KR101467372B1 - 타액을 이용한 생리활성 진단 방법 - Google Patents

타액을 이용한 생리활성 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리(월경) 활성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 타액 내 성호르몬을 측정하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 특정 pH 조절 및 온도 조절을 통해 타액을 정제함으로써 효과적으로 타액 내 에스트라디올의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 임상 및 비 임상단계의 다양한 연구분야 및 부신과 관련된 질환을 가진 환자의 건강상태 평가에 있어서 신속하고 객관적인 기준을 제공할 수 있으며, 스트레스와 관련되어 있는 부신 상태를 판별하는 유용한 지표로 사용될 수 있다.

Description

타액을 이용한 생리활성 진단 방법{A Method of Diagnosing a Menstrual Activation using Saliva}
본 발명은 생리(월경) 활성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 타액 내 성호르몬을 측정하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 특정 pH 조절 및 온도 조절을 통해 타액을 정제함으로써 효과적으로 타액 내 스페로이드 호르몬, 예를 들어, 에스트라디올의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
여성의 난소는 여러 발달단계에 있는 여포들로 구성되어 있으며 여포는 생식세포인 난자와 체세포인 난구세포와 협막세포롤 구성되어 있다. 난자를 둘러싸고 있는 난구세포와 협막세포는 여러 가지 스테로이드 호르몬을 생성, 분비하며 이들 호르몬은 난자의 성장과 성숙, 배란을 조절하고 자궁, 유선과 같은 생식활동에 필요한 부속기관의 기능을 조절하는 것으로 알려져 있다.
호르몬 생성, 분비의 하루주기 리듬은 뇌신경, 시상하부(hypothalamus), 뇌하수체 (pituitary)에 의하여 조절되는 것으로 알려져 있으며 근본적으로는 개인의 수면주기에 의하여 결정되어진다. 정상적으로 밤에 수면을 취한 후, 아침에 일어나면 뇌신경에서는 기상 (wake up)을 인지하며, 이 신호는 시상하부의 suprachiasmatic nucleus (SCN)에 도달하며, SCN에서는 생체시계 유전자 (bioclock gene)가 활성화 되며 이 신호는 다시 paraventricular nucleus (PVN)및 GnRH neurone 에 전달된다. PVN에서는 이 자극에 반응하여 부신피질자극호르몬 분비호르몬 (corticotropin releasing hormone, CRH)을 분비하며, GnRH neurone에서는 GnRH를 분비한다. 분비된 CRH 및 GnRH는 뇌하수체를 자극하여 부신피질자극호르몬 (adrenocorticotrophic hormone, ACTH), 여포자극호르몬 (follicle stimulating hormone, FSH) 및 황체형성 호르몬 (luteinizing hormone, LH) 각각 생성, 분비하게 된다.
뇌하수체에서 생성, 분비되는 ACTH 및 FSH, LH는 각각 부신 및 생식소(난소)에 각각 작용하여 코티졸 및 에스트라디올 혹은 프로제스테론을 생성, 분비를 조절하게 된다.
부신피질의 코티졸 생성은 매우 뚜렷한 일주기 리듬을 나타내는 특징을 가지고 있다. 부신피질에서 생성, 분비되는 코티졸의 일주기 리듬은 기상직후 급격한 증가를 보이며 기상 30분 후에 하루중 최고의 농도에 이르게 된다. 이러한 현상을 '기상 직후 리듬'이라고 한다. 그 후 코티졸 농도는 점차 감소하여 취침 전에 가장 낮은 농도로 나타난다. 부신피질에서 생성되는 호르몬인 코티졸은 기상 30분후에 하루 중 가장 높은 농도를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나 여성 호르몬이 기상 후 어떤 변화를 보인지에 대해서는 밝혀진 바 없다.
특히, 여성의 생리주기는 시상하부 (hypothalamus) - 뇌하수체 (pituitary) -생식소 (gonard)의 축 (HPG axis)에서 이루어지는 다양한 호르몬 및 신경에 의하여 조절되고 있으며 그 조절과정에 정교한 일주기 리듬이 포함되어져 있다는 사실을 알 수 있다. 그러나 지금까지는 호르몬 생성, 분비의 일주기리듬을 무시하고 내원하는 환자에서 혈액을 채취하여 난소기능을 평가하였기 때문에 생리활성의 변화등의 기능적인 부분은 진단되기가 비교적 어려웠고 타액에 포함되어 있는 에스트라디올을 측정하여 생리활성의 변화를 객관적으로 판단할 수 있는 정보는 전무한 상태이다.
이에 본 발명자는, 기상 후 최초 1시간 동안의 에스트라디올(estradiol)의 농도가 증가되는 것을 발견하고, 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 1시간 간격으로 채취한 타액에 포함되어 있는 에스트라디올 농도변화를 측정함으로써, 생리활성의 정상 여부 및 난소기능, 호르몬 분비기능 정상 여부도 판별할 수 있음을 확인하고, 타액 내 존재하는 미량의 에스트라디올을 검출하기 위한 타액 정제 공정을 연구하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생리활성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 타액 내 에스트라디올(estradiol)의 농도를 측정하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 타액 내 에스트라디올의 농도를 측정하기 위하여 특정 pH 조절 및 온도 조절을 통해 타액을 정제하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 에스트라디올의 농도변화를 통해 생리활성의 정상 여부를 판단하는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 목적으로, 본 발명은 생리 주기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 정제된 타액에 대하여 방사면역측정법을 이용하여 에스트라디올의 농도를 측정하는 방법을 제공한다:
(a) 채취한 타액에 pH 12~14의 강염기를 처리하는 단계;
(b) 가열 후 냉각시키는 단계;
(c) 원심분리에 의해 타액으로부터 소화효소 및 박테리아를 제거하는 단계;
(d) 중화 단계;
(e) 뮤코단백질 분해효소에 의해 뮤코단백질 제거단계;
(f) 원심분리에 의해 상기 뮤코단백질 분해효소를 제거하는 단계; 및
(g) 타액과 동일양의 젤라틴을 포함하는 완충액을 혼합하는 단계.
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이 때, 상기 (a)단계에서 타액의 채취는 기상 후 1시간 이내에 이루어지는 것이 바람직하고, 예를 들어, 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 1시간별로 채취하는 것이 더욱 바람직하다.
그리고, 상기 (a)단계에서 pH 12~14의 강염기는 NaOH, LiOH, KOH, Ca(OH)2 로 구성된 군에서 선택되는 1종일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 1N NaOH를 사용하였다.
또한, 상기 (b)단계에서 가열은 70~90℃의 온도로 이루어지는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 약 80℃이다. 그리고, 상기 냉각은 예를 들어, 얼음수조를 이용하여 급냉시키는 것에 의해 수행될 수 있다.
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또한, 상기 (d) 중화단계는 pH 1~2의 강산을 처리하는 것에 의해 수행되는 것이 가장 대표적인데, 특히, 상기 pH 1~2의 강산은 HCl, H2SO4, HNO3로 구성된 군에서 선택되는 1종일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 1N HCl을 사용하였다.
또한, 상기 뮤코단백질(점액단백질) 제거는 뮤코단백질 분해효소를 처리하는 것에 의해 이루어진다. 상기 뮤코단백질은 열에 의해 변성되지 않기 때문에 효소를 이용하여 제거하는 방법을 사용하는 것이다.
이 때, 상기 뮤코단백질 분해효소는 β-Nacetylhexosamine-[1→4] glycosidic bond을 분해할 수 있는 효소면 어느 것이나 가능하며, 본 발명의 일 실시예에서는 hyaluronidase type 1 (H 3506, Sigmaaldrich chemical co.) 500 IU를 사용하였다.
마지막으로, 완충액을 혼합하는 단계를 추가로 수행함으로써, 타액 정제공정을 마무리할 수 있다. 이 때, 상기 완충액은 타액과 동일양의 젤라틴을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 젤라틴은 타액 내 미량의 에스트라디올이 균질하게 분포하도록 유도하고 타액이 분석과정 중 외부 공기에 노출되더라도 최적의 산도를 유지하도록 한다.
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또한, 상기 에스트라디올의 농도는 방사면역측정법을 이용하여 측정하는 것이 가장 바람직하다.
한편, 본 발명은 생리활성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 다음을 포함하는 에스트라디올의 농도를 분석하는 방법을 제공한다:
(a) 제1항의 방법으로 정상적인 생리주기를 가진 여성의 타액 내 에스트라디올의 농도를 측정하는 단계;
(b) 상기 측정된 에스트라디올의 농도값으로 기준 지표를 설정하는 단계;
(c) 제1항의 방법으로 시험 대상 여성의 타액 내 에스트라디올의 농도를 측정하는 단계;
(d) 상기 수득한 에스트라디올의 농도를 (b)단계에서 설정한 기준 지표값과 비교하는 단계.
