KR102235907B1 - 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료의 제조방법 - Google Patents

액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 액체크로마토그래피 기반 분석장비에 적용 시 점성이 있어 대용량고효율 분석이 불가능한 타액 시료에 대하여 타겟 물질은 감소시키지 않으면서도 점성의 원인이 되는 단백질만을 선택적으로 감소시켜 타액 시료를 10 내지 20회 가량 반복적으로 로딩하여도 분석장비의 압력이 증가하지 않아 대용량고효율 분석이 가능한 타액 시료를 제조하는 방법을 제공한다.

Description

액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료의 제조방법{Preparation Method of Saliva Sample for High-Throughput Liquid Chromatography Based Analysis System}
본 발명은 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료의 제조방법에 관한 것이다.
전통적으로 혈액과 오줌은 신체의 변화를 진단하는 지표로서 널리 사용되어 왔으며 분석 및 이를 통한 해석에 많은 정보가 축적되어 왔다. 혈액의 경우 침습적인 방법으로 습득할 수 밖에 없어 반복적으로 채취할 경우 신체 조직에 큰 손상을 가져올 뿐만이 아니라 생명에 위험을 가져올 수 있는 단점이 있으며 오줌은 방광에 모인 후 배설되므로 필요에 따라 반복적으로 채취하거나 원하는 시간에 채취할 수 없는 단점이 있었다. 땀, 눈물, 점막, 타액등의 체액은 실시간으로 시료를 확보하고 이를 분석하거나 시간에 따른 반복적인 채취를 통해 이를 분석하는 경우 매우 유용한 시료이다. 특히 타액은 분비량이 많아 분석에 필요한 양을 채취하기 용이할 뿐 아니라 비침습적으로 채취가능하며 혈장의 상태를 바로 반영하는 특징이 있어 신체 상태에 대한 다양한 정보를 습득하기 우한 시료로서 각광받고 있다.
타액은 신체의 변화를 나타내는 지표로서 세포막을 통하여 걸러진 혈장을 의미한다. 혈장으로부터 다양한 종류의 물질을 검출하고 이를 분석하게 되면 검사대상의 질병이나 신체 상태를 진단할 수 있는데 그 예로서 타액에 존재하는 알코올, 마약, 코티솔(cortisol), 스테로이드 호르몬을 측정하고 이를 분석하는 방법이 알려져 있다.
환경호르몬을 포함하는 환경독성물질은 주위에 흔하게 존재하나 실제 환경독성물질이 질병에 미치는 영향 및 임상데이터로서 활용되는 경우는 많지 않은 실정이다. 그 이유는 환경독성물질에 대한 분석 데이터는 의료계에서 임상적용을 위하여 실제 사용 할 수 있는 수준으로 축적되지 않았을 뿐 아니라 실시간 분석 개념의 정량적 측정값 및 상기 정량적 측정값을 분석한 결과와 건강검진 결과 또는 건강이상과 관련 임상소견이 상호 추적 가능하도록 체계적으로 정리된 데이터베이스가 구비되지 않았기 때문으로 판단된다.
환경독성물질은 그 자체 또는 대사산물에 의하여 독성을 나타낸다. 따라서 혈액, 오줌, 체액등에서 분석하게 되면 체내로 유입된 환경독성물질 또는 환경독성물질이 대사되어 형성된 산물을 추적할 수 있게 된다. 그러나 체내에 유입된 환경독성물질 또는 환경독성물질의 대사산물은 그 양이 극히 적어 매우 높은 민감도를 가지는 LC-MS/MS와 같은 고가의 분석 장비를 이용하여 분석하여야만 한다. 상기와 같은 고가의 분석 장비들은 구성이 복잡하고 시료의 제약이 많아 분석을 위한 시료 전처리 과정에 많은 공정이 사용되므로 분석효율이 저하되는 문제점이 있었다.
타액은 가장 손쉽게 채취 가능한 시료임에도 불구하고 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법(Liquid Chromatography with tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)과 같은 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 환경독성물질의 분석에 활용되는 사례가 매우 제한되어 있었다. 타액은 특유의 점성이 있어 LC-MS/MS의 초기 단계인 액체크로마토그래피(liquid chromatography) 컬럼의 압력을 과도하게 증가시켜 연속적인 시료분석이 불가능하였기 때문이다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
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본 발명의 목적은 액체크로마토그래피 기반 분석장비에 적용 시 점성이 있어 대용량고효율 분석이 불가능한 타액 시료에 대하여 타겟 물질은 감소시키지 않으면서도 점성의 원인이 되는 단백질만을 선택적으로 감소시켜 타액 시료를 200회 가량 반복적으로 로딩하여도 분석장비의 압력이 증가하지 않아 대용량고효율 분석이 가능한 타액 시료를 제조하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위하여, 점성이 15 내지 25mPa.s인 타액 시료에 하이드록아파타이트(hydroxyapatite)와 아세톤(acetone)을 첨가하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료는 타액에 존재하는 코티닌을 분석하기 위한 것이며 상기 하이드록아파타이트와 아세톤은 타액의 단백질을 침강시켜 제거하는 목적으로 한다. 또한, 미세유체 액체-액체 추출 등 다른 직접 방법에 비하여 상대적으로 농축된 시료를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료는 200회 연속으로 시료를 로딩하여도 액체크로마토그래피 컬럼(3.0 * 100 mm, 1.8μm ZorbaxEclipse xDB-c18, Agilent)의 압력이 10MPa 이하로 유지되므로 후처리없이 반복적이면 연속적으로 타액 시료를 처리할 수 있으므로 대량고효율 분석이 가능한 장점이 있다.
