ES2280540T5

ES2280540T5 - Método para la identificación de muestras de mamíferos y juego para la aplicación de dicho método

Info

Publication number: ES2280540T5
Application number: ES02732486T
Authority: ES
Inventors: Ruprecht Keller; Gisela Dr. Gauchel
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2001-03-15
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2012-10-22
Anticipated expiration: 2022-03-14
Also published as: DE60217351D1; US7820444B2; ES2280540T3; EP1410014B2; DK1410014T3; HK1064738A1; DE60217351T2; ATE350659T1; AU2002304857B2; IL157917A0; CA2440045A1; CA2440045C; WO2002075307A1; JP2004535554A; US20040166532A1; PT1410014E; EP1410014B1; NZ527880A; DE10112470A1; BR0208069A

Abstract

Método para el análisis de muestras biológicas de un mamífero para determinar la presencia de un componente que consta de los pasos siguientes:(a) administración oral de una combinación de, como mínimo, dos marcadores a un mamífero; (b) espera del tiempo necesario para que la combinación de, como mínimo, dos marcadores alcance el punto de obtención de la muestra; (c) obtención de la muestra biológica del mamífero; (d) análisis de la muestra biológica para determinar la presencia o cantidad de la combinación de, como mínimo, dos marcadores o derivados de los mismos así como si la combinación de los, como mínimo, dos marcadores o derivados de éstos se puede detectar en la muestra biológica; (e) análisis de la muestra biológica para determinar la presencia de un analito, siendo la muestra biológica de un mamífero una muestra de orina obtenida mediante su recogida en un recipiente de recogida de muestras, y que se caracteriza porque los, como mínimo, dos marcadores se seleccionan de entre los isoprenoides, lípidos, sacáridos, polioles, polietilenglicoles o de entre los derivados de estas sustancias.

Description

Método para la identificación de muestras de mamíferos y juego para la aplicación de dicho método

5 El presente invento hace referencia a un método por el que se puede identificar el origen de una muestra de tejido o muestra obtenida de un excremento o fluido corporal de un mamífero y, de este modo, atribuir inequívocamente dicha muestra al donante en cuestión. Posteriormente la citada muestra se puede analizar en busca de un analito. Asimismo, el objeto del invento también consiste en el juego que permite la aplicación de este método.

10 Los métodos diagnósticos, los métodos para supervisar la evolución de una medida terapéutica, los estudios profilácticos estándar y los análisis de la medicina forense aplicados a sujetos humanos suelen incluir estudios analíticos de muestras que se llevan a cabo en el laboratorio, como muestras sanguíneas o séricas obtenidas del sujeto, así como el análisis de productos eliminados por el organismo, por ejemplo la orina.

15 Habida cuenta de la existencia de múltiples pruebas diagnósticas y tratamientos veterinarios para animales, se puede afirmar que en la actualidad existe una gama muy amplia de métodos analíticos aplicados a muestras animales y que son una práctica habitual. Los problemas que han surgido especialmente en la ganadería intensiva, como los casos de encefalopatía espongiforme bovina (EEB) provocados por el engorde con piensos de origen animal o el uso de aditivos ilegales en forma de hormonas o preparados antibióticos en

20 el pienso del ganado, exigen una ampliación de los análisis de control regulares a los que se someten los rebaños.

En este contexto, resulta evidente que cualquier estudio analítico de una muestra sólo es significativo si los resultados obtenidos se pueden atribuir sin ningún tipo de duda al donante correspondiente para iniciar la

25 respuesta correcta en el análisis de los resultados del estudio.

Continuamente se desarrollan nuevos métodos analíticos y de prueba como parte de los avances técnicos y científicos. Así, por ejemplo, los avances logrados en biología molecular permiten llevar a cabo una serie de métodos de detección basados en el análisis de ADN que llevan a diagnosticar determinadas enfermedades

30 en personas o animales.

Muchos de estos nuevos métodos analíticos y de detección también tienen aplicaciones en la medicina forense o deben su desarrollo a esta especialidad, a causa de los retos cada vez más exigentes a los que se enfrenta, como las pruebas específicas para la detección de sustancias dopantes en atletas o drogas en

35 conductores.

