KR102404986B1 - 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 이의 용도 - Google Patents

남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 출원은 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법 및 이의 용도 {A Method for providing information for an andropause diagnosis and uses thereof}
본 출원은 남성 갱년기 진단 방법에 관한 것이다.
본 출원은 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
고령화 사회가 되면서 사회 정책적인 면에서도 많은 변화가 있지만, 의료면에서도 많은 변화를 예측할 수가 있다. 특히, 비뇨기과적으로는 전립선 비대증이나 전립선 암과 성기능장애 및 남성갱년기 증상 같은 남성호르몬과 관련된 질환이 증가할 것으로 예상하고 있다.
여성은 여성호르몬이 월중변화를 보이다가 50대 초반에 폐경이 되면서 완전히 감소한다. 이에 반면, 남성은 여성과 달리 나이가 들면서 남성호르몬이 서서히 감소하기 때문에 노인이 되더라도 일정 수준의 호르몬은 계속 분비가 되기 때문에 남성갱년기 증상이 뚜렷하지 않을 뿐만 아니라, 모든 사람에게서 나타나지 않는다.
현재까지 남성갱년기를 진단하는 방법으로는 남성 갱년기 증상에 대한 설문지(Aging male symptoms, AMS)를 이용하는 방법, 혈중 총 테스토스테론 수치(total testosterone, TT)를 이용하는 방법 등이 있다.
혈중 총 테스토스테론 검사방법은 복잡하고 오차가 큰 단점이 있고, 혈중 테스토스테론 농도와 남성갱년기 증상과의 상관관계가 없거나 매우 낮은 것으로 보고되고 있다(Hanus M et al., 2006; Miwa Y et al., 2006; T'Sjoen G et al., 2004; Spetz AC et al., 2007).
설문지를 이용하는 방법은 설문지 내 질문에 대해 주관적으로 판단하여 체크하여 이를 점수화 하기 때문에 객관적이지 못하고, 설문지의 질문만으로는 남성갱년기를 판단하기에는 한계가 있다.
최근 타액을 이용하여 호르몬을 측정하는 방법이 개발되었다. 타액에는 많은 종류의 호르몬이 존재하며, 타액 채취는 비침습적이기 때문에 의료진의 도움없이 장소 및 시간에 한계 없이 반복적으로 시료를 채취할 수 있다.
하지만 테스토스테론의 농도를 근거로 남성 갱년기를 판단할 수 있는 기준과 방법은 아직까지 제시되지 않았다.
따라서, 타액 내 테스토스테론의 농도를 근거로 남성 갱년기를 판단할 수 있는 기준 및 정보를 제공하는 방법의 개발이 요구되어진다.
1. 한국 등록특허 제1228322호 2. 일본 공개특허 제2007-024822호
Hanus M, Matouskovα M, Stαrka L, Hill M. Hormonal homeostasis in a group of 216 aging Czech males and correlation with responses to a questionnaire of the University of St Louis. Aging Male. 2006;9:103-10. Miwa Y, Kaneda T, Yokoyama O. Correlation between the Aging Males' Symptoms Scale and sex steroids, gonadotropins, dehydroepiandrosterone sulfate, and growth hormone levels in ambulatory men. J Sex Med. 2006;3:723-726. T'Sjoen G, Goemaere S, De Meyere M, Kaufman JM. Perception of males' aging symptoms, health and well-being in elderly community-dwelling men is not related to circulating androgen levels. Psychoneuroendocrinology. 2004;29:201-14. Spetz AC, Palmefors L, Skobe RS, Strφmstedt MT, Fredriksson MG, Theodorsson E, Hammar ML. Testosterone correlated to symptoms of partial androgen deficiency in aging men (PADAM) in an elderly Swedish population. Menopause. 2007;14:999-1005.
본 출원의 일 과제는, 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 특히, 타액 내 테스토스테론 수치를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 출원의 다른 과제는, 남성 갱년기를 진단하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원은 전술한 상기 과제를 해결하기 위하여, 타액 내 테스토스테론 수치를 이용한다.
이를 위해, 일 양태로 남성 갱년기 정보 제공을 위한 방법이 제공된다.
상기 방법은,
(a) 대상 남자가 동일한 날에 채취한 기상 직후의 제 1타액, 기상 후 30분의 제 2타액 및 기상 후 60분의 제 3타액으로 구성된 타액세트를 준비함;
(b) 상기 제 1타액 및 제 2타액의 코티졸 농도를 각각 측정함;
(c) 상기 (b)에서 측정한 제 1타액의 코티졸 농도와 제 2타액의 코티졸 농도를 비교하여 증가량이 적어도 2.5 nmol/L 이상인 타액세트는 테스토스테론 측정 샘플로 선정함;
(d) 상기 테스토스테론 측정 샘플로 선정된 타액세트의 제 1타액의 테스토스테론, 제 2타액의 테스토스테론 및 제 3타액의 테스토스테론 농도를 각각 측정함;
(e) 상기 제1 타액, 제2 타액 및 제3타액의 테스토스테론 농도값을 적분하여 테스토스테론의 적분값(area under the curve for testosterone awakening response, TARauc)을 수득함;
을 포함하는 방법을 제공한다.
이 때, 상기 방법은,
상기 테스토스테론 적분값으로,
적분값이 8 nmol/L 이상일 경우, 남성 갱년기가 없거나 미약함으로 진단;
적분값이 6.2-7.2 nmol/L 일 경우, 남성 갱년기 경증 단계로 진단;
적분값이 4.8-5.6 nmol/L 일 경우, 남성 갱년기 중증 단계로 진단;
적분값이 3.3-4.6 nmol/L 일 경우, 남성 갱년기 고위험 단계로 진단;
하는 방법을 제공한다.
상기 방법은,
남성의 성기능 저하 여부, 신체 기능 저하 여부 또는 정신 기능 저하 여부에 대한 정보를 포함하는 방법을 제공한다.
본 출원에 따르면 다음과 같은 효과가 발생된다.
첫째, 본 출원에 의하면, 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공을 제공할 수 있게 된다.
둘째, 본 출원에 의하면, 상기 제공된 정보를 이용하여 남성 갱년기를 진단하는 방법을 제공할 수 있게 된다.
도 1은 본 출원의 실시예에서 측정된 테스토스테론의 적분값(area under the curve for testosterone awakening response, TARauc) 수치를 이용하여 남성 갱년기 지수 및 기능저하 지수를 판단하는 그래프이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 출원에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 출원의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 출원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 논문 및 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시에는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 출원에서 용어 "남성 갱년기(andropause 또는 male climacteric 또는 partial androgen deficiency in aging male, PADAM)"는 남성이 성기능저하 증상을 호소하거나, 남성호르몬으로 알려진 테스토스테론의 수치가 저하된 상태를 의미한다. 이 때, 성기능저하 증상은 성욕 감소, 성 행위에 대한 불안감 및 두려움, 발기능 저하 등일 수 있다. 용어 남성 갱년기는 남성 우울증과 상호 교환하여 사용할 수 있다.
본 출원에서 용어 "진단"은 특정 병리 또는 생리 상태의 존재 또는 활성 등을 확인하는 것을 의미한다.
본 출원에서 용어 "대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다. 본 출원에서는 인간을 대상으로 하였다.
본 출원에서 "시료" 또는 "샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 액형 조직일 수 있다. 본 출원에서는 타액(saliva)을 사용한다.
본 출원에서 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
지금까지 남성 갱년기를 진단하는 방법으로 사용되는 것은 혈중 총 테스토스테론 수치를 측정하여 이를 토대로 진단하는 것이다.
하지만, 이는 검사방법이 복잡할 뿐만 아니라 오차가 크고, 정확도가 매우 낮다. 또한, 최근에는 혈중 테스토스테론 농도와 남성 갱년기 증상과의 상관관계가 없거나 매우 낮은 것으로 보고되어지고 있다.
한편, 혈액이 아닌 타액 내 호르몬을 측정하여 남성 갱년기를 진단하고자 하는 시도가 있었다.
한국 등록특허 제1228322호에서는 타액 중에 존재하는 스테로이드 호르몬의 양을 LC/ESI-MS/MS로 정량 할 수 있는 방법이 개시되어 있다.
