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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, durch welches eine
Probe, die von einer Ausscheidung, von einer Körperflüssigkeit eines Säugetiers
oder als Gewebeprobe entnommen wurde, in bezug auf die Herkunft
der Probe identifiziert und so dem Donor der Probe eindeutig zugeordnet
werden kann, wodurch die Probe auf einen Analyten untersucht werden
kann. Gegenstand der Erfindung ist zudem ein Kit zur Durchführung dieses
Verfahrens.
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Diagnostische
Verfahren, Verfahren zur Überwachung
des Verlaufs einer therapeutischen Maßnahme, prophylaktische Routineuntersuchungen
sowie gerichtsmedizinische Untersuchungen am Menschen beinhalten
in der Regel die laboranalytische Untersuchung von Proben, wie z.B.
Blut- oder Serumproben, die dem Probanden entnommenen wurden, als
auch die Untersuchung von Ausscheidungen des Probanden, wie z.B. Urin.
In Anbetracht der Vielzahl existierender tiermedizinischer Diagnose-
und Therapieverfahren sind unterschiedlichste analytische Verfahren
mit tierischen Proben heutzutage ebenso gängige Praxis. Gerade die im Zusammenhang
mit der Massentierhaltung aufgetretenen Probleme, wie BSE-Erkrankungen
aufgrund der Verfütterung
von Tiermehl oder der Beimischung gesetzlich verbotener Futtermittelzusätze in Form
von Hormon- und/oder Antibiotika-Präparaten
in der Nutztiermast, machen eine Ausdehnung regelmäßiger Kontrolluntersuchungen
bei Tierherden in der Landwirtschaft erforderlich.
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Dabei
steht außer
Frage, dass jede analytische Untersuchung einer Probe nur dann sinnvoll
ist, wenn die infolge der Untersuchung erhaltenen Ergebnisse auch
zweifelsfrei dem jeweiligen Donor der Probe zugeordnet werden können, um
dann in Auswertung der Versuchsergebnisse gegebenenfalls die richtigen
Folgemaßnahmen
einleiten zu können.
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Im
Zuge des wissenschaftlich-technischen Fortschritts werden ständig neue
Analyse- und Testverfahren entwickelt. So erlauben Fortschritte
in der Molekularbiologie den Einsatz einer Reihe von Nachweisverfahren,
die auf DNA-Analyse beruhen, wodurch bestimmte Krankheiten am Menschen
oder am Tier diagnostiziert werden können.
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Eine
Vielzahl von neueren Analyse- und Nachweisverfahren findet auch
in der forensischen Medizin Anwendung bzw. wird infolge immer anspruchsvollerer
Aufgabenstellungen von dieser auch selbst, wie z.B. spezifische
Testverfahren zur Detektion von Dopingsubstanzen bei Leistungssportlern
oder zum Nachweis von Drogen bei Fahrzeugführern, hervorgebracht.
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Aufgrund
der Vielzahl der eingesetzten Analyseverfahren und der Komplexität dieser
werden hohe Anforderungen an die technische Ausstattung als auch
an das Personal der Laboratorien gestellt, die diese Untersuchungen
durchführen.
In der Regel ist dabei eine größere Anzahl
von Proben gleichzeitig mit modernen Analysegeräten zu untersuchen, so dass
sich zwangsläufig
das Problem einer Verwechslung von Proben ergibt und somit eine
falsche Zuordnung der Untersuchungsergebnisse gegenüber dem
Proben-Donor die Folge ist. Dieses Problem ist nicht neu und wird
zudem gerade durch die rasante Entwicklung neuerer Analysenmethoden
und dem damit wachsenden Bedarf hinsichtlich der Anwendung dieser
weiter verschärft.
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Da
die Auswirkungen einer Verwechslung oder eines Austausches von zu
analysierenden Proben zwar unterschiedlich, in aller Regel aber
unerwünscht
sind, existieren bereits eine ganze Reihe von Vorschlägen zur
Lösung
dieses Problems.
