CN109061175A - 一种检测骨钙素的试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种检测骨钙素的试剂盒，其检测灵敏度高、可靠性好。一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、生物素标记的骨钙素抗体的溶液、辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液和底物溶液；校准品包括浓度为0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、250ng/mL的骨钙素抗原溶液；生物素标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.5mg/mL；辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL。

Description

一种检测骨钙素的试剂盒及使用方法

技术领域

本发明属于医疗器械生物类免疫体外诊断领域，具体涉及一种检测骨钙素的试剂盒及使用方法。

背景技术

骨质疏松症是一种静态疾病：发生骨折前的一些非特异性症状常常被忽视:如腰背痛。大多数病例是在骨折后被诊断的 ，相关的并发症大多为骨折，这一点极大地提高了医疗费用。早期诊断能够帮助减少医疗经费。越来越多的医院科室开设了骨质疏松检测，例如：内分泌科、骨科、妇产科、中医科等，并逐渐开始重视收治骨质疏松病人。目前我国的各级医院主要以骨密度作为辅助诊断标准，尚未全面使用骨代谢标志物指标。

骨代谢标志物之一的骨钙素是在骨中含量十分丰富的非胶原蛋白，其总量占骨组织中非胶原蛋白的15%~20%。骨钙素由成骨细胞合成和分泌，与羟磷灰石有较强的亲和力，约50%沉着于骨基质，其余50%进入血循环。骨钙素的主要生理功能是维持骨的正常矿化速率，抑制异常的羟基磷灰石结晶的形成，抑制软骨矿化速率。

通过血清骨钙素可以了解成骨细胞，特别是新形成的成骨细胞的活动状态。骨钙素值随年龄的变化以及骨更新率的变化而不同。骨更新率越快，骨钙素值越高，反之降低。在原发性骨质疏松中，绝经后骨质疏松症是高转换型的，所以骨钙素明显升高；老年性骨质疏松症是低转换型的，因而骨钙素升高不明显。故可根据骨钙素的变化情况鉴别骨质疏松是高转换型的还是低转换型的，对临床研究骨疾病和内分泌代谢性骨病的发病机理﹑研究骨质成分具有重要意义。

在国内，骨钙素检测临床上主要以国外罗氏公司试剂应用为主，国外进口试剂价格非常昂贵，给患者带来很大的经济负担，不利于在基层普及。因此，有待开发一种骨钙素检测灵敏度高与可靠性好的试剂盒，以降低患者使用成本，并提高推广使用。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种检测骨钙素的试剂盒，其检测灵敏度高、可靠性好；此外，本发明还提供了适用该试剂盒检测骨钙素的方法。

一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、生物素标记的骨钙素抗体的溶液、辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液和底物溶液；

所述校准品包括浓度为0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、250ng/mL的骨钙素抗原溶液；

所述质控品包括浓度为25 ng/mL、75 ng/mL的骨钙素抗原溶液；

所述生物素标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；

所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.5mg/mL；

所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；

所述底物溶液包括溶液A和溶液B，溶液A为含有0.4%鲁米诺，pH9.0的水溶液，溶液B为含有0.06%Na₂B₄O₇ ，pH5.0的水溶液。

进一步的，所述校准品、质控品均由骨钙素抗原与0.1M、pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液配制得到，所述骨钙素抗原购自sigma，货号为O5761。

进一步的，所述生物素标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为1.02mg/ml骨钙素抗体按1:20体积比加入到浓度为10mg/ml的生物素溶液中，然后将其加入到0.01M pH值为7.2的磷酸盐缓冲液中，4℃透析18小时以上，期间换液3-4次，第一次换液间隔2小时以上，其后间隔4小时，透析完成之后再用0.01M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液透析后调整浓度至1μg/mL；骨钙素抗体购自hytest，货号为4OC8-2H9。

进一步的，所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为0.98mg/ml的骨钙素抗体按1:20体积比加入到5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，混合后并纯化，得到辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体，所述纯化是用pH为8-9的碳酸氢盐缓冲液平衡并洗脱，再紫外检测和记录纯化图谱，再用0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液对辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体稀释至1μg/mL；骨钙素抗体购自hytest，货号为4OC8-6F9。

进一步的，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过程为：先将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀；然后在去除磁场的情况下，沉淀用0.01M、pH值为7.3的磷酸盐缓冲液重悬，混匀磁分离；其次，加上磁场，使得链霉亲和素标记的纳米磁微粒沉出；再次，清洗沉淀；最后，清洗后链霉亲和素标记的纳米磁微粒分散于0.01M、pH值为7.3的磷酸盐缓冲液，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒购自GE公司，货号21152104010350。