Debido a la gran cantidad de métodos analíticos aplicados así como a su complejidad, se esperan unos elevados estándares del equipo técnico y del personal de laboratorio encargado de realizar estos estudios. Normalmente se deben analizar muchas muestras de forma simultánea con modernos equipos de análisis,

40 por lo que inevitablemente surge el problema de la confusión de muestras que, en última instancia, supone una atribución incorrecta de los resultados del análisis al donante de la muestra. Este problema no es nuevo, y todavía se agrava más especialmente como consecuencia del rápido desarrollo de nuevos métodos analíticos y de la necesidad de expansión de su uso que va asociada.

45 Puesto que las consecuencias de la confusión o intercambio de muestras para analizar son distintas pero suelen ser inconvenientes, ya se ha formulado un conjunto de sugerencias para resolver este problema.

Estos intentos de buscar soluciones se centran principalmente en una mejor organización del flujo de trabajo de un laboratorio de análisis, mientras que algunas reglas de comportamiento que se citan a continuación

50 tienen como objetivo minimizar el peligro de confusión de muestras. Sin embargo, puesto que el propio personal del laboratorio se encarga de muchos de los pasos de los protocolos de estos métodos analíticos, las confusiones atribuibles a errores humanos no se pueden descartar por completo.

Habida cuenta de estas consideraciones, la supervisión informática de cada uno de los pasos del protocolo a

55 los que se debe someter la prueba es una práctica muy extendida, por ejemplo por medio del etiquetado de los recipientes que contienen las muestras con un código informatizado para poder seguir la evolución de cada muestra durante el conjunto del proceso de análisis, desde el registro de la muestra hasta el almacenamiento de los resultados analíticos pasando por el procesado. Estos análisis supervisados y controlados informáticamente permiten un mayor número de determinaciones paralelas de muestras

60 diferentes sin un peligro significativo de confusión.

Sin embargo, para los expertos en la técnica resultará evidente que incluso utilizando el sistema más inteligente de supervisión de muestras para analizar en el laboratorio y de atribución de los resultados a las correspondientes muestras, para luego atribuirlas a los respectivos donantes, no se puede excluir por completo una confusión o intercambio de muestras, puesto que para ello basta con un etiquetado incorrecto de las muestras o de los resultados.

El problema descrito de confusión o intercambio de muestras se ve especialmente agravado en aquellos

5 ámbitos de aplicación en los que los resultados de los análisis se pueden utilizar como pruebas que incriminen al donante o, en el caso de una muestra de una cabeza de ganado, al dueño del animal. En estos casos, el sujeto o el dueño están especialmente interesados en alterar las muestras que se deben analizar para evitar que se conviertan en pruebas que les incriminen.

10 Sin embargo, es especialmente en estos casos cuando una atribución inequívoca de los resultados al donante resulta particularmente importante, puesto que con frecuencia determinadas normativas sólo se pueden hacer cumplir de este modo.

Las soluciones de la técnica anterior para evitar la alteración de las muestras se basan principalmente en

15 supervisar la obtención de la muestra. Por ejemplo, es una práctica habitual el supervisar la obtención de muestras de orina de sujetos que participan en tratamientos con metadona.

Sin embargo, incluso la supervisión y el control más exhaustivos de los sujetos durante la obtención de muestras de orina no evita por completo el intercambio de muestras. En Alemania, 20.000 de los entre

20 120.000 y 140.000 drogodependientes ya se tratan con metadona, y se ha previsto un gran incremento de esta cifra en el futuro. Puesto que los pacientes tratados con metadona a menudo también toman otros narcóticos, como barbitúricos y tranquilizantes, el tratamiento terapéutico requiere un control de las sustancias que han tomado los pacientes.

25 De conformidad con las pautas para un tratamiento con metadona, la orina se debe analizar como mínimo una vez por semana o, en determinadas circunstancias, incluso con mayor frecuencia. Normalmente, no se pueden obtener muestras de orina bajo observación en las consultas normales de los doctores puesto que, por lo general, se dispone de unos pequeños aseos y el personal médico masculino no suele mostrar la predisposición necesaria para acompañar a los pacientes varones en tratamiento con metadona. La

30 construcción de aseos adecuados para la obtención de muestras bajo observación requiere un gran desembolso financiero. Sólo los costes de esta inversión en las instalaciones sanitarias de Dusseldorf ascendieron a 50.000 marcos alemanes.