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Die
US 5,039,616 beschreibt
ein Verfahren, das die Verfälschung
von Proben verhindern soll. In diesem Dokument wird vorgeschlagen
Markersubstanzen, wie z.B. Lebensmittelfarbstoffe, Aromastoffe,
Vitamine und Spurenelemente zu verwenden.
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Die
US 4,953,562 beschreibt
ein Verfahren zur Identifizierung von Urin-Proben, das auf dem Nachweis zuvor
verabreichter Markersubstanzen, bei denen es sich um Vitamine oder
deren Metabolite handelt, basiert.
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Im
wesentlichen betreffen diese Lösungsansätze eine
verbesserte Organisation des Arbeitsablaufes in einem Untersuchungslabor,
wobei durch die Einhaltung bestimmter Verhaltensregeln die Gefahr
einer Verwechslung von Proben möglichst
gering gehalten werden soll. Da jedoch eine Vielzahl von Arbeitsschritten
bei diesen Analyseverfahren vom Laborpersonal selbst ausgeführt wird,
können
auf menschliches Versagen zurückzuführende Verwechslungen
nicht vollständig
ausgeschlossen werden.
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Im
Bewusstsein dessen findet die computer-gesteuerte Überwachung
der jeweils mit der Probe auszuführenden
Analyseschritte, z.B. indem die Probengefäße mit einem EDV lesbaren Code
markiert werden und so die jeweilige Probe während des gesamten Untersuchungsprozesses,
beginnend ab dem Eingang der Probe, und einschließend die
Aufbereitung und Lagerung der Versuchsergebnisse, verfolgt werden
kann, eine weite Verbreitung. Durch diese computer-überwachte
und -gesteuerte Analyse der Proben wird folglich eine hohe Anzahl
an Parallelbestimmungen verschiedener Proben – ohne dass eine nennenswerte
Gefahr von Verwechslungen besteht – ermöglicht.
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Dem
Fachmann ist aber klar, dass auch ein noch so ausgeklügeltes System
zur Überwachung
der zu untersuchenden Proben in einem Labor und der Zuordnung der
Testergebnisse zu diesen Proben und damit zu den Proben-Donoren
eine Verwechslung oder einen Austausch der Proben nicht vollständig ausschließen kann,
da nur eine unzureichende Markierung der Proben bzw. der dazugehörigen Testergebnisse
erfolgen kann.
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Die
geschilderte Problematik der Verwechslung oder des Austausches von
Proben wird insbesondere in Anwendungsbereichen weiter verschärft, in
denen die Testergebnisse als belastendes Beweismaterial gegen den
Proben-Donor bzw. im Falle der von einem Nutztier stammenden Probe
gegen den Eigentümer
des Tieres verwendet werden kann. In diesen Fällen besteht ein besonderes
Interesse des Probanden bzw. des Eigentümers, die Testproben zu manipulieren,
um so die Entstehung von belastendem Beweismaterial zu verhindern.
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Gerade
in diesen Fällen
kommt aber einer unzweideutigen Zuordnung der Testergebnisse zu
dem Proben-Donor eine besondere Bedeutung zu, da oft nur auf diese
Weise bestimmte gesetzliche Normen durchgesetzt werden können.
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Die
in Anbetracht dieser Problematik im Stand der Technik bereits bestehenden
Lösungsansätze zur Verhinderung
einer Manipulation der Probe betreffen ausschließlich die Überwachung der Probenentnahme. So
ist es z.B. gängige
Praxis, dass die Urin-Abgabe von Probanden, die an einer Methadon-Therapie
teilnehmen, überwacht
wird.
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Jedoch
wird auch eine noch so ausgeklügelte Überwachung
und Beobachtung der Probanden bei der Abgabe der Urin-Proben ein
Austauschen der Proben nicht gänzlich
verhindern. In Deutschland werden bereits 20.000 der 120.000-140.000
Drogenabhängigen
mit Methadon behandelt. Ein starker Anstieg dieser Zahl ist in Zukunft
zu erwarten. Da Methadon-Patienten häufig andere Narkotika wie auch
Barbiturate und Tranquilizer einnehmen, ist eine Kontrolle der vom
Patienten eingenommenen Substanzen therapeutisch erforderlich.