일본 공개특허 제2007-024822호에서는 혈액 또는 타액 중에 존재하는 테스토스테론 및 코르티솔(cortisol)의 양을 LC/MS를 사용하여 수치를 측정 후, 이를 남성 갱년기 또는 우울증을 감별하는 방법이 개시되어 있다.
이와 같이, 현재까지 보고된 문헌들에서는 남성갱년기의 진단을 위하여 타액 내 테스토스테론 수치만을 사용하고 있을 뿐, 코티졸 농도를 고려하여 테스토스테론 농도를 측정할 샘플을 선정하지 않는다. 또한, 테스토스테론 농도값을 객관적 수치로 전환시킬 수 있는 연산식이 없기 때문에 세부적인 정보를 수득하기 어렵다.
따라서, 타액 내 테스토스테론 수치를 남성 갱년기 진단을 위해 수치화 할 수 있는 연산식 개발이 필요하며, 나아가 타액 내 테스토스테론 수치만으로 남성 갱년기를 진단하는 방법을 찾을 필요가 있다.
● 본 출원의 기술적 특징
본 출원은 혈액이 아닌 타액 내 테스토스테론 수치를 이용하는 것이다. 특히, 측정되는 타액은 기상 후 1시간 이내로 수득하는 것을 특징으로 한다. 특히, 기상 후 1시간 이내로 총 3번에 걸쳐서 타액을 수득한다. 구체적으로, 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 60분 각각의 타액을 수득한다.
또한, 상기 타액으로부터 테스토스테론 수치를 측정하기 위한 타액을 선정하기 위해 타액 내 코티졸 농도를 측정하여 이로부터 테스토스테론 수치를 측정하기 위한 타액을 선정하는 것을 특징으로 한다.
본 출원은 상기 코티졸 농도를 고려하여 선정된 대상 타액세트에서 측정한 테스토스테론 농도값에 대한 적분값을 활용하여 남성갱년기 진단을 위한 정보를 수득한다.
그리고 측정된 테스토스테론 농도의 수치를 적분화하는 것을 특징으로 한다. 테스토스테론 수치를 적분화한 값으로 남성 갱년기 진단에 적용할 수 있다. 이를 위해, 테스토스테론 적분화 수치를 남성 갱년기 증상별 연산식에 대입하여 남성 갱년기 정도를 진단할 수 있는 연산식을 개발하였다.
따라서, 본 출원은 기상 후 1시간 이내 타액의 테스토스테론 농도의 수치를 적분화한 값을 이용한 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 또한, 상기 정보를 이용한 남성 갱년기 진단 방법인 것을 특징으로 한다.
상기 남성 갱년기 정보를 제공하는 방법은 남성의 성기능 저하 여부, 신체 기능 저하 여부 또는 정신 기능 저하 여부를 확인할 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.
그러므로, 본 출원은 다음과 같은 기술적 특징을 보유한다.
첫째, 비침습적인 타액을 이용하기 때문에 방법이 매우 간단하다.
둘째, 타액 내 단순 테스토스테론의 농도 수치를 이용하는 것이 아닌, 테스토스테론 농도 수치를 측정할 타액을 코티졸 농도에 기반하여 테스토스테론 농도를 측정할 타액을 선정한다. 이는 남성호르몬 뿐만 아니라 다른 호르몬인 코티졸의 변화도 갱년기의 원인이 될 수 있다는 점을 고려한 것이다.
셋째, 남성 갱년기를 객관적으로 진단할 수 있는 특정 연산식을 개발하였다. 구체적으로, 타액 내 테스토스테론 수치의 적분값을 이용하여 남성 갱년기를 정확하게 진단할 수 있는 연산식을 개발하였다. 이러한 방법은 남성 갱년기 증상에 대한 설문지(Aging male symptoms, AMS)를 요구하지 않기 때문에, 더욱 간단하고 객관적이고 정확한 진단을 할 수 있게 한다.
이하에서, 상기의 기술적 특징을 지닌 본 출원의 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 대해서 자세히 설명하도록 한다.
1. 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법
본 출원의 일 태양은 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 남성 갱년기 진단을 위한 정보는 남성의 성기능 저하 여부, 신체 기능 저하 여부 또는 정신 기능 저하 여부에 대한 정보를 포함한다.
상기 남성 갱년기는 앞서 설명하였듯, 남성 호르몬의 변화가 급격히 오는 시기가 없고, 40세 이후 테스토스테론이 점차 감소하는 추세라는 점 이외 마땅한 특징이 없다.
테스토스테론의 저하는 그 시작연령, 진행속도, 저하정도의 개인차가 매우 큰 편이다. 대체로 50세 이후 혈중 테스토스테론 수치가 1년에 약 1% 감소하는 것으로 알려져 있다.
현재까지 남성 갱년기 진단을 위해 혈중 테스토스테론 수치를 측정하여 진단하는 것이 일반적이나, 이는 침습적이고 정확도가 매우 떨어지는 한계가 있다.
본 출원은 혈액이 아닌 타액의 테스토스테론 수치를 이용하여 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 특징을 지닌다.
이하에서, 본 출원의 타액을 이용한 테스토스테론 수치 측정에 대해서 자세히 설명하도록 하겠다.
1) 타액 이용
본 출원의 남성 갱년기 진단을 위한 정보는 타액(saliva) 내 존재하는 특정 호르몬을 이용한다.
(1) 타액과 혈액
지금까지 호르몬의 농도는 주로 혈액에서 측정하였다. 내분비학 관점에서 보면 혈액은 호르몬의 표적기관이 아니라 단순히 호르몬의 이동매체이다. 대부분의 혈중 단백질계열 호르몬 (성장호르몬, 인슐린 등)은 물에 잘 용해되며 혈중에서는 활성화된 형태로 존재하지만 부신피질, 성선에서 생성되는 스테로이드는 물에 잘 녹지 않기 때문에 다른 매체 (운반단백질)와 결합하여 혈중에 존재한다. 스테로이드가 운반매체와 결합되어 있을 때(이를 bound-form이라 함)는 표적기관의 호르몬 수용체에 작용하지 못하기 때문에 '불활성 상태'라 하며 생리적인 기작을 유도할 수 없다. 혈중 스테로이드 대부분(95-99%)은 이러한 불활성 상태로 존재하며 극히 일부 (1-4%)만 운반매체와 결합되어 있지 않은 상태(활성상태)로 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서 혈중 스테로이드의 농도는 활성 상태의 호르몬의 농도 라기보다는 대부분 불활성 상태의 농도라 할 수 있다.
이에 반하여, 타액에 포함되어 있는 스테로이드 계열의 호르몬은 혈액과 달리 모두 운반매체와 결합되어 있지 않은 활성 상태이며 조직외액(extracelluar fluid)에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드가 단순 확산방식(passive diffusion)에 의해 타액샘으로 이동한 것이다. 타액에 포함되어 있는 호르몬의 농도는 혈액에 포함되어 있는 스테로이드의 전체농도(bound + free form) 및 활성형 호르몬(free-form)의 농도를 잘 반영하는 것으로 알려져 있다 (Vining RF, McGinley RA. The measurement of hormones in saliva: possibilities and pitfalls.J Steroid Biochem. 1987;27:81-94.).
따라서 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 조직 안에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드로 인식되고 있다.
또한, 타액은 혈액과 달리 의료진의 도움 없이도 개인의 수면주기에 맞추어 일반인이 쉽게 채취할 수 있기 때문에 개인의 호르몬 하루주기 리듬에 대한 연구를 쉽게 진행할 수 있는 장점을 가지고 있다. 즉, 타액을 이용할 경우 혈액으로 접근이 어려웠던 활성상태의 스테로이드의 농도와 개인의 호르몬 하루주기 리듬에 대한 접근이 용이하다는 장점이 있다.
본 출원은 타액 내 존재하는 호르몬들의 농도를 측정하는 바, 상기와 같은 장점을 효과로 발휘할 수 있다.
(2) 타액 준비
본 출원은 기상 후 1시간 이내의 타액을 이용한다. 이는 이후 설명할 대상 호르몬을 보면 더욱 명확하게 이해할 수 있는데, 간략하게 설명하자면 본 출원의 남성 갱년기 진단을 위한 정보는 기상에 따른 코티졸 반응(cortisol awakening response, 이하 CAR)에 기반한 테스토스테론 수치를 이용하기 때문이다. CAR 반응은 아침에 잠에서 깨어난 후 30분 정도에 코티졸 농도가 정상에 이르는 현상을 의미하는 것으로, 본 출원은 CAR 반응이 존재하는 타액 내 테스토스테론의 농도를 측정하여 이를 남성 갱년기 진단에 이용하는 것이다.
