关抗原50纯品配制肿瘤相关抗原50校准品；

2)用酶标记肿瘤相关抗原50的单克隆抗体；

3)以肿瘤相关抗原50的单克隆抗体包被载体；

5)组装为成品；

其中，所述包被载体的步骤3)包括以下步骤：

1)包被

2)用生理盐水洗涤上述载体；以及

3)封闭

配制封闭液，基于1000mL所述封闭液包含0.2g NaH₂PO₄·2H₂O，2.9gNa₂HPO₄·12H₂O、10gBSA、和1mL Proclin300，所述封闭液的pH值为7.0～7.5，然后将所得封闭液负载于上述洗涤后的载体上。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物为鲁米诺或异鲁米诺、(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2’-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3”-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。