Debido a que se ha observado que, con frecuencia, las muestras de orina obtenidas se alteran, cada vez se

35 dedican más esfuerzos a los métodos analíticos para la detección de drogas en la secreción salival. Incluso aunque, en contraposición al uso de muestras de sangre, plasma u orina para los análisis, se puede obtener una muestra de saliva sin una acción invasiva que provoque lesiones o sin violar la privacidad del sujeto, el peligro de una confusión de las muestras por negligencia o una alteración intencionada de las mismas sigue sin poderse evitar.

40 La patente US-5.179.027 proporciona un método para verificar el origen y la integridad de las muestras de orina que consta de: el consumo de una cantidad de un primer y un segundo marcador químico por parte de un individuo, el primero de los cuales se excreta cuantitativamente, mientras que el segundo se expulsa en cantidades cuantificables en la orina para confirmar por medio de un análisis químico posterior la integridad y

45 la exactitud del origen de la muestra de orina; la obtención de una muestra de orina de dicho individuo dentro de un periodo de tiempo desde el citado consumo que es necesario para conseguir que se expulsen por medio de la orina las cantidades requeridas del primer y del segundo marcador químico; la documentación del momento en el que se consumen los marcadores así como la cantidad y tipo de estos productos además de la identidad del individuo que los consume; finalmente, el análisis de la orina recogida para determinar las

50 cantidades del primer y del segundo marcador químico para verificar el origen y la integridad de la muestra de orina.

Así pues, el objetivo del presente invento consiste en proporcionar un método mejorado para garantizar una atribución inequívoca de la muestra al donante y, de este modo, superar los problemas o desventajas que

55 suelen presentar los métodos de la técnica anterior.

De conformidad con el invento, este objetivo se alcanza al proporcionar un método para el análisis de muestras biológicas de un mamífero para determinar la presencia de, como mínimo, un componente que consta de los pasos siguientes: a) administración oral de una combinación de, como mínimo, dos marcadores 60 a un mamífero; b) espera del tiempo necesario para que la combinación de los, como mínimo, dos marcadores alcance el punto de obtención de la muestra; c) obtención de la muestra biológica del mamífero; d) análisis de la muestra biológica para determinar la presencia o cantidad de la combinación de los, como mínimo, dos marcadores o derivados de los mismos así como si la combinación de los, como mínimo, dos marcadores o derivados de éstos se puede detectar en la muestra biológica; e) análisis de la muestra

biológica para determinar la presencia de un analito, siendo la muestra biológica del mamífero una muestra de orina que se obtiene mediante su recogida en un recipiente para recogida de muestras, y en el que los, como mínimo, dos marcadores no se metabolizan tras su consumo por parte del sujeto y se seleccionan de entre los isoprenoides, lípidos, sacáridos, polioles, polietilenglicoles o de entre los derivados de estas

5 sustancias.

En consecuencia, el objetivo del presente invento consiste en encontrar un método que permita marcar la muestra que se debe analizar y, a la vez, evitar la extracción de este marcador de la muestra mediante métodos que pueda utilizar una persona no experta en la materia. Así pues, el método es indicado, por 10 ejemplo, para supervisar los tratamientos con metadona o también para realizar controles antidopaje. Los marcadores más indicados para este fin suelen tener unas características específicas. De conformidad con el presente invento, estos marcadores no producen ningún tipo de efecto secundario farmacológico en el organismo del mamífero a las concentraciones necesarias para su detección en sangre, orina u otros fluidos

o excreciones corporales.

15 También se puede utilizar un derivado formado específicamente a partir de cualquier de los, como mínimo, dos marcadores en sustitución de esta última sustancia. Por "derivados" se entienden todos los productos generados como consecuencia de una transformación química producida en el organismo del sujeto o bien en la muestra obtenida, aunque, sin embargo, se excluyen todos los productos generados posteriormente que

20 no se pueden atribuir de forma exclusiva a la transformación de un marcador específico producida en el organismo del sujeto o en la muestra obtenida.

Resulta preferible que los marcadores sean solubles en un líquido, que su adición no modifique el sabor natural del líquido en cuestión, por ejemplo un zumo, o que, tras la disolución en agua, los marcadores no

25 confieran un sabor desagradable a la solución resultante para que el sujeto beba voluntariamente el líquido que contiene los marcadores.