본 발명은 점성이 높아 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석이 불가능한 타액 시료에 대하여 점성의 원인이 되는 단백질만을 침강시켜 제거하므로 타액 시료에 대한 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석이 가능하도록 하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 하이드록시아파타이트를 타액에 첨가하여 단백질등을 제거한 결과르 보여준다.
도 2는 본 발명의 하이드록시아파타이트와 아세톤은 이용하여 제조한 타액 시료의 특성을 분석한 결과를 보여준다. 패널 (A)는 하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 처리한 타액 시료의 점성 변화를 보여주며, 패널 (B)는 하이드록시아파타이트와 아세톤을 동시에 처리한 타액 시료의 점성 변화를 보여주며, 패널(C)는 하이드록시아파타이트와 아세톤은 이용하여 제조한 타액 시료의 단백질 양의 변화를 보여준다.
도 3은 본 발명의 하이드록시아파타이트와 아세톤을 이용하여 제조한 타액 시료와 종래의 제조방법으로 제조한 타액 시료에 대하여 LC-MS/MS을 적용하여 수행한 코티닌 분석결과를 보여준다.
도 4는 종래의 액체-액체 추출법을 이용하여 제조한 타액 시료에 대하여 LC-MS/MS을 적용하여 수행한 코티닌 분석결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 하이드록시아파타이트와 아세톤은 이용하여 제조한 타액 시료에 대하여 LC-MS/MS을 적용하여 수행한 코티닌 분석결과를 보여준다.
본 발명은 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 분석에 적합하게 전처리된 타액 시료를 빠른 시간내에 준비하는 방법을 제공한다.
본 발명은 점성이 15 내지 25mPa.s인 타액 시료에 하이드록아파타이트(hydroxyapatite)와 아세톤(acetone)을 첨가하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료는 액체크로마토그래피 컬럼을 이용하여 1차적으로 타겟물질을 분리한 후 자동으로 연결된 2차 분석장비에 의해 타겟물질이 더 분석하는 분석시스템을 위한 것으로 점성이 낮아 상기 액체크로마토그래피 컬럼의 압력을 증가시키지 않으므로 후처리 없이도 동일한 타액 시료를 반복적으로 로딩하여 분석할 수 있으므로 대량고효율(high-throughput) 분석이 가능한 장점이 있다.
본 발명의 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료는 타액에 존재하는 코티닌을 분석하기 위한 것이며 상기 하이드록아파타이트와 아세톤은 타액의 단백질을 침강시켜 제거하였으므로 액체크로마토그래피 컬럼의 압력을 급속히 증가시키지 않을 정도로 점성이 감소된 특징이 있다.
상기 타액(saliva)은 타액샘에서 분비되어, 무색, 무미, 무취로 다소 탁한 점성이 있는 액으로서 소화에 필요한 단백질 등이 포함되어 있어 점성을 가지는 특징이 있다. 흡연을 하게 되면 니코틴(nicotine)이 체내에 흡수되고 상기 니코틴은 대사를 통해 코티닌(cotinine)을 형성하고 상기 코티닌은 체액에 존재하게 된다. 따라서 상기 체액으로부터 상기 코티닌의 양을 측정하게 되면 흡연 여부 및 흡연의 양등을 간접적으로 산출할 수 있게 된다.
본 발명은 수득하기 용이하나 점성이 있어 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput)분석이 어려운 타액 시료에 대하여 타겟물질인 코티닌은 침강되지 않으면서도 점성의 원인이 되는 단백질만을 침강시켜 고효율 대용량 분석이 가능하도록 제조된 타액 시료 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 상기 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)는 주성분이 Ca5(PO4)3(OH)인 수산화인회석으로 음이온 특성을 가진 단백질 및 핵산등을 흡착하는 성질이 있으며 상기 아세톤(acetone)은 물에 잘 녹는 유기용매로서 탈수소효과를 통해 단백질을 침전시키는 특성이 있다. 상기 코티닌은 C10H12N2O 화학식을 가지는 알칼로이드(alkaloid)로서 하이드록시아파타이트와 결합하지 않으며 아세톤의 탈수소화에도 영향을 받지 않는다. 따라서 본 발명과 같이 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)와 아세톤(acetone)을 타액에 첨가하게 되면 타액의 당당백질을 포함한 단백질은 침강되는 반면 코티닌은 침강되지 않고 타액에 남게 된다.
