CN109633178A - 一种骨钙素-n端肽检测试剂及其检测方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种骨钙素‑N端肽检测试剂及其检测方法和应用，检测试剂，包括：免疫复合体，抗体检测体系；免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本复合形成标记后的第一特定抗体—骨钙素‑N端肽—标记后的第二特定抗体；第一特定抗体，第二特定抗体是由一种抗体与骨钙素‑N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素‑N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合；本检测试剂能够特异性检测完全羧化的骨钙素分子全段及其降解后的氨基端N‑端大分子片段，具有灵敏度高，稳定性好等优点，能很好反映骨量流失及骨转化速率。
Description
技术领域
本发明属于试剂诊断研究领域，特别是一种骨钙素-N端肽检测试剂及其检测方法和应用。
背景技术
骨钙素的分子生物学特征如下：
骨钙素(osteocalcin,OC)又称为γ-羧基谷氨酸蛋白(boneγ-carboxyglutamicacid-containing protein,BGP),或骨依赖维生素K蛋白(bone vitamin K dependentprotein)。骨钙素是由骨骼中成熟的成骨细胞合成并分泌的一种非胶原蛋白质，是骨细胞外基质的组成成分，约占骨非胶原蛋白的10％～20％。
人源的骨钙素在翻译后首先形成98个氨基酸残基的前体肽，其由三部分组成：第一部分是含有26个氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合，使得翻译合成的前体肽定位到内质网上进行剪切；第二部分是含有23个氨基酸残基的信号肽，它可以将内质网上剪切后的肽段定位到细胞膜上；最后一部分是含有49个氨基酸残基的成熟形式，其相对分子质量为5800。成熟形式的骨钙素一部分直接分泌到细胞外，另一部分在分泌之前，会在17、21和24三个谷氨酸的位点被羧基化修饰。羧化过程中至少需要两种酶的催化，一个是受体样跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶(osteoblast protein tyrosinephosphatase，OSTPTP),一个是维生素K依赖的谷氨酸羧化酶(γ-glutamyl carboxylase，GGCX)。此外，骨钙素分子43～44位点上的精氨酸结构很不稳定，在体内血液循环中和离体后血清中均会迅速降解，从而形成多种骨钙素片段(1-43)、(44-49)。根据骨钙素的羧化程度，骨钙素可以分为两种：完全羧化的骨钙素和不完全羧化及未羧化的骨钙素。
完全羧化的骨钙素分子在17、21和24位点有三个羧化的谷氨酸残基以及在23、29位点的半胱氨酸形成的一个分子内二硫键。在Ca2+存在的条件下,16～25位的氨基酸残基形成一个紧密的α螺旋结构,这种构象使三个谷氨酸残基突向同一方向排列,促进其与羟基磷灰石的结合，从而沉积在骨基质中发挥作用；而未羧化或是羧化不完全的骨钙素则不存在上述生物学活性。完全羧化的骨钙素和不完全羧化及未羧化的骨钙素被释放到血液中，通过循环作用参与除骨代谢以外的其他代谢调节。此外，骨吸收和溶解时，破骨细胞分泌酸性物质，使得骨基质中pH值降低，沉积在骨基质中骨钙素可能发生脱羧反应，从骨基质中游离出来，释放入血液循环系统，参与骨钙素的代谢调节作用。在正常人群和代谢性骨病患者的血液循环及血清中都存在完全羧化的骨钙素和不完全羧化及未羧化的骨钙素。
未羧化的骨钙素分子(Glu-OC【1-49】)：
肽链：Tyr—Leu—Tyr—Gln—Trp—Leu—Gly—Ala—Pro—Val—Pro—Tyr—Pro—Asp
位点：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
—Pro—Leu—Glu—Pro—Arg—Arg—Glu—Val—Cys—Glu—Leu—Asn—Pro
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
—Asp—Cys—Asp—Glu—Leu—Ala—Asp—His—Ile—Gly—Phe—Gln—Glu
28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
—Ala—Tyr—Arg—Arg—Phe—Tyr—Gly—Pro—Val
41 42 43 44 45 46 47 48 49
序列为：YLYQWLGAPV PYPDPLEPRR EVCELNPDCD ELADHIGFQE AYRRFYGPV；
其中，氨基酸肽链中位点17、21、24为未羧化的谷氨酸，即α-氨基戊二酸(L-glutamic Acid,Glu)。16～25位的氨基酸残基形成一个紧密的α螺旋结构。氨基酸肽链中位点43～44的精氨酸结构很不稳定，离体后迅速降解。
完全羧化的骨钙素分子(Gla-Oc【1-49】)：
肽链：Tyr—Leu—Tyr—Gln—Trp—Leu—Gly—Ala—Pro—Val—Pro—Tyr—Pro—Asp
位点：1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
—Pro—Leu—Gla—Pro—Arg—Arg—Gla—Val—Cys—Gla—Leu—Asn—Pro
15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
—Asp—Cys—Asp—Glu—Leu—Ala—Asp—His—IIe—Gly—Phe—Gln—Glu
28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
—Ala—Tyr—Arg—Arg—Phe—Tyr—Gly—Pro—Val
41 42 43 44 45 46 47 48 49
序列为：
其中，氨基酸肽链中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，即γ-羧基谷氨酸(γ-Carboxyglutamic Acid,Gla)。16～25位的氨基酸残基形成一个紧密的α螺旋结构。氨基酸肽链中位点43～44的精氨酸结构很不稳定，离体后迅速降解。
不完全羧化的骨钙素分子：氨基酸肽链中位点17、21、24中至少有一个位点是未羧化的谷氨酸，即γ-羧基谷氨酸(γ-Carboxyglutamic Acid,Gla)。16～25位的氨基酸残基形成一个紧密的α螺旋结构。氨基酸肽链中位点43～44的精氨酸结构很不稳定，离体后迅速降解。
骨钙素在外周血液中的存在形式是：无论是完全羧化还是不完全羧化及未羧化的成熟的骨钙素分子，都很不稳定，第43～44位点的精氨酸结构被认为可能是胰酶水解的位点，因此在外周血液循环中的骨钙素完整分子大约占36％，氨基端中段大分子片段大约占30％，其他大约34％由氨基端中段和羧基端小分子片段组成。