특히, 본 출원에서 사용되는 타액은 대상 남자가 기상 직후 1시간 이내에 3번에 걸쳐서 채취한 3개의 타액일 수 있다. 이들은 서로 동일한 시간에 채취한 것이거나 또는 서로 상이한 시간에 채취한 것일 수 있다. 이 때, 상기 동일한 시간 및 상이한 시간은 동일한 날임을 전제로 한다.
일 구체예로, 본 출원의 상기 타액은 기상 직후의 제 1타액, 기상 후 30분의 제 2타액, 기상 후 60분의 제 3타액으로 총 3개의 타액으로 구성된다.
편의상 총 3개의 타액으로만 설명할 뿐, 상기 타액의 구성은 제 1타액 내지 제 10타액 등으로 다양하게 구성될 수 있다.
이 때, 타액이 2개 이상으로 구성될 경우 즉, 복수로 구성될 경우, 이를 타액세트로 지칭할 수 있다.
즉, 상기 타액 세트는 제 1타액 내지 제 10타액 중 선택되는 적어도 2이상으로 구성된다.
예를 들어, 타액세트는 제 1타액 및 제 2타액으로 구성될 수 있다.
다른 예를 들어, 타액세트는 제 1타액, 제 2타액 및 제 3타액으로 구성될 수 있다.
상기 타액 세트는 0.5mL 내지 3mL의 용량으로 수득된 타액으로 구성될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 이 때, 상기 타액은 1회 내지 50회 반복하여 수득할 수 있다.
상기 타액은 기상 후 1시간 이내의 시간에 채취된 것이라면 어떠한 것이든 가능하다.
임의의 예로, 상기 타액은 기상 직후의 타액; 기상 후 15분의 타액, 기상 후 30분의 타액, 기상 후 45분의 타액, 기상 후 60분의 타액 중 선택되는 하나 이상;일 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 타액은 동일한 날에 기상 직후의 제 1타액, 기상 후 30분의 제 2타액, 기상 후 60분의 제 3타액이다. 이 때, 상기 제 1타액 내지 제 3타액은 1회 내지 50회 채취하여 모은 것일 수 있다.
상기 타액 채취를 하고자 하는 남자는 특정 질환 또는 특정 약을 복용 중인 경우 피험자에서 제외할 수 있다.
예를 들어, 상기 특정 질환은 치주염 등일 수 있다. 왜냐하면, 구강 내 미세 출혈이 발생할 가능성이 존재하고, 타액 내 혈액이 섞일 수 있기 때문이다.
다른 예를 들어, 상기 특정 약은 부신피질 호르몬제 또는 비스테로이드계 소염 진통제일 수 있다.
상기 타액은 피험자로부터 채취하는 날 이전에 금기사항을 수행한 후 채취할 수 있다. 이 때, 채취하는 날 이전은 적어도 1시간 전 내지 내지 3일 이전일 수 있다.
상기 금기사항은 예를 들어, 흡연, 음주, 과격한 운동 등일 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
특히, 채취하는 날 기상 직후 양치를 하지 않고 타액을 수득하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 타액은 채취 후 목적에 따라 후처리를 한 것일 수 있다.
상기 후처리는 예를 들어, 객담제거, 원심분리, 냉동보관 등일 수 있다.
이하에서, 상기 타액 내 측정되는 대상 호르몬에 대해서 상세하게 설명하도록 한다.
2) 대상 호르몬
본 출원은 타액을 채취하여 타액세트를 준비하고,
상기 타액세트 중 대상호르몬인 테스토스테론 농도 측정에 적합한 샘플을 선정하고,
상기 대상호르몬을 측정하는 것이다.
이하에서는, 대상 호르몬인 테스토스테론 농도 측정을 위해 적합한 타액 세트를 선정하기 위해 코티졸 농도를 선측정하는 것에 대해 설명하도록 하겠다.
(1) 테스토스테론 측정을 위한 타액 샘플 선정 - 코티졸 농도 측정
남성의 연령이 증가함에 따라, 테스토스테론의 생성이 이뤄지는 정소내 라이디히(Leydig) 세포에서의 스테로이드 생성이 감소하고 (Midzak AS, Chen H, Papadopoulos V, Zirkin BR. Leydig cell aging and the mechanisms of reduced testosterone synthesis. Mol Cell Endocrinol. 2009;299:23-31.) 황체형성호르몬(leutleutenizi hormone, LH)의 자극에 대한 라이디히 세포의 반응 감소가(Zirkin BR, Chen H. Regulation of Leydig cell steroidogenic function during aging. Biol Reprod. 2000;63:977-81.) 동반되는 바, 연령이 증가됨에 따라 아침 기상 후 테스토스테론 반응 등 성선 호르몬 생성, 분비에 물리적 변화 (농도 및 분비양상) 동반될 것으로 판단된다.
시상하부-뇌하수체-생식소로 구성된 생식내분비계도 빛에 의하여 호르몬 분비양상이 조절된다. 부신 내분비계에서 아침 기상 후 코티졸 반응(cortisol awakening response, CAR)이 나타나는 현상과 마찬가지로 아침기상 후 성선 호르몬 증가가 뚜렷하게 나타나며, 여성의 경우에는 이 증가현상이 사춘기 이후에 나타나고(Kang JY, Park JY, Chun SI, Suh HS, Lee K, Ahn RS. Puberty-related changes in cortisol, dehydroepiandrosterone, and estradiol-17
Figure 112022007680986-pat00001
secretions within the first hour after waking in premenarcheal girls. Neuroendocrinology. 2014;99:168-77.), 폐경기 이후에 사라지는 지는 것으로 보고되어 있다 (Ahn RS, Choi JH, Choi BC, Kim JH, Lee SH, Sung SS.J Cortisol, estradiol-17
Figure 112022007680986-pat00002
, and progesterone secretion within the first hour after awakening in women with regular menstrual cycles. Endocrinol. 2011;211:285-95.).
따라서, 테스토스테론과 아침 기상 후 코티졸 반응은 생식능력과 연관되어 있음을 예상할 수 있다.
그래서 본 출원에서는 상기 테스토스테론의 농도 측정 전에 적합한 타액시료의 결정을 위해 코티졸의 농도 변화를 먼저 확인한다.
즉, 기상 직후의 제 1타액, 기상 후 30분의 제 2타액 및 기상 후 60분의 제 3타액으로 구성된 타액세트를 준비하고; 상기 제 1타액 및 제 2타액의 코티졸 농도를 각각 측정하고; 상기 제 1타액의 코티졸 농도 및 제 2타액의 코티졸 농도를 비교하여 코티졸의 농도 변화를 먼저 확인하여; 상기 코티졸의 농도 변화가 일정 기준 이상인 타액 세트를 테스토스테론 측정을 위한 샘플로 선정하는 것이다.
특히, 상기 코디졸의 농도 변화가 없는 타액샘플은 테스토스테론 농도 측정을 위한 타액시료로 부적합하므로, 테스토스테론 농도를 측정하지 않는다.
다시 말해, 복수의 타액을 비교하여 코티졸의 농도 변화가 기준치 이상이 되지 않을 경우, 상기 복수의 타액을 채취한 대상은 타액을 새로 채취하는 것이 바람직하다.
상기 코티졸(cortisol)은 당질 코르티코이드계의 호르몬으로, 콩팥의 부신피질에서 분비되는 스테로이드 호르몬이다.
부신의 하루주기 리듬은 뇌신경, 시상하부(hypothalamus), 뇌하수체 (pituitary)에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있으며 근본적으로는 개인의 수면주기에 의하여 결정되어진다. 정상적으로 밤에 수면을 취한 후, 아침에 일어나면 뇌신경에서는 기상(wake up)을 인지하며, 이 신호는 시상하부의 시교차상핵(suprachiasmatic nucleus, SCN)에 도달하게 되고 시교차상핵에서는 생체시계 유전자(bioclock gene)가 활성화되며, 이 신호는 다시 뇌실옆핵(paraventricular nucleus, PVN)에 전달된다. 뇌실옆핵에서는 이 자극에 반응하여 부신피질자극호르몬 분비호르몬(corticotropin releasing hormone, CRH)을 분비하며, 분비된 분비호르몬은 뇌하수체를 자극하여 부신피질자극호르몬(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)을 생성, 분비하게 된다. 뇌하수체에서 생성, 분비되는 부신피질자극호르몬 농도는 기상 후 15분에 정점(peak)에 이른다. 혈액에 분비된 부신피질자극호르몬은 부신에 작용하여 부신피질의 코티졸의 생성을 증가시키게 된다.