앞서 언급한 바와 같이, 상기 에스트라디올의 농도는 기상 후 1시간 이내에 채취한 타액으로부터 측정한 것이 바람직하다.
특히, 상기 에스트라디올의 농도 분석은 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 1시간별로 채취한 타액으로부터 측정한 에스트라디올의 농도변화에 대하여 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.
이 때, 상기 시험 대상 여성의 타액 내 에스트라디올의 농도변화가 정상적인 생리주기를 가진 여성의 농도변화값으로 설정한 기준 지표의 범위를 벗어나는지 여부를 비교하는데, 만약 상기 지표의 범위를 벗어나는 경우에는 "생리활성 비정상"으로 판별할 수 있다.
본 발명은 아침 기상 후 성호르몬인 에스트라디올의 농도가 증가하는 현상을 처음으로 규명하였고, 이러한 타액 내 에스트라디올의 농도를 정확히 측정하기 위해, 급속한 온도 변화 및 pH 변화를 이용하여 타액 내 단백질을 변성시키는 공정을 이용함을 특징으로 하고 있다. 이러한 정확한 에스트라디올의 농도분석에 의해 난소의 기능, 생리불순 등에 대한 다양한 관점에서의 여성의 생리활성 진단에 필요한 정보를 수집할 수 있다.
본 발명은 급속한 온도 변화 및 pH 변화를 통해 타액 내에 포함되어 있는 단백질을 변성시켜 타액을 정제함으로써, 타액 내 미량의 에스트라디올을 검출할 수 있게 한다.
따라서, 본 발명은 기상 후 1시간 내 채취한 타액에 포함되어 있는 에스트라디올 농도를 측정하여, 지표화된 기상 후 에스트라디올(estradiol)의 농도변화를 통해 생리활성의 정상 여부를 신속하고 객관적으로 판별 가능함은 물론 에스트라디올의 기상 후 농도 변화를 기준으로 난소의 에스트라디올의 비정상적 증진 또는 비정상적 감소의 평가를 통해 난소의 이상, 폐경기의 조기진단, 원인을 알 수 없는 생리불순을 진단하는데 필요한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 정상적인 생리주기를 갖는 여성(a), 폐경기 여성(b) 및 생리불순인 여성(c)에서 각각 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 60분에 채취한 타액에서의 코티졸 농도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 생리주기를 갖는 여성(a), 폐경기 여성(b) 및 생리불순인 여성(c)에서 각각 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 60분에 채취한 타액에서의 에스트라디올 농도의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 3은 정상적인 생리주기를 갖는 여성에서 기상직후(a), 기상 후 30분(b) 및 기상 후 60분(c)의 타액내 에스트라디올 농도의 분포를 히스토그램으로 도시한 도면이다.
도 4는 정상적인 생리주기를 갖는 여성의 생리주기에 따라 Peak/A0% 의 변화(a) 및 MinInc%의 변화(b)를 도시한 도면이다.
도 5는 정상적인 생리주기를 갖는 여성, 폐경기여성 및 생리불순인 여성에서 Peak/A0% 및 MinInc%의 차이를 도시한 도면이다.
본 발명에서 사용되는 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"진단"은 특정 병리 또는 생리 상태의 존재 또는 활성 등을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 여성의 생리 활성, 생리 주기 및 관련 상태를 확인하는 것이다. 이러한 생리 활성 진단은 가임, 피임 및 여성질환의 발병 관련성에 대한 정보 제공에 유용하다.
"대상" 또는 "개체"는 동물, 몇몇 구체예에서는 포유동물, 그리고 다른 구체예에서는 치료, 관찰 또는 실험 대상인 인간을 의미하는 것이다. 특히, 본 발명에서는 인간 여성을 대상으로 하였다.
"시료" 또는 "샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 액형 조직일 수 있다. 본 발명에서는 타액(saliva)을 사용한다.
"성호르몬"이란 척추동물의 암컷·수컷의 생식선에서 분비되는 호르몬으로 생식기의 발육을 촉진시키고 그 기능을 유지시키는 역할을 한다. 호르몬을 분비하는 생식선은 웅성의 경우는 정소 중의 간세포(間細胞)이고 자성은 주로 난소(卵巢) 중의 여포나 황체이다. 생식선뿐만 아니라 부신피질로부터도 성호르몬의 작용을 갖는 물질이 분비된다. 또, 임신 중에는 태반으로부터도 성호르몬이 분비되어 임신유지에 기여한다. 성호르몬은 모두 스테로이드계 물질이다
"생리 또는 월경"은 인간의 성인 여성이 주기적으로 몸안의 난소에서 난자를 만들어 내고 수정되었을 경우 수정란이 자궁에 착상하게 하기 위한 자궁점막이 이후 출혈과 함께 질을 통해 배출되는 생리 현상을 말한다. 보통 28일 정도의 주기를 가지며 3~5일 정도 지속된다. 하지만 개인 별로 또한 몸상태에 따라 주기가 차이가 날 수 있다. 대개 12~15세 정도로 성장하게 되면 처음 월경을 시작하게 되며, 여성은 일생동안 약 400회의 월경을 하게 되고 이후 45~55세가 되면 폐경기가 되어 월경을 멈추게 된다. 월경으로 흘리는 피는 약 35 ml이며 10~80 ml 이내는 정상이다.
"월경주기 또는 생리주기(menstrual cycle)"란 내분비계통 호르몬의 영향에 의해 생식기관에 나타나는 규칙적인 변화로 21~35일 사이로 일정치는 않으나 대개 약 28일을 주기로 반복되며 월경이 시작되는 날부터 다음 월경이 나타날 때까지의 기간을 말한다. 자궁내막과 난소는 여성 호르몬의 분비 정도에 의해 주기성을 나타내는데, 자궁내막이 허물어지면서 출혈을 하는 경우를 월경이라 하고, 난소 내의 난포가 성숙하여 난자를 방출할 때를 배란일이라 한다. 월경 시작일로부터 약 13~15일 사이에 배란이 일어나고 이 때가 임신이 가장 잘 되는 시기이다.
본 발명에서는 상기 생리주기 또는 월경주기 진단으로 생리활성(menstrual activation)을 판별 및 진단하는 것을 포함한다. 따라서 본 명세서에서는 "생리주기 진단"과 "생리활성 진단"이라는 용어가 혼용되어 사용되고 있다.
"생리불순"이란, 생리주기와 생리양의 이상이 있는 경우로, 생리불순에는 생리주기가 정상 날짜에 비해 1주일 이상 앞당겨 오는 것(빈발월경)과 1주일 이상 늦어지는 것(희발월경) 월경할 때마다 나오는 피 양이 정상에 비하여 많이 나오는 것(과다월경)과, 적게 나오는 것(과소월경), 불규칙적인 경우(부정자궁출혈)가 있다
"폐경기(閉經期)"는 여성의 월경이 완전히 멈추는 시기로 갱년기(更年期)라고도 한다. 대개 40~55세 사이에 나타나며, 어떤 여성은 수술이나 조기 난소기능부진으로 일찍 폐경이 되기도 한다. 지난 12개월간 지속적으로 월경이 없었다면 폐경기에 접어들었다고 볼 수 있다. 폐경기 동안 에스트로겐과 프로게스테론이라는 호르몬의 생산이 서서히 줄어든다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 생리 주기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 타액 내의 에스트라디올의 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
(1) 본 발명에서는 여성의 생리활성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 "에스트라디올(estradiol)"의 농도 변화를 이용한다.
여성의 생리주기는 사춘기에 시작되어 폐경기에 이를 때까지 임신기간, 수유기간을 제외하고는 여성 삶의 일부분으로 자리한다. 여성의 생기주기는 크게 여포기, 배란기 황체기, 월경기로 나누어지고 있다.
여포기는 여포의 성장기로로서 6-12개의 여포가 동시에 성장되는 시기이다 이때의 여포에서는 주로 에스트라디올 생성, 분비하며 FSH의 농도가 높다. 에스트라디올의 농도는 배란 전에 최고치에 이르며 점차 감소하는 것으로 알려져 있으며 배란기의 여포에서는 프로제스테론이 주로 생성, 분비되어 진다. 프로제스테론의 농도는 황체기에 가장 높고 월경기 동안에 감소하게 된다. 이러한 형태의 주기를 '난소주기'라 부른다. 흥미롭게도 체내의 스테로이드 호르몬 생성은 두 내분비기관, 부신 및 생식소에서 이루어지며 코티졸은 부신피질에서, 에스트라디올은 난소에서 주로 생성되어진다.