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Gemäß den Richtlinien
zur Durchführung
der Methadon-Therapie muss der Urin mindestens einmal pro Woche,
bzw. unter bestimmten Umständen
noch häufiger,
kontrolliert werden. Die Abgabe der Urin-Probe unter Beobachtung
ist in aller Regel in gewöhnlichen
Arztpraxen nicht möglich,
da üblicherweise
nur eine kleine Toilette vorhanden ist und in der Regel männliches
medizinisches Personal zur Begleitung der männlichen Methadon-Patienten
nicht ausreichend zur Verfügung
steht. Die Errichtung geeigneter Toiletten zur Proben-Abgabe unter
Beobachtung erfordert einen hohen finanziellen Aufwand. So betrugen
die Kosten für
eine derartige Investition im Gesundheitsamt Düsseldorf immerhin 50 TDM.
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Aufgrund
der häufig
festgestellten Manipulation von abgegebenen Urin-Proben wird verstärkt an der Entwicklung
von Analysemethoden zum Nachweis von Drogen im Speichelausfluss
gearbeitet. Wenngleich im Gegensatz zur Verwendung von Blut, Plasma
oder Urin als Testproben eine Speichelprobe ohne einen verletzenden
Eingriff bzw. ohne Verletzung der Privatsphäre des Probanden erhalten werden
kann, so wird dadurch trotz allem nicht die Gefahr einer fahrlässigen Verwechslung
oder einer mutwilligen Manipulation der Probe verhindert werden
können.
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine eindeutige Zuordnung
der Proben zu dem Donor sicherzustellen und so die dem Stand der
Technik gemeinsamen Probleme bzw. Nachteile zu überwinden.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß durch
Bereitstellung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 gelöst.
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Idee
der vorliegenden Erfindung war es daher, eine Möglichkeit zu finden, mit welcher
die zu untersuchende Probe markiert werden kann, ohne dass dieser
Marker durch Methoden, die einem Laien zugänglich sind, wieder von der
Probe entfernt werden kann. So eignet sich das Verfahren beispielsweise
zur Kontrolle einer Methadon-Therapie als auch einer Doping-Kontrolle.
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Vorteilhafte
Markersubstanzen zeichnen sich allgemein durch eine Reihe von spezifischen
Eigenschaften aus. So üben
diese Markersubstanzen keine pharmakologischen Nebenwirkungen auf
den Organismus des Säugetiers
bei den Konzentrationen aus, wie sie erforderlich sind, damit diese
als Markersubstanzen im Blut, im Urin oder in anderen Körperflüssigkeiten
bzw. Körperausscheidungen
erfindungsgemäß detektiert werden
können.
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Ebenso
kann anstelle der mindestens einen Markersubstanz auch ein spezifisch
daraus gebildetes Derivat detektiert werden. Unter "Derivate" sind alle infolge
einer chemischen Umwandlung im Organismus des Probanden oder in
der entnommenen Probe entstandenen Folgeprodukte gemeint, wobei
jedoch alle diejenigen Folgeprodukte ausgeschlossen sind, die nicht
ausschließlich
auf die Umwandlung eines spezifischen Markers im Probandenorganismus
oder in der entnommenen Probe zurückzuführen sind.
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Vorteilhaft
ist, wenn die Markersubstanzen in einer Flüssigkeit löslich sind, dass die Flüssigkeit,
wie z.B. Saft, durch den Zusatz keine Veränderung des gewöhnlichen
Geschmacks erfährt
oder nach Auflösung in
Wasser kein unangenehmer Geschmack der erhaltenen Lösung durch
die Marker erzielt wird und somit der Proband die die Marker enthaltende
Flüssigkeit
bereitwillig trinken kann.
