PT1410014E - Método para a identificação de amostra num mamífero, bem como um kit para realizar este método - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A IDENTIFICAÇÃO DE AMOSTRA NUM MAMÍFERO, BEM COMO UM KIT PARA REALIZAR ESTE MÉTODO" A presente invenção relaciona-se com um método por meio do qual uma amostra que foi colhida de uma excreção, um fluido corporal de um mamifero ou como uma amostra de tecido, possa ser identificada com relação à origem da amostra e, deste modo, possa ser atribuída, de forma inequívoca, ao dador da amostra, de modo que a amostra possa ser analisada para a verificação de um analito. Além disso, o tema da invenção é um kit para realizar este método.

Os métodos de diagnóstico, os métodos para monitorizar o decurso de uma medida terapêutica, as investigações profiláticas de rotina, bem como as investigações da medicina legal em seres humanos normalmente incluem a investigação analítica de amostras no laboratório, tais como, por exemplo, as amostras de sangue ou soro que foram tomadas do indivíduo, bem como a análise da excreção do indivíduo, tal como, por exemplo, a urina. Devido à grande quantidade de diagnósticos médicos existentes e métodos terapêuticos para animais, uma variedade muito ampla de métodos analíticos com amostras de animais é, actualmente, também, prática comum. Especialmente os problemas que surgiram no que diz respeito à intensa criação de animais, tais como as doenças BSE devido à alimentação de ração animal ou a mistura de aditivos alimentares ilegais na forma de hormonas e/ou preparações antibióticas nas bolotas de animais de criação 2 necessitam de uma extensão das investigações de controlo regulamentares em rebanhos na agricultura.

Neste contexto, não há dúvida de que qualquer investigação analítica de uma amostra só tem significado se os resultados obtidos na análise também puderem ser atribuídos, de forma inequívoca, ao respectivo dador da amostra a fim de, deste modo, iniciar a resposta correcta na avaliação dos resultados experimentais.

Novas análises e métodos de testes estão continuamente a ser desenvolvidos como parte do progresso cientifico-tecnológico. Os avanços em biologia molecular, por exemplo, permitem a implementação de uma série de métodos de detecção com base na análise do ADN, por meio dos quais certas doenças em seres humanos ou animais podem ser diagnosticadas.

Muitas das análises e dos métodos de detecção mais recentes também encontram aplicação na medicina legal, ou, devido às tarefas constantemente mais desafiadoras desta última, devem o seu desenvolvimento à mesma, por exemplo, os métodos de teste específicos para a detecção de substâncias de doping em atletas ou para a detecção de drogas em condutores de veículos.

Devido ao grande número de métodos de análise implementados, bem como à sua complexidade, espera-se elevados padrões do equipamento técnico, bem como do pessoal nos laboratórios que realizam estas análises. Normalmente, muitas amostras têm de ser analisadas simultaneamente com aparelhos de análises modernos, de modo que o problema de um engano de amostras surge, 3 inevitavelmente, levando, deste modo, a uma atribuição incorrecta dos resultados da análise no que diz respeito ao dador da amostra. Este problema não é novo e é ainda exacerbado pelo rápido desenvolvimento de novos métodos de análise e da necessidade crescente associada com a sua utilização.

Uma vez que as consequências de um engano ou de uma troca das amostras a serem analisadas são diferentes, mas normalmente indesejáveis, já existe uma série completa de sugestões de como resolver este problema.

Estas tentativas de soluções relacionam-se principalmente a uma organização melhorada do fluxo de trabalho num laboratório de análises, onde o cumprimento de certas regras de comportamento pretende minimizar o perigo de engano das amostras. No entanto, uma vez que muitos passos de protocolos nestes métodos de análise são realizados pelo próprio pessoal do laboratório, os enganos que podem ser atribuídos a erro humano não podem ser completamente eliminados.