进一步的，所述试剂盒还包括洗液，所述洗液为含有1%吐温、0.1% Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH7.8。

使用上述试剂盒检测骨钙素的方法，包括以下步骤：

（1）将60μL链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、50μL生物素标记的骨钙素抗体和40μL待检血清样本混匀并反应，反应后置于磁场中静置并去上清，得到第一溶液；

（2）向所述第一溶液中加入60μL辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体混匀并反应，反应后置于磁场中静置并去上清，得到第二溶液；

（3）向所述第二溶液中加入200μL发光底物并反应，测发光强度；

（4）利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤（3）得到的发光强度对照所述标准曲线，计算得出待测血清样本中骨钙素的含量。

进一步的，步骤（1）中所述反应的条件为37℃下反应15分钟，所述静置的时间为2分钟；步骤（1）中还包括对所述第一溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置并去上清，清洗重复3次；

步骤（2）中所述反应的条件为37℃下反应15分钟，所述静置的时间为2分钟，步骤（2）中还包括对所述第二溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置并去上清，清洗重复3次；

步骤（3）中所述反应的条件为37℃下反应5分钟，在化学发光分析/测定仪中测定发光强度。

进一步的，所述步骤（1）、步骤（2）中磁场的强度为10000高斯(G)。

本发明的检测骨钙素的试剂盒检测灵敏度高、特异性能好、变异小，各试剂组分稳定性良好，有效期可至一年以上；该试剂盒在临床研究中与国外进口试剂的符合相关性高达90%以上，且费用仅为其1/2，能够降低患者使用成本，提高其推广使用。

附图说明

图1为本发明的实施例一的检测骨钙素的试剂盒的标准曲线图。

图2 是本发明的骨钙素检测试剂盒与进口试剂的血清样本检测值相关性能拟合曲线。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、生物素标记的骨钙素抗体的溶液、辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的溶液、链霉亲、素标记的纳米磁微粒悬浮液、底物溶液和洗液；

所述校准品包括浓度为0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、250ng/mL的骨钙素抗原溶液，所述骨钙素抗原购自sigma，货号为O5761；校准品由骨钙素抗原与0.1M、pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液配制得到；

所述质控品包括浓度为25 ng/mL、75 ng/mL的骨钙素抗原溶液，所述骨钙素抗原购自sigma，货号为O5761；质控品由骨钙素抗原与0.1M、pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液配制得到；

所述生物素标记的骨钙素抗体的浓度为1μg/mL，所述生物素标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为1.02mg/ml骨钙素抗体按1:20体积比加入到浓度为10mg/ml的生物素溶液（溶剂为二甲基甲酰胺溶液）中，然后将其加入到0.01M pH值为7.2的磷酸盐缓冲液中，4℃透析18小时以上，期间换液3-4次，第一次换液间隔2小时以上，其后间隔4小时，透析完成之后再用0.01M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液透析后调整浓度至1μg/mL；骨钙素抗体购自hytest，货号为4OC8-2H9，浓度为1.02mg/ml；

所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.5mg/mL，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过程为：先将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀；然后在去除磁场的情况下，沉淀用0.01M、pH值为7.3的磷酸盐缓冲液重悬，混匀磁分离；其次，加上磁场，使得链霉亲和素标记的纳米磁微粒沉出；再次，清洗沉淀；最后，清洗后链霉亲和素标记的纳米磁微粒分散于0.01M、pH值为7.3的磷酸盐缓冲液，以去除未与纳米磁微粒结合的链霉亲和素，确保检测效果精确，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒购自GE公司，货号21152104010350；

所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的浓度为1μg/mL，所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为0.98mg/ml的骨钙素抗体按1:20体积比加入到5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，混合后并纯化，得到辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体，纯化过程中选用Sephadexg200柱，首选用pH为8-9的碳酸氢盐缓冲液平衡柱体，然后将标记抗体用加样针缓缓注入柱体（避免气泡产生），最后再用pH为8-9的碳酸氢盐缓冲液洗脱柱体，紫外检测和记录纯化图谱，再用0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液对辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体稀释至1μg/mL；骨钙素抗体购自hytest，货号为4OC8-6F9，浓度为0.98mg/ml；