따라서, 최정상 코티졸 농도는 기상 후 30분 정도에 나타나며 이때의 코티졸 농도가 하루 중 가장 높다. 이와 같이 아침에 잠에서 깨어난 후 30분 정도에 코티졸 농도가 정상에 이르는 현상을 기상에 따른 코티졸 반응(cortisol awakening response, 이하 CAR)이라 한다. CAR은 일반적인 수면 환경, 빛, 수면시간 동안 깨는 현상등에 영향을 받지 않으며, 건강상태에 의하여 많은 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 그러나 기상 직후 타액 시료채취가 10분 이상 지연되면 CAR 현상은 나타나지 않은 것으로 보고되어 있다.
그러므로, 본 출원의 남성 갱년기 진단을 위한 정확한 정보를 수득하기 위해서는 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내 코티졸 농도의 변화가 적어도 2.5 nmol/L 이상이 확인된 타액의 테스토스테론의 농도를 측정하는 것이 가장 바람직하다.
이 때, 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안 타액 내의 코티졸 농도 변화 확인은 아침 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 60분에 각각 채취한 타액을 이용하여 측정할 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 타액은 동일한 날에 채취한 기상 직후의 제 1타액, 기상 후 30분의 제 2타액, 기상 후 60분의 제 3타액 중 제 1타액 및 제 2타액 각각의 코티졸 농도를 측정한다. 이후, 제 1타액 및 제 2타액의 코티졸 농도를 비교하여 코티졸 농도 증가율이 적어도 적어도 2.5 nmol/L 이상인 타액세트를 테스토스테론 측정 샘플로 선정한다.
(2) 테스토스테론
본 출원은 남성 갱년기 진단을 위해, 상기 타액 내 존재하는 테스토스테론(testosterone)의 농도를 이용하는 것을 특징으로 한다.
특히, 앞서 설명한 바와 같이, 코티졸 농도 변화가 확인된 타액 샘플을 선정하여 이의 테스토스테론 농도를 측정하여 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 것이다.
상기 테스토스테론은 남성 혹은 수컷의 주요 성호르몬이자 아나볼릭 스테로이드(anabolic steroid)이다. 테스토스테론은 고환에서 생성되고 분비되는 남성호르몬이다. 남성에게서 테스토스테론은 고환이나 전립선 등 남성의 생식 기관의 발달, 근골격 크기 증대나 체모(body hair) 성장 등 2차 성징 촉진에 중요한 역할을 한다. 또한, 남성과 여성 모두에게 있어 테스토스테론은 기분(mood)이나 행동 등에 관한 건강과 행복, 그리고 골다공증 예방에 관여한다. 하지만, 테스토스테론은 사춘기가 지나면 점차 테스토스테론 양이 감소되어 50세 이후에는 신체가 노화되며 활력과 성욕도 감퇴된다. 테스토스테론이 감소되면 근육량, 근력이 감소될 뿐만 아니라, 쉽게 지치며 우울감, 성기능 감소를 겪을 수 있다. 나아가, 비만, 당뇨병, 고지혈증, 고혈압 등의 대사증후군이 생길 수 있다고 보고되어진다.
(3) 측정방법
상기 테스토스테론 및 코티졸 농도의 측정은 효소면역측정법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA), 액체 크로마토그래피-질량분석법(Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometery, LC-MS), 이중 항체법(double anti- body), 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA), 섬광면역측정법(Luminescence immunoassay, LIA), 형광면역측정법(fluoroimmunoassay, FIA) 등으로 수행될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
일 예로, 본 출원에서는 방사면역측정법 (radioimmunoassay, RIA)을 이용하여 타액 내 코티졸 및 테스토스테론을 측정할 수 있다.
방사면역측정법은 높은 감도(sensitivity)와 정밀도(precision), 정확도(accuracy)를 나타내며, 반응 후의 분명하고 명백한 검출을 가능케 해주는 등 여러 이점을 가지고 있다. 방사면역측정법을 위해, 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)방법을 이용할 수 있다.
타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 혈액의 1/100-1/1000 정도로 매우 낮은 문제점이 있으므로, 타액에 포함되어 있는 소량의 호르몬 농도를 측정하기 위하여 고도로 민감한 분석 시스템이 요구되는데, 이러한 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)방법이 유용하게 활용될 수 있다.
보다 상세한 측정방법은 액상-이중항체 방법을 이용한 호르몬 측정에 관한 논문(Ahn RS, Lee YJ, Choi JY, Kwon HB, Chun SI. Salivary Cortisol and DHEA Levels in the Korean Population: Age-Related Differences, Diurnal Rhythm, and Correlations with Serum Levels. Yonsei Med J. 2007 Jun 30;48(3):379-88.)을 참조할 수 있다.
본 출원의 일 실시예에서는 요오드 125 (125I)로 표지된 항원과 2차 항체을 이용한 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)을 이용하였다.
정리하자면, 본 출원은 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 60분에 채취한 각각의 타액에서 코티졸 농도를 측정하여 아침 기상 직후부터 최초 1시간 동안 코티졸의 농도 증가량이 적어도 2.5 nmol/L 이상인 경우의 타액을 선정한다. 이후, 선정된 타액 내 테스토스테론의 농도를 측정하는 것이다.
(4) 테스토스테론 적분값 수득
본 출원은 상기 테스토스테론 농도 자체를 사용하는 것이 아니라, 기상 직후의 제 1타액, 기상 후 30분의 제 2타액, 기상 후 60분의 제 3타액 각각의 테스토스테론 농도값을 적분한 테스토스테론 총량을 이용한다.
즉, 상기에서 측정된 테스토스테론 농도값을 이용하여, 아침기상 후 최초 1시간 동안 분비된 테스토스테론 총량을 구함으로써, 대상 남자의 남성 갱년기 여부에 대한 정보를 수득할 수 있다.
이하에서, 상기 적분하여 구한 테스토스테론 총량을 TARauc(area under the curve for testosterone awakening response)으로 지칭할 수 있다.
본 출원에서, 아침기상 직후의 제 1타액, 기상 30분 후의 제 2타액, 기상 60분 후의 제 3타액 각각의 테스토스테론 농도를 적분하여 아침기상 최초 1시간 동안 분비된 테스토스테론 총량이 약 6.6 nmol/L 이상, 바람직하게는 6.18-7.2 nmol/L 범위인 경우 대상 남자가 남성 갱년기 초기 단계에 있는 것으로 판단한다.
이는, 아침기상 후 최초 1시간 동안 분비된 테스토스테론 총량이 남성 갱년기가 시작되었는지에 대한 지표로 활용될 수 있음을 의미한다.
이하에서, 상기 테스토스테론 적분값을 이용하여 남성 갱년기를 어떻게 진단하는지 더욱 구체적으로 설명하도록 하겠다.
3) 남성 갱년기 진단
본 출원은 상기 테스토스테론 적분값을 이용하여 남성 갱년기를 진단한다.
본 출원의 테스토스테론 적분값은 다음과 같이 남성 갱년기를 진단할 수 있다(표 1).
테스토스테론 적분값 남성 갱년기 진단
8 nmol/L 이상 남성갱년기 없거나 미약
6.2-7.2 nmol/L 남성갱년기 경증 단계
4.8-5.6 nmol/L 남성갱년기 중증 단계
3.3-4.6 nmol/L 남성갱년기 고위험 단계
상기 테스토스테론 적분값은 앞서 측정한 아침기상 직후의 제 1타액, 기상 30분 후의 제 2타액, 기상 60분 후의 제 3타액 각각의 테스토스테론 농도를 적분한 테스토스테론 총량이다.
예를 들어, 테스토스테론 적분값이 6.2-7.2 nmol/L인 경우, 남성 갱년기 경증 단계에 있는 것으로 판단한다.