Com este conhecimento, a monitorização controlada por computador dos respectivos passos do protocolo a ser realizado com a amostra é amplamente utilizada, por exemplo, marcando os recipientes de amostras com um código legível por computador de modo que a respectiva amostra possa ser acompanhada durante todo o processo de análise, a começar com a entrada da amostra e incluindo o processamento e a armazenagem dos resultados experimentais. Deste modo, esta análise de amostra monitorizada por computador e controlada por computador permite um grande 4 número de determinações paralelas de amostras diferentes sem um perigo significativo de enganos. É evidente, no entanto, para alguém com conhecimento corrente na técnica que, mesmo o sistema mais inteligente de monitorização das amostras a serem analisadas num laboratório e de atribuição do resultado do teste a estas amostras e, com esta atribuição, ao dador das amostras, não pode excluir completamente, um engano ou uma troca das amostras, uma vez que pode ocorrer uma marcação inadequada das amostras ou dos resultados do teste das mesmas. 0 problema descrito de um engano ou uma troca de amostras é especialmente acentuado em campos de aplicação em que os resultados dos testes podem ser utilizados como provas incriminatórias contra o dador da amostra ou, no caso de uma amostra que tem origem num animal de criação, contra o proprietário do animal. Nestes casos existe um interesse especial do indivíduo ou do proprietário em manipular as amostras de teste com a finalidade de evitar a geração de prova incriminatória.

No entanto, é especialmente nestes casos que uma atribuição inequívoca dos resultados do teste ao dador da amostra é particularmente importante, uma vez que as regulações legais, muitas vezes, só podem ser implementadas desta maneira.

As tentativas de soluções que, devido a este problema, já existem no estado da técnica anterior para evitar a manipulação com a amostra, relaciona-se, de forma predominante, à monitorização da colheita da amostra. Por exemplo, é prática comum que a apresentação da urina de 5 indivíduos que fazem parte de uma terapêutica com metadona seja supervisionada.

No entanto, mesmo o sistema mais inteligente de monitorização e supervisão dos indivíduos durante a apresentação da amostra de urina não evitará completamente uma troca das amostras. Na Alemanha, 20.000 dos 120.000 -140.000 tóxico-dependentes já são tratados com metadona. Um aumento importante neste número é esperado no futuro. Uma vez que os doentes tratados com metadona, muitas vezes, tomam outros narcóticos bem como barbitúricos e tranquilizantes, é terapeuticamente necessário um controlo das substâncias tomadas pelos doentes.

De acordo com a directrizes para a implementação da terapêutica com metadona, a urina tem de ser verificada pelo menos uma vez por semana ou, em certas circunstâncias, até com mais frequência. Normalmente, a apresentação da amostra de urina sob observação não é possível em consultórios comuns de médicos, uma vez que, de um modo geral, há apenas uma pequena casa de banho e, normalmente, não há pessoal médico adequado do sexo masculino disponível para acompanhar os doentes do sexo masculino tratados com metadona. A construção de casas de banho adequadas para a apresentação de amostras sob observação requer um elevado gasto financeiro. Apenas os custos para tal investimento no centro de saúde de Dusseldorf atingiram 50 TDM.

Devido à manipulação comummente observada nas amostras de urina apresentadas, cada vez mais têm sido realizados trabalhos em relação aos métodos de análise para a detecção de drogas na descarga de saliva. Mesmo se, em contraste com a utilização de sangue, plasma ou urina como 6 amostras de teste, uma amostra de saliva possa ser obtida sem uma intromissão adversa ou sem uma invasão da privacidade do indivíduo, o perigo de um engano negligente ou de uma manipulação intencional com as amostras não poderia ser evitado. O documento US 5.179.027 proporciona um método para verificar a fonte e a integralidade das amostras de urina compreendendo: a ingestão de uma quantidade de um primeiro e um segundo marcador químico por um indivíduo, sendo o primeiro marcador excretado quantitativamente e sendo o segundo marcador segregado em quantidades mensuráveis na urina para confirmar mediante análise química posterior a integralidade e a precisão da fonte da amostra de urina; a colheita de uma amostra de urina do referido indivíduo num período de tempo desde a referida ingestão, suficiente para permitir que quantidades necessárias do primeiro e do segundo marcadores químicos sejam segregadas na urina; documentar o tempo em que a quantidade e a identidade dos marcadores químicos foram ingeridos bem como a identidade do indivíduo; e, finalmente, analisar a urina colhida para determinar as quantidades do primeiro e do segundo marcadores químicos na mesma, para verificar a fonte e a integralidade da amostra de urina. O objectivo da presente invenção é, portanto, proporcionar um método melhorado para assegurar uma atribuição inequívoca das amostras ao dador e, deste modo, superar os problemas ou desvantagens comuns ao estado da técnica anterior.