所述底物溶液包括溶液A和溶液B，溶液A为含有0.4%鲁米诺，pH9.0的水溶液，溶液B为含有0.06%Na2B4O7 ，pH5.0的水溶液；

所述洗液为含有1%吐温、0.1% Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH7.8。

配制缓冲液：

配制0.01M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液，0.1M、pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液，0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液。

0.01M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800mL去离子水，称取2.56g Na₂HPO₄•12H₂O、0.44g NaH₂PO₄•2H₂O和9g NaCl，加入到烧杯中，搅拌使其充分溶解，用HCl或NaOH调节pH值至7.2±0.05，加入质量分数为2%的甘露醇、质量分数为1%的甘油，搅拌0.5h至完全溶解，加去离子水定容至1L。

0.1M、pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800mL去离子水，称取12.11g Tris（三羟甲基氨基甲烷）加入到烧杯中，搅拌使其充分溶解，用HCl或NaOH调节pH值至7.2±0.05，加入质量分数为2%的BSA、质量分数为0.3% 的Proclin 300，搅拌0.5h至完全溶解，加去离子水定容至1L。

0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液的配制：取容量1L的烧杯，加入800mL去离子水，称取9.76g MES（2-(N-吗啉代)乙磺酸）、9g NaCl加入到烧杯中，搅拌使其充分溶液，用HCl或NaOH调节pH值至6.0±0.05，加入质量分数为1%的BSA、质量分数为0.1%的Tween-20，搅拌0.5h至完全溶解，加去离子水定容至1L。

实施例2

分别配制不同浓度的生物素标记的抗体和辣根过氧化物酶标记的抗体，将生物素标记的抗体和辣根过氧化物酶标记的抗体按浓度比分组, 分别测定其骨钙素浓度为0、25、250ng/ml 时的发光值，结果如表1所示。

表1：不同浓度抗试剂浓度对发光值的影响

结果评价：生物素标记的抗体和辣根过氧化物酶标记的抗体浓度分别为1.0μg/ml、1.0μg/ml时，高浓度与低浓度校准品发光值比值最大，故选此浓度比为后续实验的工作浓度。

根据筛选的最佳抗试剂浓度进一步检测不同加样量和不同温浴时间对反应体系的影响，结果如表2、表3所示。

表2 不同抗试剂体积对发光值的影响。

表3 不同抗试剂孵育时间对发光值的影响。

结果评价：抗试剂加样量为60μl时，高浓度与低浓度校准品发光值比值最大，选取60μl作为后续实验抗试剂加样量；抗试剂温浴时间为15 min、30 min时，高浓度与低浓度校准品发光值比值最大，从节省反应时间的角度考虑，选取15 min为后续实验温浴时间。

实施例3

使用上述实施例1的试剂盒检测骨钙素的方法，包括以下步骤：

（1）在检测管中依次加入40μL 待测血清或校准品、60μL生物素标记的骨钙素抗体、50μL链霉亲和素标记的纳米磁微粒，混匀后，在37℃下共孵育15分钟，样本中骨钙素被捕获，并固着在纳米磁微粒表面；然后在外加磁场作用下，静置2分钟，磁微粒沉降下来，去除上清，加入500μL清洗液，去除磁场后，震荡使磁微粒重悬；重复此清洗步骤3次以除去未结合的生物素标记的骨钙素，得到第一溶液；

（2）向第一溶液中加入60μL辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体溶液，混匀，37℃下孵育15分钟；然后外加磁场作用下，静置2分钟，磁微粒沉降下来，去除上清，加入300μL清洗液，去除磁场后，震荡使磁微粒重悬；重复此清洗步骤3次以除去未结合的酶标抗体及其它杂质，得到第二溶液；

（3）向第二溶液中加入200μL酶促化学发光底物，去除磁场，37℃下孵育5分钟，充分混匀后，测定发光值；

（4）数据的处理：通过校准品的浓度值和检测到的发光值，通过四参数非线性拟合获得标准曲线，标准曲线如图1所示，将样本的发光值代入图1所示的标准曲线获得相应的浓度值。本发明的工作原理：待测血清样本与生物素标记的骨钙素抗体、链霉亲和素标记的纳米磁微粒共孵育，待测血清样本中骨钙素与生物素标记的骨钙素抗体特异性结合，同时借助生物素-链霉亲和素放大体系，生物素标记的骨钙素抗体特异性结合到固相载体纳米磁微粒上；外加磁场作用下，磁分离洗涤去除多余的生物素标记的骨钙素抗体；加入辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体，形成生物素标记的骨钙素抗体-骨钙素-骨钙素酶标抗体的免疫复合物结构；外加磁场作用下，多次磁分离洗涤去除未结合的酶标抗体及其它杂质；加入酶促化学发光底物，测定发光强度；使用已知浓度的校准品标准曲线，根据发光强度对照标准曲线，计算得出待测样本中骨钙素的含量。