일 구체예로, 아침기상 직후의 제 1타액, 기상 30분 후의 제 2타액, 기상 60분 후의 제 3타액 각각의 테스토스테론 농도값을 적분한 테스토스테론 적분값이 6.6nmol/L인 경우, 남성 갱년기 경증 단계인 것으로 진단한다.
상기 테스토스테론 적분값은 남성 갱년기 증상(Aging male symptoms, 이하 AMS로 지칭)에 대한 설문지와의 상관관계를 이용하여 더욱 세부적인 정보에 대한 판단이 가능할 수 있다. 이 때, 상기 세부적인 정보는 남성 갱년기의 정신적 증상, 신체적 증상, 성기능 증상 정도를 포함할 수 있다.
AMS는 독일 Heinemann 등에 의해 개발되었고 (Heinemann LAJ, Zimmermann T, Vermeulen A, Thiel C. A New 'Aging Male's Symptom'(AMS) Scale. The Aging Male. 1999;2:105-114.), 노화가 남성의 삶의 질에 미치는 영향을 평가하기 위해 고안된 자가보고식 설문도구이며, 한국어를 포함해 17개 언어로 번역되어 있고, 타당도와 신뢰도가 입증되어 있다(Daig I, Heinemann LA, Kim S, Leungwattanakij S, Badia X, Myon E, Moore C, Saad F, Potthoff P, Thai do M.The Aging Males' Symptoms (AMS) scale: review of its methodological characteristics. Health Qual Life Outcomes. 2003;1:77.).
AMS는 정신적 (psychological) 기능저하에 관련된 증상 (5항목), 신체적 (somatic) 기능저하에 관련된 증상 (7항목), 성 (sexual) 기능저하에 관련된 증상 (5항목)으로 구성된다. 총 3 영역, 17개 항목으로 이루어져 있으며 각각 5등급으로 점수가 배정(심각도에 따라 점수 증가)되어 있고, 총점 26점을 절단면 값(cut-off value)로 갱년기에 따른 기능저하의 유무를 평가하며, 이후에도 경증(27-36점)/중증(37-49점)/고위험증(50점 이상)의 심각도를 나누는 절단면 값이 연구에 의해 확립되어 있다.
AMS가 남성갱년기에 대해 양성예측도(positive predictive value, PPV) 89%, 음성예측도 (negative predictive value, NPV) 59%, 예민도 (sensitivity) 96%, 특이도 (specificity) 30% 라고 보고된다(Moore C, Huebler D, Zimmermann T, Heinemann LA, Saad F, Thai DM. The Aging Males' Symptoms scale (AMS) as outcome measure for treatment of androgen deficiency. Eur Urol. 2004;46:80-7.).
AMS로 남성 갱년기의 진행 정도 즉, 경증, 중증, 고위험 단계를 예측할 수 있고, 이의 수치와 테스토스테론 적분값 수치의 연관성을 확인하면, 테스토스테론 적분값으로 남성 갱년기의 진행 정도를 확인할 수 있다
상기 상관관계는 양의 상관관계(positive correlation) 또는 음의 상관관계(negative correlation)일 수 있다.
상기 상관관계를 통해, 테스토스테론 적분값이 남성 갱년기의 지표로 사용될 수 있음을 확인할 수 있다.
일 예로, 본 출원의 실시예 3에서는 테스토스테론 적분값과 AMS 점수가 모두 유의하게 음의 상관관계임을 확인하였다.
즉, 이는 테스토스테론의 농도가 감소할수록 남성 갱년기에 나타나는 정신적, 신체적, 성적 기능 저하로 인한 증상이 심화된다는 것을 의미한다.
나아가, 상기 테스토스테론 적분값을 정신적, 신체적, 성기능 증상 정도 각각 즉, 남성 갱년기 정도를 파악하기 위한 수치로 전환할 수 있다.
상기 전환을 위한 연산식은 AMS 점수를 활용하여 만들 수 있다.
구체적으로, 상기 연산식의 상수를 도출하기 위한 변이로 AMS 점수를 이용할 수 있다.
일 예로, 하기의 표 6의 연산식을 이용할 수 있다.
상기 연산식으로 남성 갱년기의 정도를 다음과 같이 파악할 수 있다(표 2).
분류 남성 갱년기
없거나 미약 		남성 갱년기
경증 		남성 갱년기
중증 		남성 갱년기
고위험
정신적 증상 0~5 6~8 10~12 14 이상
신체적 증상 9 이하 10~13 14~19 20 이상
성기능 증상 5 이하 6~9 10~13 13 이상
총 점수 21 이하 23~30 33~41 45 이상
그러므로, 본 출원의 바람직한 구체예로서,
(a) 대상 남자가 동일한 날에 채취한 기상 직후의 제 1타액, 기상 후 30분의 제 2타액 및 기상 후 60분의 제 3타액으로 구성된 타액세트를 준비함;
(b) 상기 제 1타액 및 제 2타액의 코티졸 농도를 각각 측정함;
(c) 상기 (b)에서 측정한 제 1타액의 코티졸 농도와 제 2타액의 코티졸 농도를 비교하여 증가량이 적어도 2.5 nmol/L 이상인 타액세트는 테스토스테론 측정 샘플로 선정함;
(d) 상기 테스토스테론 측정 샘플로 선정된 타액세트의 제 1타액의 테스토스테론, 제 2타액의 테스토스테론 및 제 3타액의 테스토스테론 농도를 각각 측정함;
(e) 상기 제1 타액, 제2 타액 및 제3타액의 테스토스테론 농도값을 적분하여 테스토스테론의 적분값(area under the curve for testosterone awakening response, TARauc)을 수득함;
을 포함하는 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법이 제공될 수 있다.
이하에서는, 위에서 설명한 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 이용하여 남성 갱년기를 진단하는 방법 및 진단 키트에 대해 설명하도록 하겠다.
2. 용도
본 출원의 다른 태양은 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 이용한 남성 갱년기 진단 방법에 관한 것이다.
1) 남성 갱년기 진단 방법
(1) 적합한 시료로서의 타액 준비
본 출원의 남성 갱년기 진단에 사용하는 시료는 권고하는 시간에 채취된 타액으로, 아침기상 직후, 기상 30분, 기상 60분에 채취한 타액을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
특히, 아침 기상 직후부터 최초 1시간 이내 코티졸의 농도가 적어도 2.5 nmol/L 이상인 타액을 사용하는 것이 바람직하다.
정상직인 성인 남녀에서 아침기상 후 코티졸의 농도는 50~150% 증가하는 것으로 보고된다. 기상 직후부터 기상 30분 후까지 최소 2.5 nmol이 증가하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 정상적인 남녀의 아침 기상 직후 첫 타액 시료의 채취가 10분 이상 지연되었을 경우에는 이러한 코티졸 증가 현상을 관찰할 수 없는 것으로 보고된다.
따라서, 상기 코티졸 증가 현상이 일어나지 않았을 경우, 코티졸 증가량이 2.5 nmol 미만으로 측정된 타액을 채취한 날 이후의 어느 날(최소, 24시간 이후)에 새로운 타액을 채취하는 것이 바람직하다.
본 출원은 아침 기상 직후, 기상 30분, 기상 60분에 각각 채취한 타액을 이용하여 테스토스테론을 분석하는 것을 주요한 특징으로 한다.
코티졸 증가현상을 확인하지 않은 타액은 본 출원의 남성 갱년기 검사에서 제외한다.
따라서, 본 출원의 방법은 준비된 타액이 분석에 적합한지 여부인지를 확인하기 위해 코티졸의 농도 변화를 측정하는 것을 필수로 선진행한다.
코티졸의 농도 변화를 확인함으로써, 정확한 시간에 채취한 타액인지를 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 다른 요인에 의해서 실험결과에 영향을 미칠 수 있는지를 확인하기 위한 것이다.
(2) 테스토스테론 측정
본 출원에서는 아침기상 직후, 기상 30분, 기상 60분 후에 채취한 각각의 타액에서 테스토스테론의 농도를 측정한다.
앞서 설명하였듯이, 테스토스테론 농도를 측정하기 전에 코티졸 농도 측정을 선진행한다.
코티졸, 테스토스테론의 측정에 다양한 방법을 사용할 수 있다. 이에 대한 측정방법은 상기 측정방법에서 설명한 바와 동일하다.