De acordo com a invenção, este objectivo é atingido proporcionando um método para a análise de amostras 7 biológicas de um mamífero para pelo menos um componente, em que o método inclui os seguintes passos: (a) Administrar, por via oral, uma combinação de pelo menos duas substâncias marcadoras a um mamífero; (b) Aguardar por um período de tempo que é suficiente para a combinação das pelo menos duas substâncias marcadoras alcançar a localização da remoção da amostra; (c) Remover uma amostra biológica do mamífero; (d) Analisar a amostra biológica para verificar a presença e/ou a quantidade da combinação das pelo menos duas substâncias marcadoras ou derivados destas; e, se a combinação das pelo menos duas substâncias marcadoras ou derivados destas é detectável na amostra biológica; (e) Analisar a amostra biológica para a verificação de um analito; em que a amostra biológica do mamífero é a urina e a remoção da referida urina do referido mamífero é conseguida por meio da recolha de urina num recipiente de recolha, e em que as pelo menos duas substâncias marcadoras são seleccionadas de isoprenóides, lípidos, sacáridos, polióis, polietilenoglicóis ou derivados destes. A ideia da presente invenção era, portanto, verificar a possibilidade com a qual a amostra a ser investigada pudesse ser marcada e ao mesmo tempo evitar que este marcador fosse removido da amostra por meio de métodos 8 acessíveis a uma pessoa leiga. Deste modo, o método é adequado, por exemplo, para monitorizar a terapêutica com metadona, bem como para o controlo de doping. As substâncias marcadoras vantajosas são, em geral, caracterizadas por uma série de particularidades específicas. Estas substâncias marcadoras não exercem efeitos secundários farmacológicos no organismo do mamífero às concentrações que são necessárias para a detecção destas substâncias marcadoras no sangue, na urina ou outros fluidos corporais ou em excreções corporais de acordo com a invenção.

Um derivado que é especificamente formado a partir de qualquer das pelo menos duas substâncias também pode, do mesmo modo, ser utilizado em vez desta. Por "derivados", deve ser entendido todos os produtos subsequentes que surgem como resultado de uma transformação química no organismo do indivíduo ou na amostra removida, em que, no entanto, são excluídos todos os produtos subsequentes que não sejam exclusivamente atribuíveis à transformação de um marcador específico no organismo do indivíduo ou na amostra removida. É vantajoso se a substância marcadora for solúvel num líquido, que o sabor normal do líquido, tal como por exemplo um sumo, não seja alterado pela adição ou que, depois de dissolver em água nenhum sabor desagradável da solução resultante seja provocado pelos marcadores e, deste modo, o indivíduo possa tomar, voluntariamente, o líquido contendo os marcadores.

As substâncias marcadoras vantajosas são caracterizadas por serem rapidamente absorvidas através das 9 membranas mucosas do intestino e serem excretadas do indivíduo na urina. É também vantajoso se estas substâncias marcadoras nas amostras de urina puderem ser detectadas da maneira mais simples possível, por meio de métodos de detecção já estabelecidos em laboratórios de análise química, tais como, por exemplo, métodos comuns de química analítica clínica. De acordo com a invenção, é preferível utilizar substâncias marcadoras que não sejam metabolizadas depois da absorção pelo indivíduo.

As substâncias marcadoras preferidas são açúcares ou derivados de açúcar, tais como, por exemplo arabinose, eritrulose, mio-inositol, cis-inositol, manitol, sorbose, ramnose, sorbitol, xilose e xilulose, que são solúveis em água e que podem ser facilmente detectadas por meio de testes enzimáticos. É também vantajoso utilizar isoprenóides, lípidos, sacáridos, polióis, polietilenoglicóis, derivados ou misturas destas substâncias como substâncias marcadoras.

Para a análise das amostras de urina, a combinação de pelo menos duas substâncias marcadoras é dissolvida num líquido e o líquido é administrado por via oral e o indivíduo toma o líquido aproximadamente 30 a 60 minutos antes da apresentação da urina. Os polietilenoglicóis ou misturas destes são os mais preferencialmente utilizados como substâncias marcadoras para a análise de amostras de urina. E especialmente preferido administrar substâncias marcadoras múltiplas simultaneamente, uma vez que é possível pela combinação de substâncias marcadoras 10 desenvolver um certo código numérico pertencente a uma respectiva amostra. A fim de aumentar a segurança contra a manipulação, uma combinação de pelo menos 2, preferencialmente de pelo menos 3, mais preferencialmente 5 substâncias marcadoras é administrada simultaneamente.