Los marcadores más indicados para este fin se caracterizan por su rápida absorción a través de la membrana intestinal y por su eliminación mediante la orina. Asimismo, es preferible que los marcadores presentes en las

30 muestras de orina se puedan detectar de una forma tan sencilla como sea posible mediante métodos de detección ya establecidos en los laboratorios de análisis químicos, como los métodos habituales de la química analítica de laboratorio. De conformidad con el presente invento, resulta preferible utilizar marcadores que no se metabolicen tras su consumo por parte del sujeto.

35 Los marcadores preferentes son azúcares o derivados de azúcares.

Para el análisis de las muestras de orina, la combinación de, cómo mínimo, dos marcadores se disuelve en un líquido, que luego se administra oralmente al sujeto aproximadamente entre 30 y 60 minutos antes de la obtención de la muestra de orina. Los polietilenglicoles o las mezclas de estas sustancias se utilizan de forma

40 especialmente preferente en el análisis de muestras de orina.

Resulta particularmente preferible administrar diversos marcadores de forma simultánea, caso en el que se puede desarrollar un determinado código numérico correspondiente a la respectiva muestra a partir de la combinación de marcadores. Para incrementar la seguridad frente a posibles alteraciones de las muestras, se

45 administra de forma simultánea una combinación de, como mínimo, dos, preferiblemente, tres, y de forma todavía más preferente, cinco marcadores.

Al utilizar un total de n marcadores, existen 2n–1 combinaciones distintas en un sistema numérico dual. En consecuencia, la alteración de las muestras por parte del sujeto es imposible, puesto que el sujeto tendría

50 que conocer la naturaleza química de los marcadores, el código numérico de su muestra de orina y la secuencia de los marcadores a partir de la que se genera el código.

La administración de los marcadores se puede llevar a cabo de formas distintas. Por "administración" se entiende la introducción de uno o varios marcadores en el organismo del donante de la muestra. De

55 conformidad con el presente invento, los marcadores se pueden administrar oralmente al donante. Resulta especialmente preferible que la absorción de los marcadores se produzca en el tubo digestivo y que, tras dicha absorción, no se produzca metabolización alguna de los marcadores.

En función del tipo de los, como mínimo, dos marcadores administrados y del tipo de muestra que se deba

60 obtener, es necesario que, antes de la obtención de la muestra que se debe analizar, transcurra "un periodo de tiempo necesario". Este periodo representa el tiempo necesario para que, como mínimo, un marcador alcance la zona de obtención de la muestra. En el caso de la obtención de una muestra de un componente independiente del donante, como la obtención de una muestra de un producto eliminado del organismo, se entiende que este periodo de tiempo es el necesario para que como mínimo un marcador se encuentre en el componente independiente y el donante elimine dicho componente. El periodo de tiempo que se debe esperar se puede determinar empíricamente aunque, en la mayoría de casos, los métodos o valores correspondientes para su determinación son bien conocidos en la técnica anterior (van Rossum, J. M.: Kinetics of Drug Action. Handbuch der experimentellen Pharmakologie, Vol. 47. Springer, Berlin 1977; Forth,

5 W.: Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie. Bibliographisches Institut & F. A. Brockhaus, Mannheim 1988).

La muestra se obtiene al recoger una parte del producto eliminado del organismo en un recipiente para muestras, operación tras la cual la muestra ya está lista para analizar. En el caso de análisis de muestras de

10 orina humana, el propio sujeto puede proporcionar la muestra, para lo que basta con facilitarle un recipiente para muestras.

Por "muestra biológica" se entienden los componentes de un mamífero para el que se desea realizar el estudio analítico. En este caso, se trata de orina. Los componentes que constituyen la muestra pueden incluir

15 componentes del organismo de un mamífero que todavía formen parte del propio mamífero en el momento de la obtención de la muestra así como componentes anteriores de dicho mamífero.

Por "productos eliminados del organismo" o "productos eliminados" se entiende la orina, las heces y las secreciones de glándulas salivales, mamarias, lagrimales y sudoríparas.

20 Por "mamífero" se entienden, además de los animales de esta clase, los humanos.

En función del tipo de muestra y de los, como mínimo, dos marcadores que se deben detectar, la muestra correspondiente se debe preparar con anterioridad al método analítico. Los pasos de la preparación pueden

25 incluir el centrifugado para la separación de materiales sólidos no solubilizados de una muestra líquida, por ejemplo orina, la concentración por cromatografía de intercambio iónico mediante filtros Centricon, por precipitación con reactivos adecuados, como sulfato amónico, el ajuste del valor de pH necesario para el método analítico y otros pasos de preparación bien conocidos para los expertos en la técnica.