본 발명의 방법으로 제조한 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료는 점성이 15 내지 25mPa.s에서 2 내지 3mPa.s로 감소하므로 200회 연속으로 동일한 시료를 로딩하여도 액체크로마토그래피 컬럼(3.0 * 100 mm, 1.8μm ZorbaxEclipse xDB-c18, Agilent)의 압력이 10 MPa 이하로 유지되는 특징이 있다. 상기 대량고효율 분석용 타액 시료의 점성이 3mPa.s를 초과하게 되면 연속으로 로딩 가능한 횟수가 20회 미만으로 감소하므로 분석 효율이 저하되는 문제점이 있다.
본 발명의 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료를 제조하는 방법은 하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 첨가하여 단백질을 침강시키거나 하이드록시아파타이트와 아세톤의 혼합용액을 제조하고 이를 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명의 타액 시료 제조방법은 점성이 15 내지 25mPa.s인 타액 시료에 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 첨가하여 점성이 4 내지 6mPa.s인 제 1 타액 시료를 제조하는 제 1 단계; 상기 제 1 타액 시료에 -15 내지 -25℃인 아세톤을 첨가하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 제 2 타액시료를 제조하는 제 2 단계; 상기 제 2 타액 시료를 교반 한 후 -15 내지 -25℃에서 10 내지 20시간 동안 방치하는 제 3 단계; 및 상기 -15 내지 -25℃에서 10 내지 20시간동안 방치된 제 2 타액 시료를 원심분리하고 상층액만을 분리하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료를 제조하는 제 4 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하며 바람직하게는 본 발명의 타액 시료 제조방법은 점성이 15 내지 25mPa.s인 타액 시료에 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 첨가하여 점성이 4 내지 6mPa.s인 제 1 타액 시료를 제조하는 제 1 단계; 상기 제 1 타액 시료에 -17 내지 -23℃인 아세톤을 첨가하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 제 2 타액시료를 제조하는 제 2 단계; 상기 제 2 타액 시료를 교반 한 후 -17 내지 -23℃에서 10 내지 20시간 동안 방치하는 제 3 단계; 및 상기 -17 내지 -23℃에서 10 내지 20시간동안 방치된 제 2 타액 시료를 원심분리하고 상층액만을 분리하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료를 제조하는 제 4 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 제 1 단계에 있어서 상기 하이드록시아파타이트는 120 내지 130 mM이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며 상기 제 2 단계에 있어서 상기 아세톤은 제 2 타액시료의 3 내지 5배의 부피가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며 바람직하게는 상기 제 1 단계에 있어서 상기 하이드록시아파타이트는 124.5±0.5 mM이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며 상기 제 2 단계에 있어서 상기 아세톤은 제 2 타액시료의 4배의 부피가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 한다.
상기 하이드록시아파타이트가 120mM 미만로 첨가되거나 상기 아세톤이 3배 미만이 되도록 첨가되면 타액 시료의 단백질 제거 정도가 부족하게 되고 이는 액체크로마토그래피 컬럼에 연속으로 로딩 할 수 있는 횟수가 줄어드는 결과로 이어지므로 전체적인 분석효율이 저하되는 문제점이 있다. 또한 상기 하이드록시아파타이트가 130mM을 초과하여 첨가되거나 상기 아세톤이 5배를 초과하여 첨가되더라도 점성 저하정도가 유사하여 분석효율이 더 향상되지 않는다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 타액 시료 제조 방법은 점성이 15 내지 25mPa.s인 타액 시료에 -15 내지 -25℃인 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액을 첨가하여 점성이 2 내지 2mPa.s인 제 3 타액 시료를 제조하는 제 5 단계; 상기 제 3 타액 시료를 -15 내지 -25℃에서 30 내지 1시간 30분 동안 방치하는 제 6 단계; 상기 -15 내지 -25℃에서 30 내지 1시간 30분 동안 방치된 제 3 타액 시료를 원심분리하고 상층액만을 분리하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료를 제조하는 제 7 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 제 5 단계의 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액은 하이드록시아파타이트와 아세톤이 1:400 내지 1:500의 몰비로 혼합된 것을 특징으로 하며 상기 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액은 제 3 타액 시료의 3 내지 5배가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하며 바람직하게는 상기 제 5 단계의 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액은 하이드록시아파타이트와 아세톤이 1:451의 몰비로 혼합된 것을 특징으로 하며 상기 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액은 제 3 타액 시료의 4배가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 한다.