(3) 테스토스테론 적분값 산출
상기에서 측정한 테스토스테론 농도값, 즉, 코티졸 증가량이 적어도 2.5nmol 이상인 기상 직후 타액, 기상 후 30분의 타액, 기상 후 60분의 타액 각각의 테스토스테론 농도값으로 테스토스테론 적분값을 산출한다.
테스토스테론 적분값에 대해서는 앞서 설명한 바와 동일하다.
본 출원의 남성 갱년기 진단을 위한 방법에서는 상기 테스토스테론 적분값이 6.2-7.2 nmol/L일 경우, 남성 갱년기가 시작되는 것으로 예측한다.
테스토스테론 적분값에 따른 남성 갱년기 정도를 진단하는 것은 앞서 설명한 바와 동일하다.
그러므로, 본 출원의 바람직한 구체예로서,
(a) 대상 남자가 동일한 날에 채취한 기상 직후의 제 1타액, 기상 후 30분의 제 2타액 및 기상 후 60분의 제 3타액으로 구성된 타액세트를 준비함;
(b) 상기 제 1타액 및 제 2타액의 코티졸 농도를 각각 측정함;
(c) 상기 (b)에서 측정한 제 1타액의 코티졸 농도와 제 2타액의 코티졸 농도를 비교하여 증가량이 적어도 2.5 nmol/L 이상인 타액세트는 테스토스테론 측정 샘플로 선정함;
(d) 상기 테스토스테론 측정 샘플로 선정된 타액세트의 제 1타액의 테스토스테론, 제 2타액의 테스토스테론 및 제 3타액의 테스토스테론 농도를 각각 측정함;
(e) 상기 제1 타액, 제2 타액 및 제3타액의 테스토스테론 농도값을 적분하여 테스토스테론의 적분값(area under the curve for testosterone awakening response, TARauc)을 수득함;
(f) 상기 테스토스테론 적분값으로 다음과 같이 남성 갱년기를 진단함;
적분값이 8 nmol/L 이상일 경우, 남성 갱년기가 없거나 미약함으로 진단;
적분값이 6.2-7.2 nmol/L 일 경우, 남성 갱년기 경증 단계로 진단;
적분값이 4.8-5.6 nmol/L 일 경우, 남성 갱년기 중증 단계로 진단;
적분값이 3.3-4.6 nmol/L 일 경우, 남성 갱년기 고위험 단계로 진단;
을 포함하는 남성 갱년기를 진단하는 방법이 제공될 수 있다.
2) 진단 키트
본 출원의 다른 태양은 남성 갱년기 진단을 위한 진단키트에 관한 것이다.
상기 진단 키트는
타액 수집을 위한 용기;
코티졸 측정을 위한 패널;
테스토스테론 측정을 위한 패널;
을 포함할 수 있다.
상기 타액 수집을 위한 용기는 튜브, 깔때기 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다. 이 때, 상기 용기는 진단 키트 내에 적어도 3개 이상 포함되어 있어야 한다.
상기 코티졸 측정을 위한 패널 및 테스토스테론 측정을 위한 패널은 각각 적어도 3개 이상의 패널이 진단 키트 내에 포함되어 있어야 한다.
상기 패널은 코티졸 및 테스토스테론의 측정이 가능하도록 설계된 것이라면 어떠한 형태로든 진단 키트에 포함될 수 있다.
또한, 상기 진단 키트는 선택적으로 타이머, 테스토스테론 적분값 도출을 위한 설명서를 더 포함할 수 있다.
이처럼, 본 출원은 타액 내 테스토스테론 농도를 분석함으로써, 남성 갱년기 진단에 필요한 정보를 제공한다. 특히, 테스토스테론의 농도를 분석하기 전에 코티졸의 농도를 분석하여 코티졸 농도 증가량을 선확인 한 후 이의 증가가 확인된 타액을 이용하는 것이기 때문에, 단순 혈중 테스토스테론의 농도로 진단했을 때의 많은 오류와 오차를 극복할 수 있을 것으로 예상한다. 나아가, 주관적인 설문지 조사에 의존하지 않고, 객관적으로 남성 갱년기를 진단할 수 있는 유용한 기술로 자리매김할 것으로 예측한다.
[출원의 실시를 위한 형태]
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
1) 연구 대상자 선정 및 타액 채취
본 연구는 연구 참여에 동의한 20-65세의 성인 남성을 대상으로 이루어졌다. 참여자 선정과정에 i) 관절염 등으로 병원약(부신피질호르몬제가 포함되었거나 비스테로계 소염진통제가 포함되어을 가능 때문) 복용하고 있거나, ii) 치추염등 구강질환이 있는자(구강내 미세 출혈의 가능성이 있어)는 제외하였다.
모든 참여자들은 연령, 키, 몸무게 등 신체 정보를 제공받았고, 타액을 채취할 수 있는 3개의 튜브를 제공하였다. 참여자들의 신체정보는 표 3에 정리하였다.
[표 3]
Figure 112022007680986-pat00003
Figure 112022007680986-pat00004
Figure 112022007680986-pat00005
Figure 112022007680986-pat00006
Figure 112022007680986-pat00007
모든 참여자들에게 아침 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 60분에 각각 제공한 튜브에 타액을 수집하도록 요청하였다. 각 튜브에는 타액 채취 순서에 따라 일련의 번호가 인쇄되어 있고, 2mL에 해당되는 부위에 선이 표시되어 있다.
모든 참여자들에게 타액 채취시 유의사항을 설명하였고 그 내용은 인쇄하여 튜브와 함께 제공되었다. 그 내용은 다음과 같다. i) 기상직후의 의미는 아침에 잠에서 깬 시점(침대에서 일어나는 시점이 아님)을 의미하며, ii) 기상 후 바로 조명을 켜고 ii) 전날 저녁에 음주하였거나, 1주내에 야간 근무를 하였을 경우 그렇치 않은 날에 타액을 채취하며, iv) 타액 채취 전에 흡연, 양치, 과다한 수분 섭취 및 운동를 하지 않는다.
또한, 모든 참여자들에게 채취된 타액은 필요에 따라 가정용 냉동실에 보관할 수 있고, 채취된 날짜를 기준으로 최소 1주일안에 제공한 택배 상자를 이용하여 연구실로 보내주도록 요구하였다.
2) 타액 내 코티졸 농도 및 테스토스테론 농도 측정
연구실에 도착한 타액은 원심분리 및 객담제거 등의 전처리 과정을 마무리하여 분석 전까지 -80℃로 유지되는 초저온 냉동고에 보관하였다.
모든 타액 샘플들은 전남대학교 호르몬 연구센터에서 분석되었다.
타액 내 코티졸 및 테스토스테론 농도는 Ahn 등이 사용한 액상-이중항체 (liquid phased-double antibody) 방사면역측정법 (radioimmunoassay, RIA)을 이용하여 정량분석하였다. 이에 대한 자세한 방법은 Salivary Cortisol and DHEA Levels in the Korean Population: Age-Related Differences, Diurnal Rhythm, and Correlations with Serum Levels. Yonsei Med J. 2007 Jun 30;48(3):379-88.을 참고하였다.
코티졸 분석에 사용되는 1차 항체는 US biological Life Sciences사, 테스토스테론 1차 항체는 Absolue antibody사에서 각각 구입하여 사용하였다.
코티졸 1차 항체는 11-데옥시코티졸 (11-deoxycortisol), 프레디니솔론 (prednisolone), 코티코스테론 (corticosterone), 코티손 (cortisone) 및 11-데옥시코티코스케론 (11-deoxycorticosterone) 과 각각 0.9%, 5.6%, 0.6%, 0.6% 및 < 0.1% 교차반응한다.
테스토스테론 1차 항체는 11-베타 하이드록시 테스토스테론 (11β-hydroxy testosterone), 17-알파-메틸테스토스테론 (17α-methyltestosterone), 디하이드로테스톳스테론 (dihydrotestosterone), 에스트라디올 (estradiol) 및 프로제스테론 (progesterone)과 각각 3.3%, < 0.1%, 0.8%, < 0.1% 및 < 0.1% 교차반응 한다.