30 Para determinar la presencia o ausencia de, cómo mínimo, uno marcador en una muestra hay disponibles diversos métodos de detección enzimáticos, inmunológicos, electroforéticos y por espectrometría de masas así como combinaciones de dichos métodos. Preferiblemente, la detección se lleva a cabo mediante un cromatógrafo de gases acoplado a un espectrómetro de masas, un cromatógrafo de líquidos de alto rendimiento acoplado a un espectrómetro de masas o bien mediante cromatografía de líquidos de alto

35 rendimiento o cromatografía de gases. Estos métodos permiten un análisis muy eficiente en cuanto al tiempo dedicado a su realización, especialmente de muestras líquidas o muestras que, debido a su preparación, se transfirieron a un líquido. Al mismo tiempo, estos métodos de detección permiten un elevado grado de automatización, de modo que se pueden analizar múltiples muestras en un breve periodo de tiempo, en la medida en la que los cromatogramas y, según el caso, los patrones de fragmentación espectroscópica de

40 masas de sustancias de referencia ya existan en la unidad de evaluación informática, y la detección real de los, como mínimo, dos marcadores también se simplifica en gran medida.

Si, como consecuencia de la evaluación del método analítico aplicado, se determina que los, como mínimo, dos marcadores administrados originalmente se encuentran en la muestra analizada, entonces este método

45 permite atribuir de forma inequívoca esta muestra al sujeto. Si se cumple este requisito, esto es, la muestra procede del sujeto analizado, se lleva a cabo el análisis real de esta muestra o, como alternativa, de una segunda muestra, en busca del analito.

Por "analito" se entiende como mínimo una sustancia química de la que si se conoce su presencia o, según

50 sea el caso, también su concentración en la muestra, permite formular una conclusión sobre un estado pasado, presente o previsto del donante de la muestra. A modo de ejemplo, se puede formular una conclusión que afirme que el funcionamiento de la reabsorción de la glucosa de la orina por parte de los túbulos renales (glucosuria) de un sujeto es incorrecto, porque es incompleto, a partir del conocimiento de la concentración de un analito, por ejemplo la concentración de glucosa en una muestra de orina, que se suele

55 determinar enzimáticamente mediante la glucosa oxidasa (GOD) o hexocinasa. Además, los analitos pueden ser tóxicos, fármacos o metabolitos de las sustancias antes mencionadas, la detección de los cuales en la muestra proporciona información sobre el comportamiento de un sujeto o el tratamiento al que está sometido.

Además del uso del método de conformidad con el presente invento en la medicina humana, también existen

60 múltiples aplicaciones adicionales en el ámbito veterinario y ganadero. El método se puede emplear de forma provechosa para supervisar el cumplimiento de normativas sobre el uso de aditivos en los piensos para el engorde de ganado.

Si, por ejemplo, se deben analizar muestras obtenidas de cerdos sometidos a engorde para determinar la presencia de hormonas del crecimiento, antibióticos o sus metabolitos, el uso del método de conformidad con el presente invento puede evitar el problema que supone que el dueño de la piara de cerdos altere las muestras que se deben analizar.

5 En este caso, resultan especialmente útiles aquellos marcadores que permanecen en el animal durante un largo periodo de tiempo, de forma ideal, a lo largo de todo el proceso de engorde, y que se encuentren en cantidades detectables de forma continuada, por ejemplo, en las sustancias eliminadas del organismo. Por este motivo, los marcadores que aportan más ventajas son aquellos que se pueden administrar al animal como un agente de liberación retardada, que permite, por ejemplo, una reabsorción continuada a través de la

10 membrana intestinal que se prolonga a lo largo del tiempo. Así pues, de este modo los, como mínimo, dos marcadores se pueden detectar durante un prolongado periodo de tiempo, por ejemplo, en las sustancias eliminadas del organismo, como las heces del animal. Las muestras más indicadas son aquellas que permiten llevar a cabo un análisis para detectar los, como mínimo, dos marcadores así como determinar la concentración de, como mínimo, un analito.

15 Otro objetivo del presente invento consiste en un juego para la aplicación del método descrito para la identificación de muestras de mamíferos, juego de conformidad con el presente invento que incluye una combinación de, como mínimo, dos marcadores en un contenedor, como un recipiente para comprimidos, así como, según el caso, medios para administrar los, como mínimo, dos marcadores al mamífero, en el que los

20 marcadores no se metabolizan tras su consumo por parte del sujeto.