Utilizando um total de n substâncias marcadoras, existem 2n-l combinações diferentes num sistema numérico duplo. A manipulação das amostras pelo indivíduo é, portanto, impossível, uma vez que o indivíduo teria de conhecer a natureza química das substâncias marcadoras, o código numérico para a sua amostra de urina e a sequência de substâncias marcadoras de acordo com a qual o código é construído. A administração das substâncias marcadoras pode ser conseguida de maneiras diferentes. Por "administração" deve ser entendida a introdução de uma ou de um grande número de substâncias marcadoras no organismo do dador da amostra. De acordo com a invenção, as substâncias marcadoras podem ser administradas ao dador da amostra por via oral. É especialmente preferido que as substâncias marcadoras sejam tomadas através do tracto digestivo e que, durante a absorção, não ocorra a metabolização das substâncias marcadoras.

Dependendo do tipo das pelo menos duas substâncias marcadoras administradas e o tipo da amostra a ser removida, é necessário antes da remoção da amostra a ser analisada, esperar um certo "período de tempo suficiente", antes da remoção da amostra. Este período representa o tempo que a pelo menos uma substância marcadora necessita para alcançar o local da remoção da amostra. No caso da 11 remoção da amostra de um componente que existe separadamente do dador de amostra, tal como, por exemplo, a remoção de uma secreção do corpo, o tempo deve ser entendido como o tempo que é necessário até que a pelo menos uma substância marcadora esteja presente no componente separável e este componente seja separado do dador da amostra. A duração do tempo que se deve esperar pode ser determinada empiricamente, ainda que, no entanto, na maioria dos casos, os valores ou métodos correspondentes para a sua determinação sejam conhecidos no estado da técnica anterior (van Rossum, J. M. : Kinetics of Drug Action. Handbuch der experimentellen Pharmakoligie, Vol. 47. Springer, Berlim 1977; Forth, W.: Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie. Bibliographisches Institut & F. A. Brockhaus, Mannheim 1988). A remoção da amostra ocorre colhendo parte da amostra num recipiente para amostra e, depois disto, está pronta para ser analisada. Na análise de amostras de urina de seres humanos, as amostras, de um modo geral, podem ser fornecidas pelos próprios indivíduos, em que o indivíduo é simplesmente fornecido com um recipiente para amostra.

Por "amostra biológica" pretende-se significar os componentes de um mamífero designados para a investigação analítica. Relevante, aqui, é a urina. Os componentes que perfazem a amostra podem incluir os componentes do organismo de um mamífero que ainda existem no mamífero no momento da remoção da amostra, bem como os componentes anteriores do mamífero. 12

Por "excreção corporal" ou "excreção" deve ser entendido a urina, fezes, secreções das glândulas salivares, mamárias, lacrimais e sudoríferas.

Por "mamífero" deve entendido, para além dos animais desta categoria, os seres humanos também.

Dependendo do tipo da amostra e das pelo menos duas substâncias marcadoras a serem detectadas, a respectiva amostra tem de ser preparada antes do método de análise. Os passos de preparação podem incluir a centrifugação para a separação de materiais sólidos, não solubilizados numa amostra de líquido como, por exemplo a urina, concentração por cromatografia de troca de iões utilizando Centricons, por precipitação com reagentes adequados, tais como o sulfato de amónio, ajuste do valor do pH necessário para o método de análise e outros passos de precipitação conhecidos daqueles com conhecimento corrente da técnica.