여포의 에스트라디올 및 프로제스테론 생성은 시상하부 및 뇌하수체에서 생성, 분비되는 호르몬에 의하여 조절 받게 되느데 이축을 시상하부 (hypothalamus) - 뇌하수체 (pituitary) -생식소 (gonard)의 축 (HPG axis) 이라고 한다. 뇌하수체에서 생성되는 호르몬에 의해 조절되는 내분기기관 (부신, 생식소등)의 호르몬 생성, 분비는 하루 단위의 일정한 주기를 가지고 있다. 이러한 호르몬의 주기를 '일일주기(一日週期) 리듬' 이라고 하며 기상 후부터 취침 전까지 이어지는 리듬을 '일주기 (日週期) 리듬' 이라고 한다. 여포의 이러한 호르몬 생성, 분비는 결국 여성의 생리주기조절 및 임신의 유지에 필수적인 요소이다.
여성 호르몬의 변화는 난소를 구성하고 있는 여포에 의하여 결정되기도 하지만 생식연령에 포함되어 있는 여성의 경우에도 호르몬 복용(피임제등), 스트레스, 영양상태등의 오적요인에 의하여 많은 영향을 받아 생리주기에 변화 (단축 및 지연)가 있을 수 있으며, 비정상적인 호르몬의 농도 및 에스트라디올과 프로제스테론의 호르몬의 불균형은 다낭성 난소증후군 (난소물혹), 자궁내막증, 유방암, 심혈관계 질환등과도 높은 연관성 있는 것으로 알려져 있다.
특히, 에스트라디올은 난소의 스테로이드 생성과정 중 최종산물이며 난자의 성장과 자궁비후의 조절자 역할을 한다. 생리주기의 지연은 난소주기과정 중 여포기가 길어지는 특성이 있으며 폐경기 여성의 난소에서는 여포기 난소로 여포가 발달되지 않은 특징을 보인다. 이러한 결과로서 폐경기 여성에서 에스트라디올 농도는 생리주기를 갖는 여성보다 매우 낮은 농도로 나타난다.
본 발명에서는 이러한 "에스트라디올"의 농도를 측정함으로써 생리주기등에 대한 생리활성에 대한 정보를 수득한다.
에스트라디올은 생리주기에 따라 뚜렷한 호르몬 주기를 보이며 호르몬 주기의 이상은 난소주기에 이상과 직결되어 있다.
폐경은 더 이상 여포의 성장이 일어나지 않으므로 난소의 여성호르몬 생성이 최저 상태에 이르며 일정한 리듬을 갖지 못하는 결과로 나타난다. 이와 더불어 여성의 자궁과 기타 생식에 관련된 부속기관의 생리적 변화가 주기적으로 나타나지 않은 단계이다. 즉, 생식에 관련된 모든 기관의 기능이 정지된 상태를 의미한다. 그러나, 생리불순(단축 및 지연)은 대개 여포기가 짧아지는지 혹은 늦어지는지에 따라 결정되어 진다.
특히, 본 발명에서 에스트라디올로서 베타 에스트라디올(β-estradiol)인 것이 바람직하다.
베타 에스트라디올은 척추동물의 암컷의 난소에서 분비되는 스테로이드 호르몬인 에스트라디올의 한 종류로써, 난소·태반 등에서 추출·결정화되는 여포호르몬의 하나이다. 암컷의 생식선을 발달시켜 2차·3차성징을 나타내는데, 특히 포유류에서 발정을 일으킨다. 또한, 세포핵에 들어가 새로운 단백질의 합성을 촉진하고, 세포의 증식을 일으키는 작용이 있다. 특히, 베타 에스트라디올은 여성의 몸 안에서 심하게 변동하는 생식호르몬으로, 카페인과 비슷한 작용, 즉 아데노신이 원래부터 가지고 있는 억제효과를 상쇄함으로써, 여성들이 월경 주기 중 여포기 후기, 곧 배란 직전에 경험한다는 가벼운 흥분을 일으키는 물질로 알려져 있다. 또한, 프로락틴분비를 촉진하는 인자(prolactin releasing factor: PRF)로도 사용되고, 종양을 생성·촉진하는 발암물질이라는 연구도 있다.
그 동안 폐경기 조기진단, 원인을 알 수 없는 생리불순 등에 대한 진단은 혈액에 포함되어 있는 뇌하수체 호르몬 (FSH 및 LH)을 측정함으로써 이루어져 왔다. 그러나, 본 발명의 실시예에서 확인하과 있는 바와 같이, 본 발명의 지표를 이용할 경우 에스트라디올 기상 후 농도 변화의 정상여부 신뢰도가 높고, 객관적이며 신속하게 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 에스트라디올의 기상 후 농도 변화를 기준으로 하여 난소의 에스트라디올의 비정상적 증진 또는 비정상적 감소의 평가가 가능하여 난소의 이상, 폐경기의 조기진단, 원인을 알 수 없는 생리불순을 진단하는데 많은 도움이 된다.
(2) 본 발명은 "타액(saliva)"에 존재하는 에스트라디올의 농도를 측정한다.
그 동안 호르몬의 농도는 혈액에서 주로 측정하였다. 내분비학 관점에서 보면 혈액은 호르몬의 표적기관이 아니라 단순한 호르몬의 이동매체이다. 대부분의 혈중 단백질계열 호르몬 (성장호르몬, 인슐린 등)은 물에 잘 용해되며 혈중에서는 활성화된 형태로 존재하지만 부신피질, 성선에서 생성되는 스테로이드는 물에 잘 녹지 않기 때문에 다른 매체 (운반단백질)와 결합하여 혈중에 존재한다. 스테로이드가 운반매체와 결합되어 있을 때는 표적기관의 호르몬 수용체에 작용하지 못하기 때문에 '불활성 상태'라 하며 생리적인 기작을 유도할 수 없다. 혈중 스테로이드 대부분(95-99%)은 이러한 불활성 상태로 존재하며 극히 일부 (1-4%)만 운반매체와 결합되어있지 않은 상태(활성상태)로 존재하는 것으로 알려져 있다. 따라서 혈중 스테로이드의 농도는 활성 상태의 호르몬의 농도라기보다는 대부분 불활성 상태의 농도라 할 수 있다.
이에 반하여, 타액에 포함되어 있는 스테로이드는 혈액과 달리 모두 운반매체와 결합되어 있지 않은 활성 상태이며 조직외액(extracelluar fluid)에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드가 단순 확산방식(passive diffusion)에 의해 타액샘으로 이동한 것 이다. 따라서 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 조직 안에 포함되어 있는 활성상태의 스테로이드로 인식되고 있다.
또한, 타액은 혈액과 달리 의료진의 도움 없이도 개인의 수면주기에 맞추어 일반인이 쉽게 채취할 수 있기 때문에 개인의 호르몬 하루주기 리듬에 대한 연구를 쉽게 진행할 수 있는 장점을 가지고 있다. 즉, 타액을 이용할 경우 혈액으로 접근이 어려웠던 활성상태의 스테로이드의 농도와 개인의 호르몬 하루주기 리듬에 대한 접근이 용이하다는 장점이 있다.
본 발명은 타액 내 존재하는 에스트라디올의 농도를 측정하는 바, 상기와 같은 장점을 효과로 발휘할 수 있다.
다만, 타액에 포함되어 있는 스테로이드 농도는 혈액의 1/100-1/1000 정도로 매우 낮기 때문에 상용화된 호르몬 분석 키트로는 분석이 불가능한 문제점이 존재하였다.
(3) 따라서, 본 발명은 타액에 포함되어 있는 미량의 에스트라디올 농도를 측정하기 위하여 다음과 같은 타액 정제방법을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 채취한 타액에 pH 12~14의 강염기를 처리하는 단계;
(b) 가열 후 냉각시키는 단계;
(c) 원심분리에 의해 타액으로부터 소화효소 및 박테리아를 제거하는 단계;
(d) 중화 단계;
(e) 뮤코단백질 분해효소에 의해 뮤코단백질 제거단계;
(f) 원심분리에 의해 상기 뮤코단백질 분해효소를 제거하는 단계; 및
(g) 타액과 동일양의 젤라틴을 포함하는 완충액을 혼합하는 단계.
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우선, 대상으로부터 타액을 채취한다.
바람직하게는 여성들에게 아침에 잠에서 깨는 순간(기상직후, 1분이내), 기상 후 30분, 기상 후 60분별로 각각 타액 시료를 제공된 채취용 튜브에 직접 뱉도록 하여 채취할 수 있다. 이 때, 기상 후 1시간 동안 양치질, 흡연, 카페인이 포함되어 있는 음료 섭취 및 간식이나 식사를 하지 않는 것이 바람직하다.