El juego resulta especialmente útil cuando también contiene como mínimo una sustancia de referencia para la detección de los marcadores.

25 Un juego de conformidad con el invento contiene, preferiblemente, marcadores en forma de comprimidos efervescentes hidrosolubles individuales para su administración oral. Como alternativa, estos comprimidos efervescentes también pueden contener los marcadores como mezclas de diversas sustancias marcadoras. El código de cada sustancia se puede obtener de la etiqueta del recipiente de los comprimidos.

30 El juego puede incluir comprimidos efervescentes con distintas concentraciones de marcadores correspondientes al grupo de personas a las que se deben administrar los marcadores, de modo que éstos se pueden utilizar tanto en niños como en adultos sin alcanzar una concentración de estas sustancias en el sujeto que pueda conllevar efectos secundarios farmacológicos.

35 En una forma de realización ideal, los recipientes de comprimidos del juego incorporan un código informatizado. Los juegos destinados a marcar las muestras de orina de pacientes tratados con metadona contienen preferentemente comprimidos, cápsulas o formas de presentación similares en las que están disponibles de forma conjunta tanto la cantidad de metadona que se debe administrar como la mezcla de marcadores.

40 Otras formas de realización preferentes del juego de conformidad con el presente invento incluyen múltiples sustancias de referencia mediante las cuales los marcadores se pueden identificar con total facilidad en los análisis cromatográficos de la muestra de orina.

45 A modo de ejemplo, en el análisis de la muestra de orina de un paciente tratado con metadona, el juego de conformidad con el presente invento también puede incluir una ampolla que contiene una mezcla de marcadores solubilizados en un excipiente adecuado acorde al método cromatográfico seleccionado, mezcla que corresponde exactamente a la mezcla que se encuentra en los comprimidos de metadona correspondientes.

50 En una serie posterior en la misma columna del cromatógrafo de gases, se puede determinar con gran rapidez y certeza si la muestra de orina analizada procede del paciente tratado con metadona gracias a los valores máximos de los marcadores obtenidos mediante esta técnica.

55 Ejemplo 1

Para ejemplificar en mayor medida el método de conformidad con el presente invento, a continuación se describe una forma de realización para marcar la muestra que se debe analizar.

60 Dicha forma de realización se utiliza para marcar una muestra de orina que se debe analizar así como su análisis posterior. El sujeto recibe entre 100 ml y 300 ml de líquido para beber en el que 1 g de polietilenglicol 600 se solubiliza con un marcador. El líquido para beber puede ser zumo de frutas, agua o cualquier otro líquido apto para el consumo humano.

También se pueden utilizar fracciones monodispersas o mezclas de fracciones monodispersas en lugar de polietilenglicol 600. En este caso, el laboratorio determina un código de sustancia. Dicho código se proporciona después como cinco fracciones de polietilenglicol monodispersas. En la tabla siguiente, "0" significa ausente y "1" presente.

Marcadores
Marcadores

A: B C D E

Código

1: 0 0 0
1
1

2: 0 0 1 0 1

3: 0 0 1 1 0

4: 0 0 1 1 1

5: 0 1 0 0 1

6: 0 1 0 1 0

7: 0 1 0 1 1

8: 0 1 1 0 0

9: 0 1 1 0 1

10: 0 1 1 1 0

11: 1 0 0 0 1

12: 1 0 0 1 0

13: 1 0 0 1 1

14: 1 0 1 0 0

15: 1 0 1 0 1

16: 1 0 1 1 0

17: 1 1 0 0 0

18: 1 1 0 0 1

19: 1 1 0 1 0

20: 1 1 1 0 0

Las sustancias A, B, C, D y E corresponden a fracciones de polietilenglicol con los siguientes pesos moleculares:

A: 530

B: 574

C: 618

D: 662

E: 706

10 Tras la ingestión, se pidió al sujeto que esperara, como mínimo, 30 minutos y, como máximo, 4 horas antes de orinar. El sujeto pudo consumir otros líquidos o alimentos sólidos durante esta fase de espera. El sujeto no tuvo que ser vigilado durante este periodo. La obtención de la muestra de orina por parte del sujeto se llevó a cabo sin supervisión.