코티졸과 테스토스테론의 표준시료는 Sigma-Aldrich사 등에서 구입하여 사용하였다. 또한, Corrie 등 (Corrie JE, Ratcliffe WA, Macpherson JS. Generally applicable 125 iodine-based radioimmunoassays for plasma progesterone. Steroids. 1981;38:709-17.)의 방법에 따라 코티졸과 테스토스테론을 요오드-125(I125)로 표지하여 추적자(tracer)로 사용하였다.
호르몬 분석은 표준시료, 정도관리 시료, 타액시료를 2조 분석 (duplicated assay)으로 수행하였다.
코티졸의 분석간 변이는 3.6 및 10.9 nmol/L에 각각 7.6%와 8.7% 이었고, 코티졸 분석의 최저농도는 0.1 nmol/L 였다. 테스토스테론의 분석간 변이는 34.7 p mol/L 및 173.3 pmol/L에 각각 8.9%와 7.6% 이었고, 테스토스테론 분석의 최저농도는 0.3 pmol/L 였다.
3) 데이터 분석
아침기상 후 분비된 테스토스테론의 총량은 기상직후, 기상 후 30분, 기상 후 60분 각각의 테스토스테론 값을 적분하여 구했으며, 이 적분값을 'area under the curve for testosterone awakening respone, TARauc'로 표시하였다.
참여자들이 제출한 한국어판 AMS rating scale 설문지로부터, 정신적(psychological) 기능저하에 관련된 증상 (5항목), 신체적 (somatic) 기능저하에 관련된 증상 (7항목), 성 (sexual) 기능저하에 관련된 증상 (5항목) 점수를 각각 구했고, 이들 점수를 합산하여 총점 (total score)을 아울러 구했다.
TARauc와 상기 정신적, 신체적, 성적기능 영역의 점수 및 총점수와의 상관관계를 조사하였고, 선형회귀분석 (linear regression)을 통하여 TARauc와 이루어지는 상관관계를 1차 함수식 (y = ax +b)으로 전환하였다.
모든 데이터는 통계 분석전에 정규성 검정 Shapiro-Wilk test를 이용하여 정규성 검정 (normality yest)을 수행하고, 데이터의 분포도에 따라 변이의 집단간 차이 및 상관관계의 통계방식을 달리하였으며, p < 0.05를 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였다. 모든 통계는 NCSS 11 statistical software (NCSS, Kaysville, UT, USA)로 수행하였다.
실시예 1: 테스토스테론 농도 측정 샘플을 선정하기 위한 코티졸 농도 변화 확인
앞서 설명한 바와 같이, 테스토스테론 농도 측정 전에 아침 기상 후 코티졸 반응, 즉 CAR 현상을 먼저 확인하기 위해 코티졸 농도 변화를 확인하였다.
코티졸 농도 변화를 확인 후, 기상 30분 후 타액의 코티졸 값이 기상 직후 타액의 코티졸 값보다 2.5 nmol/L 미만일 경우, 지정된 시간에 타액이 채취되지 않은 것으로 간주하고 이 시료를 제출한 참여자의 신체정도 등의 모든 데이터를 본 연구에서 제외하였다.
각 대상자의 기상 직후 타액, 기상 후 30분의 타액 각각의 코티졸 농도는 다음과 같았다(표 4).
[표 4]
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실시예 2: 테스토스테론 농도 측정
실시예 1에서 선정된 타액의 타액세트를 이용하여 테스토스테론 농도를 측정하였다.
각 대상자의 기상 직후 타액, 기상 후 30분의 타액, 기상 후 60분의 타액 각각의 테스토스테론 농도는 다음과 같았다(표 5).
[표 5]
Figure 112022007680986-pat00013
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실시예 3: 테스토스테론 적분값 산출
실시예 2에서 측정한 기상 직후 타액 내 테스토스테론 농도값, 기상 후 30분의 타액 내 테스토스테론 농도값, 기상 후 60분의 타액 내 테스토스테론 농도값을 적분하여, 테스토스테론 적분값을 산출하였다. 이 적분값을 'area under the curve for testosterone awakening response, TARauc'로 표시하였다.
대상자들의 테스토스테론 적분값 및 AMS rating scale의 정보를 수득하여 확인하였다(표 6).
연령 정신적 증상 점수 정신적 증상 점수 정신적 증상 점수 총점 CARi
(nmol/L) 		TARauc
(nmol/L)
10% Percentile 28.8 1.4 4.0 4.0 12.0 3.44 3.91
25% Percentile 40 5.0 7.0 5.0 19.0 5.7 5.14
Median 50 7.0 12.0 7.0 27.0 10.40 6.6
75% Percentile 55 11.0 16.5 11.0 37.0 15.70 9.12
90% Percentile 58 16.6 22.0 15.0 53.0 21.54 13.47
본 연구의 참여자들의 총점의 중앙값 (median)은 27 (95% 신뢰구간: 23-30)이고 상위 75% 및 90% percentile 값은 각각 37 (95% 신뢰구간: 33-41) 및 53 (95% 신뢰구간: 45-57)이었다 (표 6).
이는 Daig 등이 2003년 제시한 AMS rating scale의 경증(27-36점)/중증(37-49점)/고위험증(50점 이상)와 비슷하다. 본 연구의 참여자들의 정신적, 신체적, 성기능 저하 정도의 중앙값은 각각 7.0 (95% 신뢰구간: 6-8), 12.0 (95% 신뢰구간: 10-13), 7.0 (95% 신뢰구간: 6-9)이었고, TARauc의 중앙값은 6.6 nmol/L (95% 신뢰구간: 6.18-7.20 nmol/L) 이었다.
상기 TARauc 수치와 AMS rating scale의 정신적, 신체적, 성기능 저하에 의한 증상 점수 및 총점수와 상호 관계를 확인하였다.
확인 결과 다음과 같았다(표 7).
연령 정신적 증상 점수 신체적 증상 점수 성기능 증상 점수 총점 TARauc
Age 1 0.02 -0.05 0.30*** 0.07 0
정신적 증상 점수 1 0.75*** 0.75*** 0.83*** -0.26**
신체적 증상 점수 1 0.68*** 0.85*** -0.22**
성기능 증상 점수 1 0.78*** -0.27**
총점 1 -0.30***
TARauc 1
**과 ***는 각각 p<0.005과 p<0.001을 의미함.
TARauc 수치는 정신적, 신체적, 성기능 저하에 의한 증상 점수 및 총점수와 모두 유의하게 음의 상관관계 (negative correlation)를 나타냈다(표 6).
이는 아침기상 후 생성 분비되는 테스토스테론의 농도가 감소할수록 남성갱년기에 나타나는 정신적, 신체적, 성적 기능 저하로 인한 증상이 심화된다는 것을 의미하며, 또 다른 한편으로는 TARauc가 남성 갱년기를 판단할 수 있는 생체 지표로서 역할 할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
정신적, 신체적, 성기능 저하에 의한 증상 점수는 상호간에 유의하게 양의 상관관계를 나타냈고, 총점수와도 유의한 양의 상관관계 (positive correlation)를 나타낸다(표 6). 이는 상기한 증상의 발현이 서로 독립적이지 않고 상호작용한다는 것을 의미하며, 아울러 이들 증상이 동일한 병리생리학적 기전 (pathophysiological mechanism)을 공유한다는 것을 의미한다.
실시예 4: TARauc를 남성갱년기 수치전환 할 수 있는 연산식 개발
상기한 바와 같이 TARauc는 수치는 정신적, 신체적, 성기능 저하에 의한 증상 점수 및 총점수와 모두 유의하게 음의 상관관계 (negative correlation)를 나타고 있는 바, 선형회귀분석을 통하여 TARauc와 이들 남성갱년기 수치와의 상관관계를 다음과 같이 1차 함수식으로 표시하였다 (표 8).
분류 연산식
정신적 증상 y = 10.24 - (0.278 x TARauc)
신체적 증상 y = 14.66 - (0.313 x TARauc)
성기능 증상 y = 10.55 - (0.265 x TARauc)
총 점수 y = 35.98 - (0.924 x TARauc)
이는 TARauc 값을 상기 1차 함수식에 대입하면 피험자의 정신적, 신체적, 성기능 저하에 의한 증상 점수 및 총점수로 전환할 수 있음을 시사한다.
실시예 5: TARauc 및 이를 환산한 AMS rating scale로 남성갱년기 판단
실시예 3 및 4에서 도출한 테스토스테론 적분값 및 이의 수치 전환값으로 다음과 같이 남성 갱년기 진단을 하였다(표 9).