상기 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액의 하이드록시아파타이트와 아세톤의 혼합비율이 상기 비율을 벗어나거나 상기 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액이 제 3 타액 시료에 혼합되는 비율이 상기와 상이하게 되면 타액의 단백질 침강효과가 감소되어 분석효율이 저하될 수 있다.
하기에서 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명한다.
실시예
1. 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법용 타액 시료의 채취, 제조 및 보관
종래에는 타액(saliva) 채취하는 방법으로 양치, 헹굼, 일정시간의 금식 등의 사전조치 후 이를 수행하는 것이 일반적이었다. 상기 사전조치는 타겟물질로서 호르몬을 분석하기 위한 방법으로 사용되는데 잇몸으로부터 누출된 혈액에 의해 타액 시료가 오염되는 것을 방지하는 효과가 있었다. 그러나 상기 사전조치는 타액에 존재하는 타겟 물질의 양을 변화시키는 등 검출결과에 영향을 끼치는 경우가 있어 사전조치 없이 일정 시간에 흐르는 타액을 채취하여 검사에 사용하는 방법이 개발된 바 있다.
본 발명에서는 검사대상에게 어떠한 자극도 주지 않으며 어떠한 사전조치 없이 자연스럽게 분비되는 타액을 채취하여 시료로서 사용한다. 자극이나 사전조치 없이 타액 시료를 채취하게 되면 장소와 시간에 상관없이 채취가 가능하므로 실제 현장에서 필요에 따라 즉각적으로 검사 시료를 확보할 수 있는 장점이 있다.
1) 타액 시료의 채취
자연적으로 입안에서 분비되는 타액 15㎖을 폴리프로필렌 재질의 실험관에 모았다. 타액은 구강 헹굼이나 양치하지 않은 상태에서 채취하였으며 타액의 양을 증가시키기 위하여 어떠한 자극도 가하지 않은 상태에서 채취하였다. 채취한 타액은 4℃로 일정하게 유지하였으며 원심분리기가 준비된 경우 4℃에서 2000xg로 10분간 원심분리한 후 상층액(100㎕)만을 분리하여 미량원심관(microcentrifuge tube)에 분주한 후 -80℃에서 보관하였다. 원심분리기가 준비되지 않은 경우 4℃에 타액 시료를 충분히 두어 침전물이 가라앉도록 한 후 상층액(100㎕)만을 분리하여 미량원심관(microcentrifuge tube)에 분주한 후 -80℃에서 보관하였다.
표 1은 검사대상에 따른 타액 흐름율을 보여준다. 본 발명의 분석방법은 1회 분석을 위한 시료의 양을 100㎕(0.1㎖)로 정하였기 때문에 타액 채취가 까다로운 유아 및 구강 건조증 환자에 적용하여도 손쉽게 타액 시료를 채취할 수 있는 장점이 있다. 본 발명의 타액 시료는 생명윤리법과 그 규정에 따라 자발적 동의를 한 성인 19세에서 노령인 분들의 것을 대상으로 분석하였으며 표 1에서 보듯이 100㎕라는 극미량으로 3회 반복 측정할 수 있도록 방법을 개발함으로 분석 유의성을 확보하였고, 이를 확장하여 신생아와 구강 건조 등의 현상이 있는 분들에게 까지 적용할 수 있도록 하였다.
검사대상 타액 흐름율
신생아(생후 1일 이하) 0.0303 내지 0.186 ㎖/min
유아(2세이하) 0.56±0.18 ml/min
노인(70세 이상) 0.5±0.3 ml/min
구강 건조증 환자 0.1 ml/min
2) 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법을 이용한 코티닌 분석용 타액 시료의 제조
상기 채취한 타액 시료를 처리하여 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법(Liquid Chromatography with tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)을 이용한 코티닌 분석용 타액 시료로 제조하였다. 본 발명의 타겟 물질은 코티닌(cotinine)이다. 상기 코티닌은 흡연이나 간접흡연으로 신체로 흡수된 니코틴(nicotine)이 대사과정을 통하여 형성한 대사산물이다. 따라서 체액에 존재하는 코티닌의 양을 분석하면 검사대상의 흡연여부 및 흡연빈도 등을 파악할 수 있으며 이를 토대로 흡연에 관련된 임상데이터와 접목하면 질병과의 연관관계를 분석할 수 있을 것으로 기대된다.
종래에는 LC-MS/MS 방법을 이용하여 체액의 코티닌이나 스테로이드 호르몬 등을 대량분석하기 위하여 고가의 자동화기기를 이용한 액체-액체 추출법(Liquid-Liquid extraction) 또는 고체상 미량 추출법(solid-phase micro extraction)이 사용되었다. 그러나 상기 시료 제조방법은 단가가 높은 단점을 가지고 있다. 고가의 기기나 재료를 사용하지 않고 진행되는 방법의 경우에 있어서는 시간이 오래거리고 추출단계가 많고 복잡하여 시간이 오래 걸려 시료가 오염되거나 변질될 우려가 있으며 초기 단계인 액체크로마토그래피 컬럼의 압력이 급격히 상승하여 대용량 분석에 사용하기에는 적합하지 않은 문제점이 있었다.