实施例3

上述实施例1的试剂盒的性能评估（检测方法和结果如下）。

1、骨钙素检测试剂盒的分析性能和稳定性。

1.1 外观

在自然光线下目视检查，试剂盒中的磁微粒试剂摇匀后应为均匀悬浊液，无明显凝集；其他液体试剂溶液组分应澄清，无异物、沉淀物和絮状物。

1.2 最低检测限

对“0”浓度校准品（S0）重复检测20次，计算20次发光值的平均值M和标准差SD，根据A校准点和相邻B校准点之间进行两点回归拟合出一次方程，然后将M+2SD带入上述方程，其所对应的浓度值即为最低检测限。

1.3 准确度

对BGP企业参考品1和BGP企业参考品2各重复检测3次，测量浓度结果的平均值记为（Mi），根据公式（1）分别计算相对偏差（Bi）

公式（1）B_i=（M_i-T）/T×100%

式中：B_i—相对偏差；

M_i—测量浓度的平均值；

T —标定浓度。

公式（1）B_i=（M_i-T）/T×100%

式中：B_i—相对偏差；

M_i—测量浓度的平均值；

T —标定浓度。

1.4 重复性（批内精密度）

对BGP企业参考品1（25 ng/mL的骨钙素抗原溶液）和BGP企业参考品2（75 ng/mL的骨钙素抗原溶液）各重复检测10次，计算10次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV=SD/M×100%，计算变异系数，

1.5 批间差（批间精密度）

用三批次试剂盒分别对同一份BGP企业参考品2（[60~90]ng/mL)重复检测10次，计算30次测量浓度结果的平均值M和标准差SD，根据公式CV=SD/M×100%，计算变异系数。

1.6 37℃热稳定性

取同一批试剂盒3盒放置在37℃恒温箱中，分别在第1天，第4天，第7天取出，取出的试剂盒放置在2-8℃冰箱暂存。37℃破坏1天、4天、7天的试剂测定校准品各3个平行管。对照组为4℃保存的同一批号试剂。测试时每个校准点重复测定2次。计算信号保留率。

1.7 线性

取接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为5种浓度，其中低值浓度的样本须接近线性范围的下限，对每一浓度的样本均重复检测3次，计算其平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r

1.8 抗干扰能力

使用不同浓度的游离胆红素、甘油三酯、生物素、类风湿因子，添加到血清标本中形成干扰样本，每次运行需要进行两次校准曲线的测定，每份样本每次重复测定3次。计算结果偏差，根据结果判定对骨钙素浓度的影响。

1.9 特异性

对β-CrossLaps、甲状旁腺素（PTH）和骨特异性碱性磷酸酶分别用校准品1稀释至1ug/mL左右。然后用3个批次试剂盒检测3个高浓度重组样本。检测结果不高于0.1ng/mL为未检出交叉反应。

分析性能和稳定性评估结果如表4所示。

表4：分析性能和稳定性评估结果

2、请参阅图2，显示了骨钙素检测试剂盒与进口试剂的性能对比。

无锡市人民医院检验科随机选取118例临床血清，采用罗氏骨钙素检测试剂盒（货号12149133 122）和上述实施例1的检测试剂盒进行相关性比较，仪器为Elecsys E601，两者同时测定118例临床血清，以本申请检测值为X值，以罗氏检测值为Y值，应用EXCEL软件进行线性回归分析，计算相关系数R²。

结果评价：直线方程为Y=1.013X，相关系数R²为0.9802。表明本检测系统与进口相关检测系统相关性良好。本发明的试剂盒：

1、以辣根过氧化物酶为标记酶，通过化学反应标记抗体，并使用凝胶层析分离未反应的酶、抗体，提高反应的灵敏度；

2、以免疫磁微粒为固相，以链霉亲和素偶联磁性微球，作为通用的分离试剂，不仅使免疫反应更容易混匀和分离，而且大大提高了反应速度；

3、以化学发光底物HRP为底物，该底物是辉光性底物，而且快速达到平台期，有利于信号的检测，提高了最终试剂盒的灵敏度和特异性性能；并进一步优化了化学发光增强体系，保证了终产品的信号灵敏度高和稳定性好、变异小；