Inúmeros métodos de detecção enzimáticos, imunológicos, de espectroscopia de massa e electroforéticos, bem como combinações destes métodos estão disponíveis para a determinação da presença ou ausência de pelo menos uma substância marcadora numa amostra. Preferencialmente, a detecção é acompanhada por um método acoplado de GC/MS ou HPLC/MS ou por HPLC ou GC. Estes métodos permitem a análise em pouco tempo de, principalmente, amostras de líquido ou de amostras que, devido à sua preparação foram transferidas para um líquido. Ao mesmo tempo, estes métodos de detecção permitem um elevado grau de automatização, de modo que um grande número de amostras pode ser analisado num curto período de tempo, e no que diz respeito aos cromatogramas e, como pode ser o 13 caso, os padrões de fraccionamento espectroscópico de substâncias de referência já existirem no computador, a detecção real das pelo menos duas substâncias marcadoras é também muito simplificada.

Se for determinado como resultado da avaliação do método de análise aplicado que as pelo menos duas substâncias marcadoras originalmente administradas estão presentes na amostra analisada, então, isto permite a atribuição inequívoca desta amostra ao indivíduo. Se este exigência for cumprida, isto é, se a amostra origina do indivíduo a ser analisado, tem lugar a análise real desta amostra ou, alternativamente, de uma segunda amostra para a verificação de um analito.

Por "analito" deve ser entendido pelo menos uma substância química, em que a informação no que diz respeito à presença ou, como pode ser o caso, também da sua concentração na amostra, permite uma conclusão em relação a um estado passado, esperado ou presente do dador da amostra. Como exemplo, uma conclusão relativa a um funcionamento incorrecto - por estar incompleto - da reabsorção de glucose da urina pelos túbulos renais (glucosuria) num indivíduo é possível com base na informação da concentração de um analito, tal como, por exemplo, a concentração de glucose na urina de uma amostra de urina, que foi normalmente, determinada enzimaticamente por meio de glucose oxidase (GOD) ou hexocinase. Os analitos podem ainda ser substâncias intoxicantes, medicamentos, metabolitos das substâncias anteriormente mencionadas, cuja detecção na amostra fornece informações relativas ao comportamento ou a um tratamento do indivíduo. 14

Para além da utilização do método de acordo com a invenção em medicamentos para seres humanos, também existe um grande número de outras aplicações no campo da medicina veterinária e na agricultura. O método pode ser utilizado, de forma vantajosa, na monitorização da anuência a regulamentações para a utilização de aditivos alimentares na agricultura de animais de criação com bolotas.

Se, por exemplo, amostras obtidas de porcos alimentados com bolotas forem analisadas para verificação da presença de hormonas do crescimento ou de antibióticos nos seus metabolitos, a utilização do método de acordo com a invenção pode evitar o problema de uma manipulação com as amostras a serem analisadas pelo proprietário do rebanho de porcos alimentados com bolota.

Aqui, são especialmente vantajosas aquelas substâncias marcadoras que permanecem no animal durante um periodo de tempo prolongado - no caso ideal, por toda a duração da alimentação com bolotas - e que ainda estão continuamente presentes numa quantidade detectável, por exemplo, numa excreção do corpo. Por esta razão, são vantajosas aquelas substâncias marcadoras que podem ser administradas ao animal como um agente de libertação controlada, em virtude do qual, por exemplo, tem lugar uma reabsorção retardada porém continua através das membranas da mucosa intestinal e, deste modo, as pelo menos duas substâncias marcadoras são detectáveis por um periodo de tempo prolongado, por exemplo, numa excreção corporal como as fezes do animal. As amostras especialmente adequadas são as amostras com as quais têm lugar tanto a análise para as pelo menos duas substâncias marcadoras, bem como a detecção ou a determinação da concentração de pelo menos um analito. 15

Outro objectivo da presente invenção é um kit para realizar o método escrito para a identificação de amostra num mamífero, em que o kit de acordo com a invenção inclui uma combinação de pelo menos duas substâncias marcadoras num recipiente, tal como um recipiente de comprimido, bem como, conforme pode ser o caso, meios para administrar as pelo menos duas substâncias marcadoras ao mamífero. É especialmente vantajoso se este kit também contém pelo menos uma substância de referência para a detecção das substâncias marcadoras.