본 발명에서는 LC-MS/MS 대용량 분석을 위한 타액 시료의 문제점을 해결하기 위하여 타액의 점성을 감소시키되 타겟 물질(코티닌)의 양은 유지하여 LC-MS/MS를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석이 가능한 시료를 제조하였다.
(1) 하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 처리하여 제조한 시료
상기 채취한 타액 시료에 대하여 하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 처리하여 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법용 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료 1)를 제조하였다. 타액의 점성은 존재하는 단백질의 양에 비례한다. 상기 하이드록시아파타이트는 치아의 에나멜 구성성분으로서 타액에 존재하는 단백질과 결합하는 특성이 있다. 따라서 상기 타액 시료에 하이드록시아파타이트를 첨가하면 타액에 존재하는 당단백질을 포함한 단백질 등과 결합하여 침전되므로 시료의 점성이 감소하는 효과가 있다. 하이드록시아파타이트는 본 발명의 타겟물질인 코티닌과 결합하거나 반응을 하지 않는다. 따라서 타액에 하이드록시아파타이트를 처리하더라도 코티닌의 양은 변화하지 않으므로 분석결과에 전혀 영향을 미치지 않는다.
-80℃에서 보관한 타액 시료 100㎕를 4℃에서 녹인 후 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite, Sigma-Aldrich, Cat No: 289396)를 0.0063mg/100㎕의 농도가 되도록 첨가하고 보텍스믹서를 사용하여 혼합하였다. 타액시료의 하이드록시아파타이트 농도를 달리하여 단백질의 제거정도를 확인한 결과 0.0063mg/100㎕보다 더 높은 농도가 되도록 하이드록시아파타이트를 첨가하여도 단백질양이 감소하지 않는 것이 확인되었다(도 1 참조).
상기 하이드록시아파타이트 처리 타액 시료에 -20℃ 아세톤 400㎕를 첨가하고 보택스(vortex) 믹서기로 혼합한 후 -20℃에서 16시간동안 방치하여 하이드록시아파타이트-아세톤 처리 타액시료를 제조하였다. 상기 아세톤은 상기 하이드록시아파타이트 처리 타액 시료에서 하이드록시아파타이트에 의해 제거되지 않은 단백질을 더 제거하는 역할을 한다. 상기 아세톤은 일반적으로 타액 분석에서 많이 상용하는 유기용매로 역시 타액내의 단백질은 침강시키나 타겟물질인 코티닌은 침강시키지 않으므로 코타닌 분석결과에 영향을 미치지 않는다.
상기 하이드록시아파타이트-아세톤 처리 타액시료는 20,000g에서 30분간 원심분리한 후 상층액만을 분리하여 LC-MS/MS 타액 시료 1을 제조하였다.
(2) 하이드록시아파타이트와 아세톤을 동시에 처리하여 제조한 시료
상기에서는 하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 처리하여 제조한 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법용 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료 1)를 제조하였다. 상기 LC-MS/MS 타액 시료 1은 하이드록시아파타이트 처리 후 아세톤을 이용하여 단백질을 더 침전시키는데 16시간이 소요되었다. 하기에서는 상기 제조시간을 더 단축시키기 위하여 타액 시료에 하이드록시아파타이트와 아세톤을 동시에 처리한 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법용 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료 2)를 제조하였다.
하이드록시아파타이트와 아세톤을 동시에 처리하기 위하여 하이드록시아파타이트와 아세톤을 1:50의 질량비로 혼합한 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액을 제조하고 -20℃에 보관하였다
상기 채취한 타액 시료에 -20℃ 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액이 균질한 상태가 되게 하여 100μl 시료에 400μl를 첨가하고 -20℃에서 30분 동안 방치하여 타액 내 단백질 등을 침강시켰다. 그 후 20,000g에서 30분간 원심분리한 후 상층액만을 분리하여 LC-MS/MS 타액 시료 2를 제조하였다.
(3) 액체-액체 추출법으로 제조한 시료
채취한 타액 시료에 대하여 액체-액체 추출법을 적용하여 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법용 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료 3)를 제조하였다. 1ml의 타액 시료에 4ml의 ethyl acetate를 넣어 10분간 충분히 섞고 3000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 이후 -50℃에 1시간 방치하여 물층이 얼게 한 후 상층액을 따 새로운 실험관으로 옮겼다. 상기 상층액을 건조시킨 후 70% acetonitril 용액으로 녹인 후 분석에 사용하였다.
3) 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석
상기 제조한 LC-MS/MS 타액 시료 1, LC-MS/MS 타액 시료 2, 및 LC-MS/MS 타액 시료 3을 150㎕씩 분주한 후 LC-MS/MS에 로딩하여 코티닌을 분석하였다.