그리고, 채취한 타액에 pH 12~14의 강염기 용액을 처리한다.
상기 pH 12~14의 강염기는 NaOH, LiOH, KOH, Ca(OH)2 로 구성된 군에서 선택되는 1종의 강염기 용액일 수 있으며, 약 1N 농도인 것이 바람직하다.
이렇게 강염기를 처리한 타액을 20분 내지 30분 동안 70℃~90℃의 온도로 가열한 후, 급속히 온도를 낮춘다. 본 발명의 일 실시예에서는 80℃에서 약 20분동안 가열한 다음 얼음수조를 이용하여 급냉각시켰다.
그 후, 원심분리를 수행하여 타액에 포함되어 있는 소화효소, 박테리아 등을 제거하는 것이 더욱 바람직하다.
이와 같이, 본 발명은 "단백질 변성 원리"를 이용하여 타액을 정제함으로써, 타액 내 미량의 에스트라디올을 검출가능하게 한다.
단백질 변성이란 단백질이 물리적 요인(가열, 건조, 교반, 압력, X-선, 초음파, 진동, 동결), 화학적 요인(산, 염기, 요소, 유기용매, 중금속, 계면활성제) 및 효소작용 등에 의해 1차 구조(peptide structure)의 변화없이 특유의 고차구조(2차, 3차, 4차)가 변하는 현상을 일컫는다. 이 중에서, 열변성의 온도는 대개의 단백질에서 60∼70℃이며 온도가 높아질수록 변성속도는 빨라진다.
본 발명에서는 특히, 급속한 온도 변화 및 pH 변화를 통해 타액 내에 포함되어 있는 단백질을 변성시킨다. 그리고, 이를 통해 정확성을 높이고, 분석 시간을 단축시키는 효과를 가진다.
일반적인 타액 정제공정에서는 열처리로 약 60 ℃에서 2시간 동안 가열하고 식힌 후, 원심분리하고 바로 분석을 행한다(Howard et al., 1989; Tamate et al., 1997) 그러나, 온도에 의해 변성된 단백질은 온도가 서서히 내려갈 때, 원 상태로 돌아가는 성질이 있고 원래 상태로 돌아가면 원심분리로 분리가 어려워지는 문제점이 있다.
이에 반하여, 본 발명은 강염기 처리 후 20~30분의 단시간의 고열에 노출시키고 얼음 수조 등을 이용하여 급냉시킴으로써 단백질을 변성시키기 때문에 이러한 문제점이 없다.
다음으로, 본 발명에서는 염기성을 나타내고 있는 상기 시료에 대하여 중성 pH로 맞추는 중화단계를 수행한다. 가장 대표적으로 사용할 수 있는 방법은 pH 1~2의 강산 용액을 처리하는 것이다. pH 1~2의 강산은 예를 들어, HCl, H2SO4, HNO3 등으로 구성된 군에서 선택되는 1종을 사용할 수 있으며, 약 1N 농도로 사용할 수 있다.
바람직하게는, 원심분리 후 수득한 상층액에 대하여 1N 농도로 pH 1~2의 강산 용액을 처리하여 중성 산도(pH)를 맞춘다.
그리고,상기 수득한 중성 시료에 대하여 뮤코단백질(점액단백질) 분해효소를 처리하여 타액 내의 뮤코단백질을 제거한다.
점액(mucus)은 겔을 형성할 수 있는 생물학적 액체로, 물과 다양한 세포의 분비산물을 포함하는 성분들의 혼합물이다. 또한, 뮤신(mucin)은 뮤코단백질(mucus glycoprotein) 또는 상피당단백질(epithelialglycoprotein)로 불리우며, 다수의 이당류 측쇄(side chain)가 펩티드 중심(core)에 N- 및 O- 결합으로 연결되어 있는 것으로 특정지워지는 점액과 당복합물(glycoconjugate)의 주 구성성분이다
상기 뮤코단백질은 열에 의해 변성되지 않기 때문에 직접 이를 분해할 수 있는 다양한 점액분해제들 또는 뮤코단백질 분해효소들을 사용한다.
본 발명의 뮤코단백질 분해효소는 β-Nacetylhexosamine-[1→4] glycosidic bond을 분해할 수 있는 효소면 어느 것이나 가능하며, 본 발명의 일 실시예에서는 hyaluronidase type 1 (H 3506, Sigmaaldrich chemical co.) 500 IU를 사용하였다.
뿐만 아니라, 뮤코단백질 분해효소의 작용의 기전들에 근거하여, 점액분해제들 또는 뮤코단백질 분해효소들은 흔히 다음에 오는 그룹들로 분류될 수 있다 : 뮤신 당단백질들의 단백질 중심부를 분해시키는 프로테아제들 (예를 들면, 프로나아제(pronase), 파파인(papain)); 뮤코단백질(mucoprotein) 이황화 연결들(disulfide linkages)을 쪼개는 설프히드릴 화합물들 ; 그리고 점액질 내에서 비공유 결합들을 파괴시키는 세척제들 (예를 들면, 트리톤 엑스-100, 트윈 20). 추가적인 화합물들은 이러한 맥락에서, 거기에 국한되지는 않으나, 담즙산염과 계면 활성제들, 예를 들면, 소듐 데옥시콜레이트(sodium deoxycholate), 소듐 타우로데옥시콜레이트(sodium taurodeoxycholate), 소듐 글리콜레이트, 그리고 리소포스파티딜 콜린(lysophosphatidylcholine)을 포함한다.
본 발명에서는 상기 뮤코단백질 분해효소를 처리하고 약 37℃ 에서 10~15분 동안 반응시켜 타액 내의 뮤코단백질을 분해할 수 있다.
그리고, 상기 시료를 70℃~90℃의 온도로 가열한 후, 급속히 온도를 낮추어 상기 뮤코단백질 분해효소의 변성을 유도한다. 본 발명의 일 실시예에서는 80℃에서 약 10분동안 가열한 다음 얼음수조를 이용하여 급냉각시켰다. 그 후, 원심분리에 의해 상기 변성된 뮤코단백질 분해효소를 제거한다.
마지막으로, 상기 수득된 시료에 완충액을 섞어 타액 정제과정을 마무리한다.
특히, 상기 완충액은 타액과 동일양의 젤라틴을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 젤라틴은 미량의 스테로이드, 에스트라디올이 균질하게 분포하도록 유도하고 타액이 분석과정 중 외부 공기에 노출되더라도 최적의 산도를 유지하도록 한다.
본 발명의 에스트라디올 농도 측정을 위한 상기 타액 정제 공정은 강염기 처리, 가열 및 급냉 단계에 약 25분 ~30분이 소요되고, 뮤코단백질 제거 및 여기에 사용된 효소 제거에 약 20분 ~25분이 소요되므로, 총 50분 ~ 60분의 공정에 해당한다. 이는 2시간 이상의 가열이 필요했던 종래의 타액 정제 공정과 비교하여 시간적으로 훨씬 단축되는 효과가 있다.
한편, 본 발명에서 에스트라디올 농도 측정은, 제한은 없으나, 방사선 면역 측정법을 이용하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 효소를 표지자로 이용한 효소면역측정법(EIA), luminol이나 그 유도체 또는 aminobutyl-ethylisoluminol(ABEI)로 감도를 증가시킨 화학섬광면역측정법(chemiluminescence immunoassay; CIA), 또는 형광물질표지자(fluorescent label)를 이용한 형광면역측정법(fluorescence immunoassay; FIA) 등이 사용될 수 있으나, 특히, 방사면역측정법을 사용하는 것이 좋다.
방사면역측정법은 높은 감도(sensitivity)와 정밀도(precision), 정확도(accuracy)를 나타내며, 반응 후의 분명하고 명백한 검출을 가능케 해주는 등 여러 이점을 가지고 있는 바, 가장 바람직하게는 방사선 면역 측정법을 사용할 수 있고, 이를 위해 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)방법을 이용할 수 있다. 보다 상세한 측정과정은 액상-이중항체 방법을 이용한 호르몬 측정에 관한 논문(Salivary cortisol and DHEA levels in the Korean population; age-related differences, diurnal,and correlations with serum levels. Yonsei Med J. 2007;48:379-88)을 참조할 수 있다.
대부분의 호르몬 분석은 주로 항원-항체 반응을 이용한 면역 측정법을 이용하는데, 다양한 이물질이 항원-항체 반응과정에 교란의 요인으로 작용하여 실제 호르몬 수치와 다른 결과를 나타내는 경우가 많으므로, 본 발명의 방사면역측정법은 보다 정확한 농도측정이 가능하게 된다.