Um kit de acordo com a invenção contém, preferencialmente, para a administração oral das substâncias marcadoras, estas substâncias marcadoras na forma de comprimidos efervescentes individuais solúveis em água. Alternativamente, estes comprimidos efervescentes também podem já conter as substâncias marcadoras como misturas de substâncias marcadoras múltiplas. 0 código da respectiva substância pode, então, ser tomado do rótulo do recipiente de comprimido. 0 kit pode compreender comprimidos efervescentes com concentrações variadas de substâncias marcadoras correspondendo ao círculo de pessoas para as quais o marcador será administrado, de modo que estes marcadores possam ser aplicados, por exemplo, a crianças bem como a adultos sem alcançar uma concentração de substâncias marcadoras no indivíduo que possa fazer surgir efeitos secundários farmacológicos. É especialmente vantajoso se os recipientes de comprimidos contidos no kit forem proporcionados com um 16 código legível por computador. Os kits pretendidos para a marcação de amostras de urina de doentes tratados com metadona, preferencialmente, contêm comprimidos, cápsulas ou formas semelhantes de aplicação em que tanto a quantidade de metadona a ser administrada como a mistura das substâncias marcadoras estão disponíveis juntas.

Outras formas de realização vantajosas do kit de acordo com a invenção incluem múltiplas substâncias de referências por meio das quais as substâncias marcadoras podem ser facilmente identificadas na análise cromatográfica da amostra de urina.

Por exemplo, na análise da amostra de urina de um doente tratado com metadona, também pode estar presente uma ampola do tipo tubo no kit de acordo com a invenção, cuja uma ampola do tipo tubo contém uma mistura das substâncias marcadoras solubilizadas num meio veicular adequado de acordo com o método cromatográfico seleccionado, em que esta mistura corresponde exactamente à mistura presente nos comprimidos de metadona correspondentes.

Por uma realização subsequente na mesma coluna GC, pode-se determinar com muita rapidez e com certeza devido aos picos da cromatográfia das substâncias marcadoras numa análise por GC se a amostra de urina analisada origina-se do doente a ser tratado com metadona.

Exemplo 1

Para a explicação exemplificativa adicional do método de acordo com a invenção, é dada adiante uma forma de realização para realizar a marcação de uma amostra a ser analisada. 17 A forma de realização relaciona-se com a marcação de uma amostra de urina a ser analisada e a sua subsequente análise. 0 indivíduo recebe 100-300 mL de um liquido para beber, no qual está solubilizado 1 g de polietilenoglicol 600 como marcador. Pode-se utilizar sumo de frutas, água e outros líquidos saborosos aos humanos como líquidos para beber.

Em vez de polietilenoglicol 600, também se pode utilizar fracções monodispersas ou misturas de fracções monodispersas. Aqui, o laboratório estabelece um código da substância. Tal código é dado a seguir como cinco fracções monodispersas de polietilenoglicol. Aqui, "0" representa não presente e "1" representa presente.

Substâncias Substâncias A B c D E Código 1 0 0 0 1 1 2 0 0 1 0 1 3 0 0 1 1 0 4 0 0 1 1 1 5 0 1 0 0 1 6 0 1 0 1 0 7 0 1 0 1 1 8 0 1 1 0 0 9 0 1 1 0 1 10 0 1 1 1 0 11 1 0 0 0 1 12 1 0 0 1 0 13 1 0 0 1 1 14 1 0 1 0 0 15 1 0 1 0 1 16 1 0 1 1 0 17 1 1 0 0 0 18 1 1 0 0 1 19 1 1 0 1 0 20 1 1 1 0 0

As substâncias A, B, C, D e E correspondem a fracções de polietilenoglicol com pesos moleculares: 18 A 530 B 574 C 618 D 662 E 706

Depois da ingestão, o indivíduo foi pedido para aguardar pelo menos 30 minuto e, no máximo, 4 horas antes de urinar. Foi permitido ao indivíduo consumir outros alimentos líquidos ou sólidos durante esta fase de espera. O indivíduo não teve de ser supervisionado durante o tempo de espera. A apresentação da urina pelo indivíduo teve lugar sem supervisão. O recipiente de amostra foi identificado com um rótulo com um código de barras que codifica um número de trabalho também contido na etiqueta associada legível por computador. Na etiqueta associada foram indicados o nome do indivíduo, a análise desejada, bem como a combinação de substâncias marcadoras ou o código da substância. O remetente é memorizado pelo número do trabalho nos dados mestres do computador do laboratório. As amostras foram transportadas para o laboratório com a etiqueta associada. A etiqueta associada foi inserida no computador com um leitor de cartão. O trabalho foi registado desta maneira. Aqui, a combinação de substâncias ou o código da substância também foi inserido no computador.