LC-MS/MS는 Agilent 1200 LC, API 4000(SCIEX, MA, USA)을 사용하였으며 Analyst® 1.7 Software (SCIEX)을 이용하여 분석하였다.
2. 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법용 타액 시료 분석
종래의 액체-액체 추출법은 시료의 추출, 휘발, 용해, 고체상 필터등을 이용하므로 기술 숙련정도에 따라 시료가 손실될 가능성이 높았으며 소요되는 시간 또한 매우 길다. 이에 반하여 본 발명은 하이드록시아파타이트 및 아세톤을 첨가하여 단백질을 침강시킨 후 원심분리를 실시하여 상층액을 수득하는 방법을 사용하므로 추출, 휘발 및 필터과정이 필요 없어 99% 이상의 높은 수득율을 보이는 장점이 있으며 짧은 시간내에 준비할 수 있고 숙련도가 낮은 실험자라도 무리 없이 수행할 수 있는 장점이 있다.
채취한 타액에 대하여 원심분리만을 적용하여 제조한 타액 시료(타액 시료), 하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 처리하여 제조한 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료 1), 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액을 사용하여 하이드록시아파타이트와 아세톤을 동시에 처리하여 제조한 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료 2) 및 종래의 액체-액체 추출법을 이용하여 제조한 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료3)에 대하여 점성의변화 및 단백질 양의 변화를 측정하였다. 상기 점성은 모세관을 이용하는 신장점도 측정기(Haake Technik, 모델 명: CaBER1)을 이용하여 측정하였으며 단백질의 양은 Bradford 방법을 이용하여 정량하였다. 또한 LC-MS/MS 분석장비의 메뉴얼에 따라 가이드 컬럼의 압력이 20MPa 를 최대로 하였고 15MPa이하인 경우 로딩 가능한 수준인 것으로 판단하여 시료가 연속적으로 적용 가능한 회수를 산출하였다.
시료 시료 전처리 처리방법 시료 전처리시간 점성
(mPa.s)		 단백질의 양(㎎/㎖) 연속분석가능시료수
타액 시료 1)원심분리(2000xg) 10분 18.286 0.615 1-2
LC-MS/MS 타액 시료1 1)원심분리 (2000xg) 10분 4.975 0.513 200
2)하이드록시아파타이트 처리 1분
3)아세톤 처리 16시간 2.724 0.482
4)원심분리(20,000xg) 30분
LC-MS/MS 타액 시료2 1)원심분리(2000xg) 10분 2.627 0.475 200
2)하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액 처리 1시간
3)원심분리(20000xg) 30분
LC-MS/MS 타액 시료 3 액체-액체 추출
(용매추출, 건조, 재용해 포함)		 24시간 5.012 0.504 30
상기 전처리 방법의 소요시간을 비교한 결과 타액에 원심분리만을 적용한 제조한 타액 시료(타액 시료)의 경우 30분으로 가장 짧았으며, 종래의 액체-액체 추출법으로 제조한 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료 3)의 경우 24시간 내외로 가장 긴 것으로 확인되었다. 또한 하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 처리하여 제조한 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료1)의 경우 총 16시간 41분이 소요 되었으나 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액을 사용하여 하이드록시아파타이트와 아세톤을 동시에 처리하여 제조한 타액 시료(LC-MS/MS 타액 시료2)의 경우 총 소요시간이 1시간 40분으로 약 1/15 정도 단축된 것이 확인되었다.
상기 타액 시료에 대한 점성과 단백질의 양을 측정하고 연속적으로 LC-MS/MS를 통하여 분석 가능한 시료의 수를 확인하였다.
타액에 원심분리만을 적용하여 제조한 타액 시료는 점성이 18.286mPa.s이었으며 단백질의 양은 0.615㎎/㎖이었다. 또한 상기 타액에 원심분리만을 적용하여 제조한 타액 시료는 LC-MS/MS에 2회 연속으로 로딩하는 경우 가이드 컬럼의 압력이 20MPa 이상으로 빠르게 증가하여 더 이상 분석이 불가능한 것으로 확인 되었다.
하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 처리하여 제조한 LC-MS/MS 타액 시료1은 점성 2.724mPa.s, 단백질의 양 0.482㎎/㎖이었으며 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액을 사용하여 하이드록시아파타이트와 아세톤을 동시에 처리하여 제조한 LC-MS/MS 타액 시료 2는 점성 2.627mPa.s, 단백질의 양 0.475㎎/㎖으로 확인되어 서로 유사한 것으로 확인되었다. 또한 상기 LC-MS/MS 타액 시료 1 및 LC-MS/MS 타액 시료 2는 모두 200회를 초과하여 연속으로 로딩하는 경우 가이드 컬럼의 압력이 20MPa 이상으로 증가할 가능성이 높아져 연속 분석을 중단하고 세척 과정을 거쳐 하는 것이 안정적인 분석을 할 수 있음이 확인 되었다.