또한, 본 발명에서 상기 에스트라디올 농도 측정은 기상 후, 바람직하게는 기상 후 1시간 이내의 타액으로부터 측정되는 것이 좋다. 더욱 바람직하게는, 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 1시간 간격으로 이루어질 수 있다.
즉, 기상 후 최초 1시간 동안 나타나는 타액 에스트라디올의 농도 변화를 통하여 생리주기 및 생리활성 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
이 때, 정상적인 생리주기를 가지는 여성의 기상 후 최초 1시간 내의 에스트라디올(estradiol)의 농도변화를 지표화하여 사용하는 것이 바람직하다. 즉, 이러한 지표를 이용하여 대상 여성들의 생리활성의 정상 여부를 신속하고 객관적으로 판별 가능하고, 나아가 난소기능 및 호르몬 분비기능 정상 여부도 판별할 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 생리 주기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 다음을 포함하는 생리 주기 정상 여부를 판별하는 방법에 관한 것이다:
(a) 앞서 설명한 방법으로 정상적인 생리주기를 가진 여성의 타액 내 에스트라디올의 농도를 측정하는 단계;
(b) 측정된 에스트라디올의 농도값으로 기준 지표를 설정하는 단계;
(c) 앞서 설명한 방법으로 시험 대상 여성의 타액 내 에스트라디올의 농도를 측정하는 단계;
(d) 상기 수득한 에스트라디올의 농도를 (b)단계에서 설정한 기준 지표값과 비교하는 단계.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명은 정상적인 생리주기를 가진 여성의 기상 후 에스트라디올(estradiol)의 농도변화를 지표화하여 이것과 비교함으로써 생리주기의 정상 여부를 신속하고 객관적으로 판별할 수 있다.
상기 지표는 3개월 동안 지속적으로 정상적인 생리주기를 가진 여성의 에스트라디올 농도변화를 기준으로 하고, 통상 '정상적인 생리'는 24~32일 주기로 33~35ml (15~20 pad) 양으로 나온다.
기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 1시간 간격으로 타액 샘플을 수집하여 타액 중의 에스트라디올의 농도(수준)를 측정하고, 개인의 다른 습관 및 연습을 측정하고 조절하여 에스트라디올 농도 측정에서 정확도를 가장 잘 수득하는 것은 당해 분야의 전문가에게 익히 공지되어 있다. 샘플은 다음에 시험 시설로 보낼 수도 있고, 결과는 예를 들어, 인터넷을 통해 수득할 수 있다. 또한, 본래의 장소에서 측정을 수행하고, 팸파일럿(Palm Pilot)으로 공급할 수 있다.
이들 샘플은 적합한 분석 기술을 사용하여 각 시점에 에스트라디올 농도값을 분석한다. 타액 중의 에스트라디올은 매우 낮은 수준이지만 본 발명의 방법으로 정제된 타액은 상기 에스트라디올의 검출효율을 현저히 높여주기 때문에, 방사면역측정법 등을 이용하여 정확히 측정할 수 있다.
샘플은 특정한 방식으로 취급할 필요가 없고 실온에서 장기간 안정하므로, 기상 후 1시간 이내의 시간 경과에 따른 에스트라디올 수준을 도표로 만들고 배치할 수 있는 방법이 존재한다. 또한, 객관적 측정치를 개인에게 제공하므로, 시험을 관리하고 결과를 해석하는 의료 전문가와 상담할 필요 없이, 개인이 에스트라디올 농도변화에 따른 판단이 가능하게 한다. 수득된 시간 경과 데이터를 사용하여 개인의 에스트라디올 농도에 대해 3~6가지 상이한 값을 계산한다. 본 발명의 일 실시예에서는 기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 1시간 간격의 3가지 값을 계산하였다. 이 데이터 세트는 개인에 대한 기준 값으로 사용한다.
그리고, 이러한 데이터값 세트가 정상적인 생리주기를 가지는 여성으로부터 작성한 지표의 범위에 들어가는지 여부를 비교하여 판별한다. 비교 결과, 만약 상기 지표의 범위에 들어가지 않는 경우라면 정상적인 생리주기 진단 결과 양호하지 않는 것으로 판단할 수 있다.
즉, 에스트라디올의 기상 후 농도 변화를 기준으로 난소의 에스트라디올의 비정상적 증진 또는 비정상적 감소의 평가가 가능하여 난소의 이상, 폐경기의 조기진단, 원인을 알 수 없는 생리불순을 진단하는데 정보를 제공할 수 있다.
본 발명은 (i) 아침 기상 후 성호르몬인 에스트라디올의 농도가 증가하는 현상을 처음으로 규명하였고, (ii) 에스트라디올의 농도에 의해 난소의 기능, 예를 들어, 성호르몬을 생산할 수 있는 여포 유무, 폐경주변기 및 폐경기에는 성호르몬을 생산할 수 있는 여포가 없어지는지 여부 등을 간단히 확인할 수 있으며 (iii) 과도한 스트레스, 영향결핍, 과도한 운동 등의 요인으로 생리불순이 생겼는지 여부 등을 생식 연령기의 여성에서 확인할 수도 있는 등 다양한 관점에서 여성의 생리활성 진단에 필요한 정보를 수집할 수 있다.
[실시예]
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 스크리닝 대상자의 선별
타액을 채취하는 대상여성은 치료목적의 의약품 복용력, 생리주기, 폐경여부 및 시기 등을 확인하였고 몸무게와 키, 체질량지수를 측정하였다. 대상여성 중 최근 3개월 동안 지속적으로 정상적인 생리주기를 가진 여성과 최근 1년전에 지속적으로 정상적인 생리주기가 없는 폐경기 여성을 스크리닝 대상으로 포함시켰다.
그러나, ① 호르몬 대체요법, 경구 피임약 복용, tamoxifen 혹은 에스트로젠, 프로제스테론 코티졸이 포함되어 있는 약물을 복용하고 있는 여성, ② 임신중, 수유중, 불임판정, 성병 혹은 난소기능에 이상이 있다고 판정 받은 여성, ③ 암, 당뇨, 고/저혈압등의 심각한 질환이 있거나 체질량지수가 비정상 (BMI ≤18 or ≥25)인 여성은 제외하였다.
스크리닝 대상에 포함된 여성들에게 아침에 잠에서 깨는 순간(기상직후, 1분이내), 기상 후 30분, 기상 후 60분별로 각각 1ml의 타액 시료를 제공된 채취용 튜브에 직접 뱉도록 하였다.
여기서, 스크리닝 대상에 포함된 여성은 기상 후 1시간 동안 양치질, 흡연, 카페인이 포함되어 있는 음료수 섭취 및 간식이나 식사를 하지 않도록 하였으며, 타액 채취시간을 채취용 튜브표면에 유성펜을 이용하여 표기하도록 하였다.
부신에서 생성, 분비되는 코티졸은 매우 뚜렷한 일주기 리듬을 보이며 특히 기상직후 30분에 하루중 최고의 농도를 나타낸다. 그러나 기상 직후에 정확히 타액이 채취되지 않을 경우 기상 30분 후의 타액에서 측정한 코티졸 농도와의 차이가 나지 않는다. 이러한 결과는 최소 2.8nmol/L 정도의 차이가 있어야지 기상 직후에 정확히 타액이 채취되었다고 간주된다. 따라서 스크리닝 대상으로 포함된 여성들의 타액에서 먼저 코티졸을 정량 분석한 후, 기상 직후와 기상 후 30분에 채취한 시료에서 2.8nmol/L 이상 차이가 있는 시료만 선별하였다. 아울러 성기능이 내/외적 스트레스 요인에 의하여 영향을 받는바, 코티졸 농조가 극단적으로 낮거나 높아 부신기능에 이사이 있다고 판단되는 시료는 스크리닝 대상에서 제외하였다.
위의 기준을 만족하는 대상여성 중 정상적인 생리 주기를 가진 여성 80명, 폐경기 여성 57명, 60일 이상 원인이 밝혀져 있지 않은 생리불순 여성은 13명이 스크리닝 대상에 포함되었다. 정상적인 생리주기를 가진 여성은 생리 시작일을 기준으로 다음과 같이 세분하여 소그룹으로 만들었다.
phase Ⅰ: 생리일부터 2~3일 지난 소그룹(월경기 여성)
phase Ⅱ: 생리일부터 12~14일 지난 소그룹(여포기 후반기-배란초기 여성)
phase Ⅲ: 생리일부터 18~23일 지난 소그룹(초기 황체기 여성)
phase Ⅳ: 생리일부터 25~28일 지난 소그룹(후기 황체기 여성)
실시예 2 : 타액 정제
상기 채취한 타액 시료를 정제하였다.