第一代-第二代-第三代骨钙素检测内容如下：
血清骨钙素检测(第一代)：检测上述完全羧化、不完全羧化和未羧化的的骨钙素分子全段1-49；该测试试剂不能同等摩尔检测骨钙素分子全段1-49和其降解后的骨钙素氨基端中段大分子片段1-43，该检测不能特异性区分氨基酸肽链序列第17、21和24位点完全羧化和未羧化的骨钙素。
骨钙素N端中分子片段检测(第二代)：检测上述完全羧化、不完全羧化和未羧化的骨钙素分子全段1-49和其降解后的骨钙素氨基端中段大分子片段1-43；该检测不能特异性区分氨基酸肽链序列第17、21和24位点完全羧化和未羧化的骨钙素。
骨钙素-N端肽检测(第三代)：检测上述完全羧化的骨钙素分子全段1-49(Gla-Oc【1-49】)和降解后完全羧化的骨钙素氨基端中段大分子片段1-43(Gla-Oc【1-43】)。该测试试剂不检测氨基酸肽链序列第17、21和24位点未羧化的骨钙素，即Glu-Oc(1-49)和Glu-Oc(1-43)。
骨钙素-N端肽定义：
完全羧化的骨钙素(Gla-Oc【1-49】)分子在外周血中不很稳定，羧基端43和44之间的氨基酸链易被蛋白酶水解，裂解后的大片段(氨基酸1-43)称为完全羧化的骨钙素-N端片段(Gla-Oc【1-43】)，其包含了完全羧化的骨钙素分子中17、21和24三个钙结合位点，具有与羟基磷灰石结合的生物学活性及使骨骼组织矿物化的功能。
骨钙素-N端肽指血清中完全羧化的成熟骨钙素(Gla-Oc【1-49】)和完全羧化的骨钙素-N端片段(Gla-Oc【1-43】)的总和，其血清中的浓度比较稳定，检测骨钙素-N端肽能较好地反映近期骨转换以及骨量流失的情况，对骨代谢疾病的诊断、疗效观察有较好的价值。
由于完全羧化后的骨钙素与羟基磷灰石具有较强的亲和力并且含有钙结合位点，在骨组织形成过程中存储于骨基质来维持骨矿化，且破骨时被破骨细胞释放，因此被认定为评价骨形成和骨转换率的特异性指标。而未羧化或是羧化不完全的骨钙素则会被细胞直接释放到血液中，不参与人体骨组织的形成过程，不受骨吸收的影响。
传统的第一代骨钙素检测主要检测所有完整的骨钙素分子，但骨钙素43～44位上的精氨酸结构很不稳定，在外周血中迅速降解，导致样本前处理困难，随着样本储存的时间延长，骨钙素检出浓度下降；而第二代骨钙素检测在第一代基础上，对所有完整的骨钙素分子以及降解后的分子片段都进行检测，骨钙素检出浓度稳定，虽然解决了骨钙素分子易降解的问题，但是对完全羧化和不完全羧化的骨钙素分子未进行特异性区分，导致检测结果无法测定血液中真实参与骨转化的骨钙素含量，作为临床诊断的依据，意义不大。
市场需要针对第三代骨钙素检测的方法，可以特异性检测完全羧化的骨钙素分子全段及其降解后的氨基端N-端大分子片段，具有灵敏度高，稳定性好等优点，能很好反映骨更新及骨转化速率，对骨代谢疾病的诊断、治疗及疗效观察有较高的临床应用价值，本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种骨钙素-N端肽检测试剂及其检测方法和应用，特异性检测完全羧化的骨钙素分子全段及其降解后的氨基端N-端大分子片段，具有灵敏度高，稳定性好等优点，能很好反映骨更新及骨转化速率，对骨代谢疾病的诊断、治疗及疗效观察有较高的临床应用价值。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种骨钙素-N端肽检测试剂，包括：免疫复合体，抗体检测体系；
免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本复合形成标记后的第一特定抗体—骨钙素-N端肽—标记后的第二特定抗体；
第一特定抗体，第二特定抗体是由一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，其中氨基酸序列中的17、21、24三个位点为完全羧化的谷氨酸。
前述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，
第一特定抗体，第二特定抗体是由：
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-15位氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第16-43位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第25-43位氨基酸的表位特异性结合；
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第17-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-43位氨基酸的表位特异性结合。
前述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，
第一特定抗体，第二特定抗体是由抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合形成；
结合位点包括：
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-15位氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽的结合位点位于氨基酸序列中的第16-25位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；
一种抗体与骨钙素-N端肽的结合位点位于氨基酸序列中的第16-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第25-43位氨基酸的表位特异性结合；
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第17-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-43位氨基酸的表位特异性结合。
前述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系，固定相为磁微粒。
前述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，包括：
生物素标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体；
标记物标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体；
骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
待测样本；
链霉亲和素包被的磁微粒；
清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；
全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；
全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。