하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 처리하여 제조한 LC-MS/MS 타액 시료 1의 경우 하이드록시아파타이트만을 처리하는 경우 점성이 18.286mPa.s에서 4.975mPa.s으로 유의적으로 감소하는 것이 확인되었으며 단백질의 양 또한 0.615㎎/㎖에서 0.513㎎/㎖로 유의적으로 감소하는 것이 확인되었다. 또한 상기 하이드록시아파타이트만을 처리한 타액 시료에 -20℃ 아세톤을 더 처리하는 경우 점성이 4.975mPa.s에서 2.724mPa.s으로 유의적으로 감소하는 것이 확인되었으며 단백질의 양 또한 0.513㎎/㎖에서 0.482㎎/㎖로 유의적으로 감소하는 것이 확인되었다(도 2 참조).
종래의 액체-액체 추출법을 이용하여 타액시료를 제조하는 경우 30회 연속으로 로딩하는 경우 가이드 컬럼흐름 저항이 커져 더 이상 연속 분석이 불가능한 것으로 확인 되었다.
상기 결과는 본 발명의 하이드록시아파타이트와 아세톤을 이용한 타액시료의 제조방법이 타액 시료의 단백질의 양을 감소시켜 점성을 감소시키므로 동일한 시료에 대하여 최대 200회 연속적인 LC-MS/MS 분석이 가능하다는 것을 보여준다.
타액 시료의 제조시간을 비교하여 보면 종래의 액체-액체 추출법의 소요시간(24시간) 및 하이드록시아파타이트와 아세톤을 순차적으로 처리하는 방법의 소요시간(16시간 41분)에 대비하여 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액을 사용하여 하이드록시아파타이트와 아세톤을 동시에 처리하는 방법의 소요시간(1시간 40분)이 극히 짧은 것으로 보아 본 발명의 하이드록시아파타이트와 아세톤을 이용하는 시료 제조방법 특히, 하이드록시아파타이트와 아세톤을 동시에 처리하여 타액 시료를 제조한느 방법이 타액 시료의 LC-MS/MS를 이용한 코티닌 대량고효율(high-throughput) 분석에 가장 효율적이라는 것을 보여준다.
3. LC-MS/MS를 이용한 코티닌 분석
상기 타액 시료, LC-MS/MS 타액 시료 1, LC-MS/MS 타액 시료 2, 및 LC-MS/MS 타액 시료 3에 대하여 LC-MS/MS 분석장치를 이용하여 타액 내에 존재하는 코티닌을 분석하였다. 상기 LC-MS/MS 분석장치는 Agilent 1200 LC, API 4000(SCIEX, MA, USA)을 사용하였으며 Analyst® 1.7 Software (SCIEX), 액체크로마토그래피 컬럼은 3.0 * 100 mm, 1.8μm ZorbaxEclipse xDB-c18 (Agilent)를, UPLC guard column은 Zorbax Eclipse Plus C18 3.0x5mm, 1.8㎛을 사용하였다. 분석 조건은 positive ion mode의 MRM로 다음의 조건으로 전개하였다. Mobile phase A1은 95% D.W + 5% 0.1M ammonium formate (pH3.0)이었으며, Mobile phase B1는 Acetonitrile을 사용하였으며, Injection volume은 5uL으로 수행하고 Isocratic elution을 수행하였다. 상세한 실험조건은 하기와 표 3과 같다.
Time(min) Flow rate(ul/min) Solvent A(%) Solvent B(%)
0.0 200 5 95
0.1 200 5 95
5.0 200 5 95
Q1 Q3 CE CXP DP EP Retention Time
177.146 80 33 6 66 10 2.37min
177.146 98 29
도 3은 상기 타액 시료와 하이드록시아파타이트 및 아세톤을 처리하여 제조한 타액 시료에 알려진 농도의 코티닌을 표준물질로 더 첨가한 후 농도에 따른 검출결과를 분석한 결과를 보여준다. 분석결과 두 시료 모두 표준물질의 첨가양이 증가함에 따라 검출되는 표준물질의 양이 증가한 것으로 확인 되었다.
도 4는 종래의 액체-액체 추출법을 이용하여 제조한 타액 시료에 대하여 LC-MS/MS을 적용하여 수행한 코티닌 분석결과를 보여준다. 담배를 피우지 않는 금연그룹(non-smoker), 담배를 하루 10개피 미만으로 피우는 간헐적 흡연그룹(passive smoker), 담배를 하루 10개피 이상 피우는 적극적 흡연그룹(active smoker)으로부터 수득한 타액 시료를 용액-용액 추출법으로 처리한 후 LC-MS/MS 분석장치를 이용하여 코티닌의 농도를 측정한 결과 금연그룹, 간헐적 흡연그룹 및 적극적 흡연그룹의 코티닌 검출량이 서로 유의적으로 구분되는 것이 확인되었다. 이는 담배의 흡연정도에 따라 체액에 존재하는 코티닌의 양이 비례한다는 결과를 지지하는 결과로서 혈장 및 소변을 이용하여 분석한 결과와 동일한 결과이다(도 4 참조).