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Vorteilhafte
Markersubstanzen zeichnen sich dadurch aus, dass sie schnell über die
Darmschleimhaut absorbiert und zusammen mit dem Urin aus dem Probanden
weder ausgeschieden werden. Es ist des weiteren vorteilhaft, wenn
diese Markersubstanzen in Urin-Proben auf möglichst einfache Weise durch
bereits in chemischen Untersuchungslaboratorien etablierte Nachweisverfahren,
wie z.B. gängige
Verfahren der klinischen analytischen Chemie detektiert werden können. Erfindungsgemäß werden
Markersubstanzen verwendet, die nach der Aufnahme durch den Probanden
nicht metabolisiert werden.
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Als
Markersubstanz werden Lipide, Polyole, Polyethylenglykole, Derivate
oder Gemische dieser Markersubstanzen verwendet.
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Besonders
vorteilhaft kommt das erfindungsgemäße Verfahren bei der Untersuchung
von Urin-Proben zum Einsatz. Hierzu wird die Markersubstanz oder
eine Kombination mehrerer Markersubstanzen in einer Flüssigkeit
aufgelöst
und diese, indem der Proband die Flüssigkeit trinkt, etwa 30 bis
60 Minuten vor der Urin-Abgabe oral verabreicht. Zur Untersuchung
von Urin-Proben werden am vorteilhaftesten Polyethylenglykole oder
Gemische davon als Markersubstanzen eingesetzt.
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Es
ist besonders vorteilhaft, mehrere Markersubstanzen zugleich zu
verabreichen, wobei es durch die Kombination von Markersubstanzen
möglich
ist, einen bestimmten numerischen Code, jeweils zu einer Probe gehörig, zu
entwickeln. Bevorzugt ist zur Erhöhung der Manipulationssicherheit
die gleichzeitige Verabreichung einer Kombination von mindestens
2, besonders bevorzugt von mindestens 3, ganz besonders von 5 Markersubstanzen.
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Bei
einer Gesamtzahl von n Markersubstanzen existieren 2n – 1 verschiedene
Kombinationen in einem dualen numerischen System. Die Manipulation
der Probe durch den Probanden ist folglich unmöglich, da der Proband die chemische
Natur der Markersubstanzen, den numerischen Code für seine
Urin-Probe und die Abfolge der Markersubstanzen, nach welchen der
Code aufgebaut ist, kennen müsste.
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Die
Verabreichung der Markersubstanz kann auf verschiedenen Wegen erfolgen.
Unter "Verabreichung" ist das Einschleusen
von einer oder einer Vielzahl von Markersubstanzen in den Organismus
des Proben-Donors gemeint. Erfindungsgemäß kann die Markersubstanz oder
die Vielzahl an Markersubstanzen dem Proben-Donor bevorzugt parenteral
oder oral verabreicht werden. Es ist besonders bevorzugt, dass die Markersubstanz
oder die Vielzahl an Markersubstanzen über den Verdauungstrakt aufgenommen
wird und dabei keine Metabolisierung der Markersubstanzen eintritt.
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Bis
zur Entnahme der zu untersuchenden Probe ist es je nach Art der
verabreichten mindestens einen Markersubstanz und der Art der zu
entnehmenden Probe erforderlich, einen bestimmten "ausreichenden Zeitraum" bis zur Probenentnahme
abzuwarten. Dieser Zeitraum entspricht der Zeit, die die mindestens
eine Markersubstanz benötigt,
um an den Ort der Probenentnahme zu gelangen. Im Fall einer Probenentnahme von
einem getrennt vom Proben-Donor vorliegenden Bestandteil, wie z.B.
bei einer Probenentnahme von einer Körperausscheidung, ist die Zeit
zu verstehen, die erforderlich ist, bis die mindestens eine Markersubstanz
im abtrennbaren Bestandteil vorliegt und dieser Bestandteil vom
Proben-Donor abgetrennt ist. Der abzuwartende Zeitraum kann empirisch
bestimmt werden, wobei aber in den meisten Fällen die entsprechenden Werte
bzw. Methoden zu deren Bestimmung im Stand der Technik bekannt sind
(van Rossum, J. M.: Kinetics of Drug Action. Handbuch der experimentellen
Pharmakologie, Vol. 47. Springer, Berlin 1977; Forth, W.: Allgemeine
und spezielle Pharmakologie und Toxikologie. Bibliographisches Institut & F. A. Brockhaus,
Mannheim 1988).