前述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，包括：
兔骨钙素多克隆抗体；
标记物标记的骨钙素鼠单克隆抗体；
骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
待测样本；
羊抗兔IgG包被的磁微粒；
清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；
全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；
全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。
前述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，包括：
骨钙素单克隆或多克隆抗体包被的磁微粒，
标记物标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体抗体，
骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
待测样本；
清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；
全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；
全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。
前述的一种骨钙素-N端肽检测试剂的检测方法，包括如下步骤：
各添加10-100uL的校准品、质控品和样本到指定的反应杯中；
在各反应杯中添加20-100uL被包被的磁微粒溶液；
在各反应杯中添加20-100uL第一被标记的骨钙素抗体；
在各反应杯中添加20-100uL第二被标记的骨钙素抗体
37℃孵育25-35min；
用清洗液清洗各反应杯3-5次；
在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液A液；
在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液B液；
在全自动化学发光仪上依序测量，画出标准曲线。
一种骨钙素-N端肽检测试剂的应用，
临床体检的步骤包括：
步骤一，体检样本采集和前处理；
步骤二，检测试剂前处理：使用前，将骨钙素-N端肽检测试剂置于室温复温，准备第一被标记的骨钙素抗体，第二被标记的骨钙素抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本，羊抗兔IgG包被的磁微粒，清洗液，全自动免疫检验系统用底物液A液，全自动免疫检验系统用底物液B液；
步骤三，校准品、质控品前处理：
步骤四，在全自动化学发光测定仪上检测，
各添加10-100uL的校准品、质控品和样本到指定的反应杯中；
在各反应杯中添加20-100uL被包被的磁微粒溶液；
在各反应杯中添加20-100uL第一被标记的骨钙素抗体；
在各反应杯中添加20-100uL第二被标记的骨钙素抗体
37℃孵育25-35min；
用清洗液清洗各反应杯3-5次；
在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液A液；
在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液B液；
在全自动化学发光仪上依序测量，画出标准曲线；
步骤五，计算：用化学发光分析仪中的数据处理程序给出标准曲线及样品的浓度值；
步骤六，质控：根据标准曲线读出质控品对应的测定浓度，与标示值范围进行比较，若超出标示的质控范围，说明本次检测不合格，需重新进行检测；
步骤七，根据参考范围和检测结果判定健康情况。
前述的一种骨钙素-N端肽检测试剂的应用，
步骤七，根据参考范围和检测结果判定健康情况；
青壮年期的健康女性正常值范围为6.87-19.89ng/mL，更年期前的健康女性正常值范围为6.55-18.96ng/mL，更年期和老年的健康女性正常值范围为7.79-23.98ng/mL；
青壮年期的健康男性正常值范围为8.90-25.20ng/mL，更年期前的健康男性正常值范围为8.20-20.19ng/mL，更年期和老年健康男性的正常值范围为6.97-22.59ng/mL。
若指标异常升高，表示人体骨转化率升高，人体内骨量在持续动态流失。
本发明的有益之处在于：
本发明采用两个特定的抗体结合骨钙素-N端肽不同抗原决定簇的“双抗体夹心”技术，得到“标记后的第一特定抗体—骨钙素-N端肽—标记后的第二特定抗体”的免疫复合体，能够特异性检测完全羧化的骨钙素分子全段及其降解后的氨基端N-端大分子片段，灵敏度高，稳定性好；
本发明采用全自动磁珠化学发光平台开发出的检测方法，检测步骤简单，时间短；
检测得到的结果能很好反映骨更新及骨转化速率，对骨代谢疾病的诊断、治疗及疗效观察有较高的临床应用价值；
运用本试剂进行一项人体骨钙素浓度研究，发现不同性别、不同年龄段的血清骨钙素水平有一定区别；再对对样本结果采用用百分位数法求得参考范围，这个参考范围能够很好的辅助个人骨代谢的评估和代谢性骨病的诊断。
附图说明
图1是本发明检测方法的一种实施例的流程图；
图2是本发明女性更年期前后骨转化率差异性实验结果统计图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种骨钙素-N端肽检测试剂，包括：免疫复合体，抗体检测体系；
免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本复合形成标记后的第一特定抗体—骨钙素-N端肽—标记后的第二特定抗体；
第一特定抗体，第二特定抗体是由一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，氨基酸序列中的17、21、24三个位点为完全羧化的谷氨酸。
第一特定抗体，第二特定抗体是由抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合形成；结合位点包括以下三种实施方案：
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-15位氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第16-43位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；作为一种优选，另一种抗体与骨钙素-N端肽的结合位点位于氨基酸序列中的第16-25位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸。
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第25-43位氨基酸的表位特异性结合；作为一种优选，一种抗体与骨钙素-N端肽的结合位点位于氨基酸序列中的第16-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第25-43位氨基酸的表位特异性结合。