15 El recipiente de la muestra se identificó con una etiqueta de código de barras que contenía un código de número de trabajo que también figuraba en la etiqueta informatizada adjunta. En esta última etiqueta se anotó el nombre del sujeto, el análisis en cuestión y la combinación de marcadores o el código de sustancia. El donante se guardó mediante el número de trabajo en el ordenador del laboratorio junto con los datos

20 principales. Las muestras se transportaron hasta el laboratorio con las etiquetas adjuntas, que se introdujeron en el ordenador con un lector de tarjetas. El trabajo se guardó de este modo. En este ejemplo, la combinación de sustancias o el código de sustancias también se introdujeron en el ordenador.

Para el análisis para detectar el polietilenglicol, la orina se centrifugó, y 100 µl de sobrenadante se colocaron

25 en una columna Nucleosil C 100 – (C18) de 3 µm (4,6 x 125 mm) a una medida de caudal de 0,5 ml/min (metanol/agua 5/95) y se analizó en busca de polietilenglicol mediante un detector de índice de refracción (IR). Los valores máximos de la cromatografía se identificaron como polietilenglicoles mediante los tiempos de retención basados en las cromatografías de referencia.

30 De este modo, cada muestra de orina analizada se pudo atribuir de forma inequívoca al sujeto correspondiente mediante el código de sustancia de las distintas fracciones de polietilenglicol utilizadas. La muestra del sujeto se analizó posteriormente en busca del analito, esto es, un tóxico como la heroína o sus derivados que se debe detectar.

Los azúcares para marcar fluidos humanos se pueden utilizar del mismo modo que las fracciones de polietilenglicol. Se determinan a partir de la orina u otro fluido corporal mediante reacciones enzimáticas de detección. Los métodos analíticos de detección necesarios son habituales en la técnica anterior (Methods of Enzymic Analysis, ed. Bergmeyer, H. U. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim 1986).

5 Ejemplo 2

Para la preparación previa al análisis de los pacientes, se suministró 1 ml de polietilenglicol 400 ("marcador A"), polietilenglicol 600 ("marcador B") o una mezcla de polietilenglicol 400 y 600 ("marcador C") en 100 ml de

10 zumo de frutas a los pacientes de un centro de atención a toxicómanos. Se supervisó la ingestión de la bebida y se les pidió que esperaran como mínimo 30 minutos antes de la obtención de la muestra de orina. Una vez transcurrido este periodo, los pacientes pudieron orinar sin supervisión alguna. El frasco de orina se etiquetó y se transportó directamente al lugar de análisis.

15 Antes del análisis, las muestras se prepararon del modo siguiente: se centrifugaron 10 ml de orina a 10.500 x g durante diez minutos.

Para los análisis para detectar la presencia de polietilenglicol, el cromatógrafo se accionó para elución isocrática a temperatura ambiente en el modo de cambio de columna. Puesto que la detección del IR se limita 20 a las fases móviles isocráticas, el eluyente de la bomba analítica y de la bomba de desgasificación fueron los mismos, formados por un 44% de metanol y un 56% de agua. 100 µl de sobrenadante de la orina centrifugada se inyectaron automáticamente en una precolumna (60 x 4,6 mm) llena con 5 µm de Nucleosil 100 C18. Con el eluyente suministrado por la bomba de desgasificación a un caudal de 0,4 ml/min y a una presión de 36 bares, las impurezas de la matriz se desecharon, mientras que las fracciones de polietilenglicol 25 se retardaron en la fase estacionaria. Tras 120 segundos, la válvula de seis vías pasó la precolumna al flujo del eluyente de la bomba analítica, y los analitos se volvieron a lavar para conseguir la separación a una medida de caudal de 0,5 ml/min y a una presión de 96 bares en una columna analítica Nucleosil 100 C8 de 5 µm. El análisis supuso un total de 18 minutos. La caracterización fenomenológica del patrón de elución cromatográfica de la orina se consiguió mediante detección de IR a 40º C. Según el patrón observado, los

30 marcadores se identificaron como "marcador A", "marcador B" o "marcador C" tal y como se muestra en la figura 1-3 adjunta.