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Je
nach Art der zu untersuchenden Probe erfolgt die Probenentnahme
auf unterschiedliche Weise. Im Fall der Analyse von Körperausscheidungen
wird von der Probe ein Teil in ein Probengefäß aufgenommen und steht ab
dann der weiteren Untersuchung zur Verfügung. Bei der Untersuchung
humaner Urin- oder Stuhlproben können
die Proben in der Regel von den Probanden selbst beigebracht werden,
indem lediglich dem Probanden ein Probengefäß ausgehändigt werden muss. Zur Entnahme
von Proben an Körperflüssigkeiten
oder von Gewebsproben ist regelmäßig ein
direkter Eingriff beim Probanden erforderlich. So kann die Gewinnung von
Probandenblut mittels Saugpipette nach Hauteinstich oder -schnitt
mit einer Einweglanzette bzw. – in
größeren Mengen – mittels
Injektionsspritze oder Ventile nach Venenpunktion erfolgen. Zur
Untersuchung von Liquor wird dieser durch Lumbal-, Subokzipital-
oder Ventrikelpunktion erhalten.
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Unter "biologischer Probe" sind die für die analytische
Untersuchung bestimmten Bestandteile eines Säugetiers gemeint. Dabei handelt
es sich um Körperausscheidungen,
Körperflüssigkeiten
oder Gewebeproben. Die die Probe bildenden Bestandteile können sowohl
Bestandteile eines Säugetierorganismus
sein, die zum Zeitpunkt der Probenentnahme noch im Säuger vorliegen
als auch ehemalige Bestandteile des Säugers umfassen.
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Unter "Körperausscheidungen" oder "Ausscheidung" sind Urin, Stuhl,
Sekrete von Speichel-, Milch-, Tränen- und Schweißdrüsen zu verstehen.
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Unter "Körperflüssigkeit" sind extrazelluläre Flüssigkeiten eines Säugerorganismus
wie Blut, Serum und Liquor zu verstehen.
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Unter "Säugetier" oder "Säuger" ist neben Tieren
dieser Kategorie auch der Mensch zu verstehen.
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Vorzugsweise
sind die einem Säugetier
entnommenen oder von diesen ausgeschiedenen Proben Körperausscheidungen,
Körperflüssigkeiten
oder Gewebsproben.
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Unter "Gewebeprobe" ist ein durch einen
unmittelbaren Eingriff in den lebenden Säugerorganismus gewonnener Verband
gleichartig differenzierter Zellen sowie deren Interzellularsubstanz.
Ebenso fallen Haarproben und Proben abgestoßener Hautpartien unter diesen
Begriff.
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Je
nach Art der Probe und der zu detektierenden mindestens einen Markersubstanz
ist die jeweilige Probe vor dem Analyseverfahren aufzubereiten.
Die Aufbereitungsschritte können
Zentrifugieren zur Abtrennung von festen, nicht gelösten Stoffen
in einer flüssigen
Probe, wie z.B. Urin, Auflösen
oder Suspendieren fester Proben, wie z.B. Stuhl, Aufkonzentration
durch Ionenaustauschchromatographie, durch Verwendung von Centricons,
durch Ausfällung
mit geeigneten Reagenzien, wie z.B. Ammoniumsulfat, Einstellen des
für das Analyseverfahren
erforderlichen pH-Wertes, Homogenisieren der Probe, wie z.B. durch
Ultraschall oder unter Verwendung von Vibrationszellmühlen um
z.B. Bestandteile von ursprünglich
intakten Geweben untersuchen zu können, Abtrennen von beim Probenaufschluss
eingesetzten Stoffen, wie z.B. Detergenzien und weitere dem Fachmann
bekannte Aufbereitungsschritte umfassen.