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第17-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-43位氨基酸的表位特异性结合。
抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系，固定相为磁微粒。有以下三种固相分离实施方案：
(1)“链霉亲和素-生物素”体系；
一种骨钙素-N端肽检测试剂，包括：
生物素标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体。
标记物标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体，作为一种实施例，发光信号标记物可以是吖啶脂，HRP，碱性磷酸酶或鲁米钠；
骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
待测样本；
链霉亲和素包被的磁微粒；
清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，
0.05％-0.5％吐温20；
全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；
全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。
(2)抗体特异性免疫反应体系；
一种骨钙素-N端肽检测试剂，包括：
兔骨钙素多克隆抗体；
标记物标记的骨钙素鼠单克隆抗体；作为一种实施例，标记物可以是吖啶脂，HRP，碱性磷酸酶或鲁米钠；
骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
待测样本；
羊抗兔IgG包被的磁微粒；
清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，
0.05％-0.5％吐温20；
全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；
全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。
(3)抗体直接包被的磁微粒体系；
一种骨钙素-N端肽检测试剂，包括：
骨钙素单克隆或多克隆抗体包被的磁微粒，
标记物标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体抗体，作为一种实施例，标记物可以是吖啶脂，HRP，碱性磷酸酶或鲁米钠；
骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
待测样本；
清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，
0.05％-0.5％吐温20；
全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；
全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。
骨钙素-N端肽检测试剂的使用方法的一种实施例—磁微粒化学发光法；
骨钙素-N端肽检测试剂包括：生物素标记骨钙素抗体，吖啶酯标记骨钙素抗体，人骨钙素校准品，人骨钙素质控品，待测样本，链霉亲和素包被的磁微粒溶液，清洗液，全自动免疫检验系统用底物液A液和B液。清洗液的主要成分为磷酸盐、氯化钠、吐温20。全自动免疫检验系统用底物液A液的主要成分为过氧化氢。全自动免疫检验系统用底物液B液的主要成分为氢氧化钠。人骨钙素校准品和人骨钙素质控品的主要成分为人骨钙素抗原。
如图1所示，骨钙素-N端肽检测试剂的检测方法包括以下步骤：
(1)各添加25ul的校准品、质控品和样本到指定的反应杯中；
(2)在各反应杯中添加25ul链霉亲和素包被的磁微粒溶液；
(3)在各反应杯中添加75ul生物素标记骨钙素抗体；
(4)在各反应杯中添加75ul吖啶酯标记骨钙素抗体
(5)37℃孵育25min；
(6)用清洗液清洗各反应杯3次；
(7)在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液A液；(8)在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液B液；
(9)在全自动化学发光仪上依序测量，画出标准曲线；得到如下表格，根据如下表格画出标准曲线。
骨钙素-N端肽检测试剂的应用，
骨质疏松症定义
骨质疏松症是一种全身性疾病，它的主要特征是骨矿物质含量低下、骨结构破坏、骨强度降低、易发生骨折。2003年至2006年一次全国性大规模流行病学调查显示，50岁以上人群骨质疏松症总患病率女性为20.7％，男性为14.4％。60岁以上人群中骨质疏松症的患病率明显增高，女性尤为突出。按调查估算全国2006年在50岁以上人群中约有6944万人患有骨质疏松症，约2亿1千万人存在低骨量。疼痛、驼背、身高降低和骨折是骨质疏松症的特征性表现。但有许多骨质疏松症患者在疾病早期常无明显的感觉。骨折是骨质疏松症的直接后果，轻者影响机体功能，重则致残甚至致死。常见的骨折部位是腰背部、髋部和手臂。女性一生发生骨质疏松性骨折的危险性(40％)高于乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌的总和，男性一生发生骨质疏松性骨折的危险性(13％)高于前列腺癌。骨质疏松症被称为沉默的杀手，髋部骨折后第一年内由于各种并发症死亡率达到20－25％，存活者中50％以上会有不同程度的残疾。
现阶段检测骨质疏松症的国际标准为骨密度检测。骨密度检测是骨形态学意义的监测，是临床上诊断骨质疏松的定量指标。其反应人体过去较长时间累积的骨代谢状况，提现人体骨量正常或者减少，无法判定人体骨转化率变化或者人体内骨量是否动态流失，对人体即时动态的骨代谢状况评估缺乏灵敏度。
而骨钙素-N端肽是由人体成骨细胞特异性合成，沉积在骨基质中发挥作用，随后在破骨细胞破坏骨基质的过程中被释放到血液循环系统中。因此通过持续检测骨钙素-N端肽的含量，可以反映人体骨转化率的变化，监测人体内骨量是否持续动态的流失。
应用科室如下：
体检科：骨钙素检测可预测是否有早期骨量丢失，是早期骨代谢异常的指标。骨质疏松症发病率位居世界常见病第四位，骨质疏松症不能靠自我感觉来发现，出现身高缩短，腰背酸痛，骨折等症状就已经是临床骨质疏松症，不可逆。所以正确的骨健康管理宜早不宜迟，建议所有35岁以上人群都进行骨钙素-N端肽的检测，用以检测自身骨量流失情况，及时把握治疗最佳时期。
骨科：骨折4-6周后病人骨钙素明显高于正常水平，反映骨折处于愈合过程。因此，骨钙素N-端肽作为骨转换率的有效指标，适用于跟踪监测骨折病人的骨愈合状况，评估骨折病人的骨愈合能力，判断是否存在延迟愈合情况。