우선 1N NaOH를 각각 처리한 타액을, 80℃에서 약 20분동안 가열한 다음 얼음수조를 이용하여 급냉각시켰다. 그리고, 원심분리를 수행하여 타액에 포함되어 있는 소화효소, 박테리아 등을 제거하였다. 그 후, 상청액을 수거하여 1N HCl을 처리하여 pH를 중성산도로 맞추었다.
그리고, 여기에 뮤코당 분해효소 hyaluronidase type 1 (H 3506, Sigmaaldrich chemical co.) 500 IU를 처리하고 약 37℃ 에서 10분 동안 반응시켜 타액 내의 뮤코단백질을 분해하였다.
상기 시료를 80℃에서 약 10분 동안 가열한 다음 얼음수조를 이용하여 급냉각시켰다. 그 후, 원심분리에 의해 상기 변성된 뮤코단백질 분해효소를 제거하였다.
마지막으로, 타액과 동일양의 0.2% 젤라틴을 포함하는 완충액을 섞어 타액 정제과정을 마무리하였다.
비교예 1 : 열처리에 의한 전처리와 pH 조절에 의한 전처리의 경우 에스트라디올 검출의 정확성 비교
방법 1 : 56℃로 2시간 가열 후 원심분리하여 전처리된 타액시료
기존의 타액 전처리 방법에 의거하여 (Howard et al., 1989; Tamate et al., 1997), 타액에 포함되어 있는 객담 및 이물질을 원심분리하여 (3000g, 10분) 제거한 후 타액 시료를 56℃에서 2시간 가열한 후 상온 (25℃) 에 10분간 방치한 후, 원심분리 (3000g, 20분)하고 상층액을 취하였다. (소요시간 약 3시간)
방법 2 : 산도 (pH) 변화를 통하여 전처리된 타액 시료(본 발명)
타액시료를 1차 원심분리(3000g, 10분)하여 객담성분 1차적으로 제거하였고, 상층액을 취하였다. 200 ul의 의 상층액에 1N NaOH 용액 50 ul를 더하여 80℃에서 20분간 가열하였다. 가열된 타액이 포함된 시험관은 얼음수조 (0 ℃)에 5분간 방치하여 급냉시킨 후, 원심분리 (12000g, 10분) 한 후 상층액을 취하였다. 취해진 상층액에 50ul의 1N HCl을 처리하고 뮤코당을 제거하기 위하여 hyaluronidase type 1 (H 3506, Sigmaaldrich chemical co.) 500 IU 을 처리하여 37℃에서 10분간 방치하였다. 효소의 활성을 없애고 이를 제거하기 위하여 80℃에서 10분간 가열후 원심분리 (12000g, 10분) 하였다. (소요시간 약 1시간 30분)
각각의 방법으로 처리된 처리된 타액시료가 방사면역측정법에 의한 에스트라디올 정량분석시 미치는 영향에 대하여 조사하였다.
이를 위하여 타액시료를 1차 원심분리(3000g, 10분)하여 객담성분을 1차적으로 제거하였고, 상층액을 취하였다. 상층액에 Dextrane이 코팅된 활성탄 (dextran coated 0.1% activated charcoal (w/v))을 4℃로 유지되는 저온실에서 12시간 동안 교반하여 타액 시료내에 포함되어 있는 분자량이 작은 물질들을 제거하였다 (charcoal stripped saliva, CSS). 이 CSS에 잔류 스테로이드 호르몬이 포함되어 있는지 RIA 방법으로 확인한 결과 CSS내에는 코티졸 및 성 호르몬이 포함되어 있지 않았다 (검출범위 이하). CSS에 기지농도(旣知濃度)의 에스트라디올 (50 pg/100 ul)를 각각 첨가하여 방법1)과 방법2)에 의한 타액시료 전처리 과정을 수행한 후 타액 시료 내에 이들 에스트라디올을 각각 정량분석하였다.
그 결과를 표 1에 도시하였다.
전처리 과정 없음
(pg/100 ul)		 방법 1
(pg/100 ul)		 방법 2
(pg/100 ul)
에스트라디올 첨가
(50 pg/100ul)		 56.2 ± 3.2 44.6 ± 2.2 47.9 ± 2.3
표 1에서와 같이 전처리하지 않은 타액시료에서는 스테로이드 호르몬이 기대농도보다 다소 높게 검출되었다. 이는 타액 시료내에 포함되어있는 활성탄으로 제거하지 못한 분자량이 큰 물질 (단백질, 뮤코당등)이 호르몬 정량분석시 항원-항체반응을 간섭한 효과로 해석되어 진다.
그리고, 방법1)에 의하여 전처리 된 타액시료에서는 코티졸을 제외한 성호르몬은 기대농도 보다 다소 낮게 검출되었으나 방법2)에 의하여 전처리된 타액시료에서 검출된 스테로이드 호르몬들의 검출농도와 비교하면 유의하게 높은 농도로 검출되었다.
또한 방법2)의 경우 기대농도와 유의한 차이없이 스테로이드 호르몬이 검출되는 바, 방법2)의 큰분자량 물질의 제거와 함께 다당류의 분해가 검출농도의 정확성을 향상시키는 것으로 여겨진다.
실시예 3 : 호르몬 분석
실시예 2의 방법으로 정제된 타액 시료는 방사면역측정법, 특히 액상-이중 항체(liquid-phased-double antibody)방법을 이용하여 측정 하였다.
표준 시료로 사용되는 순수 코티졸, 에스트라디올은 시그마-알드리치 사에서 구입하여 사용하였으며, 에틸알코올(ethyl alcohol)과 프로필렌글리콜(prophylene glycol)이 1:1의 비율로 혼합된 유기 용매에 녹이고 정해진 농도에 따라 0.1% 젤라틴(gelatin)이 녹아있는 인산염 완충용액 (GPBS, pH = 7.2, 이하 GPBS)로 더 희석하여 표준 (standard) 시료를 제조하였다. 방사선으로 표지된 코티졸[cortisol-3-(O-carboxymethyloximino)-2-125Iiodohistamine], 에스트라디올[estradiol-3-(O-carboxymethyloximino)-2-125Iiodohistamine]은 퍼킨엘머(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)에서 구입하여 사용하였다.
코티졸, 에스트라디올의 항체는 바이오제네시스 사에서 구입하여 사용하였다. 코티졸 항체는 알도스테론 (aldosterone)과 1.001% 11-디옥시코르티코스테론 (11-deoxycorticosterone)과 4.1%, 디옥시코티졸 (deoxycortisol)과 5.7%, 21-디옥시코티졸(21-deoxycortisol)과 0.5% 코르티코스테론(corticosterone)과 2.1% 이밖의 다른 스테로이드 호르몬과는 0.001% 이하의 교차반응 하였다. 에스트라디올 항체는 에스트론 (estrone)과 0.4%, 에스트리올 (estriol)과 0.1%, 디하이드로테스토스테론 (dehydrotestosterone)과 0.05%, 그 밖의 스테로이드와는 0.001%이하의 교차 반응하였다. 코티졸의 검출범위는 1 - 250 nmol/L이며 에스트라디올의 검출범위는 0.1 - 100 pmol/L 이다. 코티졸 분석의 분석내 변이 (within assay variation)는 5.4% (n = 20) 이었으며 분석간 변이 (betwenn assay variation)은 8.8% (n = 16) 이었다. 에스트라디올의 분석내 변이는 9.7% (n = 20) 이었으며 분석간 변이는 13.4%이었다.
타액에 호르몬 정량분석 과정을 설명하면, 보다 상세한 측정과정은 액상-이중항체 방법을 이용한 호르몬 측정에 관한 논문(Salivary cortisol and DHEA levels in the Korean population; age-related differences, diurnal,and correlations with serum levels. Yonsei Med J. 2007;48:379-88)을 참조한다.
측정용 시험관에 정해진 농도의 표준시료들과 타액시료를 0.1ml을 각각 넣고, 비 특이 반응을 측정하기 위해 스테로이드 호르몬이 첨가되지 않은 시험관에 항체 대신 GPBS로 대체되었으며, 표준시료의 스테로이드 호르몬이 포함되어 있는 시험관에는 활성탄을 이용하여 정제된 타액 (charcoal-stripped saliva)이 추가되었다.