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Zur
Feststellung der An- oder Abwesenheit von mindestens einer Markersubstanz
in einer Probe stehen eine Reihe von enzymatischen, immunologischen,
massenspektrometrischen und elektrophoretischen Nachweisverfahren
sowie von Kombinationen dieser zur Verfügung. Bevorzugt erfolgt der
Nachweis durch ein gekoppeltes GC/MS- oder HPLC/MS-Verfahren oder
durch HPLC oder GC. Durch diese Verfahren lassen sich insbesondere
flüssige
Proben bzw. Proben, die infolge der Aufbereitung in eine Flüssigkeit überführt wurden, sehr
zeitökonomisch
untersuchen. Gleichzeitig erlauben diese Nachweisverfahren einen
hohen Automatisierungsgrad, so dass eine Vielzahl von Proben in
kurzer Zeit analysiert werden können
und indem bereits die Chromatogramme und ggf. massenspektrometrischen
Fraktionsmuster von Referenzsubstanzen in der EDV-Auswertungseinheit
vorliegen, wird zudem auch der eigentliche Nachweis der mindestens
einen Markersubstanz stark vereinfacht.
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Wird
infolge der Auswertung des angewandten Analyseverfahrens festgestellt,
dass die ursprünglich verabreichte
mindestens eine Markersubstanz in der untersuchten Probe vorliegt,
so erlaubt das die eindeutige Zuordnung dieser Probe zum Probanden.
Ist diese Voraussetzung erfüllt,
d. h. dass die Probe dem zu untersuchenden Probanden entstammt,
erfolgt die eigentliche Untersuchung dieser Probe oder alternativ
einer zweiten Probe auf einen Analyt.
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Unter "Analyt" ist mindestens eine
chemische Substanz zu verstehen, wobei die Kenntnis über die
Anwesenheit des Analyt bzw. ggf. auch von dessen Konzentration in
der Probe einen Rückschluss
auf einen zurückliegenden,
zu erwartenden oder momentanen Zustand des Proben-Donors erlaubt.
Beispielsweise kann auf Basis der Kenntnis der Konzentration eines
Analyten, wie z.B. der Glukosekonzentration im Harn in einer Urin-Probe, die in der
Regel enzymatisch mittels Glukose-Oxidase (GOD) bzw. Hexokinase
bestimmt wurde, z.B. ein Rückschluss
auf eine nicht korrekt funktionierende, da nicht vollständige Resorption
der Glukose aus dem Harn durch die Nierentubuli (Glukosurie) bei
einem Probanden ermöglicht
werden. Analyten können
weiterhin Rauschmittel, Arzneimittel, Metabolite der vorgenannten
Substanzen sein, deren Nachweis in der Probe Aufschluss über das
Verhalten oder eine Behandlung des Probanden zulässt.
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Neben
der Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
in der Humanmedizin existieren zudem eine Vielzahl weiterer Anwendungen
auch im veterinärmedizinischen
Bereich und in der Landwirtschaft. So kann das Verfahren vorteilhaft
bei der Überwachung
der Einhaltung der Vorschriften zum Einsatz von Futterzusatzstoffen
in der landwirtschaftlichen Masttierhaltung angewandt werden.
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Sollen
beispielsweise von Mastschweinen gewonnene Proben auf die Anwesenheit
von Wachstumshormonen oder Antibiotika oder deren Metaboliten untersucht
werden, kann durch Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens die Problematik
einer vom Eigentümer
einer Mastschweinherde bewirkten Manipulation von zu untersuchenden
Proben vermieden werden.