妇科：围更年期妇女由于雌激素水平下降易发生骨质疏松症。在发现早期骨质疏松症方面，骨钙素比骨密度更灵敏，因此，骨钙素可用于诊断围更年期妇女的早期骨质疏松。当骨钙素-N端肽呈阳性，不论骨密度处于骨量减少或者骨质疏松，都是临床上抗骨吸收治疗的指标。同时，骨钙素-N端肽可用于骨质疏松治疗的疗效评估，结合第一次检测值(基线值)和治疗后的定期检测值(监测值)，可评估治疗方案的合理性及有效性。而运用骨密度进行疗效评估，须在治疗开始1年后才具有意义，相对滞后。
内分泌科：用于原发性骨质疏松(高骨转换率引起的骨质疏松)以及继发性骨质疏松症(包括甲状旁腺亢进、甲状腺激素亢进、活性维生素D缺乏、长期使用糖皮质激素、肾上腺皮质增生等引起的骨质疏松)的诊断治疗。对于原发性高骨转换率的骨质疏松，骨钙素-N端肽增高是临床上抗骨吸收治疗的指标。同时，骨钙素-N端肽可用于骨质疏松治疗的疗效评估(见妇科说明)。
老年科：老年科80％的患者都患有骨质疏松症，应用骨钙素指标可进行老年性骨质疏松分型。老年性骨质疏松症多为原发性骨质疏松症，又可分为两个型：高转换型骨质疏松症和低转换型骨质疏松症。运用骨钙素可根据骨质疏松分型确定治疗方案：高转换型骨质疏松指导用抗骨吸收治疗，低转换型指导用基础治疗或是合成代谢治疗。同时，骨钙素-N端肽可用于骨质疏松治疗的疗效评估(见妇科说明)。
肿瘤科：骨是晚期恶性肿瘤最常见的转移部位，骨转移常见于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌等。骨钙素与肿瘤骨转移间存在密切关联，骨转移发生时其水平改变可早于影像学检查所发现的形态学改变。连续监测骨钙素动态变化，有助于抗肿瘤治疗的疗效评估。骨转移时骨钙素呈增高趋势，其水平随转移病灶数目的增加而增加。
产科：骨钙素对于孕、产妇主要运用是监测,并有助于指导补钙剂量。孕、产妇在这期间体内激素水平容易发生紊乱并在产后一段时间内自动回复，检测骨钙素指标虽不能指导临床用药，但能指导孕产妇合理饮食及适当户外运动。骨钙素-N端肽适用于产妇怀孕开始至产后半年，建议每3个月监测一次。
肾内科：在肾内科多用肾透析治疗患者，慢性肾功能衰竭时，由于钙、磷及维生D代谢障碍，继发甲状旁腺机能亢进，酸碱平衡紊乱等因素而引起肾性骨病，此时可用骨钙素水平和PTH水平来指导患者临床用药，调节维生素D的治疗剂量。
皮肤科：糖皮质激素药物作为皮肤病最常用的药物之一。然而，使用糖皮质激素可导致成骨细胞活性降低，血清骨钙素-N端肽水平明显下降，是检测成骨活性降低的最重要的指标，也是最灵敏的指标。同时破骨细胞的活跃度反而相对增高，这种成骨细胞和破骨细胞的不平衡导致了严重的继发性骨质疏松症，不仅影响松质骨也同时影响皮质骨，由它引起的脆性骨折的危险性比更年期骨质疏松和老年性骨质疏松更大。近年来，糖皮质激素性骨质疏松发病率不断上升，在骨质疏松症中其发病率居于第三位，仅次于绝经后骨质疏松及老年性骨质疏松。所以建议用药同时进行骨钙素-N端肽测定，监测骨转换率、骨量流失情况及指导糖皮质激素用药剂量，必要时可联合二磷酸盐类药物进行抗骨吸收治疗。
临床体检的步骤包括：
步骤一，体检样本采集和前处理；检验机构对体检人员进行正规采血，采血后对血样进行离心处理，骨钙素-N端肽检测适用于新鲜无溶血的血清，严重溶血样本不宜使用。血清样本在15-25℃可保存3天，2-8℃可保存5天，-20℃可保存3个月，仅限冻融3次。样本在运输时应避免剧烈震动。
步骤二，检测试剂前处理：使用前，将骨钙素-N端肽检测试剂置于室温复温，准备第一被标记的骨钙素抗体，第二被标记的骨钙素抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本，羊抗兔IgG包被的磁微粒，清洗液，全自动免疫检验系统用底物液A液，全自动免疫检验系统用底物液B液；作为一种实施例，第一被标记的骨钙素抗体为生物素标记骨钙素抗体，第二被标记的骨钙素抗体为吖啶酯标记骨钙素抗体。
步骤三，校准品、质控品前处理：校准品、质控品每管添加0.5mL的蒸馏水或去离子水溶解，静置5分钟，上下颠倒混匀，确保所有的固体物溶解完全。使用完毕后应立即置于-15℃保存，仅限冻融3次。
步骤四，在全自动化学发光测定仪上检测，
，按下表程序进行加样和操作(单位：μL)：
在全自动化学发光仪上依序测量，画出标准曲线；
步骤五，计算：用化学发光分析仪中的数据处理程序给出标准曲线及样品的浓度值；
步骤六，质控：根据标准曲线读出质控品对应的测定浓度，与标示值范围进行比较，若超出标示的质控范围，说明本次检测不合格，需重新进行检测；
步骤七，根据参考范围和检测结果判定健康情况。
参考范围的确定方法如下：
运用本试剂对1,175例样本(其中男性598例，平均年龄38.70岁±标准差12.86岁；女性577例，平均年龄38.76岁±标准差11.62岁)进行一项人体骨钙素-N端肽浓度研究。结果表明，不同性别、不同年龄段的骨钙素-N端肽水平有一定区别。对样本结果采用用百分位数法求得参考范围，如下表所示：
注：上述临床样本要求：即未患有重大器质性疾病，如慢性肾炎、慢性肾功
能衰竭、慢性肝病、肿瘤、心血管系统疾病等，但不排除患有代谢性骨病。
参考范围的应用和检测结果的解释：
骨钙素-N端肽检测试剂对于检验结果的解释如下：
青壮年期的健康女性正常值范围为6.87-19.89ng/mL，更年期前的健康女性正常值范围为6.55-18.96ng/mL，更年期和老年的健康女性正常值范围为7.79-23.98ng/mL；青壮年期的参考范围可以用于辅助青壮年个人骨代谢的评估和代谢性骨病的诊断；更年期前参考范围可以用于辅助更年期前个人骨代谢的评估和代谢性骨病的诊断；更年期和老年参考范围可以用于辅助更年期后个人骨代谢的评估和代谢性骨病的诊断。
健康男性正常值范围为8.90-25.20ng/mL，更年期前的健康男性正常值范围为8.20-20.19ng/mL，更年期和老年的健康男性正常值范围为6.97-22.59ng/mL；
青壮年期的在正常值范围的结果解释：骨转换率正常，没有明显骨量流失。
高于正常值范围的结果解释：
①患有甲状腺功能亢进、甲状旁腺功能亢进、慢性肾功能不全、Paget病等。
②部分成年人因运动、骨折、妊娠、抽烟、日晒不足等因素可导致指标相对升高。
③若为中、晚期恶性肿瘤患者，结果偏高可能提示肿瘤发生骨转移。
④排除以上三种情况下，提示骨转换率增高，骨量持续丢失，可能患有骨质疏松症。建议：1、检测骨密度，鉴别早期骨质疏松和临床骨质疏松；2、专科就诊，按医嘱进行抗骨吸收治疗，并适量补钙及维生素D。
低于正常值范围的结果解释：
①患有甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退等。
②使用糖皮质激素等。
△本发明的检测试剂的临床使用数据如下：
在上海地区某医院进行本公司的第三代骨钙素-N端肽测定试剂临床项目的对比试验。对比试剂选择罗氏公司的骨钙素N端中分子片段(N-MID)检测试剂。试验地点为该院的检验科。试验样本为随机选取5天内体检的50周岁以上汉族人群血液样本。样本例数为73例。该院检验科采用静脉采血，并将血液样本离心，取离心后样本的血清进行试验。样本检验过程严格按照本公司的第三代骨钙素-N端肽测定试剂说明书要求、罗氏公司的骨钙素N端中分子片段(N-MID)检测试剂说明书要求分别进行。为验证试验结果的准确性，对样本选取对象进行了骨密度检测。以下为本次临床试验的结果：