Para a análise para a verificação de polietilenoglicol, a urina foi centrifugada, 100 pL do sobrenadante estava em Nucleosil C 100 - (Cl8), 3 pm (4,6, x 125 mm) a um caudal de 0,5 mL/min (metanol/água - 5/95) e foi analisada para a verificação de polietilenoglicol por 19 detecção com um detector RI. Os picos da cromatografia foram identificados como polietilenoglicóis pelos tempos de retenção com base nas cromatografias de referência.

Desta maneira, cada mostra de urina analisada poderia ser atribuída de forma inequívoca ao respectivo indivíduo por meio do código da substância das diferentes fracções de polietilenoglicol utilizadas. 0 indivíduo foi subsequentemente analisado para verificação do analito, isto é, uma substância intoxicante a ser detectada, como a heroina ou os seus derivados.

Os açúcares para a marcação de fluidos corporais podem ser utilizados da mesma maneira conforme descrito para as fracções de polietilenoglicol. Estas são determinadas para a urina ou outros fluidos corporais por meio de reacções de detecção enzimáticas. Os métodos de detecção analíticos exigidos para esta finalidade são conhecidos na técnica (Methods of Enzymic Analysis, Ed. Bergmeyer, H. U. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim 1986) .

Exemplo 2

Para a preparação do doente pré-analítico, os doentes da ambulância de drogas foram dados 1 mL de polietilenoglicol 400 ("Marcador A"), 600 ("Marcador B") ou uma mistura de 400 e 600 ("Marcador C") em 100 mL de sumo de fruta. Os doentes foram supervisionados enquanto bebiam e pediu-se que esperassem pelo menos 30 minutos antes de apresentar a urina. Depois deste tempo foi permitido aos doentes que urinassem sem supervisão. O tubo de urina foi, então, etiquetado e directamente transportado para o local das análises. 20

Antes da análise, as amostras foram preparadas como a seguir: 10 mL de urina foram centrifugados a 10500 x g durante 10 minutos.

Para a análise de polietilenoglicol, o cromatógrafo foi operado isocraticamente à temperatura ambiente no modo de acoplamento de coluna. Pelo facto da detecção à temperatura ambiente limita a fases móveis isocráticas, o eluente da remoção das impurezas e da bomba analítica foram idênticos, consistindo em 44% de metanol e 56% de água. 100 pL de sobrenadante da urina centrifugada foram injectados automaticamente num pré-coluna (60 x 4,6 mm) cheia com Nucleosil 100 C18, 5 pm. Com o eluente administrado pela bomba de remoção das impurezas a um fluxo de 0,4 mL / min e uma pressão de 36 bar, as impurezas da matriz foram descarregadas no resíduo, enquanto as fracções de PEG foram retardadas na fase estacionária. Depois de 120 segundos a pré-coluna foi ligada pela válvula de seis orifícios para a corrente de eluente da bomba analítica e os analitos foram submetidos à reversão de fluxo para a separação com um caudal de 0,5 mL / min e uma pressão de 96 bar na coluna analítica, Nucleosil 100 C8 5 pm. O tempo da análise foi de 18 minutos. A caracterização fenomenológica do padrão de eluição cromatográfico urinário foi alcançada por detecção à Temperatura Ambiente, regulada a 40°C. De acordo com o padrão observado, os marcadores foram então diagnosticados como "Marcador A", "Marcador B" ou "Marcador C", conforme ilustrado nas Figuras 1-3, em anexo.

Os seguintes materiais e equipamentos foram utilizados neste exemplo: Polietilenoglicol, qualidade PH Eur, de peso molecular médio de 400 ou 600 da Merck, Darmstadt, Alemanha; metanol e acetonitrilo grau HPLC da 21

Baker; água desionizada e purificada por sistemas Millipore Elix3 e MilliQ Gradient AIO, Inertsil C8-3 Spm, (250 x 4,6) e Nucleosil 100 C18 5 pm (50 x 4,6 mm) colunas HPLC da Schambeck SFD GmbH, Bad Honnef, Alemanha. Equipamento-HPLC: o injector de amostra S 5200 equipado com um circuito de injecção de 100 pL, a bomba de limpeza de pré-coluna S2100, o desgaseificador integrado, a válvula de ligação do motor de seis orifícios ProLAB, o forno de coluna SFD 125-600, o detector de indice de refracção do tipo deflexão, o elemento de filtro inline PAT™, para PEEK 3 pm filtros inline foram obtidos de Schambeck SED GmbH, Bad Honnef, Alemanha. A bomba analítica M480, o módulo de desgaseificação Degasys DG1310 e o sistema de aquisição de dados Chromeleon 6.11 sob Windows NT 4.0 foram adquiridos da Gynkotec.