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Hierbei
sind insbesondere Markersubstanzen von Vorteil, die über einen
langen Zeitraum – im
Idealfall die gesamte Mastdauer – im Tier verbleiben, aber
welche dennoch in einer noch nachweisbaren Menge in z.B. einer Körperausscheidung
ständig
vorliegen. Deshalb sind Markersubstanzen vorteilhaft, die in der
Art eines Depotwirkstoffes dem Masttier verabreicht werden und infolgedessen
z.B. eine zeitlich verzögerte,
aber dennoch fortlaufend erfolgende Resorption durch die Darmschleimhaut
stattfindet und somit über
einen längeren Zeitraum
die mindestens eine Markersubstanz in z.B. einer Körperausscheidung,
wie Tierkot, nachweisbar ist. Besonders geeignete Proben sind solche
Proben, mit denen sowohl die Untersuchung auf die mindestens eine Markersubstanz
als auch der Nachweis bzw. die Konzentrationsbestimmung mindestens
eines Analyt erfolgt.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist zudem ein Kit zur Durchführung des
beschriebenen Verfahrens zur Proben-Identifizierung bei einem Säugetier,
wobei der erfindungsgemäß verwendete
Kit mindestens eine Markersubstanz in einem Behälter wie einem Tablettengefäß, sowie
gegebenenfalls Mittel zur Verabreichung der mindestens einen Markersubstanz
an das Säugetier
umfasst.
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Es
ist besonders vorteilhaft, wenn dieser Kit zudem mindestens eine
Referenzsubstanz für
die Detektion der Markersubstanz oder der Vielzahl an Markersubstanzen
enthält.
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Bevorzugt
enthält
der Kit für
die orale Verabreichung der Markersubstanzen diese in Form von jeweils wasserlöslichen
Brausetabletten. Alternativ können
diese Brausetabletten die Markersubstanzen auch bereits als Mischungen
mehrerer Markersubstanzen enthalten. Der jeweilige Substanz-Code
kann dann vom Etikett des Tablettengefäßes entnommen werden.
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Entsprechend
dem Personenkreis, dem die Marker verabreicht werden sollen, kann
der Kit Brausetabletten mit unterschiedlicher Konzentration an Markersubstanzen
aufweisen, damit diese Marker z.B. sowohl Kindern wie auch Erwachsenen
appliziert werden können,
ohne dass dabei im Probanden eine Konzentration der Markersubstanzen
erzielt wird, bei welcher pharmakologische Nebenwirkungen eintreten
können.
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Besonders
vorteilhaft ist, wenn die im Kit enthaltenen Tablettengefäße mit einem
EDV-lesbaren Code versehen sind. Kits, die zur Markierung von Urin-Proben
bei Methadon Patienten vorgesehen sind, enthalten bevorzugt Tabletten,
Kapseln o. ä.
Applikationsformen, bei denen sowohl die zu verabreichende Menge
an Methadon wie auch die Mischung an Markersubstanzen gemeinsam
vorliegt.
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Weitere
vorteilhafte Ausführungsformen
des erfindungsgemäß verwendeten
Kits enthalten mehrere Referenzsubstanzen, mittels derer auf einfache
Art und Weise bei der chromatographischen Analyse der Probe, wie
z.B. bei der Untersuchung der Urin-Probe, die Markersubstanzen identifiziert
werden können.
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So
kann z.B. bei der Untersuchung der Urin-Probe eines mit Methadon
therapierten Patienten zusätzlich
ein Ampullenröhrchen
im erfindungsgemäßen Kit
vorliegen, das eine in einem geeigneten Laufmittel gemäß dem gewählten chromatographischen
Verfahren gelöste
Mischung an Markersubstanzen enthält, wobei diese Mischung exakt
derjenigen entspricht, welche in den korrespondierenden Methadon-Tabletten
vorliegt.
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Bei
Anwendung einer GC-Analyse kann durch einen nacheinander erfolgenden
Lauf auf der gleichen GC-Säule
aufgrund der Chromatographie-Gipfel der Markersubstanzen sehr schnell
und mit Sicherheit festgestellt werden, ob die untersuchte Urin-Probe dem mit Methadon
behandelten Patienten entstammt:
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Beispiel
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Im
folgenden wird zur Erläuterung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
ein Ausführungsbeispiel
zur Durchführung
der Markierung einer zu untersuchenden Probe beispielhaft angegeben.
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Das
Ausführungsbeispiel
betrifft die Markierung einer zu untersuchenden Urin-Probe un deren
anschließende
Untersuchung.
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Der
Proband erhält
100-300 ml Trinkflüssigkeit,
in der 1 g Polyethylenglykol 600 als Markersubstanz gelöst ist.