4、HRP底物的优点在于灵敏度高和平台稳定期长。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、生物素标记的骨钙素抗体的溶液、辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的溶液、链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液和底物溶液；

所述校准品包括浓度为0 ng/mL、10 ng/mL、25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL、250ng/mL的骨钙素抗原溶液；

所述质控品包括浓度为25 ng/mL、75 ng/mL的骨钙素抗原溶液；

所述生物素标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；

所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的浓度为0.5mg/mL；

所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体溶液的浓度为1.0μg/mL；

所述底物溶液包括溶液A和溶液B，溶液A为含有0.4%鲁米诺，pH9.0的水溶液，溶液B为含有0.06%Na₂B₄O₇ ，pH5.0的水溶液。

2.根据权利要求1所述的一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于：所述校准品、质控品均由骨钙素抗原与0.1M、pH值为7.2的Tris-HCl缓冲液配制得到，所述骨钙素抗原购自sigma，货号为O5761。

3.根据权利要求1所述的一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于：所述生物素标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为1.02mg/ml骨钙素抗体按1:20体积比加入到浓度为10mg/ml的生物素溶液中，然后将其加入到0.01M pH值为7.2的磷酸盐缓冲液中，4℃透析18小时以上，期间换液3-4次，第一次换液间隔2小时以上，其后间隔4小时，透析完成之后再用0.01M、pH值为7.2的磷酸盐缓冲液透析后调整浓度至1μg/mL；骨钙素抗体购自hytest，货号为4OC8-2H9。

4.根据权利要求1所述的一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于：所述辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体的配制方法为：将浓度为0.98mg/ml的骨钙素抗体按1:20体积比加入到5mg/mL的辣根过氧化物酶溶液，混合后并纯化，得到辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体，所述纯化是用pH为8-9的碳酸氢盐缓冲液平衡并洗脱，再紫外检测和记录纯化图谱，再用0.05M、pH值为6.0的MES缓冲液对辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体稀释至1μg/mL；骨钙素抗体购自hytest，货号为4OC8-6F9。

5.根据权利要求1所述的一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于：所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液的制备过程为：先将链霉亲和素标记的纳米磁微粒用磁分离器沉淀；然后在去除磁场的情况下，沉淀用0.01M、pH值为7.3的磷酸盐缓冲液重悬，混匀磁分离；其次，加上磁场，使得链霉亲和素标记的纳米磁微粒沉出；再次，清洗沉淀；最后，清洗后链霉亲和素标记的纳米磁微粒分散于0.01M、pH值为7.3的磷酸盐缓冲液，所述链霉亲和素标记的纳米磁微粒购自GE公司，货号21152104010350。

6.根据权利要求1所述的一种检测骨钙素的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括洗液，所述洗液为含有1%吐温、0.1% Proclin300的Tris-HCl缓冲液，pH7.8。

7.使用权利要求1~6中任一所述试剂盒检测骨钙素的方法，包括以下步骤：

（1）将60μL链霉亲和素标记的纳米磁微粒悬浮液、50μL生物素标记的骨钙素抗体和40μL待检血清样本混匀并反应，反应后置于磁场中静置并去上清，得到第一溶液；

（2）向所述第一溶液中加入60μL辣根过氧化物酶标记的骨钙素抗体混匀并反应，反应后置于磁场中静置并去上清，得到第二溶液；

（3）向所述第二溶液中加入200μL发光底物并反应，测发光强度；

（4）利用已知浓度的校准品绘制发光强度标准曲线，根据步骤（3）得到的发光强度对照所述标准曲线，计算得出待测血清样本中骨钙素的含量。

8.根据权利要求7所述的检测骨钙素的方法，其特征在于：步骤（1）中所述反应的条件为37℃下反应15分钟，所述静置的时间为2分钟；步骤（1）中还包括对所述第一溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置并去上清，清洗重复3次；

步骤（2）中所述反应的条件为37℃下反应15分钟，所述静置的时间为2分钟，步骤（2）中还包括对所述第二溶液用清洗液进行清洗，置于磁场中静置并去上清，清洗重复3次；

步骤（3）中所述反应的条件为37℃下反应5分钟，在化学发光分析/测定仪中测定发光强度。

9.根据权利要求7所述的检测骨钙素的方法，其特征在于：所述步骤（1）、步骤（2）中磁场的强度为10000高斯。