Lisboa, 28 de Fevereiro de 2007

Claims (11)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para a análise de amostras biológicas de um mamifero para pelo menos um componente, em que o método inclui os seguintes passos: (a) Administrar, por via oral, uma combinação de pelo menos duas substâncias marcadoras a um mamífero; (b) Aguardar por um período de tempo que é suficiente para a combinação das pelo menos duas substâncias marcadoras alcançar a localização da remoção da amostra; (c) Remover uma amostra biológica do mamífero; (d) Analisar a amostra biológica para verificar a presença e/ou a quantidade da combinação das pelo menos duas substâncias marcadoras ou derivados destas; e, se a combinação das pelo menos duas substâncias marcadoras ou derivados destas é detectável na amostra biológica; (e) Analisar a amostra biológica para a verificação de um analito; em que a amostra biológica do mamífero é a urina e a remoção da referida urina do referido mamífero é conseguida por meio da recolha de urina num recipiente de recolha, e caracterizado por as pelo menos duas substâncias marcadoras serem seleccionadas de isoprenóides, lípidos, sacáridos, polióis, polietilenoglicóis ou derivados destes. 2

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida combinação das pelo menos 2 substâncias marcadoras compreende pelo menos 3, preferencialmente 5 substâncias marcadoras.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que arabinose, eritrulose, mio-inositol, eis-inositol, manitol, sorbose, ramnose, sorbitol, xilose e xilulose são seleccionados como sacáridos.

4. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que pelo menos dois polietilenoglicóis de pesos moleculares diferentes são utilizados como substâncias marcadoras.

5. Método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que a substância marcadora ou o grande número de substâncias marcadoras é detectado por meio de GC, GC/MS, HPLC OU HPLC/MS.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que as amostras de urina de doentes tratados com metadona são analisadas para a verificação de substâncias intoxicantes e o método inclui os seguintes passos: muito especialmente a) Administrar, por via oral, uma combinação de 2n”l polietilenoglicóis de pesos moleculares diferentes a um doente tratado com metadona, em que n é um número inteiro e superior a zero, preferencialmente, pelo menos 2, especialmente preferido pelo menos 3, preferido 5; 3 (b) Aguardar por um período de tempo de pelo menos 30 minutos até, no máximo, 4 horas; (c) Remover uma amostra de urina da urina excretada do doente; (d) Analisar a amostra de urina para verificar a presença dos polietilenoglicóis e; conforme seja o caso, (e) Analisar a amostra de urina para a verificação de substâncias intoxicantes.

7. Kit para realizar o método de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o kit inclui, num recipiente, uma combinação de pelo menos 2, preferencialmente, pelo menos 3, particularmente preferido 5 substâncias marcadoras, sendo as referidas pelo menos duas substâncias marcadoras seleccionadas de isoprenóides, lípidos, sacáridos, polióis, polietilenoglicóis ou derivados destes.

8. Kit de acordo com a reivindicação 7, em que o kit contém uma combinação de 2n“l de polietilenoglicóis de pesos moleculares diferentes num ou mais recipientes em que n é um número inteiro e superior a zero, preferencialmente, pelo menos 2, especialmente preferido pelo menos 3, muito especialmente preferido 5 .

9. Kit de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o kit inclui, adicionalmente, meios para administrar a pelo menos uma substância marcadora. 4

10. Kit de acordo com a reivindicação 9, em que o kit inclui, adicionalmente, meios para a detecção das pelo menos duas substâncias na amostra removida de um mamífero.

11. Kit de acordo com a reivindicação 10, em que o kit contém, adicionalmente, substâncias de referência para a detecção das pelo menos duas substâncias marcadoras. Lisboa, 28 de Fevereiro de 2007