Als Trinkflüssigkeit
können
Fruchtsäfte,
Wasser und andere humanverträgliche
Flüssigkeiten
verwendet werden.
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Anstelle
von Polyethylenglykol 600 können
auch monodisperse Fraktionen oder Gemische monodisperser Fraktionen
eingesetzt werden. Hierbei stellt das Labor einen Substanz-Code
auf. Im folgenden ist ein solcher Code aus 5 monodispersen Polyethylenglykol-Fraktionen
angegeben. Hierbei steht „0" für nicht
vorhanden und „1" für vorhanden.
Substanzen |
| A | B | C | D | E |
Code | | | | | |
1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 |
2 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 |
3 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
4 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 |
5 | 0 | 1 | 0 | 0 | 1 |
6 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 |
7 | 0 | 1 | 0 | 1 | 1 |
8 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 |
9 | 0 | 1 | 1 | 0 | 1 |
10 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 |
11 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 |
12 | 1 | 0 | 0 | 1 | 0 |
13 | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 |
14 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 |
15 | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 |
16 | 1 | 0 | 1 | 1 | 0 |
17 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
18 | 1 | 1 | 0 | 0 | 1 |
19 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 |
20 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 |
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Die
Substanzen A, B, C, D und E entsprechen Polyethylenglykol-Fraktionen
mit den Molekulargewichten:
A | 530 |
B | 574 |
C | 618 |
D | 662 |
E | 706 |
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Nach
Ingestion wurde der Proband aufgefordert, mindestens 30 min., maximal
4 h bis zum Wasserlassen zu warten. Innerhalb dieser Wartephase
durfte der Proband weitere Flüssigkeiten
oder feste Nahrung zu sich nehmen. Der Proband musste während der
Wartezeit nicht beaufsichtigt werden. Die Abgabe des Urins durch
den Probanden erfolgte ohne Aufsicht.
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Das
Probengefäß wurde
mit einem Bar-Code-Etikett identifiziert, das eine Auftragsnummer
kodiert, die auch der EDV-lesbare Begleitschein enthält. Auf
dem Begleitschein wurde der Name des Probanden, die gewünschten
Untersuchungen sowie die Kombination von Markersubstanzen bzw. der
Substanz-Code vermerkt. Der
Einsender ist durch die Auftragsnummer in den Stammdaten der EDV
des Labors hinterlegt. Die Proben wurden mit dem Begleitschein in
das Labor transportiert. Der Begleitschein wurde in die EDV über einen
Kartenleser eingelesen. Auf diese Weise wurde der Auftrag erfasst.
Hierbei wurde auch die Substanzkombination bzw. der Substanz-Code in die EDV eingegeben.
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Zur
Analyse auf Polyethylenglykol wurde der Urin zentrifugiert, 100 μl des Überstands
an Nucleosil C 100 – (C18),
3 μm (4,6 × 125 mm)
bei einer Flussrate von 0,5 ml/min (Methanol/Wasser 5/95) und einer
Detektion mit einem RI-Detektor
auf Polyethylenglykol untersucht. Die Chromatographiegipfel wurden
aufgrund der Referenzchromatographien als Polyethylenglykole durch
die Retentionszeiten identifiziert.
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Auf
diese Weise konnte jede untersuchte Urin-Probe über den Substanz-Code der verwendeten
unterschiedlichen Polyethylenglykol-Fraktionen dem jeweiligen Probanden
eindeutig zugeordnet werden. Der Proband wurde anschließend auf
den Analyten, d.h., ein nachzuweisendes Rauschmittel wie Heroin
oder dessen Derivate untersucht.
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In
gleicher Weise, wie für
Polyethylenglykolfraktionen beschrieben, können Zucker für die Markierung von
Körperflüssigkeiten
eingesetzt werden. Diese werden über
enzymatische Nachweisreaktionen aus Urin oder anderen Körperflüssigkeiten
bestimmt. Die hierzu erforderlichen analytischen Nachweisverfahren
sind im Stand der Technik bekannt (Methods of Enzymic Analysis,
ed. Bergmeyer, H.U. VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim 1986).