도 5는 본 발명의 하이드록시아파타이트와 아세톤은 이용하여 제조한 타액 시료에 대하여 LC-MS/MS을 적용하여 수행한 코티닌 분석결과를 보여준다. 담배를 하루 10개피 이하로 피우는 흡연그룹, 담배를 하루 11 내지 15개피 피우는 흡연그룹, 담배를 하루 16 내지 25 개피 피우는 흡연그룹 및 담배를 하루 26 개피 이상 피우는 흡연그룹 으로부터 수득한 타액 시료를 하이드록시아파타이트 및 아세톤으로 처리한 후 LC-MS/MS 분석장치를 이용하여 코티닌의 농도를 측정하였다. 그 결과 각 그룹 사이의 코티닌 양이 유의적으로 차이가 있는 것이 확인되었으며 흡연량이 증가함에 따라 코티닌의 양도 증가하는 것이 확인되었다.
추가적으로 본 발명의 하이드록시아파타이트와 아세톤을 사용하여 제조한 타액시료는 시료 1800개에 대한 전처리 시간으로 1시간이 소요되었으며 각 샘플의 전개시간을 3분으로하여 1890시간에 분석이 가능한 것이 확인되었다.
따라서 본 발명의 하이드록시아파타이트와 아세톤을 사용하여 타액 시료를 전처리하는 방법은 타액 특유의 점성과 긴 전처리 시간으로 인하여 LC-MS/MS 대용량 고효율분석이 불가능하였던 타액 시료를 문제점을 해결한 것으로 종래의 액체-액체 추출법을 대체할 수 있는 효율적인 시료 제조 방법으로 실시간 분석에 적용되어 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

Claims (11)

  1. 점성이 15 내지 25mPa.s인 타액 시료에 하이드록아파타이트(hydroxyapatite)와 아세톤(acetone)을 첨가하여 점성이 2 내지 3mPa.s이 되도록 제조한 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법이며,
    상기 시료는 200회 연속으로 로딩하여도 액체크로마토그래피 컬럼(3.0 * 100 mm, 1.8μm ZorbaxEclipse xDB-c18, Agilent)의 압력이 20MPa 이하로 유지되는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료는 타액에 존재하는 코티닌을 분석하기 위한 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 하이드록아파타이트와 아세톤은 타액의 단백질을 침강시켜 제거하는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 액체크로마토그래피 기반 분석장비는 액체크로마토그래피 컬럼을 이용하여 1차적으로 타겟물질을 분리한 후 자동으로 연결된 2차 분석장비에 의해 타겟물질이 더 분석되는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.은;
    점성이 15 내지 25mPa.s인 타액 시료에 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)를 첨가하여 점성이 4 내지 6mPa.s인 제 1 타액 시료를 제조하는 제 1 단계;
    상기 제 1 타액 시료에 -15 내지 -25℃인 아세톤을 첨가하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 제 2 타액시료를 제조하는 제 2 단계;
    상기 제 2 타액 시료를 교반 한 후 -15 내지 -25℃에서 10 내지 20시간동안 방치하는 제 3 단계; 및
    상기 -15 내지 -25℃에서 10 내지 20시간동안 방치된 제 2 타액 시료를 원심분리하고 상층액만을 분리하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료를 제조하는 제 4 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트는 120 내지 130 mM이 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 아세톤은 제 2 타액시료 부피의 3 내지 5배가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법은;
    점성이 15 내지 25mPa.s인 타액 시료에 -15 내지 -25℃인 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액을 첨가하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 제 3 타액 시료를 제조하는 제 5 단계;
    상기 제 3 타액 시료를 -15 내지 -25℃에서 30 내지 1시간 30분 동안 방치하는 제 6 단계;
    상기 -15 내지 -25℃에서 30 내지 1시간 30분 동안 방치된 제 3 타액 시료를 원심분리하고 상층액만을 분리하여 점성이 2 내지 3mPa.s인 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료를 제조하는 제 7 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액은 하이드록시아파타이트와 아세톤이 1:400 내지 500의 몰비로 혼합된 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 하이드록시아파타이트-아세톤 혼합용액은 제 3 타액 시료량의 2 내지 5배가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율(high-throughput) 분석용 타액 시료의 제조방법.
KR1020200162402A 2020-11-27 2020-11-27 액체크로마토그래피 기반 분석장비를 이용한 대량고효율 분석용 타액 시료의 제조방법 KR102235907B1 (ko)

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