En este ejemplo se han utilizado los siguientes materiales y equipos: polietilenglicol, calidad PH Eur, con un peso molecular medio de 400 o 600 de Merck, Darmstadt (Alemania); metanol y acetonitrilo para 35 cromatografía líquida de alto rendimiento de Baker; agua desionizada y purificada mediante los sistemas Elix3 y MilliQ de Millipore de gradiente 10; columnas para cromatografía líquida de alta resolución Inertsil c8-3 Spm (250 x 4,6 mm) y Nucleosil 100 C18 de 5 µm (50 x 4,6 mm) de Schambeck SFD GmbH, Bad Honnef (Alemania). Equipo para cromatografía líquida de alta resolución: inyector de muestras S 5200 con un bucle de inyección de 100 µl; bomba de desgasificación de la precolumna S 2100; desgasificador integrado; válvula

40 de conmutación del motor de seis vías ProLAB; horno para columnas SFD 125-600; detector de índice de refracción de tipo deflección; elemento filtrante del interior del conducto PATTM para filtros del conducto de 3 µm PEEK de Schambeck SED GmbH, Bad Honnef (Alemania). Bomba analítica M480, módulo desgasificador Degasys DG1310 y sistema de adquisición de datos Chromeleon 6.11 con Windows NT 4.0 de Gynkotec.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para el análisis de muestras biológicas de un mamífero para determinar la presencia de un componente que consta de los pasos siguientes:(a) administración oral de una combinación de, como 5 mínimo, dos marcadores a un mamífero; (b) espera del tiempo necesario para que la combinación de, como mínimo, dos marcadores alcance el punto de obtención de la muestra; (c) obtención de la muestra biológica del mamífero; (d) análisis de la muestra biológica para determinar la presencia o cantidad de la combinación de, como mínimo, dos marcadores o derivados de los mismos así como si la combinación de los, como mínimo, dos marcadores o derivados de éstos se puede detectar en la muestra biológica; (e) análisis de la

10 muestra biológica para determinar la presencia de un analito, siendo la muestra biológica de un mamífero una muestra de orina obtenida mediante su recogida en un recipiente de recogida de muestras, y que se caracteriza porque los, como mínimo, dos marcadores no se metabolizan tras su consumo por parte del sujeto y se seleccionan de entre los isoprenoides, lípidos, sacáridos, polioles, polietilenglicoles o de entre los derivados de estas sustancias.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que la citada combinación de, como mínimo, dos marcadores incluye, por lo menos, tres marcadores y, preferiblemente, cinco marcadores.
3. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se utilizan como 20 mínimo dos polietilenglicoles con distintos pesos moleculares como marcadores.
4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el marcador o marcadores se detectan por medio de cromatografía de gases, cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía líquida de alto

25 rendimiento acoplada a espectrometría de masas.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que las muestras de orina de los pacientes tratados con metadona se analizan en busca de tóxicos, y que consta de los siguientes pasos: (a) administración oral de una combinación de 2n–1 polietilenglicoles con distintos pesos moleculares a un paciente tratado con

30 metadona, siendo n un número entero mayor que cero, preferiblemente por lo menos 2, de forma todavía más preferente 3, y en una forma de realización ideal, 5; (b) espera durante un periodo de tiempo de, como mínimo, 30 minutos y, como máximo, 4 horas; (c) obtención de una muestra de orina de la orina miccionada por el paciente; (d) análisis de la muestra de orina para detectar la presencia de los polietilenglicoles administrados y, según el caso; (e) análisis de la muestra de orina en busca de tóxicos.
6. El juego para la aplicación del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que incluye, en un envase, una combinación de como mínimo dos o, preferentemente, tres, y de forma todavía más preferente, cinco marcadores, que se seleccionan de entre los isoprenoides, lípidos, sacáridos, polioles, polietilenglicoles o de entre los derivados de estas sustancias, en el que los marcadores no se

40 metabolizan tras su consumo por parte del sujeto.
7. El juego de conformidad con la reivindicación 6, que contiene una combinación de 2n–1 polietilenglicoles con distintos pesos moleculares en uno o varios recipientes, siendo n un número entero mayor que cero, preferiblemente por lo menos 2, de forma todavía más preferente 3, y en una forma de realización ideal, 5.
8. El juego de conformidad con la reivindicación 6 u 7, que además incluye medios para administrar, como mínimo, un marcador.
9. El juego de conformidad con la reivindicación 8, que además incluye medios para la detección de los, como 50 mínimo, dos marcadores en la muestra obtenida del mamífero.
10. El juego de conformidad con la reivindicación 9, que además incluye sustancias de referencia para la detección de, como mínimo, dos marcadores.