125I로 표지된 코티졸 혹은 에스트라디올의 전체 방사선량은 대략 시험관 당 20,000 cpm으로 하였고 항체는 30-35% 결합하게 희석하였다. 1차 반응 전체 시험관 당 0.4ml이었고, 표준시료와 타액시료는 항체와 방사선 표지된 코티졸 혹은 에스트라디올과 함께 4℃에서 24시간 반응 시켰다. 그리고 다음날 2차 반응을 위해 실온에서 30분간 추가로 반응시킨 후 2차 항체 0.1ml을 각 시험관에 추가하여 30분간 더 반응시켰다. 그 다음 10% PEG 0.5ml을 추가한 후 15분간 상온에서 반응시켰다. 반응이 종료된 후에는 모든 시험관을 4℃에서 1500g로 20분간 원심 분리하였으며 상층액은 진공펌프를 이용하여 제거하였고 각 시험관에 남아 있는 침전물의 방사선량은 감마선 계측기 (Cobra 5005, PerkinElmer Life and Analytic Sciences)를 이용하여 측정하였다. 각 측정된 코티졸 혹은 에스트라디올의 농도는 RIASMART 소프트웨어 (PerkinElmer Life and Analytic Sciences)를 이용하여 표준곡선 (standard curve)으로부터 산출되었다.
실시예 4 : 데이터 분석
기상 직후 (0 min), 기상 후 30분, 기상 후 60분에서 채취한 타액 시료에서 측정된 코트졸, 에스트라디올 각각의 농도들의 분포검정을 수행하였다. 또한 각 개인에서 얻어진 호르몬의 농도로부터 개인별 ①기상 직후 호르몬 농도를 기준으로 기상 후 30 60분 중 최고의 농도의 상대적 퍼센트, Peak/A0% [(최고 호르몬 농도/0분 호르몬농도)* 100], ②기상 직후 에스트라디올 농도를 기준으로 기상 후 30, 60분 동안 변화된 에스트라디올 농도의 상대적 페센트, MinInc % [(30분 호르몬 농도 + 60분 호르몬농도/2)/기상 직후 농도)]*100, 두 그룹간의 통계적 검정은 Mann Whitney test U-test로 수행하였으며 세 그룹이상의 통계적 유의성 검정은 Kruskal-Wallis test의 Dunn's Multiple Comparison test 로 수행하였다. 각 호르몬의 농도 및 각 지표는 서열화 하였으며 백분위 계수는 SAS 통계 프로그램을 이용하였다.
정상적인 생리 주기를 갖는 여성의 기상 직후 코티졸 농도의 변화를 보면,
도 1 a에 도시된 바와 같이 기상 후 30분에 코티졸의 농도는 정상치에 이르렀으며 기상 직후부터 기상 30분사이에 11.2 ± 5.8 nmol/L의 농도 증가가 있었으며 증가된 범위는 3.0 - 22.7 nmol/L 이었다. MinInc% 는 209.3 ± 107.0%이었다.
이러한 결과들은 본 발명에 참여한 정상적인 생리주기를 가진 여성에게서 타액이 정확한 시간에 채취되었고 그들은 정상적인 부신기능을 가지고 있음을 알 수 있다.
정상적인 생리 주기를 갖는 여성집단의 기상 직후 에스트라디올 농도의 변화를 보면,
기상 직후, 기상 후 30분, 기상 후 60분에 채취한 타액에 포함되어 있는 에스트라디올의 농도를 측정하였다. 도 2 a에 도시된 바와 같이 기상직후, 기상 후 30분, 기상 후 60분의 에스트라디올 농도는 각각 1.4 ± 0.2, 2.8 ± 0.5, 2.7 ± 0.3 nmol/L로 나타나 기상 후 30분에 에스트라디올의 농도가 유의하게 증가하는 것을 보였다 (p < 0.05).
도 3a 내지 도 3c에서와 같이 기상직후, 30분후, 60분후의 에스트라디올의 농도는 0.1- 12.70, 0.1- 25.90, 0.1- 16.20 pmol/L 에 범위를 보였으며 정규분포를 따르지 않았다 (p < 0.001).
정상적인 생리주기를 잦는 여성의 개인별 에스트라디올 Peak/A0 %지표, 에스트라디올 Minlnc% 지표를 보면,
도 3 a 내지 도 3 c에서와 같이 시간별 에스트라디올의 농도는 넓은 범위로 존재하였고, 이는 개인별 호르몬 농도의 차이가 크다는 것을 의하며 그 차이는 각 여성의 생리주기 (여포기, 배란기, 황체기, 월경기)가 다르기 때문으로 해석되어 진다. 그러나 전체적으로는 생리주기에 관계없이 기상 후부터 점차 에스트라디올의 농도가 뚜렷이 증가하는 특징을 보이고 있다. 따라서 생리주기에 관계없이 개인별로 상기한 지표를 계산하고 지표를 서열화하여 백분율로 표시하였다.
정상적인 생리주기를 갖는 여성의 에스트라디올의 Peak/A0% 지표, 에스트라디올 MinInc% 지표의 범위는 각각 135.4 - 427.1%, 115.6 - 309.8% 로 나타났다. 이들 지표의 평균(표준편차)는 239.1 ± 99.3%, 187.2 ± 64.1%이었다.
이는 생리주기와 관계없이 기상 직후의 에스트라디올 농도를 기준으로 최고농도가 평균 239.1% 증가를 보인다는 것을 의미며 기상 직후부터 1시간 동안의 평균 농도가 지상지후에 비해 평균 187.2% 증가한다는 것을 의미한다. 이들 지표의 백분위 계수는 아래의 정상적인 생리주기를 갖는 여성의 에스트라디올의 Peak/A0% 지표, 에스트라디올 MinInc% 지표의 주요 백분위 수를 나타낸 표 2과 같다.
5% 10% 25% 50% 75% 90% 95%
Peak/A0% 135.4 143.0 166.2 215.1 284.4 372.1 437.1
MinInc% 115.6 118.4 142.5 171.3 214.8 287.4 309.8
그리고, 생리주기에 따라 에스트라디올의 Peak/A0% 지표, 에스트라디올 MinInc% 지표의 변화를 아울러 조사하였다.
그 결과, 에스트라디올의 Peak/A0% 지표, 에스트라디올 MinInc% 지표는 도 4 a 및 도 4 b에서와 같이 배란기 때 가장 높게 나타났으며 월경기 때 상대적으로 낮았다.
따라서, 에스트라디올의 Peak/A0% 지표, 에스트라디올 MinInc% 지표를 이용한 정상적인 생리주기를 판단하기에 월경시작일부터 12~14일이 가장 효과적임을 알 수 있다.
실시예 5 : 추출지표를 이용한 블라인드 테스트 1
상술한 지표의 스크리닝과 동일한 방법으로 폐경기 여성을 대상으로 에스트라디올의 농도를 측정하고 추출된 지표를 사용하여 블라인드 테스트를 수행하였다.
먼저 도 1b에서와 같이 폐경기 여성에서 (n = 58, 연령; 61.7 ± 8.7세기상후 30분에 코티졸의 농도는 정상치에 이르렀으며 기상 직후부터 기상 30분사이에 8.3 ± 5.7 nmol/L의 농도 증가가 있었으며 증가된 범위는 2.8 - 24.4 nmol/L 이었다. MinInc%는 173.8 ± 78.6%이었다.
이 결과는 폐경기 여성에서 타액이 정확한 시간에 채취되었고 그들은 정상적인 부신기능을 가지고 있음을 알 수 있다
도 2 b에서와 같이 폐경기 여성에서 에스트라디올 농도는 기상직후, 기상 후 30분, 기상후 60분 각각 1.7± 1.0, 1.3 ± 0.9, 1.2 ± 0.9 pmol/L로 나타났으며 기상 후 시간이 경과함에 따라 점차 감소하는 경향을 보였으나 그 감소가 통계적으로는 유의하지는 않았다. (p 〉0.05)
Peak/A0% 지표 및 MinInc% 지표를 이용한 폐경기여성의 기상 후 에스트라디올 농도 변화 평가를 나타낸 아래 표 3에서와 같이 폐경기 여성의 개인별 지표를 구하여 정상적인 생리주기를 갖는 여성과 비교한 결과, 폐경기 여성 56명 모두 상기한 지표의 정상범위 내에 포함되지 않았다.