结果分析：
XJGla-OC是本公司研制的检测试剂的测试结果，A公司是罗氏公司的检测试剂的测试结果；
受试样本均未经过骨质疏松症相关治疗，经过骨密度测试和相关诊断为骨质疏松症的大约占50％。
A公司测试结果显示样本均在其正常范围内，没有阳性样本。而用本公司的第三代骨钙素-N端肽测定试剂盒检测结果大约有23％左右的阳性样本，且和样本骨密度测试等相关诊断结果一致性较高。故本产品在人体骨转换率、骨量流失的检测等方面效果较好。
女性在更年期前后骨转化率差异性临床验证实验：
在上海地区某医院进行本公司的第三代骨钙素-N端肽测定试剂的临床试验。试验目的是考察更年期前后女性的骨转化率变化情况。试验地点为该院的检验科。试验样本为随机选取近期体检的40-59周岁的汉族女性血液样本。样本例数为2164例。该院检验科采用静脉采血，并将血液样本离心，取离心后样本的血清进行试验。样本检验过程严格按照本公司的第三代骨钙素-N端肽测定试剂说明书要求进行。以下为本次临床试验的样本检验结果：
对上述结果进行显著性分析，统计学中以P值为数据显著性检验指标，一般以P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有显著统计学差异，P<0.001为有极其显著的统计学差异。下表为上述各年龄段数据的P值统计：
| 显著性(P值) | 40-43 | 44-47 | 48-51 | 52-55 | 56-59 |
| 40-43 | — | 0.589 | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| 44-47 | — | — | 0.000 | 0.000 | 0.000 |
| 48-51 | — | — | — | 0.000 | 0.082 |
| 52-55 | — | — | — | — | 0.600 |
| 56-59 | — | — | — | — | — |
为直观表现上述各年龄段显著性指标(P值)，做了上述数据的条形统计图，如图2所示；
结果分析：
以48-51岁年龄段为界限，骨钙素-N端肽的平均值数据在48-51岁年龄段前后有显著的差异性，而48-51岁年龄段为女性的更年期年龄段，说明女性在更年期前后骨转化率会有显著的差异性。
△检测限实验：
取零浓度校准品作为样本测定其相对光强度值(xi)，重复测定20次，得出20次测量结果的相对光强度值(xi)，求出平均值按公式(1)计算标准差(SD)，得出+2SD所对应的相对光强度值。根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-相对光强度值结果求出一次回归方程y＝a+bx，将+2SD所对应的相对光强度值代入上述方程，求对应的浓度值，即为检测限,根据行业标准及设计要求，检测限应不大于0.5ng/mL。
根据上述方法，本实验用零浓度校准品L1进行第三代骨钙素-N端肽测定试剂盒检测限实验。实验结果如下：
上述结果表明，第三代骨钙素-N端肽测定试剂盒检测限为0.09ng/mL，远低于0.5ng/mL的标准，说明试剂盒的检测灵敏度较高。
重复性
取2个不同浓度的样本或质控品，各重复检测10次，分别求出平均值按公式(1)计算标准差(SD)，根据公式(3)分别计算变异系数(CV),根据行业标准及设计要求，变异系数(CV)应不大于10％。
根据上述方法，本实验用质控品1和质控品2进行第三代骨钙素-N端肽测定试剂盒重复性实验。实验结果如下：
上述结果表明，第三代骨钙素-N端肽测定试剂盒重复性的平均CV为6.2％，低于10％的标准，说明试剂盒的稳定性较好。
本发明提供提供一种骨钙素-N端肽检测试剂及其检测方法和应用，特异性检测完全羧化的骨钙素分子全段及其降解后的氨基端N-端大分子片段，具有灵敏度高，稳定性好等优点，能很好反映骨更新及骨转化速率，对骨代谢疾病的诊断、治疗及疗效观察有较高的临床应用价值。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 嘉兴行健生物科技有限公司
<120> 一种骨钙素-N端肽检测试剂及其检测方法和应用
<141> 2019-01-30
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 49
<212> PRT
<213> human genes
<400> 1
Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu
1 5 10 15
Glu Pro Arg Arg Glu Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu
20 25 30
Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro
35 40 45
Val
<210> 2
<211> 49
<212> PRT
<213> human genes
<220>
<221> SIMILAR
<222> (17)..(17)
<223> 羧化
<220>
<221> SIMILAR
<222> (21)..(21)
<223> 羧化
<220>
<221> SIMILAR
<222> (24)..(24)
<223> 羧化
<400> 2
Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu
1 5 10 15
Glu Pro Arg Arg Glu Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu
20 25 30
Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro
35 40 45
Val
Claims (10)
1.一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，包括：免疫复合体，抗体检测体系；
所述免疫复合体由标记后的第一特定抗体，标记后的第二特定抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本复合形成标记后的第一特定抗体—骨钙素-N端肽—标记后的第二特定抗体；
所述第一特定抗体，第二特定抗体是由一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的氨基酸的表位特异性结合，其中氨基酸序列中的17、21、24三个位点为完全羧化的谷氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，
所述第一特定抗体，第二特定抗体是由：
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-15位氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第16-43位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第25-43位氨基酸的表位特异性结合；