분류 남성 갱년기
없거나 미약 		남성 갱년기
경증 		남성 갱년기
중증 		남성 갱년기
고위험
TARauc
(nmol/L) 		중앙값 8 이상 6.6 5.14 3.91
95% 신뢰구간 8 이상 6.18~7.2 4.8~5.64 4.59 이하
정신적 증상 중앙값 5 이하 7 11 16.6 이상
95% 신뢰구간 0~5 6~8 10~12 14 이상
신체적 증상 중앙값 7 이하 12 16.5 22 이상
95% 신뢰구간 9 이하 10~13 14~19 20 이상
성기능 증상 중앙값 5 이하 7 11 15
95% 신뢰구간 5 이하 6~9 10~13 13 이상
총 점수 중앙값 19 이하 27 37 53
95% 신뢰구간 21 이하 23~30 33~41 45 이상
표 9는 TARauc 수치를 상기 표 8의 1차 함수식에 적용하여 정신적, 신체적, 성기능 저하에 의한 증상 점수 및 총 점수의 범위를 나타내고, 아울러 각 점수에 따른 심각도를 Daig 등이 제시한 방법으로 나타낸 것이다.
남성갱년기 증상이 나타나기 시작하는 TARauc는 6.6 nmol/L이고 이에 대한 95% 신뢰구간은 6.18-7.2 nmol/L이다. 실제로 TRAauc 6.6 nmol/L을 표 9의 1 차함수식에 대입하면, 총 점수는 29.9로 환산되고, 정신적, 신체적, 성기능 증상 점수는 각각 8.6, 12.6, 8.8 이다 (도 1).
상기 결과들을 통해, 본 출원의 발명자가 개발한 남성 갱년기 진단을 위한 정보 제공 방법에서 테스토스테론 적분값은 중요한 요소임을 알 수 있었다. 특히, 테스토스테론 적분값을 도출하기 위해 테스토스테론 농도를 측정하는데, 테스토스테론 농도 측정을 위한 타액 샘플 선정을 위해 코티졸 농도를 선측정 하여 선정하는 것이 중요하다. 이는 종래 혈중 테스토스테론 농도로 남성 갱년기를 진단하였을 때의 진단 오류를 극복할 수 있을 뿐만 아니라, 주관적인 설문지에 기반한 판단이 아닌 객관적인 판단을 할 수 있기 때문에 남성 갱년기 진단 효율이 높을 것으로 예상된다.

Claims (13)

  1. 다음을 포함하는 남성 갱년기 진단을 위한 정보를 제공하는 방법:
    (a) 대상 남자가 동일한 날에 채취한 기상 직후의 제 1타액, 기상 후 30분의 제 2타액 및 기상 후 60분의 제 3타액으로 구성된 타액세트를 준비함;
    (b) 상기 제 1타액 및 제 2타액의 코티졸 농도를 각각 측정함;
    (c) 상기 (b)에서 측정한 제 1타액의 코티졸 농도와 제 2타액의 코티졸 농도를 비교하여 증가량이 적어도 2.5 nmol/L 이상인 타액세트는 테스토스테론 측정 샘플로 선정함;
    (d) 상기 테스토스테론 측정 샘플로 선정된 타액세트의 제 1타액의 테스토스테론, 제 2타액의 테스토스테론 및 제 3타액의 테스토스테론 농도를 각각 측정함;
    (e) 상기 제1 타액, 제2 타액 및 제3타액의 테스토스테론 농도값을 적분하여 테스토스테론의 적분값(area under the curve for testosterone awakening response, TARauc)을 수득함;
    (f) 상기 테스토스테론의 적분값 6.6 nmol/L 을 기준으로 남성 갱년기 시작 여부에 대한 정보를 제공함;
    이 때, 상기 테스토스테론의 적분값 6.6 nmol/L 이하인 경우 남성 갱년기가 시작된 상태라고 판단함.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 테스토스테론 적분값으로 다음과 같은 추가 정보를 더 제공하는 것을 특징으로 하는 방법:
    적분값이 8 nmol/L 이상일 경우, 남성 갱년기가 없거나 미약함으로 평가;
    적분값이 6.2-7.2 nmol/L 일 경우, 남성 갱년기 경증 단계로 평가;
    적분값이 4.8-5.6 nmol/L 일 경우, 남성 갱년기 중증 단계로 평가;
    적분값이 3.3-4.6 nmol/L 일 경우, 남성 갱년기 고위험 단계로 평가.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 남성 갱년기 진단을 위한 정보는 남성의 성기능 저하 여부, 신체 기능 저하 여부 또는 정신 기능 저하 여부에 대한 정보를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은
    상기 (e)의 적분값을 y = 10.24 - (0.278 x TARauc) 연산식에 대입하여 남성 갱년기 증상 중 정신적 증상에 대한 수치로 전환할 수 있고,
    상기 전환된 수치가 0~5 면 남성 갱년기 증상 중 정신적 증상이 없거나 미약으로 평가,
    전환된 수치가 6~8이면 남성 갱년기 증상 중 정신적 증상이 경증으로 평가,
    전환된 수치가 10~12이면 남성 갱년기 증상 중 정신적 증상이 중증으로 평가,
    전환된 수치가 14 이상이면 남성 갱년기 증상 중 정신적 증상이 고위험으로 평가,
    하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은
    상기 (e)의 적분값을 y = 14.66 - (0.313 x TARauc) 연산식에 대입하여 남성 갱년기 증상 중 신체적 증상에 대한 수치로 전환할 수 있고,
    상기 전환된 수치가 9 이하면 남성 갱년기 증상 중 신체적 증상이 없거나 미약으로 평가,
    전환된 수치가 10~13이면 남성 갱년기 증상 중 신체적 증상이 경증으로 평가,
    전환된 수치가 14~19이면 남성 갱년기 증상 중 신체적 증상이 중증으로 평가,
    전환된 수치가 20 이상이면 남성 갱년기 증상 중 신체적 증상이 고위험으로 평가,
    하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은
    상기 (e)의 적분값을 y = 10.55 - (0.265 x TARauc) 연산식에 대입하여 남성 갱년기 증상 중 성기능 증상에 대한 수치로 전환할 수 있고,
    상기 전환된 수치가 5 이하면 남성 갱년기 증상 중 성기능 증상이 없거나 미약으로 평가,
    전환된 수치가 6~9이면 남성 갱년기 증상 중 성기능 증상이 경증으로 평가,
    전환된 수치가 10~13이면 남성 갱년기 증상 중 성기능 증상이 중증으로 평가,
    전환된 수치가 13 이상이면 남성 갱년기 증상 중 성기능 증상이 고위험으로 평가,
    하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 방법은
    상기 (e)의 적분값을 y = 35.98 - (0.924 x TARauc) 연산식에 대입하여 남성 갱년기 증상의 정도에 대한 수치로 전환할 수 있고,
    상기 전환된 수치가 21 이하면 남성 갱년기 증상의 정도가 없거나 미약으로 평가,
    전환된 수치가 23~30이면 남성 갱년기 증상의 정도가 경증으로 평가,
    전환된 수치가 33~41이면 남성 갱년기 증상의 정도가 중증으로 평가,
    전환된 수치가 45 이상이면 남성 갱년기 증상의 정도가 고위험으로 평가,
    하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 (a)의 제 1타액 내지 제 3타액은 냉동보관 또는 냉장보관된 것일 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 (a)의 제 1타액 내지 제 3타액은 객담제거 및 원심분리 중 선택되는 하나 이상을 추가적으로 더 수행하여 준비된 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 (a)의 제 1타액 내지 제 3타액 각각은 0.5mL 내지 2mL 준비하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 (c)에서 코티졸 농도의 증가량이 2.5 nmol/L 미만인 타액세트는 테스토스테론 측정 샘플로 선정하지 않고, 대상 남자가 다른 날에 타액세트를 채취하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 코티졸 또는 테스토스테론 농도의 측정은 액상-이중항체(liquid phased-double antibody) 방사면역측정법(radioimmunoassay, RIA)을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 4항, 제 5항, 제 6항 및 제 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 연산식의 상수는 남성 갱년기 증상(Aging male symptoms, AMS)에 대한 설문지의 점수를 이용하여 도출된 것을 특징으로 하는 방법.
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