폐경기 여성
 정상범위 (5~95%범위)
종합
Peak/A0% Minlnc%
참여자 Peak/A0% Minlnc% 135.4~437.1 115.6~309.8
1 92.7 97.6 비정상 비정상 비정상
2 78.1 81.3 비정상 비정상 비정상
3 128.2 118.7 비정상 비정상 비정상
4 73.0 55.9 비정상 비정상 비정상
5 18.9 50.9 비정상 비정상 비정상
6 134.9 117.3 비정상 비정상 비정상
7 79.2 70.9 비정상 비정상 비정상
8 42.7 43.0 비정상 비정상 비정상
9 15.4 37.5 비정상 비정상 비정상
10 111.8 115.5 비정상 정상 비정상
11 61.3 51.8 비정상 비정상 비정상
12 108.3 113.6 비정상 비정상 비정상
13 129.4 86.1 비정상 비정상 비정상
14 67.6 83.3 비정상 비정상 비정상
15 61.3 51.8 비정상 비정상 비정상
16 32.6 72.2 비정상 비정상 비정상
17 115.9 104.6 비정상 비정상 비정상
18 61.6 89.8 비정상 비정상 비정상
19 49.2 50.0 비정상 비정상 비정상
20 106.2 83.9 비정상 비정상 비정상
21 83.1 65.9 비정상 비정상 비정상
22 94.9 81.9 비정상 비정상 비정상
23 42.4 63.0 비정상 비정상 비정상
24 106.2 108.2 비정상 비정상 비정상
25 119.0 86.9 비정상 비정상 비정상
26 101.8 98.2 비정상 비정상 비정상
27 58.0 60.9 비정상 비정상 비정상
28 3.7 13.2 비정상 비정상 비정상
29 58.8 102.6 비정상 비정상 비정상
30 26.6 63.6 비정상 비정상 비정상
31 45.6 60.6 비정상 비정상 비정상
32 42.3 75.3 비정상 비정상 비정상
33 105.5 101.6 비정상 비정상 비정상
34 26.7 55.7 비정상 비정상 비정상
35 58.1 48.0 비정상 비정상 비정상
36 66.4 71.7 비정상 비정상 비정상
37 24.0 41.3 비정상 비정상 비정상
38 75.0 53.7 비정상 비정상 비정상
39 55.7 80.5 비정상 비정상 비정상
40 34.6 62.4 비정상 비정상 비정상
41 63.1 75.2 비정상 비정상 비정상
42 97.7 83.5 비정상 비정상 비정상
43 127.7 115.2 비정상 비정상 비정상
44 105.1 92.7 비정상 비정상 비정상
45 36.3 45.8 비정상 비정상 비정상
46 49.6 99.3 비정상 비정상 비정상
47 144.4 99.3 정상 비정상 비정상
48 54.0 86.2 비정상 비정상 비정상
49 72.0 60.7 비정상 비정상 비정상
50 34.2 51.0 비정상 비정상 비정상
51 52.4 51.1 비정상 비정상 비정상
52 106.2 83.9 비정상 비정상 비정상
53 65.3 70.3 비정상 비정상 비정상
54 111.8 115.5 비정상 비정상 비정상
55 69.4 76.9 비정상 비정상 비정상
56 118.0 119.6 비정상 비정상 비정상
이는 도 5에서와 같이 Peak/A0% 지표 및 MinInc% 지표가 정상적인 생리주기를 가지고 있는 여성과 유의하게 차이가 나기 때문이다. (p 〈 0.05)
실시예 6 : 추출지표를 이용한 블라인드 테스트 2
상술한 지표의 스크리닝과 동일한 방법으로 생리불순인 여성(최근 60일이상 생리가 지연된 여성, n = 13, 연령; 31.5 ± 12.9세)을 대상으로 에스트라디올의 농도를 측정하고 추출된 지표를 사용하여 블라인드 테스트를 수행하였다. 우선 도 1c에서 보듯이 기상 후 30분에 코티졸의 농도는 정상치에 이르렀으며 기상 직후부터 기상 30분 사이에 12.5 ± 9.1 nmol/L의 농도 증가가 있었으며 증가범위는 2.9 - 28.6 nmol/L 이었다. MinInc%는 176.1 ± 75.5%이었다.
이 결과는 생리불순 여성에게서 타액이 정확한 시간에 채취되었고 그들은 정상적인 부신기능을 가지고 있음을 알 수 있다.
그리고, 도 2c에서와 같이 여성에서 에스트라디올 농도는 기상직후, 30분 후, 60분 각각 1.1± 0.5, 0.8 ± 0.6, 0.8 ± 0.6 pmol/L로 나타났으며 기상 후 시간이 경과함에 따라 큰 차이를 보이지 않았으며 통계적으로도 유의한 변화는 없었다 (p > 0.05).
Peak/A0% 지표 및 MinInc% 지표를 이용한 생리불순 여성의 기상 후 에스트라디올 농도 변화 평가를 나타낸 아래 표 4에서와 같이 생리불순 여성의 개인별 지표를 구하여 정상적인 생리주기를 가진 여성과 비교한 결과, 생리불순여성 13명 모두 상기한 지표의 정상범위 내에 포함되지 않았다.
생리불순여성 정상범위 (5%-95%범위)
Peak/A0% MinInc% 종합
참여자ID Peak/A0% MinInc% 135.4 - 437.1 115.6 - 309.8
1 114.9 99.3 비정상 비정상 비정상
2 117.4 100.6 비정상 비정상 비정상
3 128.8 114.1 비정상 비정상 비정상
4 18.8 56.8 비정상 비정상 비정상
5 78.1 89.1 비정상 비정상 비정상
6 81.4 85.1 비정상 비정상 비정상
7 50.3 53.7 비정상 비정상 비정상
8 36.9 39.7 비정상 비정상 비정상
9 101.5 121.1 비정상 비정상 비정상
10 44.8 36.5 비정상 비정상 비정상
11 100.8 92.1 비정상 비정상 비정상
12 39.8 33.1 비정상 비정상 비정상
13 89.1 90.6 비정상 비정상 비정상
이는 도 5에서와 같이 Peak/A0% 지표 및 MinInc% 지표가 정상적인 생리주기를 가지고 있는 여성과 유의하게 차이가 나기 때문이다. (p 〈 0.05)
이처럼, 본 발명의 지표로 테스트한 결과에서 알 수 있듯이 본 발명의 지표를 이용할 경우 에스트라디올 기상 후 농도 변화의 정상여부 신뢰도가 높고, 객관적이며 신속하게 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 에스트라디올의 기상 후 농도 변화를 기준으로 하여 난소의 에스트라디올의 비정상적 증진 또는 비정상적 감소의 평가가 가능하여 난소의 이상, 폐경기의 조기진단, 원인을 알 수 없는 생리불순을 진단하는데 많은 도움이 된다.

Claims (20)

  1. 생리 주기 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 정제된 타액에 대하여 방사면역측정법을 이용하여 에스트라디올의 농도를 측정하는 방법:
    (a) 채취한 타액에 pH 12~14의 강염기를 처리하는 단계;
    (b) 가열 후 냉각시키는 단계;
    (c) 원심분리에 의해 타액으로부터 소화효소 및 박테리아를 제거하는 단계;
    (d) 중화 단계;
    (e) 뮤코단백질 분해효소에 의해 뮤코단백질 제거단계;
    (f) 원심분리에 의해 상기 뮤코단백질 분해효소를 제거하는 단계; 및
    (g) 타액과 동일양의 젤라틴을 포함하는 완충액을 혼합하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 타액의 채취는 기상 후 1시간 이내에 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 (a)단계에서 타액의 채취는 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 1시간별로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계에서 pH 12~14의 강염기는 NaOH, LiOH, KOH, Ca(OH)2 로 구성된 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 가열은 70~90℃의 온도로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 냉각은 얼음수조를 이용하여 급냉시키는 것에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서, 상기 (d) 중화단계는 pH 1~2의 강산을 처리하는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 pH 1~2의 강산은 HCl, H2SO4, HNO3로 구성된 군에서 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. 제1항에 있어서, 상기 뮤코단백질 분해효소는 Nacetylhexosamine-[1→4] glycosidic bond를 분해하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 생리활성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 다음을 포함하는 에스트라디올의 농도를 분석하는 방법.
    (a) 제1항의 방법으로 정상적인 생리주기를 가진 여성의 타액 내 에스트라디올의 농도를 측정하는 단계;
    (b) 상기 측정된 에스트라디올의 농도값으로 기준 지표를 설정하는 단계;
    (c) 제1항의 방법으로 시험 대상 여성의 타액 내 에스트라디올의 농도를 측정하는 단계;
    (d) 상기 수득한 에스트라디올의 농도를 (b)단계에서 설정한 기준 지표값과 비교하는 단계.
  17. 제16항에 있어서, 상기 에스트라디올의 농도는 기상 후 1시간 이내에 채취한 타액으로부터 측정한 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 에스트라디올의 농도는 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 1시간별로 채취한 타액으로부터 측정한 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 에스트라디올의 농도 분석은 기상 직후, 기상 후 30분 및 기상 후 1시간별로 채취한 타액으로부터 측정한 에스트라디올의 농도변화에 대하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 시험 대상 여성의 타액 내 에스트라디올의 농도변화가 정상적인 생리주기를 가진 여성의 농도변화값으로 설정한 기준 지표의 범위를 벗어나는지 여부를 비교하는 것을 특징으로 하는 방법.
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