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第17-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-43位氨基酸的表位特异性结合。
3.根据权利要求2所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，
所述第一特定抗体，第二特定抗体是由抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中氨基酸位点进行表位特异性结合形成；
结合位点包括：
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-15位氨基酸的表位特异性结合，另一种抗体与骨钙素-N端肽的结合位点位于氨基酸序列中的第16-25位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；
一种抗体与骨钙素-N端肽的结合位点位于氨基酸序列中的第16-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸，另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第25-43位氨基酸的表位特异性结合；
一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第17-24位氨基酸的表位特异性结合，其中位点17、21、24为完全羧化的谷氨酸；另一种抗体与骨钙素-N端肽氨基酸序列中的第1-43位氨基酸的表位特异性结合。
4.根据权利要求1所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，所述抗体检测体系为磁珠化学发光检测体系，固定相为磁微粒。
5.根据权利要求4所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，包括：
生物素标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体；
标记物标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体；
骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
待测样本；
链霉亲和素包被的磁微粒；
清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；
全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；
全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。
6.根据权利要求4所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，包括：
兔骨钙素多克隆抗体；
标记物标记的骨钙素鼠单克隆抗体；
骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
待测样本；
羊抗兔IgG包被的磁微粒；
清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；
全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；
全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。
7.根据权利要求4所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂，其特征在于，包括：
骨钙素单克隆或多克隆抗体包被的磁微粒，
标记物标记的骨钙素单克隆或多克隆抗体抗体，
骨钙素校准品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
骨钙素质控品，成分包括：人骨钙素抗原Gla-Oc【1-49】或人骨钙素抗原Gla-Oc【1-43】；
待测样本；
清洗液，清洗液的成分包括：0.01mol/L-0.2mol/L磷酸盐，0.5mol/L-2mol/L氯化钠，0.05％-0.5％吐温20；
全自动免疫检验系统用底物液A液，成分包括：过氧化氢；
全自动免疫检验系统用底物液B液，成分包括：氢氧化钠。
8.根据权利要求5-7任一项所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
各添加10-100uL的校准品、质控品和样本到指定的反应杯中；
在各反应杯中添加20-100uL被包被的磁微粒溶液；
在各反应杯中添加20-100uL第一被标记的骨钙素抗体；
在各反应杯中添加20-100uL第二被标记的骨钙素抗体
37℃孵育25-35min；
用清洗液清洗各反应杯3-5次；
在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液A液；
在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液B液；
在全自动化学发光仪上依序测量，画出标准曲线。
9.一种骨钙素-N端肽检测试剂的应用，其特征在于，
临床体检的步骤包括：
步骤一，体检样本采集和前处理；
步骤二，检测试剂前处理：使用前，将骨钙素-N端肽检测试剂置于室温复温，准备第一被标记的骨钙素抗体，第二被标记的骨钙素抗体，骨钙素校准品，骨钙素质控品，待测样本，羊抗兔IgG包被的磁微粒，清洗液，全自动免疫检验系统用底物液A液，全自动免疫检验系统用底物液B液；
步骤三，校准品、质控品前处理：
步骤四，在全自动化学发光测定仪上检测，
各添加10-100uL的校准品、质控品和样本到指定的反应杯中；
在各反应杯中添加20-100uL被包被的磁微粒溶液；
在各反应杯中添加20-100uL第一被标记的骨钙素抗体；
在各反应杯中添加20-100uL第二被标记的骨钙素抗体
37℃孵育25-35min；
用清洗液清洗各反应杯3-5次；
在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液A液；
在各反应杯中添加100ul全自动免疫检验系统用底物液B液；
在全自动化学发光仪上依序测量，画出标准曲线；
步骤五，计算：用化学发光分析仪中的数据处理程序给出标准曲线及样品的浓度值；
步骤六，质控：根据标准曲线读出质控品对应的测定浓度，与标示值范围进行比较，若超出标示的质控范围，说明本次检测不合格，需重新进行检测；
步骤七，根据参考范围和检测结果判定健康情况。
10.根据权利要求9所述的一种骨钙素-N端肽检测试剂的应用，其特征在于，步骤七，根据参考范围和检测结果判定健康情况；
青壮年期的健康女性正常值范围为6.87-19.89ng/mL，更年期前的健康女性正常值范围为6.55-18.96ng/mL，更年期和老年的健康女性正常值范围为7.79-23.98ng/mL；
青壮年期的健康男性正常值范围为8.90-25.20ng/mL，更年期前的健康男性正常值范围为8.20-20.19ng/mL，更年期和老年健康男性的正常值范围为6.97-22.59ng/mL；
若指标异常升高，表示人体骨转化率升高，人体内骨量在持续动态流失。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110488025A (zh) * | 2019-09-24 | 2019-11-22 | 嘉兴行健生物科技有限公司 | 一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠道健康检测的用途 |
| CN111707636A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-09-25 | 西安交通大学 | 结合傅里叶变换红外光谱和化学计量学分析鉴别生前死后骨折的方法 |
| CN112162099A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-01-01 | 安徽大千生物工程有限公司 | 基于胶乳增强免疫比浊法测定n-mid的试剂盒及其制备方法 |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5789149A (en) * | 1993-11-29 | 1998-08-04 | B.R.A.H.M.S. Diagnostica Gmbh | Method for stabilizing osteocalcin in human serum or plasma samples for the determination of the osteocalcin content therein, and instruments and sample vessels for carrying out said method |
| CN102154217A (zh) * | 2011-01-25 | 2011-08-17 | 南京农业大学 | 一种重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体及其应用 |
| US20160045571A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-02-18 | Univ Columbia | Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders |
| CN106353506A (zh) * | 2016-08-12 | 2017-01-25 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 一种测定骨钙素含量的试剂盒及其测试方法 |
| CN107831314A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-23 | 太原瑞盛生物科技有限公司 | 一种n‑中端骨钙素化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
| CN109061175A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-21 | 江南大学 | 一种检测骨钙素的试剂盒及使用方法 |
-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5789149A (en) * | 1993-11-29 | 1998-08-04 | B.R.A.H.M.S. Diagnostica Gmbh | Method for stabilizing osteocalcin in human serum or plasma samples for the determination of the osteocalcin content therein, and instruments and sample vessels for carrying out said method |
| CN102154217A (zh) * | 2011-01-25 | 2011-08-17 | 南京农业大学 | 一种重组鸡骨钙素成熟蛋白单克隆抗体及其应用 |
| US20160045571A1 (en) * | 2013-03-15 | 2016-02-18 | Univ Columbia | Osteocalcin as a treatment for cognitive disorders |
| CN106353506A (zh) * | 2016-08-12 | 2017-01-25 | 江苏泽成生物技术有限公司 | 一种测定骨钙素含量的试剂盒及其测试方法 |
| CN107831314A (zh) * | 2017-10-31 | 2018-03-23 | 太原瑞盛生物科技有限公司 | 一种n‑中端骨钙素化学发光检测试剂盒及其制备方法 |
| CN109061175A (zh) * | 2018-06-29 | 2018-12-21 | 江南大学 | 一种检测骨钙素的试剂盒及使用方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NOBUTO KOYAMA等: "A one step sandwich enzyme immunoassay for 3,-carboxylated osteocalcin using monoclonal antibodies", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110488025A (zh) * | 2019-09-24 | 2019-11-22 | 嘉兴行健生物科技有限公司 | 一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠道健康检测的用途 |
| CN111707636A (zh) * | 2020-05-22 | 2020-09-25 | 西安交通大学 | 结合傅里叶变换红外光谱和化学计量学分析鉴别生前死后骨折的方法 |
| CN111707636B (zh) * | 2020-05-22 | 2021-07-13 | 西安交通大学 | 结合傅里叶变换红外光谱和化学计量学分析鉴别生前死后骨折的方法 |
| CN112162099A (zh) * | 2020-09-28 | 2021-01-01 | 安徽大千生物工程有限公司 | 基于胶乳增强免疫比浊法测定n-mid的试剂盒及其制备方法 |
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